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Medicine

Untersuchung der Mechanosensorik von luminalen Partikeln im murinen Dünndarm

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/63697
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 1,4
1Enteric NeuroScience Program (ENSP), Division of Gastroenterology & Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Mayo Clinic, 3Easy Learning Labs, 4Department of Physiology & Biomedical Engineering (PBME), Mayo Clinic
* These authors contributed equally

Summary

Um zu untersuchen, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Größe umgeht, haben wir eine etablierte in vivo-Methode zur Bestimmung des Dünndarmtransits modifiziert.

Abstract

Die gastrointestinale Motilität (GI) ist entscheidend für eine normale Verdauung und Resorption. Im Dünndarm, der Nährstoffe aufnimmt, optimiert die Motilität die Verdauung und Absorption. Aus diesem Grund umfassen einige der Motilitätsmuster im Dünndarm Segmentierung zum Mischen von luminalen Inhalten und Peristaltik für ihren Antrieb. Physikalische Eigenschaften des luminalen Inhalts modulieren die Muster der Dünndarmmotilität. Die mechanische Stimulation mechanosensorischer GI-Schaltkreise durch den Transit von luminalen Inhalten und der zugrunde liegenden Darmmotilität initiiert und moduliert komplexe GI-Motormuster. Die mechanosensorischen Mechanismen, die diesen Prozess antreiben, sind jedoch noch wenig verstanden. Dies ist vor allem auf einen Mangel an Werkzeugen zurückzuführen, um zu analysieren, wie der Dünndarm mit Materialien unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften umgeht. Um zu untersuchen, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Größe umgeht, haben wir eine etablierte in vivo-Methode zur Bestimmung des Dünndarmtransits modifiziert. Wir gördern lebende Mäuse mit fluoreszierender Flüssigkeit oder winzigen fluoreszierenden Perlen. Nach 30 Minuten sezieren wir den Darm, um die Verteilung des fluoreszierenden Inhalts über den gesamten GI-Trakt abzubilden. Zusätzlich zu hochauflösenden Messungen des geometrischen Zentrums verwenden wir Binning variabler Größe und Spektralanalysen, um zu bestimmen, wie verschiedene Materialien den Dünndarmtransit beeinflussen. Wir haben untersucht, wie ein kürzlich entdeckter "Darmberührungsmechanismus" die Dünndarmmotilität mit diesem Ansatz beeinflusst.

Introduction

Der menschliche Magen-Darm-Trakt (GI) ist ein mehrere Fuß langes Organsystem, grob angenähert als Röhre mit unterschiedlichen Abmessungen und physikalischen Eigenschaften1. Während sich der Inhalt durch seine Länge bewegt, besteht die Hauptfunktion des Magen-Darm-Trakts darin, lebenswichtige Substanzen aufzunehmen. Der Dünndarm ist speziell für die Nährstoffaufnahme verantwortlich. Der Transit des Dünndarms ist streng reguliert, um den Verdauungs- und Absorptionsfunktionen zu entsprechen, was zu verschiedenen Motilitätsmustern führt. Bayliss und Starling beschrieben 1899 das "Gesetz des Darms"2 und zeigten das kontraktile Antriebsprogramm im Darm, das heute als peristaltischer Reflex bekannt ist; Das Segment in der Nähe des Nahrungsbolus zieht sich zusammen, um es vorwärts zu treiben, und das distale Segment entspannt sich, um es zu empfangen. Theoretisch könnte dieses Muster allein ausreichen, um Material aboral zu transportieren, aber über ein Jahrhundert Forschung hat ein komplexeres Bild der kontraktilen Aktivität im Magen-Darm-Trakt gezeichnet. Beim Menschen werden drei Dünndarmmotilitätsperioden erkannt: der wandernde motorische Komplex (MMC), die Fastenperiode und die postprandiale Periode3. Die gleichen Muster wurden bei Mäusenberichtet 4,5. Die MMC ist ein zyklisches motorisches Muster, das bei den meisten Säugetieren erhalten bleibt 6,7. Die MMC hat ein charakteristisches Vier-Phasen-Muster, das als nützlicher klinischer Marker bei funktionellen GI-Störungen dient7. Die vier Phasen, in der Reihenfolge ihres Auftretens, sind (I) Ruhe, (II) unregelmäßige, niedrige Amplitudenkontraktionen, (III) regelmäßige Kontraktionen mit hoher Amplitude und (IV) Ramp-down-Periode abnehmender Aktivität7. Die MMC markiert das wichtigste motorische Muster der Fastenperiode3. MMCs der Fastenzeit klären den Inhalt des Dünndarms in Vorbereitung auf die nächste Mahlzeit.

Die motorischen Muster der postprandialen Periode sind für die Verdauungs- und Absorptionsfunktionen optimiert3. Unabhängig von der kalorischen Zusammensetzung ist der anfängliche Transit schnell entlang des Dünndarms, der Inhalt wird entlang der Länge des Darms verteilt und der Transit verlangsamt sich anschließend8. Die Absorption wird optimiert, indem die Kontaktfläche vergrößert und verlangsamt wird, um die Verweilzeit zu verlängern. Sobald sich die Nährstoffe im Lumen befinden, besteht das dominante Muster aus engen (<2 cm auseinander) unkoordinierten Kontraktionen (segmentierende Kontraktionen), mit einigen überlagerten Kontraktionen mit großer Amplitude, die sich über die gesamte Länge des Dünndarms erstrecken (peristaltische Kontraktionen)9. Segmentierende Kontraktionen mischen die intraluminalen Inhalte an Ort und Stelle. Die gelegentlichen großen peristaltischen Kontraktionen treiben den Inhalt in Richtung Dickdarm.

