Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

CRISPR Gene Editing Tool voor MicroRNA Cluster Network Analyse

Published: April 25, 2022 doi: 10.3791/63704
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

Summary

Dit protocol beschrijft een high-throughput clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR) genbewerkingsworkflow voor microRNA-clusternetwerkanalyse die de snelle generatie van een panel van genetisch gemodificeerde cellijnen met unieke miRNA-clusterliddeletiecombinaties zo groot als 35 kb binnen een enkel experiment mogelijk maakt.

Abstract

MicroRNA's (miRNA's) zijn naar voren gekomen als belangrijke cellulaire regulatoren (tumoronderdrukkers, pro-oncogene factoren) van kanker en metastase. De meeste gepubliceerde studies richten zich op een enkel miRNA bij het karakteriseren van de rol van kleine RNA's bij kanker. ~30% van de menselijke miRNA-genen zijn echter georganiseerd in geclusterde eenheden die vaak co-expressie zijn, wat wijst op een complex en gecoördineerd systeem van niet-coderende RNA-regulatie. Een duidelijker onderschatting van hoe geclusterde miRNA-netwerken samenwerken om tumorgroei, kankeragressiviteit en medicijnresistentie te reguleren, is vereist voordat niet-coderende kleine RNA's naar de kliniek worden vertaald.

Het gebruik van een high-throughput geclusterde regelmatig interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-gemedieerde genbewerkingsprocedure is gebruikt om de oncogene rol van een genomisch cluster van zeven miRNA-genen te bestuderen binnen een locus met een lengte van ~ 35.000 bp in de context van prostaatkanker. Voor deze aanpak werden menselijke kankercellijnen geïnfecteerd met een lentivirusvector voor doxycycline (DOX)-induceerbare Cas9-nuclease gekweekt in DOX-bevattend medium gedurende 48 uur. De cellen werden vervolgens getransfecteerd met synthetisch trans-activerend CRISPR-RNA (tracrRNA) gecomplexeerd met genomische site-specifieke CRISPR-RNA (crRNA) oligonucleotiden om de snelle generatie van kankercellijnen mogelijk te maken die de volledige miRNA-clusterdeletie en individuele of gecombineerde miRNA-genclusterdeleties binnen een enkel experiment dragen.

De voordelen van dit high-throughput genbewerkingssysteem zijn de mogelijkheid om tijdrovende DNA-vectorsubcloning te vermijden, de flexibiliteit bij het transfecteren van cellen met unieke gids-RNA-combinaties in een 24-well-formaat en de goedkopere PCR-genotypering met behulp van ruwe cellysaten. Studies die deze gestroomlijnde aanpak gebruiken, beloven functionele redundanties en synergetische / antagonistische interacties tussen miRNA-clusterleden te ontdekken, wat zal helpen bij het karakteriseren van de complexe kleine niet-coderende RNA-netwerken die betrokken zijn bij menselijke ziekten en beter informeren over toekomstig therapeutisch ontwerp.

Introduction

Er zijn betere onderzoeksinstrumenten nodig om de bijdrage van niet-coderende RNA's aan ziekten bij de mens te onderzoeken. MiRNA-ontregeling wordt vaak waargenomen bij menselijke aandoeningen zoals kanker bij het vergelijken van de expressieprofielen van deze kleine niet-coderende RNA's in de weefsels en lichaamsvloeistoffen (bijv. Bloed, urine) van kankerpatiënten versus niet-kanker, gezonde personen, met behulp van microarrays, kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en diepe sequencingtechnologieën van de volgende generatie 1,2 . Recent werk heeft een grote subset van deze miRNA's gekarakteriseerd als tumorsuppressor, oncogene en metastasefactoren die tumorvorming, ziekteprogressie en medicijnresistentie beheersen. Experimentele overexpressie en/of downregulatie/verlies van miRNA's resulteren in functionele en pleiotrope gevolgen in de cel, als gevolg van het brede scala aan kankergerelateerde activiteiten die deze niet-coderende RNA's coördineren - groei, apoptose, differentiatie, chromatineremodellering, angiogenese, epitheliale naar mesenchymale (EMT) en MET-overgangen, metabolisme en immuunrespons3.

MiRNA's worden gecodeerd als enkele genen of verblijven in genomische clusters, die in de kern worden getranscribeerd en uitgebreid worden verwerkt voordat de biologisch volwassen, enkelstrengs ~ 22 nucleotide (nt) miRNA-soorten worden gegenereerd die zijn gelokaliseerd in het cytoplasma4. Deze kleine RNA's oefenen hun effecten post-transcriptioneel uit en fungeren als negatieve genregulatoren die zich op een sequentiespecifieke manier binden aan messenger-RNA (mRNA) -doelen om het katalytische RNA-geïnduceerde uitschakelingscomplex (RISC) naar de mRNA-site te brengen, wat resulteert in mRNA-afbraak en / of een blok in eiwittransformatie. MiRNA's zijn een extreem overvloedige klasse van niet-coderende RNA's in dierlijke systemen en er bestaan 2.654 volwassen miRNA's in het menselijk genoom (miRBase release 22.1)5. MiRNA's associëren meestal met onvolledige complementariteit met hun mRNA-doelen4. Daarom kan een enkel miRNA tientallen tot honderden verschillende mRNA-doelen reguleren en functioneel een groot aantal biologische routes beïnvloeden. Om de complexiteit van miRNA-gebaseerde mechanismen te vergroten, kan een enkel mRNA worden gereguleerd door meerdere, verschillende miRNA's. Het is dus een uitdaging om te onderzoeken hoe miRNA-ontregeling de homeostatische balans van het lichaam verstoort en leidt tot menselijke maligniteit.

De meerderheid van de gepubliceerde studies hebben zich gericht op een enkel miRNA bij het karakteriseren van hun rol in ziektegebeurtenissen. ~30% van de menselijke miRNA-genen zijn echter georganiseerd in geclusterde eenheden (meestal ~ 10 kilobases [kb]) die vaak in dezelfde oriëntatie worden getranscribeerd en mede tot expressie worden gebracht, wat wijst op een gecoördineerd en complex systeem van niet-coderende RNA-regulatie6. De grootste polycistronische menselijke miRNA-cluster is de 14q32-cluster bestaande uit 54 miRNA-voorlopers. Een van de meest goed bestudeerde geclusterde miRNA-eenheden geassocieerd met menselijke kankers is de miR-17-92 polycistronische cluster bestaande uit miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 en miR-92-1 die zich bevinden in intron 3 van het niet-coderende RNA, c13orf25. De miR-17-92-cluster wordt vaak versterkt in hematopoietische maligniteiten en overexpressie in solide tumoren en heeft oncogene rollen vastgesteld bij het bevorderen van celcyclusprogressie, apoptose en angiogenese7. Bovendien wordt de tumorsuppressieve miR-15a- en miR-16-1-cluster in het intron van het niet-coderende gen Leu2 vaak verwijderd bij leukemieën en gedownreguleerd in een groot aantal kankers, waardoor tumorgroei wordt geblokkeerd door zich te richten op het antiapoptotische gen BCL2 en aanvullende celcyclusprogressiegenen8. De miR-888-cluster is verhoogd bij patiënten met hooggradige prostaatkanker en bestaat uit zeven miRNA-genen (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b en -891a) op menselijk chromosoom Xq27.3 9,10.

De miR-888 cluster kaarten binnen de HPCX1 locus (Erfelijke Prostaatkanker, X-gebonden 1) verspreid over Xq27-2, die werd geïdentificeerd door koppelingsanalyse van erfelijke prostaatkanker familie stambomen 11,12,13,14,15,29. Functionele karakterisering van individuele miR-888 geclusterde leden met behulp van conventionele miRNA-misexpressietools - miRNA-mimics en antisense-remmers - gaf aan dat deze miRNA's overlappende rollen spelen bij het reguleren van prostaattumorgroei en invasie 9,10. Deze experimentele methoden lenen zich echter niet gemakkelijk om te bestuderen hoe meerdere miR-888 geclusterde leden synergetisch of antagonistisch werken in een niet-coderend RNA-netwerk om weefselhomeostase en kankerprogressie te beheersen. Dit beschreven gestroomlijnde protocol met behulp van crispr-genbewerkingstechnologie met hoge doorvoer wordt aangepast om miRNA-clusters geassocieerd met menselijke kankers (bijv. miR-888-cluster) moleculair te ontleden om deze kenniskloof te overbruggen.

Bacteriële CRISPR- en CRISPR-geassocieerde (cas) genen bemiddelen adaptieve immuniteit tegen bacteriofagen16. De ontdekking van dit oude procaryotische surveillancesysteem werd snel aangepast als een efficiënt wetenschappelijk hulpmiddel om gemakkelijk elke gewenste genomische locus aan te pakken en DNA-sequentieveranderingen aan te brengen binnen een groot aantal diersystemen en celtypen, zowel in vitro als in vivo16,17. Deze techniek is veelbelovend als een effectieve methode om miRNA-netwerken te ondervragen in de context van menselijke ziekten. Hiertoe is dit high-throughput CRISPR-genbewerkingsprotocol om het miR-888-cluster van ~ 35 kb op menselijk chromosoom X in onsterfelijk gemaakte menselijke prostaatkankercellijnen (LNCaP, PC3-ML) te bestuderen, geconstrueerd om te onderzoeken hoe clusterleden kankerprogressieroutes coördineren. Deze aanpak kan worden toegepast op het karakteriseren van elk miRNA-cluster en stelt onderzoekers in staat om snel menselijke cellijnen te genereren die de volledige miRNA-clusterdeletie en individuele en gecombineerde miRNA-genclusterdeleties binnen een enkel experiment dragen.