Der Zeitpunkt dieses Übergangs zurück zu MMCs hängt vom Nahrungsvolumen und der Kalorienzusammensetzung ab10. So probiert der Dünndarm luminale Hinweise, um zu regulieren, wann zwischen den Motilitätsperioden übergegangen werden soll. Mechanische Hinweise, wie physikalische Eigenschaften des luminalen Inhalts11, des luminalen Volumens und der Wandspannung, greifen Mechanorezeptorzellen in der GI-Wand 12,13,14,15,16 ein. In der Tat führt die Erhöhung der festen Komponente einer Mahlzeit zu einer Zunahme des Dünndarmtransits17. Wir spekulieren, dass physikalische Eigenschaften, wie der flüssige oder feste Zustand von intraluminalen Inhalten, aufgrund der verschiedenen Kräfte, die sie an der GI-Wand erzeugen, verschiedene Mechanorezeptoren aktivieren müssen18.

Der Goldstandard für die Messung des In-vivo-GI-Transits beim Menschen wie bei Mäusen ist die Verwendung radioaktiver Tracer, die durch Szintigraphie gemessen werden, wenn sie den Magen verlassen oder entlang des Dickdarms19,20 gelangen. Bei Säugetieren schlingt sich der Dünndarm auf unvorhersehbare Weise, so dass der Dünndarm in vivo schwer zuverlässig abgebildet werden kann, aber es werden Fortschritte erzielt21. Darüber hinaus fehlen derzeit Werkzeuge, um zu quantifizieren, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Eigenschaften und Größen umgeht. Ausgangspunkt war hier eine Goldstandardtechnik, die die Untersuchung des Dünndarmtransits 22,23,24 und der Barrierefunktion 22 standardisiert. Es besteht darin, Mäuse mit einem fluoreszierenden Material zu glätten, auf die GI-Motilität zu warten, um das Material zu transportieren, den GI-Trakt zu entfernen, ihn in mehrere Abschnitte vom Magen zum Dickdarm zu segmentieren, intraluminale Inhalte zur Fluoreszenzquantifizierung zu schneiden und zu homogenisieren. Wir haben zwei Verbesserungen vorgenommen. Zuerst änderten wir die Zusammensetzung des gavaged Inhalts, um fluoreszierende mikroskopische Perlen einzubeziehen, um zu bestimmen, wie der Dünndarm physikalische Partikel verteilt. Zweitens verbesserten wir die räumliche Auflösung, indem wir den gesamten GI-Trakt vom Magen bis zum Dickdarm ex vivo abbildeten und Binning variabler Größe verwendeten, um unsere Analyse über Tiere hinweg zu standardisieren. Wir postulieren, dass dies neue Einblicke in das Gleichgewicht von propulsiven versus segmentierenden Kontraktionen während der postprandialen Phase liefert.

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Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Mayo Clinic genehmigt.

1. Einrichtung

  1. Schnelle 8- bis 10 Wochen alte Mäuse für 4 h. Geben Sie Mäusen Zugang zu Wasser.
    HINWEIS: Wir verwenden männliche Wildtyp-C57BL / 6J-Mäuse für alle hier vorgestellten Experimente, aber sie können an Mäusen aller Stämme, Geschlechter und Genotypen durchgeführt werden.
  2. Kühlen Sie 15 ml destilliertes Wasser in einem 50 ml konischen Röhrchen in einem 4 °C Kühlschrank.
  3. Weitere 15 mL destilliertes Wasser werden in einem Becherglas mit einer Heizplatte mit Magnetrührstab auf ca. 80-90 °C erhitzt.
  4. Messen Sie 0,5% Methylcellulose für insgesamt 30 ml (0,15 g).
  5. Fügen Sie Methylcellulose vorsichtig zu 15 ml heißem Wasser hinzu, damit es nicht verklumpt. Die Methylcelluloselösung wird während dieses Prozesses trüb.
  6. Nach dem Auflösen nehmen Sie das Becherglas von der Heizplatte und geben Sie die 15 ml gekühltes Wasser in das heiße Becherglas.
  7. In einem 4 °C Kühlschrank aufstellen, bis die Lösung klar ist, ca. 15-20 min.
  8. Wenn klar, 3 mg Rhodaminisothiocyanat (RITC)-Dextran pro 5 ml 0,5% ige Methylcelluloselösung wiegen und mischen, um zu kombinieren. Dies ist der flüssige Zustand im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse .
    1. Alternativ können Sie 25 mg fluoreszierende Polyethylen-Mikrokugeln wiegen und mit 200 μL der Methylcelluloselösung mischen, bis sie gut eingearbeitet sind. Die gründliche Einarbeitung der Mikrosphären wird durch den Wirbel vor dem Gavage sichergestellt. Der Experimentator muss die homogene Verteilung der suspendierten Mikrokugeln in der Mischung visualisieren.
    2. Da die RITC-Dextran-Lösung lichtempfindlich ist, kühlen Sie die Lösung. Bereiten Sie die RITC-Dextran-Lösung und die Mikroshpere-Mischung im Voraus vor und verwenden Sie sie innerhalb von 2 Monaten. Resuspendieren Sie die Mikrokugelmischung vor Gebrauch.
      HINWEIS: Mikrosphären unterschiedlicher Größe werden verwendet, um den gastrointestinalen Umgang mit verschiedenen Materialien zu untersuchen. Im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse demonstrieren wir die Ergebnisse der Verwendung kleiner (Durchmesser: 75-90 μm) und größerer (Durchmesser: 180-212 μm) Mikrokugeln.