In deze procedure worden stabiele cellijnen vastgesteld met een doxycycline (DOX) -induceerbaar lentiviral expression-systeem dat de onderzoeker in staat stelt streptococcus pyogenes CRISPR-geassocieerde endonuclease Cas9 (csn1) genexpressie te controleren via de constitutieve DOX-induceerbare promotor TRE3G. Het Tet-On 3G bipartiete systeem omvat een constitutieve menselijke rekfactor 1 alfa (hEF1alpha) promotor om de transcriptie van zowel het Tet-On 3G gen als het blasticidin resistentie gen (BlastR) als een bicistronisch transcript aan te sturen. Het Tet-On 3G-transactivatoreiwit bindt alleen aan de TRE3G-promotor in aanwezigheid van DOX, wat resulteert in robuuste Cas9-transcriptie. Bij afwezigheid van DOX is er geen of zeer minimale basale Cas9-expressie. Daarom kan de onderzoeker een hoge Cas9-eiwitproductie induceren in cellen die zijn gekweekt in media aangevuld met DOX tijdens de CRISPR-genbewerkingsstappen en controle voor snelle CAS9-eiwitklaring bij DOX-terugtrekking.

Dit protocol beschrijft ook het ontwerp van synthetische CRISPR-RNA (crRNA) oligonucleotiden gericht op regio's die het hele miRNA-cluster flankeren, individuele miRNA-haarspeld (premiRNA) -regio's en / of subsets van miRNA-genen binnen het cluster. Elk ontworpen crRNA bevat een unieke 5'-terminale 20 nt gidssequentie (complementair aan de genomische sequentie van belang die moet worden gericht), gevolgd door een invariante 22 nt S. pyogenes repeat sequence (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') die base-pairing met het universele trans-activerende CRISPR RNA (tracrRNA) oligonucleotiden18 mogelijk maakt. Samen fungeren het gegloeide crRNA en tracrRNA (gemengde 1:1-verhouding) als gids-RNA voor dit protocol (figuur 1A). In elk experiment worden twee synthetische gids-RNA's getransfecteerd in DOX-geïnduceerde cellen om het bacteriële Cas9-eiwit te associëren en te escorteren naar de genomische DNA-sites (5 'en 3 ') die het miRNA-clustergebied flankeren dat is bedoeld voor verwijdering (figuur 1B).

Een protospacer adjacent motif (PAM) sequentie (5'-NGG-3' voor wild type S. pyogenes Cas9) moet aanwezig zijn in het celgenoom en zich direct naast de 20 nt DNA-sequentie bevinden waarop de gids RNA17 zich richt. De PAM-sequentie dient als een bindend signaal en positioneert het katalytische gebied van het endonuclease Cas9-enzym op de beoogde genomische DNA-site, wat vervolgens leidt tot gerichte, dubbelstrengs (ds) DNA-splitsing die zich ~ 3 nt stroomopwaarts van de PAM bevindt. De DNA-reparatiemachines van de cel repareren de gespleten DNA-uiteinden, wat kan resulteren in perfecte ligatie, maar vaak treedt niet-homologe eindverbinding (NHEJ) op, waardoor kleine inserties of deleties (indels) op de reparatielocatie ontstaan. Omdat miRNA's niet-coderende genen zijn die zich vaak in intergene en intronische regio's bevinden, hebben deze indels een laag risico op het creëren van ongewenste onzin / missense-mutaties.

Door synthetische RNA-oligonucleotiden (gegloeid crRNA en tracrRNA, 1:1 molaire ratio) te gebruiken die coderen voor het gids-RNA-complex in deze experimenten, vermijdt deze gen knock-outstrategie tijdrovende DNA-vectorsubcloning en zorgt voor enorme flexibiliteit bij het transfecteren van unieke gids-RNA-combinaties naar cellen in een 24-well-formaat. Voorbereiding van ruwe cellysaten voor PCR-genotypescreening vermijdt ook dure en tijdrovende DNA-zuiveringsmethoden, terwijl gestroomlijnde cellijngeneratie van één kolonie en fenotypische analyse mogelijk is. Inderdaad, dit high-throughput CRISPR-genbewerkingsprotocol is met succes gebruikt om gekweekte prostaatkankercellijnen (LNCaP, PC3-ML) te transfecteren met 32 unieke gids-RNA-combinaties in één experiment en knock-outlijnen te genereren die deleties dragen voor het hele clustergebied van ~ 35 kb miR-888; kleinere deletiecombinaties voor miR-888 clusterleden die behoren tot de miR-743- en miR-891a-families; evenals deleties voor individuele miRNA-leden binnen het miR-888-cluster. Studies zoals deze zullen een duidelijker onderschatting geven van hoe geclusterde miRNA's samenwerken om tumorgroei, agressiviteit en medicijnresistentie te reguleren voordat miRNA's naar de kliniek worden vertaald als therapeutische en diagnostische hulpmiddelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding voor CRISPR-genbewerking en gids-RNA-ontwerp om miRNA-cluster knock-out cellijnen te genereren

  1. Maak een DNA-bestand met de volledige genomische sequentie van het miRNA-clustergebied van belang (intergeen, intronisch) en ten minste 1 kB van de omliggende genomische gebieden met behulp van een DNA-sequentie-annotatiesoftwareprogramma19.
    1. Gebruik een functiebewerkingstool in het gemaakte DNA-bestand om de beoogde miRNA-clusterlocus (intergeen, intronisch) en elke individuele miRNA-haarspeldingsequentie die tot het miRNA-cluster behoort te markeren, evenals andere nabijgelegen coderende en niet-coderende genen en / of regelgevende kenmerken 5,20,21,22.
    2. Zorg ervoor dat de miRNA-regio's die zijn bedoeld voor deletie niet per ongeluk nabijgelegen eiwitcoderende genen, niet-coderende genen of belangrijke regulerende DNA-elementen verstoren.
      OPMERKING: Overweeg de genomische complexiteit (bijv. chromosoomduplicaties / fusies) van de cellijn die in dit protocol wordt gebruikt.
  2. Ontwerp synthetische crRNA's gericht op 20 nt genomische DNA-sequentie die het hele miRNA-cluster flankeert, individuele miRNA-haarspeld (pre-miRNA) regio's en / of subsets van miRNA-genen binnen het cluster met behulp van een bioinformatische gids RNA-ontwerpsoftwaretool (bijv.23). Zorg ervoor dat het juiste Cas9-enzym wordt genoteerd in de gids-RNA-ontwerptool (d.w.z. S. pyogenes Cas9).
    OPMERKING: Het gesynthetiseerde crRNA bevat deze unieke 5'-terminale 20 nt gidssequentie (complementair aan DNA-doelwit), gevolgd door een invariante 22 nt S. pyogenes herhaal de sequentie om base-pairing met het gesynthetiseerde universele tracrRNA oligonucleotide mogelijk te maken. Samen gegloeid, zullen ze fungeren als de gids-RNA in dit protocol.
    1. Verwijzend naar het gemaakte DNA-bestand (stap 1.1.), voert u ~150 nt DNA-sequentie in die zich onmiddellijk stroomopwaarts (5') of stroomafwaarts (3') bevindt van de miRNA-haarspeldbocht/ clusterlocus die is bedoeld voor verwijdering in de bioinformatische gids RNA-ontwerpsoftwaretool23.
      OPMERKING: De ontwerptool identificeert unieke 20 nt-sequenties voor crRNA-oligonucleotideontwerp die direct grenzen aan de PAM-sequentie (op de niet-gerichte DNA-streng) (bijv . S. pyogenes Cas9 PAM-sequentie NGG). Hieronder vindt u een voorbeeld van crRNA-ontwerp gericht op een plaats onmiddellijk stroomopwaarts (5') van de mir-891a genlocus (met name 5A (891a) besproken in de sectie met representatieve resultaten en tabel 1).
      1. Open de gids RNA design software tool23.
      2. Voer de naam 5A(891a) in het venster Naam invoeren in.
      3. Voer in het venster Een DNA-sequentie invoeren 150 nt genomische sequentie in die onmiddellijk stroomopwaarts (5') van het voorlopergen mir-891a verblijft: 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
        TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTCTTTGTTTTTTTCTAGGTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. Schakel het selectievakje Specificiteitscontrole inschakelen in om sites met externe targeting uit te sluiten die computationeel door het programma zijn gedetecteerd. Kies het juiste organisme (d.w.z. menselijk [Homo sapiens]).
      5. Specificeer het juiste Cas9-enzym PAM dat voor de onderzoeken wordt gebruikt, in dit geval Streptococcus pyogenes Cas9-PAM: NGG, om de volgende standaardinstellingen te genereren: PAM ten opzichte van het doel: Na; Herhalingsvolgorde: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; Ten opzichte van Gids: 3; Doelreekslengte: 20; Knip ten opzichte van doel 5' start: Sense 17 Anti-sense 17.
      6. Klik op de knop Volgende om de resultaten voor synthetische crRNA-synthese te bekijken.
        OPMERKING: In dit voorbeeld zal het voorgestelde crRNA dat moet worden gesynthetiseerd het DNA-doelwit ATACATGCTGATAGTTACAC herkennen en zich naast PAM: AGG bevinden.
    2. Verwijs naar het DNA-bestand (gemaakt in stap 1.1.) om de beste kandidaat-crRNA 20 nt-doelsequenties te bepalen die zich het dichtst bij de te verwijderen miRNA-locus bevinden en de hoogste specificiteit hebben voor het beoogde genomische doelwit.
      1. Gebruik computationele off-targeting analysetools om de kandidaat-crRNA-specificiteit te evalueren en potentiële off-targeting sites in genomische loci te voorspellen die geen verband houden met het beoogde miRNA-clustergebied van belang (bijv. 24,25,26,27).
      2. Noteer potentiële off-targeting resultaten voor latere referentie bij het genotyperen van crispr-klonale cellijnen met één kolonie door PCR (stap 4.2.6.).
        OPMERKING: De mate van sequentiecomplementariteit die wordt gedeeld tussen het ontworpen crRNA-oligonucleotide en de genomische doelsequentie zal bepalen hoe selectief het Cas9-enzym het genoom op die locus splitst. Omdat het geleide-RNA in een richting van 3' tot 5' naar het genomische doelwit gloeit, zullen mismatches aan het 5'-einde van de DNA-doelsequentie (de eerste 8-10 basen) vaak Cas9-gemedieerde splitsing blokkeren. Als de genomische doelsequentie homologie deelt met een andere genomische locus, behalve binnen de eerste acht basen van de DNA-sequentie, wordt voorspeld dat dit gids-RNA een lage kans heeft op off-targeting op deze site.
      3. Ontwerp vier unieke crRNA's voor elke beoogde miRNA-locus: twee ontworpen crRNA's om complementaire DNA-sequenties onmiddellijk 5' van de miRNA-haarspeld/cluster (5'A, 5'B) te targeten en twee ontworpen crRNA's om complementaire DNA-sequenties onmiddellijk 3' van de miRNA-haarspeld/cluster (3'A, 3'B) te targeten.
        OPMERKING: Bij het uitvoeren van de CRISPR-transfecties (in sectie 3) worden vier mogelijke 5' en 3' gids-RNA-paarcombinaties (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) getest voor elke gerichte miRNA-locus om de kans op het genereren van succesvolle miRNA-locusdeleties in een enkel experiment te vergroten.
      4. Gebruik een functiebewerkingstool in het gemaakte DNA-bestand (stap 1.1.) om de DNA-doelsequentie (met aangrenzende PAM) te markeren voor elk ontworpen crRNA dat moet worden gesynthetiseerd.
  3. Ontwerp en synthetiseer PCR-primers (vooruit, achteruit) die de beoogde miRNA-clustergebieden flankeren voor genotypering van CRISPR-cellijnen (en label de primers in het gemaakte DNA-bestand).
    1. Voor genotyperingscellijnen met kleine genomische deleties voor nauw geclusterde of individuele miRNA's, ontwerpt u PCR-primers (vooruit, achteruit) met ongeveer 150 bp aan elke kant van de Cas9-splitsingsplaats / knock-outregio die detectie van zowel het wildtype (~ 600 bp) als knock-out (~ 300 bp) DNA-fragmenten in een enkele PCR-reactie via gel-elektroforese mogelijk maakt.
    2. Voor genotyperingscellijnen met grote genomische deleties voor miRNA-precursorcombinaties of het hele miRNA-cluster, ontwerpt u opnieuw PCR-primers (vooruit, achteruit) met ongeveer 150 bp aan elke kant van de Cas9-splitsings- / knock-outplaats. Merk op dat, als de beoogde miRNA-clusterdeletie >4 kb lang is, de PCR-reactie waarschijnlijk alleen het kleinere (~ 300 bp) knock-out DNA-fragment zal detecteren, maar niet het wildtype DNA-fragment. Ontwerp daarom extra PCR-primers (vooruit, achteruit) die de aan- of afwezigheid van interne miRNA-clustergenen kunnen detecteren om het screeningsproces te ondersteunen en te valideren voor homozygote knock-outcellijnen.