2. Intraluminale Inhaltssonde

  1. Bereiten Sie die Sonde vor, indem Sie einen 18 Ga x 50 mm großen Ernährungsschlauch an eine 1-ml-Spritze anbringen und 200 μl RITC-Lösung oder Mikrokugellösung aufziehen.
  2. Halten Sie das nüchterne Tier manuell mit der Einhand-Rückhaltetechnikzurück 25. Beziehen Sie sich auf die Informationen der Institution über die richtigen Maus-Rückhaltetechniken.
  3. Führen Sie die Ernährungssonde vorsichtig durch den Mund und die Speiseröhre der Maus ein, bis sie in den Magen gelangt.
    HINWEIS: Der Gavage-Schritt ist entscheidend für ein erfolgreiches Experiment. Es erfordert erfahrene Hände, die den Schlauch konsequent in etwa den gleichen Abstand in jede Maus einführen können. Dieser Schritt muss von Experimentatoren, die das Protokoll durchführen, standardisiert werden. Derselbe Experimentator sollte alle Mäusekohorten untersuchen, die miteinander verglichen werden.
  4. Schieben Sie den Spritzeninhalt langsam in den Magen und entfernen Sie den Schlauch vorsichtig von der Maus.
  5. Nach dem Gavage, bringen Sie die Maus in den Käfig zurück.
  6. Entsorgen Sie das Sondenrohr.
  7. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf für die gewünschte Anzahl von Tieren.

3. Darmdissektion

  1. Bevor Sie mit den Dissektionen beginnen, schalten Sie das In-vivo-Bildgebungsinstrument ein, damit es auf Temperatur kommen kann.
  2. Opfern Sie die Maus 30 Minuten nach dem Gavage. Verwenden Sie Kohlendioxid-Inhalation, um die Maus zu opfern, gefolgt von zervikaler Dislokation, um eine erfolgreiche Euthanasie zu gewährleisten.
  3. Nachdem Sie eine erfolgreiche Euthanasie bestätigt haben, legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Sezierstadium und stecken Sie ihre vier Anhängsel auf die Bühne, um Zugang zum Bauch zu haben. Befeuchten Sie die Oberfläche des Bauches mit 70% Ethanol, um die Bauchhaare zu benetzen.
  4. Verwenden Sie Mikrodissektionszange , um die Haut zu ziehen und eine scharfe chirurgische Schere zu erwerben, um einen Querschnitt 1 cm über dem Anus zu machen. Um die intraperitoneale Höhle freizulegen, setzen Sie den Schnitt vertikal den Bauch hinauf bis zum Brustkorb fort.
  5. Bewegen Sie den Blinddarm vorsichtig mit der Mikrodissektionszange nach links, um den distalen Dickdarm freizulegen.
  6. Schneiden Sie den distalen Dickdarm mit einer Mikrodissektionsschere in der Nähe des Rektums ab.
  7. Entwirren Sie sanft den Dickdarm, den Blinddarm und den Dünndarm, indem Sie langsam in die entgegengesetzte Richtung ziehen.
    HINWEIS: Die Aufrechterhaltung des sezierten Darms in einem kontinuierlichen Segment wird den Ermittler am einfachsten machen. Risse und Risse entlang des Segments führen dazu, dass nachfolgende Schritte schwieriger werden.
  8. Verwenden Sie eine Mikrodissektionschere, um proximal zum Magen zu schneiden.
  9. Verwenden Sie eine Pinzette, um den sezierten Darm auf das Messblatt zu übertragen (Abbildung 1). Legen Sie den Magen auf 0 mm und ordnen Sie den Darm entlang des Lineals bis 200 mm an. Verwenden Sie eine Mikrodissektionschere, um bei 200 mm zu schneiden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie den Darm von 0 mm bis 200 mm entlang der Lineale ausrichten, während Sie sicher sind, dass die Ausrichtung des Darms nicht verwirrt wird.
    1. Achten Sie darauf, den Darm nicht zu dehnen, während Sie sich an den Linealen ausrichten.
  10. Sobald das Gewebe auf dem Lineal angeordnet ist, ordnen Sie den Blinddarm so an, dass er parallel zum Gewebe ist, aber nicht in direktem Kontakt mit ihm steht (wenn in diesem Bereich Fluoreszenz gefunden wird, ist eine klare Unterscheidung zwischen Blindblut und Darm erforderlich).
  11. Legen Sie das Messblatt mit dem sezierten Gewebe in einen dunklen Bereich, damit die Fluoreszenz erhalten bleibt, bis es Zeit für die Aufnahme ist.

4. Ex-vivo-Bildgebung

  1. Öffnen Sie die In-vivo-Bildgebungssoftware und melden Sie sich an.
  2. Initialisieren Sie das Bildgebungsinstrument, damit es für die Bildaufnahme bereit ist.
  3. Stellen Sie die Felder "Anregung" und "Emission" auf die entsprechende Farbe ein, die für die Perle oder den RITC-Gavage verwendet wird. Rot (flüssig): Anregung 535 nm / Emission 600 nm. Grün (Mikrosphären): Anregung 465 nm / Emission 520 nm.
  4. Stellen Sie die Belichtung auf "Auto".
  5. Wählen Sie das Sichtfeld aus.
  6. Bevor Sie das Messblatt in das Instrument legen, stellen Sie sicher, dass sich der Darm während des Transports nicht verschoben hat.
  7. Legen Sie das Messblatt innerhalb des Sichtfeldes in das Gerät.
  8. Schließen Sie die Tür zum Instrument sicher und wählen Sie Schnappschuss , um das Sichtfeld zu fotografieren.
  9. Speichern Sie die gesammelten Bilder zur Analyse auf einem Flash-Laufwerk. Speichern Sie einzelne Aufnahmen der fluoreszierenden und fotografischen Bilder. Eine Überlagerung des Fotos und der Fluoreszenz zeigt die Position von fluoreszierendem Material im GI-Trakt an (Abbildung 1).
    HINWEIS: Wir empfehlen, die Dateien für die nachgelagerte Verarbeitung im Format Tag-Bilddatei (.tif) zu speichern.