2. Generatie van stabiele lentivirale cellijnen met de DOX-induceerbare Cas9-expressiecassette

OPMERKING: Voer alle celkweek- en viruswerkzaamheden uit in een gecertificeerde bioveiligheidskap met behulp van BSL2-procedures en aseptische techniek.

  1. Bepaal het juiste cellijntype voor de CRISPR-studies en de gewenste groeimedia.
    OPMERKING: Dit protocol is ontwikkeld voor menselijke prostaatkankercellijnen LNCaP (voorkeursmedium: RPMI, 10% foetaal runderserum [FBS]) en PC3-ML (voorkeursmedium: DMEM, 10% FBS).
  2. Voer een blasticidin "dood" -curve uit om de optimale medicijnconcentratie te bepalen om te selecteren op lentivirus-geïnfecteerde cellen die de blasticidinresistentiegencassette dragen (stap 2.3.).
    1. Plaatcellen in 11 putten van een 24-wells plaat en groeien bij 37 °C, 5% CO2 in het gewenste medium tot ongeveer 75% confluent.
    2. Verdun de blasticidin (werkvoorraad 1 mg/ml) in het voorkeursmedium met een eindconcentratie variërend van 0, 1 tot 10 μg/ml en verdund in stappen van 1 μg/ml.
    3. Label de putten van de gezaaide 24-well plaat van 1 tot 11. Verwijder het groeimedium uit de putjes en vervang door de juiste blasticidineconcentraties.
    4. Verander het medium met de juiste blasticidinconcentraties om de andere dag gedurende 7-10 dagen.
    5. Onderzoek de cellen dagelijks tijdens het tijdsverloop en bepaal de minimale blasticidinconcentratie die nodig is om alle cellen binnen 5-7 dagen te doden.
      OPMERKING: Een blasticidin "kill" -curve moet worden uitgevoerd voor elke specifieke cellijn die wordt gebruikt voor de CRISPR-genbewerkingsexperimenten.
  3. Infecteer de cellen met lentivirus die de DOX-induceerbare Cas9-expressiecassette dragen en voer blasticidinselectie uit met behulp van de optimale concentratie bepaald in stap 2.2.
    1. In drie putten van een 6-well plaat, zaad 5 × 104 cellen per put en groei in het gewenste medium bij 37 °C, 5% CO2 's nachts (ON).
    2. Ontdooi de volgende dag de lentivirusexpressievector voor DOX-induceerbare Cas9 (Lenti-iCas9) op ijs. Voorzichtig mengen (geen vortexvirusdeeltjes).
      OPMERKING: Bewaar het lentivirus in aliquots bij -80 °C om meerdere vries- / dooicycli te voorkomen, wat de virale titers en infectie-efficiëntie zal verminderen.
    3. Bereken het volume dat nodig is om 5 × 104 cellen met virus te transduceren bij een veelvoud van infectie van 0,3 (MOI = 0,3) op basis van de virale titerconcentratie.
    4. Pipetteer het juiste virusvolume in 250 μL (per putje) serumvrij en antibioticavrij voorkeursmedium aangevuld met 0,8 μg/ml hexadimethrinebromide. Meng voorzichtig.
      OPMERKING: Hexadimethrinebromide is een kationisch polymeer waarvan wordt vastgesteld dat het de virale adsorptie en infectie-efficiëntie verhoogt.
    5. Verwijder het medium. Voeg de 250 μL bereid transductiemedium met Lenti-iCas9 virus (MOI = 0,3) toe aan de cellen en incubeer ON bij 37 °C, 5% CO2. (Verkort de incubatietijd tot 4-6 uur als de cellen virusgerelateerde toxische effecten vertonen.)
    6. Vervang het medium door vers voorkeursmedium en laat de cellen 1-2 dagen herstellen.
    7. Voer blasticidinselectie uit op de geïnfecteerde cellen gedurende 10-14 dagen met behulp van de optimale blasticidinconcentratie afgeleid van de "kill" -curve beschreven in stap 2.2.
      1. Tegelijkertijd groeien de niet-geïnfecteerde cellen in het medium met de optimale blasticidinconcentratie om te worden gebruikt als een positieve controle voor virale selectie.
    8. Verander het medium aangevuld met de optimale blasticidinconcentratie om de 3 dagen tijdens de selectietijd om dode cellen te verwijderen.
      OPMERKING: Alleen cellen die blasticidinselectie overleven, hebben de lentivirale vector geïntegreerd.
    9. Vouw de door Blasticidin geselecteerde Lenti-iCas9-cellijnen uit.
      OPMERKING: Noteer het celpassagenummer bij elke uitbreiding.
      1. Vries een deel van de Lenti-iCas9-cellen in het gewenste medium in, aangevuld met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) voor cryoviale opslag op lange termijn.
      2. Analyseer een deel van de Lenti-iCas9-cellen met western blot9 om de cellijn te identificeren die de meest robuuste DOX-induceerbare Cas9-eiwitniveaus vertoont (zie stap 2.3.).
  4. Voer een doxycyclineconcentratiecurve uit op nieuw vastgestelde Lenti-iCas9-cellijnen om de optimale omstandigheden voor Cas9-eiwitinductie te bepalen.
    1. Stel vier onafhankelijke 6-well platen in voor elke geteste cellijn om deze DOX-concentratietijdcursus uit te voeren. Plaat 5 × 104 cellen per put van elke 6-wells plaat en groeien bij 37 °C, 5% CO2 in het gewenste medium gedurende 24 uur.
    2. Verdun DOX (werkvoorraad 1 mg/ml) in het voorkeursmedium met een uiteindelijke DOX-concentratiecurve variërend van 0, 50, 100, 150, 250 tot 500 ng/ml.
    3. Label de putten van elke gezaaide 6-well plaat van 1 tot 6. Verwijder het medium en vervang door de juiste DOX-concentraties. Kweekplaten 1-4 tot de volgende tijdstippen: 24 uur, 48 uur en 72 uur DOX-inductie; en 120 uur na dox-ontwenning (aanvankelijk 72 h DOX-geïnduceerd).
    4. Oogst de putten van de plaat op elk tijdstip met behulp van geschikte methoden (bijv. Trypsinisatie). Bewaar de celpellets bij -80 °C. Verwerk de celpellets in RIPA-buffer voor lysaatisolatie en Cas9 western blot-analyse.
      1. Voer 40 μg cellysaat uit voor elk monster van de DOX-inductietijdcursus met behulp van een denaturerende 4% -12% Bis-Tris-gel en breng de eiwitten over naar een immunoblotmembraan.
      2. Hybridiseer het immunoblotmembraan met een primair antilichaam tegen Cas9 om het 160 kDa-eiwit te detecteren. Normaliseer Cas9-niveaus met behulp van een huishoudgen zoals GAPDH (37 kDa).
    5. Bepaal op basis van de western blot-resultaten de optimale DOX-concentratie om Cas9 in de Lenti-iCas9-cellijnen te induceren.
      OPMERKING: Deze tijdcursus zal ook onthullen hoe strak Cas9-expressie wordt gereguleerd na 120 uur na DOX-verwijdering.
    6. Stel eencellige kolonies vast voor de Lenti-iCas9-cellijnen met robuuste Cas9-eiwitexpressie om de CRISPR-transfecties te optimaliseren (in sectie 3).

3. Crispr-reacties uitvoeren door Cas9-inductie en synthetische gids-RNA-transfectie van cellen met behulp van een high-throughput formaat

OPMERKING: Een werkstroomdiagram wordt weergegeven in figuur 1.