5. Analyse

  1. Öffnen Sie die fluoreszierenden und fotografierenden Bilddateien in einer Bildbearbeitungssoftware.
  2. Passen Sie die Pixelgröße beider Bilder so an, dass sie genau die gleichen Abmessungen haben (unsere Konvention war, beide Bilder auf 1280 Pixel x 850 Pixel [Höhe x Breite] einzustellen).
  3. Schließen Sie die Fotodatei. Die folgenden Schritte betreffen nur das fluoreszierende Bild.
  4. Verwenden Sie ein Radiergummi-Werkzeug, um den Hintergrund zu entfernen und transparent zu machen. Ein Radiergummi kann erforderlich sein, um Patches des verbleibenden Hintergrunds zu entfernen.
  5. Erstellen Sie einen neuen Layer. Machen Sie es zu einem vollständig schwarzen Hintergrund für das fluoreszierende Signal. Dies kann erreicht werden, indem eine schwarze Füllung für die Schicht gewählt und die Schicht so gezogen wird, dass sie unter der Schicht mit dem fluoreszierenden Bild liegt.
  6. Speichern Sie das neue fluoreszierende Bild, das nur das fluoreszierende Signal auf schwarzem Hintergrund enthält, als neue .tif Datei.
  7. Öffnen Sie die neuen fluoreszierenden und fotografieren Sie Bilder in ImageJ.
  8. Wandeln Sie jedes Bild in ein 32-Bit-Bild um, indem Sie Bild > Typ > 32-Bit auswählen.
  9. Erstellen Sie ein zusammengeführtes Bild beider, indem Sie "Bild> " Farbe> Kanäle zusammenführen" auswählen. Wählen Sie im daraufhin angezeigten Dialogfeld die Fotodatei für den Graukanal und die Fluoreszenzdatei unter beliebigen Farbkanälen aus.
  10. Deaktivieren Sie die Skalierung des zusammengeführten Bildes, indem Sie Analysieren > Maßstab festlegen auswählen > Klicken Sie hier, um die Skalierung zu entfernen.
  11. Wählen Sie das Werkzeug "Rechteck" in ImageJ.
  12. Zeichne ein Rechteck um einen Abschnitt des Dünndarms. Achten Sie genau auf die Breite dieser Region of Interest (ROI), da sie zwischen allen ROIs konstant bleiben sollte. Der Nominalwert ist nicht wesentlich, nur dass er über alle auf diesem Bild gezeichneten ROIs konsistent gehalten wird [da der Dünndarm mehrere Zeilen übernimmt, werden individuelle ROIs über jeden Abschnitt des Dünndarms in einer anderen Reihe gezeichnet (Abbildung 1)]. Abbildung 2 zeigt die Position des Breitenwerts auf der ImageJ-Symbolleiste.
  13. Duplizieren Sie den ROI, indem Sie Bild > Duplizieren auswählen. Wählen Sie nur den Kanal aus, der dem farbigen Kanal entspricht.
  14. Verwenden Sie das Rechteckwerkzeug erneut, um einen ROI für das gesamte neue Bild zu zeichnen.
  15. Rufen Sie ein Profil der Fluoreszenz ab, indem Sie > Plotprofil analysieren auswählen. Das resultierende Diagramm stellt auf der y-Achse die durchschnittliche Intensität für jedes Pixel entlang der Länge des ROI dar. Dies wurde in Schritt 5.12 als Länge des analysierten Abschnitts des Dünndarms ausgewählt
  16. Öffnen Sie die Liste der Werte und kopieren Sie sie in eine Tabellenkalkulationssoftware.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 5.12-5.16 für jeden Abschnitt des Dünndarms in einer anderen Linealreihe. Fügen Sie die Werte in derselben Tabellenkalkulationsdatei unmittelbar unter jedem vorherigen Satz von Werten ein, sodass alle fortlaufenden Zeilen in dieser Spalte den durchschnittlichen Intensitätswert für die gesamte Länge des Dünndarms enthalten.
  18. Multiplizieren Sie in der Tabellenkalkulationssoftware jeden durchschnittlichen Intensitätswert mit der konstanten Breite des ROI-Rechtecks, das in Schritt 5.12 erstellt wurde. Dies ergibt den tatsächlichen Intensitätswert entlang des Dünndarms an jedem Punkt.
    HINWEIS: Verschiedene Tiere haben leichte Abweichungen von der Dünndarmlänge. Um zu verhindern, dass die Längenunterschiede das Ergebnis der nachgeschalteten Datenanalyse beeinflussen, muss die Zeichenfolge der Intensitätswerte in eine konsistente Anzahl von Behältern über alle experimentellen Proben verteilt werden (Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5 zeigen die Ergebnisse für drei Behältergrößen an).
  19. Teilen Sie die Anzahl der Intensitätswerte durch die Anzahl der gewünschten Behälter. Der resultierende Quotient S bestimmt die Anzahl der Intensitätswerte , die in jedem Behälter enthalten sind.
  20. Bestimmen Sie mithilfe einer Aufrundungsformel den Papierkorb, in dem jeder rohe Intensitätswert abgelegt wird. In diesem Schritt wird jeder rohe Intensitätswert in einen Behälter verschoben. Jeder Rohintensitätswert wird chronologisch mit der ganzen Zahl N indiziert. Der Quotient N/S bestimmt die jedem Rohwert zugeordnete Lagerplatznummer. Die Aufrundungsformel sollte diesen Quotienten auf eine ganze Zahl ohne Dezimalstellen runden.
  21. Generieren Sie den Wert für jede Ablage mithilfe einer Mittelwertwenn-Formel. Ziel ist es, die Rohwerte, die einem bestimmten Lagerplatz in Schritt 5.20 zugeordnet sind, zu mitteln. Daher sollten die Argumente in der Formel wie folgt lauten: (1) zugewiesene Klassen, die in Schritt 5.20 generiert wurden, (2) Lagerplatznummer, (3) rohe Intensitätswerte.
    HINWEIS: Die erste Analyse, die wir mit den zusammengefassten Daten durchführen können, ist eine geometrische Mittenanalyse, die quantifiziert, wie weit wir die höchste Fluoreszenzintensität entlang des Dünndarms beobachten (Abbildung 4).
  22. Normalisieren Sie jeden Intensitätswert über die gesamte Fluoreszenzintensität. Mit anderen Worten, dividieren Sie jeden Intensitätswert durch die Summe aller Intensitäten.
  23. Multiplizieren Sie jeden normalisierten Wert mit der Lagerplatznummer. Das Produkt spiegelt das relative Gewicht jedes Behälters wider und trägt zur Gesamtfluoreszenzintensität bei.
  24. Addiert man alle in Schritt 5.23 generierten Werte, erhält man die Bin-Nummer in der Mitte des Fluoreszenzsignals. Teilen Sie durch die Anzahl der Behälter, um das geometrische Zentrum als den Anteil des Dünndarms auszudrücken, der vom fluoreszierenden Zentrum zurückgelegt wird.
    HINWEIS: Um die räumliche Verteilung des Signals widerzuspiegeln, besteht der nächste Schritt darin, das Leistungsspektrum des Binned Intensity Datensatzes zu generieren (Abbildung 5).
  25. Öffnen Sie einen FFT-Assistenten (Fast Fourier Transform) in der Tabellenkalkulationssoftware. Wählen Sie die Eingabe als Binned Data Set und die Ausgabe als leeren Satz mit der gleichen Anzahl von Zeilen wie Bins aus.
  26. Extrahieren Sie die Realwertkomponente der FFT.
  27. Erhöhen Sie jeden realen Wert der FFT auf die zweite Potenz. Daraus ergibt sich ein Datensatz von Leistungsspektren.
  28. Wählen Sie die erste Hälfte des Leistungsspektrendatensatzes aus und verschieben Sie sie so, dass sie unter der zweiten Hälfte liegt. Dies hat den Effekt, dass die Leistungsspektren im nächsten Schritt um die Mittenfrequenz zentriert werden.
  29. Zeichnen Sie die Leistungsspektren auf der y-Achse eines x-y-Graphen, wobei die x-Achsenwerte der Bereich von -1 x (Anzahl der Bins/2) bis (Anzahl der Bins/2) -1 sind. Bei 1000 Lagerplätzen würden die Achsenwerte zwischen -500 und 499 liegen.
  30. Leistungsspektren für jedes Tier sollten auf der Grundlage der Spreizung von Peaks ungleich Null und der Höhen dieser Peaks ungleich Null verglichen werden.