  1. Breng op papier de crRNA-paarcombinaties in kaart die zullen worden getransfecteerd in elke put van een 24-well-plaat gericht op het hele miRNA-cluster, verschillende geclusterde miRNA-gencombinaties en individuele miRNA-clusterleden.
    1. Label op de kaart vier putten per gerichte miRNA-locus. Laat elke put een transfectiereactie vertegenwoordigen, met twee unieke crRNA's op 5' en 3' van de gewenste miRNA knockout genomische locus en de tracrRNA (gegloeide 1:1 molaire verhouding).
    2. Zorg ervoor dat elk van de vier gelabelde putten een uniek crRNA-paar voor transfectie vertegenwoordigt (bijv. 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      OPMERKING: Het ontwerp van twee 5' crRNA's en twee 3' crRNA's die elke gerichte miRNA-locus flankeren (sectie 1) maakt het mogelijk om vier mogelijke 5' en 3' gids-RNA-paren in de transfectiereactie te genereren.
  2. Plaats de Lenti-iCas9 cellijn op 5 x 104 cellen/put van een 24-well plaat in het voorkeursmedium met de geoptimaliseerde DOX-concentratie (bepaald in stap 2.4.). Laat de cellen 24-48 uur groeien bij 37 °C, 5% CO2 om Cas9-eiwitexpressie te induceren.
  3. Transfecteer de Lenti-iCas9 cellen met de voorbereide 5' en 3' gids RNA's.
    1. Reconstitueer de gesynthetiseerde crRNA- en tracrRNA-oligonucleotiden met nucleasevrij water tot een voorraadconcentratie van 10 μM. Bewaar bij -80 °C op lange termijn.
    2. Label vier microcentrifugebuizen van 1,5 ml per gerichte miRNA-locus op basis van de experimentele kaart die is ontworpen in stap 3.1. en vertegenwoordigt de vier mogelijke 5' en 3' crRNA-paarcombinaties (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
    3. Meng in elke buis een 1:1 molaire verhouding tracrRNA en unieke crRNA's (5' en 3') samen om het 2 μM gids-RNA-complex te vormen met behulp van de volgende reactie (eindvolume van 10 μL):
      1. Voeg 2,5 μL tracrRNA (10 μM-voorraad), 1,25 μL van het 5' gepositioneerde crRNA (10 μM-stam), 1,25 μL van het 3' gepositioneerde crRNA (10 μM-stam) en 5 μL 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml. Microcentrifuge voor 30 s bij 16.000 × g om te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min.
    4. Voeg aan elke buis 40 μL gereduceerd serummedium (bijv. Opti-MEM) toe aan de 10 μL geleide-RNA-complexreactie (50 μL totaal volume). Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren.
    5. Meng in een schone centrifugebuis van 1,5 ml 2 μL van het transfectieregens28 (zie NOOT 3.3.5.1.) en 48 μL gereduceerd serummedium (bv. Opti-MEM, eindvolume van 50 μL) voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer bij RT gedurende 5 min.
      1. Bereid een hoofdmengsel van het transfectieregens door de hoeveelheden reagens (2 μL) en het gereduceerde serummedium (bijv. Opti-MEM, 48 μL) te vermenigvuldigen met het aantal te transfecteren putten, plus 10% extra volume om rekening te houden met kleine pipetteeronnauwkeurigheden.
        OPMERKING: Selecteer een transfectiereagens dat is geoptimaliseerd voor kleine RNA- en CRISPR-RNA-oligonucleotidetransfecties, evenals voor de cellijntype28.
    6. Voeg aan elke buis die het geleide-RNA-mengsel van 50 μL bevat (uit stap 3.3.4.) de 50 μL van het verdunde transfectiereagens (uit stap 3.3.5.). Pipetteer het mengsel langzaam op en neer om te mengen. Incubeer bij RT gedurende 20 min.
    7. Voeg 400 μL antibioticavrij medium aangevuld met DOX (optimale concentratie) toe aan elke buis die de 100 μL van de geleide RNA/transfectiemix bevat. Pipetteer voorzichtig om te mengen.
  4. Verwijder het medium uit de dox-geïnduceerde Lenti-iCas9-cellen (stap 3.2.). Voeg 500 μL media/DOX/gids RNA/transfectiemix toe op basis van de 24-well plate experimental map (stap 3.1.). Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende 48 uur bij 37 °C, 5% CO2.
  5. Vervang het medium door het verse voorkeursmedium zonder DOX (om Cas9-eiwit uit de cellen te verwijderen). Laat de cellen nog 24-48 uur herstellen bij 37 °C, 5% CO2.
  6. Oogst de getransfecteerde cellen (trypsinisatie) en bereid je voor op genotypering en eencellige verdunningen.
    OPMERKING: Cellen vertegenwoordigen een gemengde populatie met getransfecteerde CRISPR-gen-bewerkte en niet-getransfecteerde wild-type cellen. Deze stap bepaalt de efficiëntie van CRISPR-bewerking voordat tijd / middelen worden geïnvesteerd in uitbreiding van eencellige kolonies.
    1. Was de cellen 1x met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Incubeer de cellen in 100 μL trypsine gedurende 5 min bij 37 °C, 5% CO2 en breng de cellen over naar een schone centrifugebuis van 1,5 ml met 1 ml medium.
    2. Keer om om de cellen te mengen en microcentrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 20 °C. Verwijder het medium en resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS.
    3. Microcentrifugeer de gewassen cellen gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 20 °C. Verwijder de PBS en resuspenseer de celpellet in 150 μL van het gewenste medium.
  7. Bepaal het celnummer per microliter van de 150 μL geresuspendeerde cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerd celtelinstrument.
  8. Scheid de 150 μL geresuspendeerde cellen in drie delen.
    1. Vries 1/3 van de getransfecteerde cellen (50 μL) in het medium plus 10% DMSO (eindvolume van 150 μL) in cryovialen voor toekomstige expansie/langdurige opslag.
    2. Breng 1/3 van de getransfecteerde cellen (50 μL) over in een schone PCR-buis van 0,2 ml voor genotypering.
      1. Microcentrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 4 °C en verwijder het medium.
      2. Resuspendeer de celpellet in 100 μL PBS.
      3. Microcentrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 4 °C en verwijder de PBS. Bewaar gemengde celpellets langdurig bij -80 °C.
      4. Verwerk de celpellet voor genotypering met behulp van de workflow in sectie 4.
    3. Bereid de laatste 1/3 van de cellen (50 μL) voor verdunning en plating in een 96-well plaatformaat om eencellige kolonies te genereren.
      1. Bereken op basis van het celgetal in stap 3.7. de verdunningen die nodig zijn om 10, 5, 2 en 1 cel(en) te bereiken in 100 μL medium per put van een 96-well plaat.
      2. Gebruik een 12-kanaals meerkanaals pipettor en een steriel reagensreservoir en voeg 100 μL verdunde cellen per put toe aan twee rijen van de plaat (24 putten totaal) voor elke verdunning (10, 5, 2 of 1 cel per put). Laat de cellen 4-6 weken groeien tot samenvloeiing voor eencellige kolonie-uitbreiding. Observeer de cellen wekelijks onder een lichtmicroscoop en noteer of de kolonies een- of meercellige kolonies vertegenwoordigen.
      3. Verzamel ~10-15 eencellige kolonies voor genotypering (sectie 4). Identificeer ten minste drie onafhankelijke, knock-out, eencellige kolonielijnen voor elke gerichte miRNA-locus. Behoud wild-type eencellige lijnen als besturingselementen.
        OPMERKING: Het screeningsnummer is afhankelijk van het cellijntype en de impact van miRNA knock-out fenotype op celgroei / levensvatbaarheid.

4. PCR-genotypering van CRISPR-cellijnen met behulp van ruwe cellysaten

  1. Oogst individuele, eencellige kolonies uit bijna-confluente putten van een 96-well plaat.
    OPMERKING: Het verwijderen van medium/PBS zoals beschreven in deze stappen kan handmatig worden uitgevoerd met behulp van een vacuümaspirator in de bioveiligheidskast, maar wees voorzichtig om kruisbesmetting te voorkomen. Gebruik een nieuwe steriele "gele" pipetmanpunt van 200 μL voor elke put van de 96-well plaat bij het aspirateren, waarbij elke uitgewisselde gele punt stevig wordt geplaatst aan het einde van een steriele glazen weidepipet die aan de vacuümaspirator is bevestigd.
    1. Was de putjes 1x met 100 μL PBS. Aspirateer de PBS.
    2. Voeg 50 μL trypsine toe en incubeer gedurende 2-5 min bij 37 °C, 5% CO2.
    3. Pipetteer voorzichtig op en neer en breng de geresuspendeerde cellen over in een centrifugebuis van 1,5 ml met 1 ml medium.
    4. Keer om om de cellen te mengen en voorzichtig in een microcentrifuge te pelleteren gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 20 °C.
    5. Verwijder het medium en voeg 1 ml PBS toe. Veeg voorzichtig met de buis om de pellet te verstoren en keer meerdere keren om om te mengen.
    6. Microcentrifuge gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 20 °C om de cellen te pelleteren.
    7. Verwijder de PBS en resuspenteer de pellet in 300 μL verse PBS.
    8. Splits het monster van 300 μL in twee delen.
      1. Breng 200 μL van de cellen (2/3 van de pellet) over naar een putje van een 24-wellsplaat met 1 ml van het gewenste medium. Zodra het genotype is gevalideerd, gebruikt u deze cellen om de CRISPR-gemedieerde knock-out cellijnen uit te breiden voor functionele analyse.
      2. Breng 100 μL van de cellen (1/3 van de pellet) over naar een PCR-buis van 0,2 ml. Microcentrifuge gedurende 5 minuten bij 3.000 x g bij 4 °C. Verwijder de PBS. Bewaar de pellet bij -80 °C.
  2. Bereid ruwe cellysaten voor genotypering en sequentieanalyse voor met behulp van de PCR-primers die zijn ontworpen in stap 1.3. Neem de cellysaten op die zijn bereid uit niet-getransfecteerde cellen in deze experimenten om te gebruiken als wild-type positieve controles.
    1. Resuspendeer de celpellet in 4 μL 5x DNA-polymerasebuffer (zie de materiaaltabel, eindconcentratie 1x), 1 μL proteïnase K (20 ng/ml bouillon), 1 μL RNase A (10 ng/ml voorraad) en nucleasevrij water tot een totaal volume van 20 μL.
    2. Lyse de cellen in een thermocycler met behulp van een PCR-programma: 56 °C gedurende 30 minuten en 96 °C gedurende 5 minuten. Bewaar de cellysaten bij -20 °C.
    3. Voer een PCR-reactie uit met behulp van de ontworpen PCR-primers (vooruit, achteruit) die de geleide RNA 5'- en 3'-gids-RNA-doellocaties flankeren (tabel 1).
      OPMERKING: De OMSTANDIGHEDEN VAN DE DNA-polymerasebuffer en thermocycler zijn afhankelijk van het Taq DNA-polymerase-enzym dat wordt gebruikt voor de PCR-reactie. Dit protocol is geoptimaliseerd voor een Phusion HF DNA Polymerase.
      1. Stel de PCR-reactiemix in op ijs: 5 μL 5x DNA-polymerasebuffer, 0,5 μL voorwaartse PCR-primer (10 μM-bouillon), 0,5 μL omgekeerde PCR-primer (10 μM-bouillon), 0,5 μL 10 mM dNTPs, 0,25 μL DNA-polymerase, 1-4 μL cellysaat en nucleasevrij water tot een totaal volume van 25 μL.
      2. Voer de PCR-reactie uit in een thermocycler met behulp van het programma: 98 °C gedurende 3 minuten en 35 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 62 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 15 s en vervolgens 72 °C gedurende 10 minuten. Houd 4 °C vast. Zie NOOT 4.2.3. boven.
    4. Laad de PCR-producten op een 1% agarose-gel voor elektroforeseanalyse.
    5. Extraheer DNA uit de geïsoleerde PCR-fragmenten van de voorspelde moleculaire grootte voor de knock-out (en wild-type) genotypen. Bereid de monsters voor op DNA-sequencing.
    6. Valideer dat de CRISPR-reactie succesvol was en voer DNA-sequencing van de geïsoleerde PCR-fragmenten uit om de Cas9-splitsingsplaats te identificeren en miRNA-locusdeletie te bevestigen.
      1. Isoleer ten minste drie onafhankelijke knock-out cellijnen voor elke miRNA-locus waarop CRISPR zich richt. Behoud wild-type (en heterozygote) cellijnen om te gebruiken als controles in downstream functionele studies.
      2. Voer qRT-PCR- of northern blot-analyse uit om te bevestigen dat de knock-outcellijnen geen volwassen miRNA tot expressie brengen voor de verwijderde locus.
        OPMERKING: Whole-genome sequencing (WGS) is de meest definitieve methode om CRISPR-genbewerking en off-targeting te valideren.
      3. Test op CRISPR off-targeting effecten door PCR, die computationeel werden voorspeld (stap 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. Als uitgebreide screening van eencellige kolonies alleen resulteert in heterozygote genotypen, herhaal dan de gids-RNA-transfectie in de eencellige heterozygote lijnen.
        OPMERKING: Het onvermogen om homozygote knock-out cellijnen te verkrijgen, kan wijzen op dodelijke effecten als gevolg van miRNA-verlies of inherente genomische complexiteit (bijv. chromosoomduplicaties / fusies) van de oudercellijn die verdere analyse vereisen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit crispr-deletieprotocol met hoge doorvoer werd met succes gebruikt met behulp van transfectie van Cas9-induceerbare LNCaP- en PC3-ML-menselijke kankercellijnen met synthetische oligonucleotidegids RNA's gericht op het miR-888-cluster, die werden bestudeerd in de context van prostaatkanker. Het miR-888-cluster werd aanvankelijk geïdentificeerd in een expressieprofileringsscherm als verhoogd bij prostaatkankerpatiënten met een hooggradige ziekte in vergelijking met laaggradige en niet-kankerpatiënten 9,10. De miR-888-cluster, verspreid over 35.124 bp, bestaat uit zeven miRNA's (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b en -891a) op menselijk chromosoom Xq27.3 (figuur 2A). Deze locus ligt binnen de HPCX1 (Erfelijke Prostaatkanker, X-gebonden 1, Xq27-28), die geassocieerd is met erfelijke prostaatkanker 11,12,13,14,15,29. miR-888, -890, -892a, -892b en -892c delen de homologie van de sequentie en behoren tot de zoogdier-geconserveerde miR-743-familie. Clusterleden miR-891a en miR-891b delen alleen sequentie homologie met elkaar en behoren tot de primatenspecifieke miR-891 familie. De genomische organisatie van de miR-888-cluster wordt bewaard over primaten heen, wat een functioneel behoud van een belangrijk signaleringsnetwerk impliceert30.

Eerder werk met behulp van experimentele overexpressie (miRNA-mimics) en inhibitie (antisense oligonucleotiden) studies om individuele miR-888 clusterlidactiviteit te evalueren, onthulde een overlappende rol voor alle miR-888 clusterleden om prostaatkankercelinvasiviteit te bevorderen met behulp van Matrigel Boyden-kamertests 9,10. Met name miR-888 en miR-891a functioneerden op dezelfde manier om prostaatcelgroei te induceren (WST-1-testen), de belasting van prostaattumoren in xenografts van muizen te versnellen en gemeenschappelijke doelen te reguleren (bijv. TIMP-2) 9,10. Dit werk suggereerde echter een complexere interactie tussen de miR-888 clusterleden. MiR-888 en miR-891a vertoonden bijvoorbeeld synergetische effecten bij het bevorderen van PC3-N prostaatcelproliferatie, terwijl zowel miR-890 als miR-892c remmende groei-effecten vertoonden met behulp van WST-1-testen9. Daarom werd dit high-throughput CRISPR-protocol gebruikt om het miR-888 clusternetwerk genetisch te ondervragen in de context van prostaatkanker.

De beschreven workflow voor CRISPR Cas9-genbewerking (figuur 1) maakte het mogelijk om 32 unieke CRISPR-gids RNA-transfectiereacties in één experiment te testen met behulp van een 24-well-formaat. Dit protocol resulteerde in de succesvolle identificatie van een panel van menselijke prostaatkanker knock-out cellijnen met deleties voor de gehele miR-888 cluster, specifieke miRNA clusterlid combinaties en individuele miRNA leden. De generatie van stabiele induceerbare Cas9-cellijnen werd voor het eerst vastgesteld. Kortom, PC3-ML en LNCaP menselijke prostaatkankercellen werden geïnfecteerd met een DOX-induceerbare Streptococcus pyogenes Cas9 lentivirus vector (Lenti-iCas9; EditR Induceerbare Lentivirale hEF1aBlastCas9 Nuclease Deeltjes; MOI 0,3) gedurende 6 uur (LNCaP) of 's nachts (PC3-ML), afhankelijk van de inherente gevoeligheid van cellijn voor virustoxiciteit.

De geïnfecteerde cellijnen ondergingen vervolgens blasticidinselectie (7,5 μg / ml) en eencellige kolonie-uitbreiding. Western blot studies werden gebruikt om de single-colony PC3-ML en LNCaP Lenti-iCas9 cellijnen te selecteren die de meest robuuste Cas9-expressie vertonen op basis van een DOX-inductietijdcursus (figuur 2A). Dit lentivirale Cas9-induceerbare systeem werd strak gecontroleerd en na dox-ontwenning gedurende 120 uur werd het grootste deel van het Cas9-eiwit uit de cellen verwijderd (figuur 2A). Een DOX-concentratiecurve bepaalde dat 250 ng/ml DOX de optimale dosis was om robuuste Cas9-eiwitexpressie te induceren in deze Lenti-iCas9 prostaatcellijnen (figuur 2B). Met behulp van een online crRNA-ontwerptool23 werden unieke crRNA's (twee 5' en twee 3' crRNA's die elke geplande miRNA knock-out locus flankeren om vier mogelijke 5' en 3' gids RNA-combinaties mogelijk te maken) ontworpen die gericht waren op het hele clustergebied van ~ 35 kb miR-888; kleinere clustercombinaties binnen de miR-743-familie of de miR-891-familie; evenals individuele miRNA-deleties (miR-888, -891a) (figuur 3A). Bij het uitvoeren van de CRISPR-experimenten werden menselijke prostaatkanker Lenti-iCas9-cellijnen gekweekt in medium aangevuld met 250 ng / ml DOX gedurende 48 uur om Cas9-expressie te induceren.

De cellen werden vervolgens getransfecteerd in een 24-well plaatformaat met het synthetische universele tracrRNA gecomplexeerd (1:1 molaire verhouding) met een unieke set van 5' en 3' genomische site-specifieke crRNA's (tabel 2). DOX werd 48 uur na transfectie uit het celkweekmedium verwijderd om Cas9-eiwit uit de prostaatkankercellen te verwijderen. De putten werden 48 uur later geoogst (96 uur na transfectie) en een derde van elke geoogste celpellet werd bereid voor PCR-genotypering met behulp van ruwe cellysaten (tabel 3). Gel-elektroforeseanalyse van de PCR-reacties gaf aan dat de voorspelde DNA-fragmentgrootte die het knock-outgenotype vertegenwoordigt, werd versterkt voor elke CRISPR-transfectie (figuur 3B). DNA-sequencing van deze geïsoleerde knock-out PCR-fragmenten bevestigde dat de getransfecteerde 5' en 3' gids RNA's Cas9-splitsing/ligatie ~3 nt stroomopwaarts van de PAM-locaties stuurden en genomisch verlies van de beoogde miRNA-locus valideerden (representatief voorbeeld weergegeven in figuur 4C). Aangezien de miR-888-cluster zich in een intergeen gebied van chromosoom X bevindt (ver van eiwitcoderende genen), werd niet verwacht dat knock-outcellijnen, die vaak INDELs bezaten op de Cas9-splitsingsplaats vanwege NHEJ, downstream artefactuele effecten zouden veroorzaken.