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Representative Results

Wir zeigen repräsentative Ergebnisse ab Schritt 3. Abbildung 1 zeigt den intakten explantierten Darm, wobei fluoreszierende Messungen überlagert sind. Der Magen (lila) liegt entlang der gleichen Achse wie der Dünndarm (orange), aber wir ziehen es vor, den Blinddarm (blau) zur Seite zu bewegen, um eine Überlappung mit dem Dickdarm (orange) zu vermeiden. Wie im linken Bild zu sehen ist, ist dies aufgrund der Organgröße nicht immer möglich. Wir schneiden den Dünndarm bei ~ 200 mm, um die Abdeckung kontinuierlicher Segmente zu maximieren, aber dies ist nicht immer möglich, da das Mesenterium die Fähigkeit zur Entfaltung des Darms einschränkt und wir es vorziehen, Strukturen wie fluoreszierende Pellets oder den Blinddarm nicht zu durchschneiden. Die rote Intensität im linken Bereich von Abbildung 1 und die grünen Intensitäten des mittleren und rechten Feldes werden in unterschiedlich große Behälter sortiert, um Abbildung 3 zu erzeugen. Nur die Intensitäten innerhalb der orangefarbenen ROIs (Dünndarm) werden zur Analyse extrahiert. Die gesamte Länge des Dünndarms (jeder orangefarbene ROI in jedem Panel) wird zur Analyse extrahiert. Die orangefarbenen ROIs haben die gleiche Breite wie in ImageJ (Abbildung 2). Sie werden zusammengenäht, indem alle Intensitäten vor dem Binning nacheinander platziert werden. Abbildung 3 zeigt die durchschnittliche fluoreszierende Spur ± REM pro Kohorte; Weitere Informationen finden Sie unter Abbildungslegende.

Die letzten beiden Abbildungen zeigen die Ergebnisse der Analysen: geometrisches Zentrum und Leistungsspektrum. Das geometrische Zentrum misst die durchschnittliche Position der Fluoreszenzsignale in Abbildung 3 und gewichtet den Mittelwert anhand der Signalstärke jedes Bins. Daher ziehen höhere Peaks in der Spur den Durchschnitt näher an die Position dieses Peaks. Das geometrische Zentrum kann die räumliche Verteilung der intraluminalen Inhalte nicht vollständig charakterisieren. Zum Beispiel kann das gleiche geometrische Zentrum aus einem Bolus erhalten werden, der an einem einzigen Punkt konzentriert ist, und einem Ausbreitungssignal, das um denselben Punkt zentriert ist. Diese Einschränkung der geometrischen Mittenmessung zeigt sich im Vergleich zwischen Flüssigkeiten und größeren Perlen (Abbildung 3 und Abbildung 4). Der Großteil der flüssigen Fluoreszenzspur ist um zwei frühe Peaks zentriert, während die größeren Perlen mehrere Peaks entlang der gesamten Länge des Dünndarms zeigen (Abbildung 3, linkes und rechtes Feld). Die fluoreszierende Spur der größeren Perlen ist stärker verteilt, aber sie mittelt sich auf einen ähnlichen Punkt wie die der Flüssigkeit, unabhängig von der Binning-Granularität, was die Einschränkung der ausschließlichen Fokussierung auf das geometrische Zentrum unterstreicht (Abbildung 4). Um der distributiven Natur von Dünndarmkontraktionen Rechnung zu tragen, haben wir eine Leistungsspektralanalyse in das Protokoll integriert. Die Leistungsspektrumanalyse funktioniert durch Dekonstruktion der Fluoreszenzverteilung im Raum in mehrere sinusförmige Kurven unterschiedlicher Ortsfrequenzen. Jede Ortsfrequenz spiegelt den Abstand zwischen zwei zufällig ausgewählten Punkten in der Fluoreszenzspur wider. Einige dieser Entfernungen treten häufiger auf als andere, so dass jeder eine Stärke (Kraft) zugeschrieben wird. Die Leistung korreliert damit, wie oft zwei zufällige Punkte durch diesen Abstand getrennt werden. Durch das Aufzeichnen des Leistungsspektrums (Abbildung 5) können wir zeigen, wie viele Ortsfrequenzen zum gemessenen Signal beitragen (Ausbreitung des Spektrums) und die relative Stärke dieser Beiträge (Höhe des Spektrums) vergleichen. Dies ermöglicht es uns, die Ausbreitung der Fluoreszenz entlang des GI-Trakts quantitativ zu beschreiben.