Hoewel de CRISPR-transfectiereacties succesvol waren (figuur 3B), vertegenwoordigden de getransfecteerde cellen een gemengde celpopulatie van getransfecteerde (knock-out) en niet-getransfecteerde (wild-type) cellen. Deze populatie vertegenwoordigde ook een mengsel van cellen met homozygote en heterozygote deleties voor de beoogde miRNA-locus. LNCaP- en PC3-prostaatkankercellijnen zijn afgeleid van mannen met abnormale karyotypen die twee X-chromosomen bevatten31,32. Daarom werd een deel van elke celtransfectiereactie serieel verdund in een 96-well plaatformaat om eencellige kolonielijnen te verkrijgen. Deze kolonies werden gescreend door PCR om te selecteren op homozygote cellijnen die niet alle kopieën van de beoogde miRNA-locus misten.

Deze procedure was belangrijk om tijdig te volgen, omdat eerdere gegevens hebben gewezen op een rol voor de miR-888-cluster bij het bevorderen van tumorcelgroei en ziekte-agressiviteit. Kankercellen met CRISPR-deleties voor de miR-888-clusterleden zouden langzamer groeien dan wild-type cellen. Een geldige zorg was dat, na verloop van tijd, de gids RNA-getransfecteerde putten, met een gemengde populatie van miRNA knock-out en wild-type cellen, zouden resulteren in wild-type cellen snel overtreffen de gecompromitteerde mutantcellen in cultuur. Dit werd opgemerkt en werd vooral uitgesproken in experimenten met behulp van de zeer agressieve PC3-ML-cellijnen. Zo werden stappen met seriële verdunningen om eencellige kolonielijnen of celvoorbereiding voor cryostorage te genereren binnen 48-72 uur na het uitvoeren van de CRISPR-transfectie-experimenten uitgevoerd om de knock-outcellen in de gemengde populatiemonsters te behouden.

Het meest moeizame deel van de CRISPR-workflow voor de miR-888-cluster was het genereren van homozygote, eencellige kolonie-miRNA-deleties. Een uitdaging in dit proces was dat de gekweekte LNCaP- en PC3-ML-cellen meestal niet goed gedijden wanneer ze werden verguld bij eencellige dichtheden. Bovendien bleek de celgroei fenotypisch te worden aangetast door combinatorisch verlies van miR-888 clusterleden (en gecorreleerd met agressiviteit van de cellijn). Daarom waren voor sommige van de transfectiereacties gericht op bepaalde miRNA-locuscombinaties aanvullende celverdunningen (met behulp van een 96-well-formaat) nodig om voldoende eencellige kolonielijnen voor genotypering te genereren. Bij het screenen van de genotypen van de eencellige kolonies door middel van elektroforese-gelbeeldvorming, was het nuttig om de bandintensiteit van het wildtype te vergelijken met de knock-out PCR-fragmenten en te bepalen of de cellijn heterozygoot was (gelijke bandintensiteit) of een meercellige kolonie vertegenwoordigde (ongelijke bandintensiteit), die zou profiteren van extra rondes van eencellige verdunningen. Als celkolonies werden opgemerkt dat ze PCR-fragmenten van abnormale grootte en inconsistent met wild-type of knock-out genotypen bezaten, werden deze lijnen uit de studie geëlimineerd.

DNA-sequencing van geïsoleerde PCR-fragmenten die consistent zijn voor de wild-type en knock-out genotypen werden opnieuw gevalideerd voor elke gevestigde eencellige kolonie en bevestigd met behulp van onafhankelijke methoden (d.w.z. qRT-PCR, WGS). In termen van de typische efficiëntie van het genereren van homozygote nulcellijnen in deze experimenten, varieerde dit met de beoogde miRNA-locus en het gebruikte celtype. De efficiëntie bij het verkrijgen van single-colony mir-891a knockout-lijnen met behulp van LNCaP was bijvoorbeeld 30%, maar daalde tot ~ 7% in PC3-ML-cellen. Dit verschil kan te wijten zijn aan inherente verschillen in celtypen (pc3-ML-cellen hebben bijvoorbeeld hogere delingssnelheden /gemetastaseerd potentieel dan LNCaP-cellen). CRISPR-efficiëntieverschillen kunnen ook de functionele impact van miRNA-verlies weerspiegelen (bijvoorbeeld miR-891a bevordert celgroei en agressiviteit 9,10) en dus kunnen knock-outfenotypen worden vergroot in agressievere cellijnen zoals PC3-ML. Het verkrijgen van enkelvoudige kolonielijnen voor grotere miRNA-locusdeleties van de miR-888-cluster vertoonde verminderde efficiëntie. We waren niet in staat om te bepalen of dit te wijten was aan het uitschakelen van grotere delen van het DNA of het onderstrepen van de essentiële en overlappende functionele rollen van miR-888-leden in prostaatkankercellen.

Gedetailleerde beschrijving en fenotypische analyse van de eencellige kolonie-geëxpandeerde knock-out miR-888 clustercellijnen gegenereerd uit deze workflow zijn aan de gang en zullen elders worden gepubliceerd. Als een representatief resultaat van miRNA-deleties gegenereerd in deze CRISPR-genbewerkingsstudies, worden de bevindingen voor LNCaP-prostaatkankercellen met een individuele mir-891a-deletie getoond. Eencellige kolonies werden gegenotypeerd door PCR en sequentie geverifieerd (figuur 4A-C). Cellijnen met abnormaal grote PCR-fragmenten werden niet geanalyseerd (bijv. kloon L14 H7 weergegeven in figuur 4D). Zodra knock-out en wild-type eencellige kolonies werden verkregen voor de mir-891a locus, werden functionele studies uitgevoerd. Eerder werk heeft aangetoond dat overexpressie van miR-891a (miRNA mimic lentiviral vector) prostaatcelgroei induceert9 en daarom werd voorspeld dat miR-891a-verlies wederzijdse effecten zou vertonen. WST-1 proliferatietests waarbij mir-891a knock-out en wild-type cellen werden vergeleken, bevestigden deze hypothese, en miR-891a verlies resulteerde in vertraagde groei (figuur 4D, E).

Figure 1
Figuur 1: CRISPR-genbewerkingsworkflow om miRNA-clusterdeleties te genereren. (A) Het gids-RNA bestaat uit het gegloeide synthetische crRNA en tracrRNA-oligonucleotiden (gemengde 1:1 molaire verhouding). Het crRNA-oligonucleotide is ontworpen om een unieke 5'-terminale 20 nt-gidssequentie (geel) te bevatten die complementair is aan de beoogde genomische DNA-site en wordt gevolgd door een invariante 22 nt Streptococcus pyogenes-herhalingssequentie (groen) die base-pair met het tracrRNA-oligonucleotide. Rode pijlen geven cas9-enzym dubbelstrengs DNA-splitsingsplaatsen aan die zich meestal 3 nt stroomopwaarts van de PAM bevinden. (B) Deze experimentele workflow toont een enkele put van een 24-well plaat. Cellen geïnfecteerd met een DOX-induceerbare Cas9 lentivirus vector (Lenti-iCas9, MOI 0.3) worden gekweekt in medium met DOX gedurende 48 uur om Cas9-eiwitexpressie te induceren. Twee synthetische gids-RNA's (gemengde 1:1 molaire verhouding van crRNA::tracrRNA) worden getransfecteerd in Cas9-geïnduceerde cellen. De gids RNA's begeleiden Cas9 naar de genomische DNA-sites (5' en 3') die het miRNA-clustergebied flankeren dat is bestemd voor verwijdering. Cellen worden 48 uur na transfectie bereid voor verdunning met behulp van een 96-well-formaat om eencellige kolonies te genereren voor PCR-genotypering en downstream fenotypische analyses. Afkortingen: CRISPR = geclusterde regelmatig tussen elkaar geplaatste korte palindromische herhalingen; miRNA = microRNA; crRNA = CRISPR-RNA; tracrRNA = trans-activerend CRISPR-RNA; nt = nucleotide; Cas9 = CRISPR-geassocieerd endonuclease; PAM = protospacer aangrenzend motief; DOX = doxycycline; MOI = veelheid van infectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Kankercellijnen met een doxycycline-induceerbare Cas9 lentivirale cassette met strakke Cas9-eiwitregulatie. (A) Western blot-analyse toonde aan dat menselijke prostaatkanker PC3-ML-cellijnen geïnfecteerd met de Lenti-iCas9-vector (EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, MOI 0.3) en gekweekt gedurende 48 uur in medium met 250 ng / ml DOX tot expressie brachten optimale Cas9-eiwitniveaus. Cas9-expressie werd genormaliseerd naar GAPDH-expressie. (B) PC3-ML-cellen gekweekt in medium met 250 ng/ml DOX gedurende 48 h en 120 h (+DOX) vertoonden robuuste Cas9-eiwitexpressie. DOX-verwijdering uit de media (-DOX) gedurende 120 h (120 h post) resulteerde in Cas9-eiwitklaring, zoals gemeten door western blot-analyse. Vergelijkbare resultaten werden verkregen bij het genereren van de LNCaP Lenti-iCas9 cellijn (niet weergegeven). Afkortingen: CRISPR = geclusterde regelmatig tussen elkaar geplaatste korte palindromische herhalingen; Cas9 = CRISPR-geassocieerd endonuclease; DOX = doxycycline; MOI = veelheid van infectie; GAPDH = glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: High-throughput CRISPR experimenteel ontwerp om meerdere miR-888 clusterdeletiecombinaties in één experiment te genereren. (A) Diagram van de miR-888-cluster op het menselijk chromosoom Xq27.3, wat de zoogdiergeconserveerde miR-743-familieleden mir-892c, -890, -888, -892a en -892b (blauwe dozen) en de primaatspecifieke miR-891-familieleden miR-891a en -891b (kastanjebruine dozen) aangeeft. Unieke synthetische crRNA oligonucleotiden (groene pijlen) werden gebruikt om de miR-888 cluster knockout combinaties te genereren. Voorwaartse en omgekeerde PCR-primers (kleine rode rechthoeken) werden ontworpen om cellen te genotyperen en te screenen op knock-outs. (B) Dit representatieve resultaat toont 25 CRISPR-reacties in getransfecteerde PC3-ML-cellen (Lenti-iCas9) die gericht waren op een reeks miR-888 cluster knock-out combinaties in een enkel experiment. Elke getransfecteerde put van een 24-well plaat bevatte twee unieke gRNA's die de 5' en 3' zijden van de beoogde miRNA-genomische locus (Δ) flankeerden (zoals vermeld in tabel 2). Ruwe cellysaten werden bereid voor elke CRISPR-reactie en PCR-genotypatie. Geïsoleerde PCR-fragmenten die migreerden op de voorspelde knock-outgroottes door gel-elektroforese werden DNA-gesequenced en gevalideerd voor gerichte Cas9-splitsing en miRNA-locusverwijdering. Voorspelde WT PCR-fragment bp-groottes worden tussen haakjes aangegeven en de gewenste CRISPR KO PCR-fragmentgroottes worden aan de onderkant van de gel weergegeven. Afkortingen: CRISPR = geclusterde regelmatig tussen elkaar geplaatste korte palindromische herhalingen; Cas9 = CRISPR-geassocieerd endonuclease; gRNA = gids-RNA; DOX = doxycycline; bp = basenpaar; WT = wild-type; KO = knock-out. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Prostaatkankercellen verwijderd voor mir-891a met behulp van CRISPR-genbewerking die onderdrukte proliferatie vertoont. (A) Ontwerp van PCR-primers (paars) en de twee 5'- en twee 3'-gids-RNA's (oranje) gericht op genomische sequenties die het mir-891a-gen flankeren (groen). (B) PCR-genotypering van getransfecteerde LNCaP-cellen met aangegeven 5' en 3' gids-RNA's bevestigde dat Δmir-891a-deleties werden verkregen voor alle vier gids-RNA-combinaties. Cellysaten werden gemaakt van gemengde celpopulaties 48 uur na transfectie. (C) PCR-fragmenten werden gesequenced en gevalideerd. Een representatief voorbeeld toont de DNA-sequentie van getransfecteerde cellen behandeld met 5A(891a) en 3B(891a) gids RNA's, resulterend in de voorspelde Cas9 splitsingsplaats (3 nt stroomopwaarts van de PAM-site) en CRISPR Δmir-891a-deletie. (D) Eencellige kolonies werden verkregen en PCR-gegenotypeerd. Kloon L14 G9 werd sequentie-gevalideerd als ko en kloon L14 G9 als een WT voor het mir-891a gen. (E) miR-891a bleek eerder prostaatkankercelgroei te induceren en daarom werd voorspeld dat miR-891a-verlies het reciproke fenotype zou hebben. WST-1-testen van prostaatkankercellen verwijderd voor mir-891a (L14 G9 [KO], blauw) vertoonden onderdrukte proliferatie in vergelijking met WT-cellen (L14 G9 [WT], rood). Afkortingen: CRISPR = geclusterde regelmatig tussen elkaar geplaatste korte palindromische herhalingen; Cas9 = CRISPR-geassocieerd endonuclease; WT = wild-type; KO = knock-out; WST-1 = in water oplosbaar tetrazoliumzout-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