Figure 1
Abbildung 1. Die sezierten Eingeweide werden explantiert und vor der Fotografie und Fluoreszenzmessung auf laminiertes Linealpapier gelegt. Die Fluoreszenzintensität ist überlagert und pseudogefärbt, um der nativen Fluoreszenz des gebrannten Materials zu entsprechen. Links: flüssiges Rhodaminisothiocyanat (RITC) fluoresziert im roten Spektrum; Mitte: klein (Durchmesser: 75-90 μm) und rechts: größere (Durchmesser: 180-212 μm) Perlen fluoreszieren beide im grünen Spektrum. Lila, orange, blau und rosa Kästchen umgeben Regionen von Interesse (ROIs) im Magen, Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm in jeder Probe. Die Breite jedes ROI wird über alle Zeilen hinweg konsistent gehalten, um Verwirrung bei der Berechnung der Rohfluoreszenzintensität während der nachgeschalteten Analyse zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2. Position der Breite des interessierenden Bereichs (in Pixel) in der ImageJ-Symbolleiste (gelb unterstrichen). Um es noch einmal zu wiederholen: Die Breite wird nur dann in Pixel angezeigt, wenn die Skala entfernt wurde (Schritt 5.10). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3. Fluoreszenzspuren entlang der Länge des Dünndarms. Linie bezeichnet die durchschnittliche Fluoreszenz an einem gegebenen Bin. Der schattierte Bereich kennzeichnet den Standardfehler des Mittelwerts (REM). Die Verteilung des fluoreszierenden Materials variiert je nach Materialeigenschaften der intraluminalen Gehalte (Säulen). Links: Flüssigkeitsverteilung (n = 7 Mäuse) über einige Dünndarmsegmente 30 min nach der Gavege. Mitte und rechts: Kleine (n = 6 Mäuse) und größere (n = 5 Mäuse) Perlen verteilen sich 30 min nach dem Gavage breiter entlang des Dünndarms. Wenn Sie die Anzahl der Bins erhöhen, die zum Sortieren derselben Rohdatensätze verwendet werden, werden granulare Trace-Features angezeigt, die mit weniger Bins (Zeilen) nicht aufgelöst werden können. Kleinere Bins verringern die Messunsicherheit, erhöhen die räumliche Auflösung und spiegeln die distributive Komponente von Dünndarmkontraktionen besser wider. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4. Das geometrische Zentrum der Fluoreszenzverteilung im Dünndarm 30 min nach dem Sonden mit flüssigem RITC, kleinen Perlen (75-90 μm) und größeren Perlen (180-212 μm) (Mittelwert ± REM, n = 7, n = 6, n = 5, Einweg-ANOVA mit Bonferroni-Korrektur). Die Behältergröße hat keinen Einfluss auf die Transitinterpretation, dass kleine Perlen 30 Minuten nach dem Gavage distal transportiert werden als Flüssigkeiten, aber die größeren Perlen verteilen sich so weit, dass es keine signifikanten Unterschiede in ihrem geometrischen Zentrum im Vergleich zu Flüssigkeiten und kleinen Perlen gibt (*P < 0,05. ns = nicht statistisch signifikant). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5. Leistungsspektren werden nach Materialeigenschaften (Spalten) und Lagerplatzgröße (Zeilen) kategorisiert. Die Verbesserungen bei der räumlichen Auflösung und dem kleineren Binning sind offensichtlich. Obere Reihe: In den weit gebündelten Spektren sind nur wenige Unterschiede zu unterscheiden. Untere Reihe: Wenn die Behältergrößen schrumpfen, können wir signifikante dominante Frequenzen im Spektrum der größeren Perlen erkennen, aber nicht in dem der kleinen Perlen. Einige, aber nicht alle dieser zusätzlichen dominanten Frequenzen sind im Flüssigkeitsspektrum vorhanden. Unter Verwendung der Spektren der unteren Reihe können wir mit den fluoreszierenden Spuren in Abbildung 3 vergleichen. In Abbildung 3 zeigt die Flüssigkeitsfluoreszenzspur zwei markante Peaks, die mit einigen dominanten Peaks im Leistungsspektrum korrelieren. Die kleine Perlenspur in Abbildung 3 zeigt einen einzelnen dominanten Peak, der mit einem einzelnen dominanten Peak im Leistungsspektrum korreliert. Die größere Perlenspur in Abbildung 3 zeigt dominantere Spitzen. Dementsprechend weist das Leistungsspektrum eine größere Anzahl dominanter Frequenzen auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Der Magen-Darm-Trakt benötigt wie andere röhrenförmige Organe wie Blutgefäße mechanische Sensoren und Effektoren, um die Homöostaseaufrechtzuerhalten 26,27,28. Der GI-Trakt ist jedoch insofern einzigartig, als die physikalischen Eigenschaften der Materialien, die ihn durchqueren, über die Mahlzeiten hinweg nicht konstant sind. Intraluminale Gehalte verschiedener physikalischer Eigenschaften (fest, flüssig und gasförmig) passieren den Darm und erzeugen unterschiedliche mechanische Inputs für die GI-Mechanorezeptoren. Tatsächlich werden verschiedene mechanische Reize im Dickdarm durch unterschiedliche Wege wahrgenommen und weitergeleitet29.

Dieses Protokoll ist technisch für jeden zugänglich, der routinemäßige Mausarbeit ausführt, aber einige kritische Schritte erfordern genaue Aufmerksamkeit. Wir finden, dass Fastenmäuse vor Beginn der Studie wichtig sind, da sie den Beitrag früherer Mahlzeiten entfernen und das fluoreszierende Signal verdünnen. Darüber hinaus zeigen Mäuse, die mit einer Standarddiät gefüttert wurden, intraluminale Fluoreszenz aus Diätkomponenten, insbesondere der Chlorophyllkomponente30. Durch Fasten und Fluorophorselektion verhindern wir, dass die Chow-Fluoreszenz die kontrollierten Bedingungen der in diesem Protokoll beschriebenen Experimente stört. Wir empfehlen Experimentatoren, unabhängig voneinander zu bestätigen, dass die gewählte Fastenperiode ausreicht, um unspezifische Fluoreszenz im Dünndarm zu eliminieren, da dies je nach Sorte, Alter oder Geschlecht variieren kann. Der Experimentator sollte die homogene Verteilung der gaffenden Inhalte visuell beurteilen. Andernfalls wird es Unsicherheiten in ihrer Lieferung und den Studienergebnissen geben. Gavages sollten konsequent von demselben Experimentator durchgeführt werden, vorzugsweise von jemandem, der Erfahrung mit der Technik gesammelt hat. Der Experimentator sollte eine konsistente Abgabe des Inhalts an den Magen anstreben. Der Nachweis von Fluoreszenz in der Speiseröhre oder ausschließlich im Magen ist ein Grund, ein Tier von der Analyse auszuschließen, da es unsicher ist, ob der Dünndarm den gleichen Zugang zum Gavaged Inhalt hatte. Nach dem Gavaging können die Wartezeiten auf 15 Minuten verkürzt oder auf 90 Minuten verlängert werden, je nachdem, ob frühe oder späte Transitphasen von Interesse sind22. Das ursprüngliche Protokoll mit flüssiger Sonde zeigte, dass sich der Großteil des Materials nach 30 Minuten im Dünndarm befindet. Obwohl es wichtig ist, während des Präparationsschritts schnell zu arbeiten, muss darauf geachtet werden, dass die Position des intraluminalen Inhalts nicht gestört wird und der Magen-Darm-Trakt nicht reißt.

Dieses Protokoll entwickelte sich aus zuvor veröffentlichten Ansätzen, die den Dünndarm physisch binden, indem er in fünf bis 10 Segmente geschnitten und intraluminale Inhalte vor der Fluoreszenz- / Radioaktivitätsmessung homogenisiert wurde22,23,24. Der bisherige Ansatz war bedeutsam, da er die Messung des Dünndarmtransits standardisierte. Der Dünndarm schlängelt sich notorisch in komplizierten und unvorhersehbaren Mustern in der Bauchhöhle. Bildgebungsbasierte Transitstudien sind unabhängig von der Spezieseine Herausforderung 31,32. Während unser Protokoll ein terminales Experiment bleibt, das nicht auf den Menschen ausgeweitet werden kann, verbessern wir die räumliche Auflösung signifikant und nutzen diese Verbesserung, um regionale Transite aufzulösen und sie in eine unvoreingenommene Messung der Ausbreitung im Dünndarm (Leistungsspektrum) zu übersetzen.

In diesem Protokoll wird die räumliche Auflösung durch die Auflösung der Kamera im Bildgebungssystem begrenzt. Da Binning die Dünndarmlänge bei Tieren normalisiert, können wir die durchschnittliche Position des intraluminalen Inhalts direkt vergleichen. Abbildung 3 zeigt deutlich die drastische Glättung, die erhöhte Unsicherheit und die verringerte Auflösung infolge der Dimensionierung großer Behälter. Das geometrische Zentrum quantifiziert das Fluoreszenzzentrum entlang des GI-Trakts (Abbildung 4). Erwartungsgemäß wird diese Messung nicht wesentlich von der Behältergröße beeinflusst. Das Leistungsspektrum ist eine unverzerrte und komplementäre Methode, die die Analyse von Peaks und Spreads in den fluoreszierenden Spuren von Abbildung 3 standardisiert. Durch die Verbesserung der Auflösung werden die berechneten Spektren verbessert, so dass sichtbare Unterschiede zwischen fluoreszierenden Spuren nachgewiesen werden können (Abbildung 5). Bei niedriger Auflösung (10 Bins) wäre es schwierig, zwischen Flüssigkeiten und größeren Perlen zu unterscheiden, entweder durch die geometrische Mitte oder die Spektrumbewertung, obwohl aus der Betrachtung der fluoreszierenden Spuren klar hervorgeht, dass sie im Raum nicht ähnlich verteilt sind. Bei höherer Auflösung (1000 Bins) sind die geometrischen Zentren immer noch ähnlich (aufgrund der Tatsache, dass das geometrische Zentrum ein durchschnittliches Maß ist), aber das Leistungsspektrum kann zuverlässig verwendet werden, um zwischen beiden Kohorten zu unterscheiden. Es ist erwähnenswert, dass die Fluoreszenzspuren für andere Arten von Analysen, wie z. B. Spitzenmessungen, zugänglich sind. Erwartete Änderungen im geometrischen Mittelpunkt können während der Stichprobengrößenberechnungen vor Beginn der Experimente verwendet werden. Da wir wussten, dass Flüssigkeiten ein geometrisches Zentrum von etwa 0,4-0,518 haben, verwendeten wir mindestens fünf Mäuse in jeder Gruppe, um Veränderungen von bis zu 45% statistisch aufzulösen.