PCR-reactie wordt op ijs ingesteld.
Bestanddeel 25 μL reactie Eindconcentratie
5x DNA polymerase buffer 5 μL 1x
Forward PCR Primer (10 μM) 0,5 μL 0,2 μM
Omgekeerde PCR Primer (10 μM) 0,5 μL 0,2 μM
10 mM dNTPs 0,5 μL 200 μM
DNA Polymerase (2 U/μL) 0,25 μL 0,125 U/ 25 μL
Ruw cellysaat 1 - 4 μL veranderlijk
Nucleasevrij water tot 25 μL
Thermocycler condities voor PCR reactie:
Stap Temperatuur Tijd
Initiële denaturatie 98 °C 3 min.
98 °C 10 s
35 cycli 62 °C 15 s
72 °C 15 s
Definitieve verlenging 72 °C 10 min.
Houden 4 °C

Tabel 1: PCR-reactievoorwaarden voor ruwe lysaatgenotypering. Afkorting: dNTP = deoxynucleotiden.

CRISPR-gerichte verwijderingssite Gids RNA Combinatie Wild-type (bp) Knock-out (bp) PCR Primer Paren
∆Volledig cluster 5A(891a)+3A(892c)
5B(891a)+3A(892c)
5A(891a)+3B(892c)
5B(891a)+3B(892c)		 35,664 389
496
378
485		 891a FWD
892c omw/rev
∆892c/890/888 5A(888)+3A(892c)
5B(888)+3A(892c)
5A(888)+3B(892c)
5B(888)+3B(892c)		 2,739 478
487
467
476		 888 FWD
892c omw/rev
∆892c/890 3A(888)+3A(892c)
3B(888)+3A(892c)
3A'(888)+3B(892c)
3B(888)+3B(892c)		 2,739 710
754
699
743		 888 FWD
892c omw/rev
∆892b/892a 5A(888)+5A(892b)
5B(888)+5A(892b)
5A(888)+5B(892b)
5B(888)+5B(892b)		 2,938 554
547
573
566		 892b FWD
888 OMW
∆892b/892a/888 5A(892b )+3A'(888)
5A(892b )+3B'(888)
5B(892b )+3A'(888)		 2,938 322
278
341		 892b FWD
888 OMW
∆743 Familie 5A(892b)+3A(892c)
5B(892b)+3A(892c)
5A(892b)+3B(892c)
5B(892b)+3B(892c)		 5,015 370
389
359
378		 892b FWD
892c omw/rev
∆891 familie 5A(891 bis)+3A(891b)
5B(891a)+3A(891b)		 27,294 330
270		 891a FWD
891b omw
∆891a 5A(891a)+3A(891a)
5A(891a)+3B(891a)
5B(891a)+3A(891a)
5B(891a)+3B(891a)		 554 333
273
454
394		 891a FWD
891a omw/17

Tabel 2: CRISPR-gids RNA's die worden gebruikt om miR-888 cluster knock-out combinaties te genereren. Afkortingen: CRISPR = geclusterde regelmatig tussen elkaar geplaatste korte palindromische herhalingen; bp = basenpaar; FWD = vooruit; REV = achteruit.

Abc Volgorde Tm (°C)
888 FWD AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG 52.2
888 OMW CTGGATGATGGCCAAGACAAG 55.9
891a FWD TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA 53.9
891a omw/17 TTCATCTTGCTGCTACCTGTC 54.8
891b omw TCATCTTGCTGCTATACGTCCT 55.6
892b FWD GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA 53.5
892b omw CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC 53.5
892c FWD TGTGAGCACCTACAGGTTAG 53.9
892c omw/rev CACTCTCACTTGGCTTCATG 53.5

Tabel 3: PCR-primers die worden gebruikt voor genotypering. Afkortingen: FWD = forward; REV = achteruit; Tm = smelttemperatuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze CRISPR-genbewerkingsprocedure stelt de onderzoeker in staat om snel een heel panel van cellijnen te genereren met unieke miRNA-clusterdeletiecombinaties. De transfectie van synthetische geleidings-RNA's bestaande uit 5' en 3' genomische site-specifieke crRNA's gegloeid met synthetisch tracrRNA (1:1 molaire verhouding) in dit protocol voorkomt tijdrovende plasmidevectorsubcloning en maakt een flexibeler en high-throughput experimenteel ontwerp mogelijk met behulp van een 24-well-formaat. De generatie van cellijnen met een DOX-induceerbare Cas9 lentivirale cassette maakt strak DOX-gereguleerde en robuuste Cas9-expressie mogelijk tijdens de celtransfectie van geleide-RNA's en een snelle klaring van dit bacteriële eiwit bij dox-terugtrekking uit het kweekmedium in volgende stappen. Deze procedure vertrouwt ook op ruwe cellysaten voor PCR-genotypering, die minimaal celmateriaal vereist voor analyse en vermijdt het gebruik van dure en arbeidsintensieve silicakolom-DNA-zuiveringsmethoden of de noodzaak om nucleïnezuurconcentraties te meten met behulp van een spectrofotometer, waardoor de methoden voor de onderzoeker verder worden gestroomlijnd.

Inderdaad, de representatieve resultaten die hier werden gedeeld, toonden een succesvolle aanpassing van deze methode aan transfecterende menselijke prostaatkankercellijnen met 32 unieke gids-RNA-combinaties in een enkel experiment en het genereren van meerdere eencellige kolonie knock-outlijnen met deleties voor het hele clustergebied van ~ 35 kb miR-888; kleinere deletiecombinaties voor miR-888 clusterleden die behoren tot de miR-743- en miR-891a-families; evenals deleties voor individuele miRNA-leden binnen het miR-888-cluster. Deze workflow genereerde een waardevolle cellijnbron om het miR-888-clusternetwerk moleculair te ontleden in de context van menselijke prostaatziekte en te bepalen hoe miR-888-clusterleden functioneel overlappen of synergetisch / antagonistisch met elkaar interageren om de groei van prostaattumoren, kankeragressiviteit en medicijnresistentie te reguleren (elders te publiceren). Deze studies zullen cruciaal zijn omdat dit onderzoek zich beweegt in de richting van diagnostische en therapeutische toepassingen voor de behandeling van patiënten met geavanceerde en gemetastaseerde vormen van prostaatkanker.

Er zijn verschillende kritieke stappen in dit crispr-genbewerkingsprotocol met hoge doorvoer die onderzoekers zorgvuldig moeten overwegen bij het aanpassen van deze methode om aanvullende miRNA-clusternetwerken in andere ziektecontexten te bestuderen. Ten eerste is de belangrijkste stap in dit proces het zorgvuldige ontwerp van de gids-RNA's die het miRNA-cluster flankeren voor CRISPR-gemedicineerde verwijdering, evenals aanvullende gids-RNA's om individuele miRNA's of combinaties van miRNA-clusterleden te verwijderen. De onderzoeker moet zorgvuldig overwegen om de omliggende genen of regulerende elementen niet te verstoren, vooral als het miRNA-cluster zich in een genintron bevindt of antisense is voor een ander gen. Er zijn CRISPR off-targeting voorspellingsbronnen 24,25,26,27 beschikbaar die de onderzoeker kunnen helpen bij het kiezen van de meest discriminerende crRNA-oligonucleotiden om te synthetiseren. Deze workflow beschrijft het ontwerp van twee 5' en twee 3' crRNA's die elke gerichte miRNA-locus flankeren, waardoor vier unieke gids-RNA-combinaties kunnen worden getest in de CRISPR-transfectiestap en de kans op het genereren van de gewenste knock-out cellijn wordt vergroot. De onderzoeker heeft echter slechts één van deze gids-RNA-combinaties nodig om met succes te werken aan het verstoren van een bepaalde miRNA-genlocus.