Wir erweiterten den Umfang und verwendeten dieses Protokoll, um den Transit von Feststoffen im Dünndarm zu untersuchen. Wie bei Flüssigkeiten haben wir die festen Mikrosphären in den Magen gegackert. Der Pylorusschließmuskel befindet sich am Magen-Dünndarm-Übergang. Dieser Schließmuskel fungiert als Größenausschlussfilter. Bei Mäusen liegt der Größengrenzwert bei ~ 300 μm, wobei Partikel <300 μm beim Eintritt in den Dünndarm auf keinen Widerstand stoßen33, aber dieser Ansatz funktioniert auch mit etwas größeren Partikeln, die wir in einer kürzlich durchgeführten Studie verwendethaben 18. Wir haben unsere Mikrosphärengrößen hier ausgewählt, um eine Reihe von Größen bereitzustellen, die die aktuelle Studie ergänzen. Wir verwendeten zwei handelsübliche fluoreszierende Perlenpräparate mit Durchmessern von 75-90 μm und 180-212 μm. Abbildung 1 zeigt eine ähnliche Fluoreszenzdichte und -profile im Magen über Kohorten hinweg, was darauf hindeutet, dass weder Flüssigkeiten noch Partikel vom Magen unterschiedlich zurückgehalten werden. Die hier vorgestellten Originaldaten zeigen, wie der Dünndarm von Wildtyp-Mäusen unterschiedlich mit Flüssigkeiten und mikroskopisch kleinen Feststoffen umgeht. Bisher haben wir Perlen eines Größenbereichs pro unabhängigem Experiment verwendet. Zukünftige Studien können sich darauf konzentrieren, wie Mischungen unterschiedlich großer Partikel gehandhabt werden, und fluoreszierende Flüssigkeiten verschiedener physikalischer Eigenschaften mit fluoreszierenden Perlen mischen, um zu bestimmen, wie realistischere Speisebreimischungen vom Dünndarm gehandhabt werden.

Die hier berichteten Verteilungsunterschiede deuten auf einen Unterschied in den Motilitätsmustern hin, die durch Materialien mit unterschiedlichen Eigenschaften aktiviert werden. Wir postulieren, dass das Gleichgewicht zwischen Segmentierung und Antriebskontraktionen bestimmt, wie weit und wie homogen Materialien den Dünndarm passieren. Das geometrische Zentrum für kleine Perlen liegt im Vergleich zu Flüssigkeiten weiter entlang des Dünndarms, was darauf hindeutet, dass kleine feste Partikel treibende Kontraktionen auslösen. Auf der anderen Seite, während das geometrische Zentrum für größere Perlen einer Flüssigkeit ähnelt, zeigt die Spektralanalyse signifikante Unterschiede in der räumlichen Verteilung, die auf mehr Segmentierungskontraktionen in der größeren Perleneinstellung zurückzuführen sein könnten. Wir stellen die Hypothese auf, dass der Dünndarm Größendiskriminierung, eine Art mechanosensorischen Schaltkreis, als einen der Inputs verwendet, die zur Entscheidung über das Gleichgewicht zwischen den Kontraktionstypen beitragen. Zum Beispiel sind Dogiel-Typ-II-Neuronen mechanosensorische Neuronen, von denen spekuliert wird, dass sie eine Rolle bei der Steuerung des Wechsels von propulsiven zu segmentierenden Kontraktionen spielen16,34. Diese faszinierenden Spekulationen erfordern weitere Forschung, um die Mechanismen zu bestimmen, mit denen der GI-Trakt physikalische Eigenschaften wahrnimmt und sie auf physiologische Ergebnisse wie Kontraktionen überträgt.

Wir glauben, dass dieses Protokoll als zusätzliches Werkzeug hilfreich sein wird, um die Lücke von Molekülen über Zellen bis hin zur Organfunktion zu schließen. Wir erkannten, dass GI-epitheliale Mechanorezeptoren Entwicklungs- und Strukturähnlichkeiten mit Hautmechanorezeptorenaufweisen 35. Unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls haben wir dazu beigetragen, die sensorische Rolle der "Darmberührung" zu demonstrieren, bei der diese GI-epithelialen Mechanorezeptoren lichtmechanische Reize wahrnehmen und an der intrinsischen taktilen Empfindlichkeit teilnehmen18. Wir gehen davon aus, dass sich dieses Protokoll als ähnlich hilfreich erweisen wird, um zu untersuchen, wie andere sensorische Schaltkreise zum Dünndarmtransit beitragen.

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Disclosures

Nichts.

Acknowledgments

Wir danken Frau Lyndsay Busby für die administrative Unterstützung und Herrn Joel Pino für die Unterstützung durch die Medien. NIH-Zuschüsse unterstützten diese Arbeit: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 und Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664 other mice can be used with this protocol
Dissection tools n/a n/a
Excel software Microsoft n/a used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g "smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g "larger beads" in the manuscript
Gavage needles Instech FTP-18-50-50
ImageJ software n/a n/a used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house) n/a n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) Sigma M0262
Photoshop software Adobe n/a used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma r8881-100mg "liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system

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Medizin Ausgabe 181
Untersuchung der Mechanosensorik von luminalen Partikeln im murinen Dünndarm
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Mercado-Perez, A., Wegner, A., Knutson, K., Zumchak, M., Beyder, A. Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates. J. Vis. Exp. (181), e63697, doi:10.3791/63697 (2022).

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