Ten tweede moet de onderzoeker de meest geschikte methode bepalen voor het leveren van Cas9 aan de cellen voor CRISPR-genbewerking. Deze procedure gebruikte het DOX-induceerbare Cas9 lentivirale expressiesysteem, maar alternatieve benaderingen voor Cas9-eiwitproductie (bijv. Cas9-recombinant-eiwit, Cas9-mRNA-afgifte of het gebruik van conventionele Cas9-expressieplasmidevectorsystemen) kunnen eenvoudig worden aangepast voor dit protocol. Experimentele overwegingen zouden bijvoorbeeld het gebruik van Cas9-transiënte expressie kunnen dicteren versus het genereren van stabiele lentivirale expressiecellijnen, de promotor die wordt gebruikt om Cas9 aan te drijven (alomtegenwoordig, celtypespecifiek, induceerbaar) en de integratie van positieve / negatieve selectiesystemen om cas9-expressievectorafgifte aan de cellen van belang te garanderen (d.w.z. antibioticaresistentie).

Ten derde is het belangrijk om snel genotype genotype getransfecteerde cellen binnen 48-72 uur na geleide RNA-afgifte in het geval dat verlies van het miRNA-cluster de levensvatbaarheid / groei van de cellen negatief kan beïnvloeden. Bij het verwijderen van tumorbevorderende factoren zoals miR-891a in prostaatkankercellijnen, werd bijvoorbeeld opgemerkt dat deze mir-891a knock-outcellen langzamer groeiden dan onbehandelde cellen en vervolgens haalden de wild-type cellen snel de celpopulatie in. Ten slotte is het cruciaal om aanvullende validatiemethoden te integreren om miRNA-locusverwijdering tijdens het genotypische screeningsproces te garanderen, vooral voor grotere genomische deleties. Deze maatregelen omvatten het gebruik van interne PCR-genotyperingscontroles die alleen worden gedetecteerd als het wild-type allel aanwezig is en het uitvoeren van qRT-PCR-analyse op eencellige kolonies om ervoor te zorgen dat knock-outcellijnen de beoogde miRNA's niet tot expressie brengen. Al deze overwegingen zullen zorgen voor succesvolle resultaten voor de onderzoeker.

Er waren enkele duidelijke beperkingen bij het opnemen van deze CRISPR-techniek in het laboratorium. Bijvoorbeeld, ondanks de high-throughput aard van de gids RNA-transfectiestappen die in dit protocol worden beschreven om snel meerdere miRNA-clusterdeletiecombinaties te genereren, was de snelheidsbeperkende stap van deze procedure de genotypescreening en uitbreiding van cellijnen met één kolonie voor elke CRISPR-gemedieerde miRNA-deletie. Het opnemen van positieve selectiestrategieën in dit protocol zou een voordeel zijn; het zou echter nog steeds ~ 3-4 weken duren om een lijn uit te breiden van een eencellige kolonie gekweekt in een 96-well-formaat. Inderdaad, de verzameling van ten minste drie onafhankelijke single-colony cellijnen per miRNA locus knockout plus wild-type cellen zal helpen om ervoor te zorgen dat de geteste fenotypen niet te wijten zijn aan artefact / off-targeting effecten, maar dit draagt opnieuw bij aan de tijdrovende aard van deze procedure. De onderzoeker moet mogelijk ook meerdere rondes CRISPR-genbewerking uitvoeren om homozygote nulcellijnen te verkrijgen. Dit wordt vooral uitgesproken in studies met behulp van gevestigde onsterfelijke kankercellijnen die vaak een complex genomisch landschap van chromosomale herschikkingen en abnormale karyotypen bezitten.

Deze representatieve studie gebruikte bijvoorbeeld LNCaP- en PC3-afgeleide menselijke prostaatkankercellijnen om deleties te genereren voor het miR-888-cluster, in kaart gebracht op het X-chromosoom. Het was belangrijk om te erkennen dat deze van mannen afgeleide prostaatkankercellijnen abnormale karyotypen hebben en twee X-chromosomen bezaten (en PC3-cellen hebben ook partiële X-chromosoomtranslocaties op andere autosomen)31,32. Ondanks deze aandoeningen was CRISPR-genbewerking robuust genoeg om homozygote knock-outs te genereren met behulp van deze prostaatcellijnen. Er kunnen echter gevallen zijn waarin de cellijn van een onderzoeker met een abnormaal karyotype (bijv. Inserties, deleties, inversies, duplicaties) "onzichtbare mutaties" kan herbergen die de detectie van tweede (of meer) kopieën van de beoogde genlocus zullen verduisteren vanwege ontbrekende elementen die nodig zijn voor succesvolle detectie met behulp van de ontworpen PCR-primers / gids-RNA's. Dit onderstreept het belang van het verifiëren van de homozygote null CRISPR-cellijnen met behulp van onafhankelijke methoden (d.w.z. qRT-PCR, northern blot, WGS) voordat functionele testen worden uitgevoerd. Ten slotte is dit protocol ontworpen om alleen miRNA-clustercombinaties uit te schakelen die naast elkaar in kaart worden gebracht. Als een onderzoeker miRNA's wil uitschakelen die gescheiden zijn tussen andere miRNA-genen, dan zijn meerdere rondes crispr-transfecties nodig, waarvoor zorgvuldige genotypering en validatie nodig zijn.

Ondanks deze uitdagingen is de mogelijkheid om snel een compleet panel van miRNA-deletiecombinaties te genereren voor een bepaald miRNA-cluster met behulp van dit beschreven protocol een enorm voordeel ten opzichte van de bestaande methoden in de miRNA-onderzoekstoolbox. Overexpressiestudies met behulp van miRNA-mimics om de niet-coderende RNA-functie te karakteriseren, kunnen leiden tot onbedoelde artefacten of celtoxiciteiten. Evenzo kan het gebruik van antisense antimir oligonucleotideremmers om functieverlies fenotypes te bepalen moeilijk zijn, omdat antimirs meestal resulteren in een knockdown en niet in een volledige eliminatie van miRNA-activiteit. Pogingen om combinaties van miRNA-mimics of miRNA-antimirs te gebruiken om miRNA-clusternetwerksignalering op te helderen, zijn moeizaam en moeilijk te interpreteren gebleken. Daarom zal de integratie van CRISPR-genbewerkingstechnologie in het onderzoeken van hoe miRNA-leden interageren binnen een bepaald niet-coderend genomisch cluster onderzoekers in staat stellen een duidelijker begrip te krijgen van hoe niet-coderende RNA's ziektesignaleringsroutes beïnvloeden en belooft enorme implicaties te hebben op het gebied van diagnostiek en medicijnontdekking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

PC3-ML cellijnen werden vriendelijk verstrekt door Mark Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey hielp bij PCR genotypering. Dit werk werd ondersteund door een Breedan Adams Foundation Grant, een Ryan Translational Research Fund en een Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20) aan AE-K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap Fisher 14-230-225 Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Seal-Rite 1615-5500 Plasticware
24-well tissue culture plate Corning Costar  09761146 Plasticware
5x Phusion HF Buffer Thermo Scientific F-518L PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate Fisher FB012927 Plasticware
96-well tissue culture plate Falcon 08-772-2C Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal AbCam ab191468 Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062 Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine National Center for Biotechnology Information NA Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes Calbiochem CAS 589205 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter Invitrogen A50298 Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes Thermo Scientific 50001012 Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool Horizon Discovery Ltd. NA Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 Dharmacon, Inc. T-2002-02 Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher  BP231100 Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10013CV Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution Sigma-Aldrich D3072-1ML CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed Dharmacon, Inc. U-002005-20 CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		 Dharmacon, Inc. crRNA-460XXX CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL Dharmacon, Inc. VCAS11227 CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer Ensembl NA Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal Santa Cruz Biotechnology sc25778 Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit IBI Scientific IB47010 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified Gibco 16000044 Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide MilliporeSigma H9268 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane MilliporeSigma IPFL10100 Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer LI-COR 927-60001 Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 926-68070 Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 926-32211 Western blot reagent
Microcentrifuge Eppendorf  5425 R Plasticware
miRBase microRNA viewer miRBase NA Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well Invitrogen NP0321BOX Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System LI-COR CLx Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System Owl D2-BP Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) Integrated DNA Technology NA PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Scientific F530S PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x MilliporeSigma 20-188 Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade Invitrogen 25530049 PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) Thermo Scientific EN0531 PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium Gibco MT10041CV Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer Snap Gene NA Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12563029 Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler ThermoFisher Scientific 4375305 Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System Invitrogen EI0001 Equipment; Protein gel electrophoresis system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com). , Available from: https://www.snapgene.com (2022).
  20. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI). , Available from: https://www.ensembl.org (2022).
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory). , Available from: https://www.mirbase.org (2022).
  23. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon). , Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022).
  24. Tools for Guide Design and Off-Target Prediction (MIT CRISPR Design Tool from the Zhang Lab). , Available from: http://crispr.mit.edu (2022).
  25. Sangsu Bae, J. P., Kim, J. -S. Cas-OFFinder (from Sangsu Bae, Jeongbin Park, Jin-Soo Kim). , Available from: http://www.rgenome.net/cas-offinder/ (2022).
  26. Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center). , Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022).
  27. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  28. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents. , Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022).
  29. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  30. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  31. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  32. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Tags

Biologie CRISPR induceerbare Cas9 microRNA knockout miR-888 cluster
CRISPR Gene Editing Tool voor MicroRNA Cluster Network Analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, C., Quan, L., Yi, G.,… More

Chambers, C., Quan, L., Yi, G., Esquela-Kerscher, A. CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63704, doi:10.3791/63704 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter