Summary
이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.
Abstract
MicroRNA (miRNAs)는 암 및 전이의 중요한 세포 조절자 (종양 억제제, 발암 유발 인자)로 부상했습니다. 대부분의 발표 된 연구는 암에서 작은 RNA의 역할을 특성화 할 때 단일 miRNA에 중점을 둡니다. 그러나, 인간 miRNA 유전자의 ~30%는 종종 공동-발현되는 클러스터된 단위로 조직되며, 이는 비코딩 RNA 조절의 복잡하고 배위된 시스템을 나타낸다. 클러스터링된 miRNA 네트워크가 종양 성장, 암 공격성 및 약물 내성을 조절하기 위해 어떻게 협력적으로 기능하는지에 대한 명확한 과소평가는 비코딩된 작은 RNA를 클리닉으로 번역하기 전에 필요하다.
전립선암의 맥락에서 ∼35,000 bp 길이에 걸쳐 있는 유전자좌 내에 위치한 일곱 miRNA 유전자의 게놈 클러스터의 종양원성 역할을 연구하기 위해 고처리량 클러스터가 규칙적으로 간격이 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR)-매개 유전자 편집절차의 사용을 이용하였다. 이러한 접근법을 위해, 인간 암 세포주를 48시간 동안 DOX 함유 배지에서 성장시킨 독시사이클린(DOX)-유도성 Cas9 뉴클레아제에 대한 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. 세포를 후속적으로 게놈 부위와 복합체화된 합성 트랜스활성화 CRISPR RNA (tracrRNA) 올리고뉴클레오티드로 공동-형질감염시켜 전체 miRNA 클러스터를 운반하는 암 세포주의 신속한 생성을 허용하여 단일 실험 내에서 결실 및 개별 또는 조합 miRNA 유전자 클러스터 결실을 허용하였다.
이 고처리량 유전자 편집 시스템의 장점은 시간이 많이 걸리는 DNA 벡터 서브클로닝을 피할 수 있는 능력, 24-웰 포맷의 고유한 가이드 RNA 조합으로 세포를 형질감염시킬 때의 유연성, 조세포 용해물을 사용한 저비용 PCR 유전자형화입니다. 이 간소화 된 접근법을 사용하는 연구는 miRNA 클러스터 구성원 간의 기능적 중복성 및 시너지 효과 / 적대적 상호 작용을 밝혀 낼 것을 약속하며, 이는 인간 질병과 관련된 복잡한 작은 비 코딩 RNA 네트워크를 특성화하고 미래의 치료 설계를보다 잘 알리는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
인간 질병에서 비코딩 RNA의 기여도를 조사하기 위해서는 더 나은 연구 도구가 필요하다. MiRNA 조절 이상은 암 환자의 조직 및 체액(예를 들어, 혈액, 소변)에서 이러한 작은 비코딩 RNA의 발현 프로필을 비암, 건강한 개인과 비교할 때 암과 같은 인간 장애에서 종종 관찰되며, 마이크로어레이, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 및 차세대 심층 시퀀싱 기술 1,2를 채택한다. . 최근의 연구는 종양 형성, 질병 진행 및 약물 내성을 조절하는 종양 억제자, 종양형성 및 전이 인자로서 이들 miRNAs의 큰 서브세트를 특성화하였다. miRNA의 실험적 과발현 및/또는 하향조절/손실은 세포에서 기능적 및 pleiotropic 결과를 초래하며, 이러한 비코딩 RNA가 조정하는 광범위한 암 관련 활동(성장, 아폽토시스, 분화, 염색질 리모델링, 혈관신생, 상피-중간엽 (EMT) 및 MET 전이, 대사 및 면역 반응3.
MiRNAs는 단일 유전자로서 코딩되거나 게놈 클러스터에 상주하며, 이는 핵에 전사되고 생물학적으로 성숙한, 세포질4에 국소화된 22개의 뉴클레오티드(nt) miRNA 종을 생성하기 전에 광범위하게 처리된다. 이러한 작은 RNA는 전사 후 효과를 발휘하고 촉매 RNA 유도 침묵 복합체 (RISC)를 mRNA 부위로 가져 오기 위해 서열 특이적 방식으로 메신저 RNA (mRNA) 표적에 결합하는 음성 유전자 조절자로서 작용하여 mRNA 분해 및 / 또는 단백질 번역 블록을 초래합니다. MiRNAs는 동물 시스템에서 매우 풍부한 부류의 비코딩 RNA이며, 인간 게놈 내에 2,654개의 성숙한 miRNA가 존재한다(miRBase 방출 22.1)5. MiRNAs는 전형적으로 그들의 mRNA 표적에 대한 불완전한 상보성과 연관된다4. 따라서, 단일 miRNA는 수십 내지 수백 개의 별개의 mRNA 표적을 조절할 수 있고 기능적으로 광범위한 생물학적 경로에 영향을 미칠 수 있다. miRNA 기반 메카니즘의 복잡성을 부가하기 위해, 단일 mRNA는 다수의 별개의 miRNA에 의해 조절될 수 있다. 따라서 miRNA 조절 장애가 어떻게 신체의 항상성 균형을 방해하고 인간의 악성 종양을 유발하는지 조사하는 것은 어렵습니다.
대부분의 발표 된 연구는 질병 사건에서 자신의 역할을 특성화 할 때 단일 miRNA에 중점을 두었습니다. 그러나, 인간 miRNA 유전자의 ~30%는 종종 동일한 배향으로 전사되고 공동-발현되는 클러스터형 단위(전형적으로 ~10 킬로베이스[kb])로 조직되며, 이는 비코딩 RNA 조절6의 배위되고 복잡한 시스템을 나타낸다. 가장 큰 폴리시스트로닉 인간 miRNA 클러스터는 54개의 miRNA 전구체로 구성된 14q32 클러스터이다. 인간 암과 관련된 가장 잘 연구된 클러스터된 miRNA 유닛 중 하나는 비코딩 RNA, c13orf25의 인트론 3 내에 상주하는 miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 및 miR-92-1로 구성된 miR-17-92 폴리시스트로닉 클러스터이다. miR-17-92 클러스터는 조혈 악성 종양에서 자주 증폭되고 고형 종양에서 과발현되며 세포주기 진행, 아폽토시스 및 혈관신생을 촉진하는 종양원성 역할을 확립했습니다7. 또한, 종양 억제 miR-15a 및 miR-16-1 클러스터는 비코딩 유전자 Leu2의 인트론 내에 위치하여 백혈병에서 종종 결실되고 광범위한 암에서 하향조절되며, 항세포자멸사 유전자 BCL2 및 추가적인 세포 주기 진행 유전자8을 표적화함으로써 종양 성장을 차단하는 기능을 한다. miR-888 클러스터는 고급 전립선암 환자에서 상승되며 인간 염색체 Xq27.3 9,10에 위치한 7개의 miRNA 유전자(miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b 및 -891a)로 구성됩니다.
miR-888 클러스터는 Xq27-2에 걸친 HPCX1 유전자좌 (유전성 전립선암, X-linked 1) 내에 매핑되며, 이는 유전성 전립선암 가족 혈통 11,12,13,14,15,29의 연결 분석에 의해 확인되었다. 기존의 miRNA 오발현 도구를 사용하는 개별 miR-888 클러스터형 부재의 기능적 특성화-miRNA 모방체 및 안티센스 억제제-는 이들 miRNA가 전립선 종양 성장 및 침윤을 조절하는데 중첩되는 역할을 한다는 것을 나타내었다 9,10. 그러나, 이러한 실험 방법은 다중 miR-888 클러스터된 구성원이 조직 항상성 및 암 진행을 제어하기 위해 비코딩 RNA 네트워크에서 상승적 또는 길항적으로 어떻게 작용하는지를 연구하는 데 쉽게 도움이 되지 않는다. 이러한 기술된 고처리량 CRISPR 유전자 편집 기술을 사용하는 간소화된 프로토콜은 이러한 지식 갭을 메우기 위해 인간 암과 관련된 miRNA 클러스터(예를 들어, miR-888 클러스터)를 분자적으로 해부하도록 변형된다.
박테리아 CRISPR 및 CRISPR-연관 (cas) 유전자는 박테리오파지16에 대한 적응 면역을 매개한다. 이 고대 원핵 감시 시스템의 발견은 원하는 게놈 유전자좌를 쉽게 표적화하고 시험관 내 및 생체 내16,17 동물 시스템 및 세포 유형의 넓은 범위 내에서 DNA 서열 변경을 수행하는 효율적인 과학 도구로 신속하게 적응되었습니다. 이 기술은 인간 질병의 맥락에서 miRNA 네트워크를 조사하는 효과적인 방법으로서 큰 약속을 지닙니다. 이를 위해, 불멸화된 인간 전립선암 세포주(LNCaP, PC3-ML)에서 인간 염색체 X에 ~35kb에 걸쳐 있는 miR-888 클러스터를 연구하기 위해 이러한 고처리량 CRISPR 유전자 편집 프로토콜은 클러스터 구성원이 암 진행 경로를 어떻게 조정하는지 조사하기 위해 구축된다. 이 접근법은 임의의 miRNA 클러스터를 특성화하는데 적용될 수 있고, 조사자들이 단일 실험 내에서 전체 miRNA 클러스터 결실 및 개별 및 조합 miRNA 유전자 클러스터 결실을 운반하는 인간 세포주를 신속하게 생성할 수 있게 한다.
이 절차에서, 안정한 세포주는 조사자가 구성적 DOX 유도성 프로모터 TRE3G를 통해 스트렙토코커스 피오게네스 CRISPR-관련 엔도뉴클레아제 Cas9 (csn1) 유전자 발현을 조절할 수 있게 하는 독시사이클린 (DOX)-유도성 렌티바이러스 발현 시스템을 운반하는 확립된다. Tet-On 3G bipartite 시스템은 비시스트로닉 전사체로서 Tet-On 3G 유전자 및 블라스티시딘 내성 유전자 (BlastR) 둘 다의 전사를 구동하는 구성적 인간 신장 인자 1 알파 (hEF1alpha) 프로모터를 수반한다. Tet-On 3G 트랜스액티베이터 단백질은 DOX의 존재 하에 TRE3G 프로모터에만 결합하여 강력한 Cas9 전사를 유도한다. DOX가 없을 경우, 기저 Cas9 표현식이 없거나 최소한입니다. 따라서, 조사자는 DOX 철수시 신속한 CAS9 단백질 클리어런스를 위해 CRISPR 유전자 편집 단계 및 조절 동안 DOX로 보충된 배지에서 성장한 세포에서 높은 Cas9 단백질 생산을 유도할 수 있다.
이 프로토콜은 또한 전체 miRNA 클러스터를 플랭킹하는 합성 CRISPR RNA (crRNA) 올리고뉴클레오티드 표적화 영역, 개별 miRNA 헤어핀 (premiRNA) 영역, 및/또는 클러스터 내의 miRNA 유전자의 서브세트의 설계를 기술한다. 각각의 설계된 crRNA는 독특한 5'-말단 20 nt 가이드 서열 (표적화되는 관심있는 게놈 서열에 상보적임)을 함유하고, 이어서 불변의 22 nt S. pyogenes 반복 서열 (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3')은 범용 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA) 올리고뉴클레오티드18과 염기쌍을 가능하게 한다. 함께, 어닐링된 crRNA 및 tracrRNA(혼합된 1:1 비율)는 이 프로토콜에 대한 가이드 RNA로서 기능한다(도 1A). 각 실험에서, 두 개의 합성 가이드 RNA가 DOX 유도 세포로 형질감염되어 박테리아 Cas9 단백질을 게놈 DNA 부위(5' 및 3')에 연관시키고 호위시켜 제거를 위해 표적화된 miRNA 클러스터 영역을 플랭킹한다(도 1B).
야생형 S. pyogenes Cas9에 대한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열(5'-NGG-3')은 세포 게놈 내에 존재해야 하고, 가이드 RNA(17)에 의해 표적화된 20 nt DNA 서열에 바로 인접하여 위치해야 한다. PAM 서열은 결합 신호로서 작용하고, 엔도뉴클레아제 Cas9 효소의 촉매 영역을 표적화된 게놈 DNA 부위 상에 위치시키고, 이어서 PAM의 상류에 위치하는 지시된, 이중 가닥 (ds) DNA 절단을 유도한다. 세포의 DNA 복구 기계는 절단된 DNA 말단을 수리하여 완벽한 결찰을 초래할 수 있지만, 종종 비상동성 말단 접합(NHEJ)이 발생하여 수리 부위에 작은 삽입 또는 결실(indels)이 발생합니다. miRNA는 종종 인터제닉 및 인트로닉 영역 내에 위치하는 비코딩 유전자이기 때문에, 이러한 인델은 원치 않는 넌센스/오센스 돌연변이를 생성할 위험이 낮다.
이 실험에서 가이드 RNA 복합체를 코딩하는 합성 RNA 올리고뉴클레오티드 (어닐링된 crRNA 및 tracrRNA, 1:1 몰비)를 사용함으로써, 이 유전자 녹아웃 전략은 시간이 많이 소요되는 DNA 벡터 서브클로닝을 방지하고 독특한 가이드 RNA 조합을 24-웰 포맷으로 세포에 형질감염하는데 큰 유연성을 허용한다. PCR 유전자형 스크리닝을 위한 조세포 용해물의 제조는 또한 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 DNA 정제 방법을 피하면서 간소화된 단일 콜로니 세포주 생성 및 표현형 분석을 가능하게 한다. 실제로, 이 고처리량 CRISPR 유전자 편집 프로토콜은 단일 실험에서 32개의 고유한 가이드 RNA 조합으로 배양된 전립선암 세포주(LNCaP, PC3-ML)를 형질감염시키고 ~35kb miR-888 클러스터 영역 전체에 대한 결실을 운반하는 녹아웃 라인을 생성하는데 성공적으로 사용되었다; miR-743 및 miR-891a 패밀리에 속하는 miR-888 클러스터 멤버에 대한 더 작은 삭제 조합; 뿐만 아니라 miR-888 클러스터 내의 개별 miRNA 부재에 대한 결실. 이와 같은 연구는 miRNA를 치료 및 진단 도구로 클리닉에 번역하기 전에 클러스터 된 miRNA가 종양 성장, 공격성 및 약물 내성을 조절하기 위해 어떻게 협력적으로 기능하는지에 대한보다 명확한 과소 평가를 제공 할 것입니다.
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Protocol
1. CRISPR 유전자 편집을 위한 준비 및 miRNA 클러스터 녹아웃 세포주를 생성하기 위한 가이드 RNA 설계
- DNA 서열 주석 소프트웨어 프로그램(19)을 사용하여 관심 대상 miRNA 클러스터 영역(intergenic, intronic) 및 적어도 1 kB의 주변 게놈 영역의 완전한 게놈 서열을 포함하는 DNA 파일을 생성한다.
- 생성된 DNA 파일의 특징 편집 도구를 사용하여 miRNA 클러스터에 속하는 표적 miRNA 클러스터 유전자좌(인터제닉, 인트로닉) 및 각 개별 miRNA 헤어핀 서열을 표시하고 근처의 다른 코딩 및 비코딩 유전자 및/또는 조절 기능 5,20,21,22에 표시하십시오.
- 결실을 목표로 하는 miRNA 영역이 근처의 단백질 코딩 유전자, 비코딩 유전자 또는 중요한 조절 DNA 요소를 실수로 방해하지 않도록 합니다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 세포주의 게놈 복잡성(예를 들어, 염색체 복제/융합)을 고려하십시오.
- 전체 miRNA 클러스터, 개별 miRNA 헤어핀(pre-miRNA) 영역 및/또는 군집 내의 miRNA 유전자의 서브세트를 플랭킹하는 20nt의 게놈 DNA 서열을 표적화하는 합성 crRNA를 생물정보학적 가이드 RNA 설계 소프트웨어 툴(예를 들어,23). 적절한 Cas9 효소가 가이드 RNA 설계 도구에 공지되어 있는지 확인하십시오 (즉, S. pyogenes Cas9).
참고: 합성된 crRNA는 이 독특한 5'-말단 20 nt 가이드 서열(DNA 표적에 상보적)과 불변 22 nt를 포함할 것이다. S. pyogenes 반복 서열은 합성된 유니버셜 tracrRNA 올리고뉴클레오티드와의 염기 쌍을 허용한다. 함께 어닐링되면, 그들은 이 프로토콜에서 가이드 RNA로서 기능할 것이다.- 생성된 DNA 파일을 참조하여(단계 1.1.), 결실을 목표로 하는 miRNA 헤어핀/클러스터 유전자좌의 바로 상류(5') 또는 하류(3')에 상주하는 ∼150 nt의 DNA 서열을 생물정보학적 가이드 RNA 설계 소프트웨어 도구(23)로 입력한다.
참고: 설계 도구는 PAM 서열(비표적화된 DNA 가닥 상에서)에 바로 인접한 crRNA 올리고뉴클레오티드 설계에 대해 고유한 20nt 서열을 식별합니다(예를 들어, S. pyogenes Cas9 PAM 서열 NGG). 이하에 제공된 것은 mir-891a 유전자 유전자좌의 바로 상류(5') 부위(구체적으로는 대표적인 결과 섹션 및 표 1에서 논의된 5A(891a))를 표적화하는 crRNA 설계의 예이다.- 가이드 RNA 설계 소프트웨어 툴(23)을 개방한다.
- 이름 입력 창에 이름 5A(891a) 를 입력합니다 .
- DNA 서열 입력 창에서 mir-891a 전구체 유전자의 바로 상류(5')에 있는 게놈 서열 150nt를 입력합니다. 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
ATTACGTAGCTTCTTTTTTTTTTTCTAGGTT
CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3' - 특이성 확인 사용으로 표시된 상자를 선택하여 프로그램에서 계산적으로 검색된 오프 타겟팅 사이트를 제외합니다. 적절한 유기체 (즉, 인간 [호모 사피엔스])를 선택하십시오.
- 연구에 사용되는 정확한 Cas9 효소 PAM을 지정하고, 이 경우, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9-PAM:NGG를 지정하여 다음과 같은 기본 설정을 생성한다: 표적에 상대적인 PAM: 이후; 반복 순서: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; 가이드에 상대적: 3; 표적 서열 길이: 20; 목표 5' 시작에 상대적인 컷: 센스 17 안티센스 17.
- 다음 버튼을 클릭하여 합성 crRNA 합성에 대한 결과를 확인합니다.
참고: 이 예에서, 합성될 제안된 crRNA는 DNA 표적 ATACATGCTGATAGTTACAC을 인식하고 PAM:AGG에 인접하여 위치할 것이다.
- DNA 파일(단계 1.1에서 생성됨)을 참조하여 결실될 miRNA 유전자좌에 가장 근접하게 상주하고 의도된 게놈 표적에 대해 가장 높은 특이성을 보유하는 최상의 후보 crRNA 20 nt 표적 서열을 결정한다.
- 전산 오프 표적화 분석 도구를 사용하여 후보 crRNA 특이성을 평가하고 표적화된 miRNA 클러스터 관심 영역과 관련없는 게놈 유전자좌에서 잠재적인 오프 표적화 부위를 예측한다 (예를 들어,24,25,26,27).
- PCR에 의해 단일 콜로니 CRISPR 클론 세포주를 지노타이핑할 때 추후 참조에 대한 잠재적인 오프-표적화 결과를 기록한다(단계 4.2.6.).
참고: 설계된 crRNA 올리고뉴클레오티드와 게놈 표적 서열 사이에 공유되는 서열 상보성의 정도는 Cas9 효소가 그 유전자좌에서 게놈을 얼마나 선택적으로 절단하는지를 지시할 것이다. 가이드 RNA가 게놈 표적에 3' 내지 5' 방향으로 어닐링되기 때문에, DNA 표적 서열의 5' 말단에서의 미스매치(처음 8-10개 염기)는 종종 Cas9 매개된 절단을 차단할 것이다. 게놈 표적 서열이 DNA 서열의 처음 여덟 염기 내를 제외하고는 다른 게놈 유전자좌와 상동성을 공유하는 경우, 이러한 가이드 RNA는 이 부위에서 오프표적화될 가능성이 낮을 것으로 예측된다. - 각 표적 miRNA 유전자좌에 대해 네 개의 고유한 crRNA를 설계하십시오: miRNA 헤어핀/클러스터(5'A, 5'B)의 5' 즉시 상보적 DNA 서열을 표적으로 하기 위해 설계된 두 개의 crRNA와 miRNA 헤어핀/클러스터(3'A, 3'B)의 바로 3'을 표적으로 하는 두 개의 설계된 crRNA가 있습니다.
참고: CRISPR 트랜스펙션을 수행할 때(섹션 3에서), 네 개의 가능한 5' 및 3' 가이드 RNA 쌍 조합(5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B)은 단일 실험에서 성공적인 miRNA 유전자좌 결실을 생성할 확률을 증가시키기 위해 각각의 표적화된 miRNA 유전자좌에 대해 시험될 것이다. - 생성된 DNA 파일(단계 1.1)의 특징 편집 도구를 사용하여 합성할 각 설계된 crRNA에 대한 DNA 표적 서열(인접한 PAM 포함)을 표시합니다.
- 생성된 DNA 파일을 참조하여(단계 1.1.), 결실을 목표로 하는 miRNA 헤어핀/클러스터 유전자좌의 바로 상류(5') 또는 하류(3')에 상주하는 ∼150 nt의 DNA 서열을 생물정보학적 가이드 RNA 설계 소프트웨어 도구(23)로 입력한다.
- CRISPR 세포주를 지노타이핑하기 위해 표적화된 miRNA 클러스터 영역을 플랭킹하는 PCR 프라이머(앞으로, 역방향)를 설계하고 합성한다(생성된 DNA 파일에서 프라이머를 표지함).
- 밀접하게 클러스터된 또는 개별 miRNA에 대해 작은 게놈 결실을 운반하는 유전자형 세포주의 경우, 겔 전기영동을 통한 단일 PCR 반응에서 야생형(~600bp) 및 녹아웃(~300bp) DNA 단편을 모두 검출할 수 있는 Cas9 절단 부위/녹아웃 영역의 양쪽에 약 150bp에 상주하는 PCR 프라이머(앞으로, 역방향)를 설계한다.
- miRNA 전구체 조합 또는 전체 miRNA 클러스터에 대해 큰 게놈 결실을 운반하는 유전자형 분석 세포주의 경우, Cas9 절단/녹아웃 부위의 양쪽에 약 150bp 상주하는 PCR 프라이머(앞으로, 역방향)를 다시 설계한다. 표적화된 miRNA 클러스터 결실이 길이가 >4kb에 걸쳐 있는 경우, PCR 반응은 야생형 DNA 단편이 아닌 더 작은(~300bp) 녹아웃 DNA 단편만을 검출할 가능성이 높다는 점에 유의한다. 따라서, 스크리닝 과정을 돕고 동형접합성 녹아웃 세포주에 대해 검증하기 위해 내부 miRNA 클러스터 유전자의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는 추가적인 PCR 프라이머(앞으로, 역방향)를 설계한다.
2. DOX 유도성 Cas9 발현 카세트를 운반하는 안정한 렌티바이러스 세포주의 생성
참고: BSL2 절차 및 무균 기술을 사용하여 인증된 생물 안전 후드에서 모든 세포 배양 및 바이러스 작업을 수행하십시오.
- CRISPR 연구 및 바람직한 성장 배지에 적합한 세포주 유형을 결정한다.
참고: 이 프로토콜은 인간 전립선암 세포주 LNCaP(선호 배지: RPMI, 10% 태아 소 혈청 [FBS]) 및 PC3-ML(선호 배지: DMEM, 10% FBS)을 위해 개발되었다. - 블라스티시딘 "사멸" 곡선을 수행하여 블라스티시딘 내성 유전자 카세트를 운반하는 렌티바이러스 감염 세포에 대해 선택하기 위한 최적의 약물 농도를 결정한다(단계 2.3.).
- 플레이트 세포는 24-웰 플레이트의 11개 웰 내로 들어가 대략 75% 컨플루언트될 때까지 바람직한 배지에서 37°C, 5%CO2 에서 성장한다.
- 블라스티시딘 (작업 원료 1 mg / mL)을 0, 1 ~ 10 μg / mL의 최종 농도로 선호하는 배지에 희석하고 1 μg / mL 단위로 희석하십시오.
- 시드된 24웰 플레이트의 웰에 1에서 11까지 라벨을 붙입니다. 웰에서 성장 배지를 제거하고 적절한 블라스티시딘 농도로 교체하십시오.
- 7-10 일 동안 격일로 적절한 블라스티시딘 농도로 배지를 변경하십시오.
- 시간 과정 동안 매일 세포를 검사하고 5-7 일 이내에 모든 세포를 죽이는 데 필요한 최소 블라스티시딘 농도를 결정하십시오.
참고: 블라스티시딘 "킬" 곡선은 CRISPR 유전자 편집 실험에 사용된 각각의 특정 세포주에 대해 수행되어야 할 것이다.
- 세포를 DOX 유도성 Cas9 발현 카세트를 운반하는 렌티바이러스로 감염시키고, 단계 2.2에서 결정된 최적 농도를 사용하여 블라스티시딘 선택을 수행한다.
- 6-웰 플레이트의 3개의 웰에서, 시드 5 × 웰 당 10개의4개의 세포를 보유하고, 바람직한 배지에서 37°C, 5%CO2 하룻밤 동안 성장시킨다(ON).
- 다음날, DOX 유도성 Cas9 (Lenti-iCas9)에 대한 렌티바이러스 발현 벡터를 얼음 상에서 해동시킨다. 부드럽게 혼합하십시오 (바이러스 입자를 와류하지 마십시오).
참고: 렌티바이러스를 -80°C의 분취량에 보관하여 여러 번의 동결/해동 주기를 피하면 바이러스 역가와 감염 효율이 저하됩니다. - 바이러스 역가 농도를 기준으로 0.3 (MOI = 0.3)의 감염 다도에서 5 × 104 세포를 바이러스로 형질도입하는 데 필요한 부피를 계산하십시오.
- 적절한 바이러스 부피를 0.8 μg/mL 헥사디메트린 브로마이드가 보충된 무혈청 및 항생제 없는 선호 배지 250 μL(웰 당)에 피펫팅한다. 부드럽게 섞는다.
참고: 헥사디메트린 브로마이드는 바이러스 흡착 및 감염 효율을 증가시키는 것으로 밝혀진 양이온성 중합체입니다. - 매체를 분리합니다. 250 μL의 제조된 형질도입 배지를 Lenti-iCas9 바이러스 (MOI = 0.3)로 세포에 첨가하고, 37°C, 5%CO2에서 ON인큐베이션한다. (세포가 바이러스 관련 독성 효과를 나타내는 경우 배양 시간을 4-6 시간으로 단축하십시오.)
- 배지를 신선한 선호 배지로 교체하고 세포가 1-2 일 동안 회복되도록하십시오.
- 단계 2.2에 기재된 "사멸" 곡선으로부터 유래된 최적의 블라스티시딘 농도를 사용하여 10-14일 동안 감염된 세포에 대해 블라스티시딘 선택을 수행한다.
- 병행하여, 감염되지 않은 세포를 바이러스 선택을 위한 양성 대조군으로 사용되는 최적의 블라스티시딘 농도로 배지에서 성장시킨다.
- 최적의 블라스티시딘 농도로 보충된 배지를 선택 시간 과정 동안 3일마다 변경하여 죽은 세포를 제거한다.
참고: 블라스티시딘 선택에서 살아남은 세포만이 렌티바이러스 벡터를 통합할 것이다. - 블라스티시딘-선택된 렌티-iCas9 세포주를 확장한다.
참고: 각 확장 시 셀 통과 번호를 기록하십시오.- Lenti-iCas9 세포의 일부를 장기간 냉동 보관을 위해 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)로 보충된 바람직한 배지에서 동결시킨다.
- Lenti-iCas9 세포의 일부를 웨스턴 블롯9로 분석하여 가장 강력한 DOX 유도성 Cas9 단백질 수준을 나타내는 세포주를 동정하였다(단계 2.3 참조).
- 새로 확립된 Lenti-iCas9 세포주에 대해 독시사이클린 농도 곡선을 수행하여 Cas9 단백질 유도를 위한 최적 조건을 결정한다.
- 이 DOX 농축 시간 과정을 수행하기 위해 테스트 된 각 세포주에 대해 4 개의 독립적 인 6-웰 플레이트를 설정하십시오. 플레이트 5× 각 6-웰 플레이트의 웰 당 10개의 4개 세포를 혼합하고, 바람직한 배지에서 37°C, 5%CO2 에서 24시간 동안 성장시킨다.
- 바람직한 배지에 DOX (작업 스톡 1 mg/mL)를 희석하여 0, 50, 100, 150, 250 ~ 500 ng/mL의 최종 DOX 농도 곡선을 가집니다.
- 씨를 뿌린 각 6웰 플레이트의 웰에 1에서 6까지 라벨을 붙입니다. 배지를 제거하고 적절한 DOX 농도로 교체하십시오. 다음 시점까지 플레이트 1-4를 성장시킨다: 24 h, 48 h, 및 72 h DOX 유도; 및 120 시간 후 DOX 철수 (초기에 72 시간 DOX 유도).
- 적절한 방법(예를 들어, 트립신화)을 사용하여 각각의 시점에서 플레이트의 웰을 수확한다. 세포 펠릿을 -80°C에서 보관한다. 세포 펠릿을 용해물 분리 및 Cas9 웨스턴 블롯 분석을 위해 RIPA 완충액에 처리한다.
- 변성 4%-12% Bis-Tris 겔을 사용하여 DOX 유도 시간 코스의 각 샘플에 대해 40 μg의 세포 용해물을 실행하고 단백질을 면역블롯 막으로 옮긴다.
- 면역블롯 막을 Cas9에 대한 일차 항체와 혼성화시켜 160 kDa 단백질을 검출한다. GAPDH (37 kDa)와 같은 하우스 키핑 유전자를 사용하여 Cas9 수준을 정상화하십시오.
- 웨스턴 블롯 결과에 기초하여, Lenti-iCas9 세포주에서 Cas9를 유도하기 위한 최적의 DOX 농도를 결정한다.
참고 :이 시간 과정은 또한 Cas9 표현이 DOX 제거 후 120 시간 동안 얼마나 엄격하게 규제되는지 밝힐 것입니다. - CRISPR 형질감염을 최적화하기 위해 강력한 Cas9 단백질 발현을 나타내는 Lenti-iCas9 세포주에 대한 단일 세포 콜로니를 확립한다 (섹션 3).
3. 고처리량 포맷을 사용하여 세포의 Cas9 유도 및 합성 가이드 RNA 형질감염에 의한 CRISPR 반응 수행
참고: 워크플로우 다이어그램은 그림 1에 나와 있습니다.
- 종이에, 전체 miRNA 클러스터, 다양한 클러스터된 miRNA 유전자 조합, 및 개별 miRNA 클러스터 구성원을 표적화하는 24-웰 플레이트의 각 웰로 형질감염될 crRNA 쌍 조합을 지도화한다.
- 지도에서 표적 miRNA 유전자좌당 네 개의 웰을 라벨링한다. 각각의 웰이 형질감염 반응을 나타내게 하고, 원하는 miRNA 녹아웃 게놈 유전자좌 및 tracrRNA(어닐링된 1:1 몰비)의 5' 및 3'에 위치된 두 개의 독특한 crRNA를 갖는다.
- 네 개의 표지된 웰 각각이 형질감염을 위한 독특한 crRNA 쌍을 나타내는지 확인하십시오 (예를 들어, 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
참고: 두 개의 5' crRNA와 두 개의 3' crRNA가 각각의 표적화된 miRNA 유전자좌(섹션 1)를 플랭킹하도록 설계하면 형질감염 반응에서 네 개의 가능한 5' 및 3' 가이드 RNA 쌍을 생성할 수 있습니다.
- Lenti-iCas9 세포주를 최적화된 DOX 농도를 함유하는 바람직한 배지에24-웰 플레이트의 5 x 10 4 세포/웰로 플레이트화한다(단계 2.4에서 결정됨). 세포를 37°C, 5% CO2에서 24-48시간 동안 성장시켜 Cas9 단백질 발현을 유도하였다.
- Lenti-iCas9 세포를 제조된 5' 및 3' 가이드 RNA로 형질감염시킨다.
- 합성된 crRNA 및 tracrRNA 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제가 없는 물로 재구성하여 10 μM의 스톡 농도로 -80°C에서 장기간 보관한다.
- 단계 3.1.에서 설계한 실험 맵에 기초하여 표적화된 miRNA 유전자좌당 네 개의 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브를 라벨링하고, 네 개의 가능한 5' 및 3' crRNA 쌍 조합을 나타낸다(5'A+3'A; 5'A+3'B; 5'B+3'B).
- 각 튜브에서, tracrRNA와 독특한 crRNAs(5' 및 3')의 1:1 몰비를 함께 혼합하여 다음 반응(최종 부피 10 μL)을 사용하여 2 μM 가이드 RNA 복합체를 형성하였다:
- 2.5 μL의 tracrRNA (10 μM 스톡), 1.25 μL의 5' 위치된 crRNA (10 μM 스톡), 1.25 μL의 3' 위치된 crRNA (10 μM 스톡), 및 5 μL의 10 mM 트리스-HCL pH 7.5를 1.5 mL 원심분리 튜브에 첨가한다. 혼합하기 위해 16,000 × g 에서 30 s 동안 마이크로원심분리. 실온(RT)에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 각 튜브에, 40 μL의 환원된 혈청 배지 (예를 들어, Opti-MEM)를 10 μL의 가이드 RNA 복합체 반응 (50 μL 총 부피)에 첨가한다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞으십시오.
- 깨끗한 1.5 mL 원심분리 튜브에서, 2 μL의 형질감염 시약 28 (참고 3.3.5.1 참조) 및48 μL의 환원된 혈청 배지 (예를 들어, Opti-MEM, 50 μL의 최종 부피)를 위아래로 피펫팅함으로써 부드럽게 혼합한다. RT에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 시약 (2 μL) 및 환원된 혈청 배지 (예를 들어, Opti-MEM, 48 μL) 양을 형질감염시킬 웰의 수에 의해 곱하고, 약간의 피펫팅 부정확성을 설명하기 위해 10% 추가 부피를 더함으로써 형질감염 시약의 마스터 믹스를 제조한다.
참고: 작은 RNA 및 CRISPR RNA 올리고뉴클레오티드 형질감염뿐만 아니라 세포주 유형28에 최적화된 형질감염 시약을 선택하십시오.
- 시약 (2 μL) 및 환원된 혈청 배지 (예를 들어, Opti-MEM, 48 μL) 양을 형질감염시킬 웰의 수에 의해 곱하고, 약간의 피펫팅 부정확성을 설명하기 위해 10% 추가 부피를 더함으로써 형질감염 시약의 마스터 믹스를 제조한다.
- 50 μL의 가이드 RNA 믹스를 함유하는 각 튜브에 (단계 3.3.4로부터), 희석된 트랜스펙션 시약 50 μL를 첨가한다 (단계 3.3.5로부터). 혼합물을 천천히 위아래로 한 번 피펫하여 혼합하십시오. RT에서 20분 동안 인큐베이션한다.
- DOX로 보충된 항생제가 없는 배지 400μL(최적 농도)를 가이드 RNA/형질감염 믹스 100μL가 들어있는 각 튜브에 추가합니다. 부드럽게 피펫을 섞는다.
- DOX 유도 Lenti-iCas9 세포로부터 배지를 제거한다(단계 3.2). 24-웰 플레이트 실험 맵을 기반으로 500μL의 배지/DOX/가이드 RNA/트랜스펙션 믹스를 추가합니다(단계 3.1.). 형질감염된 세포를 37°C, 5%CO2에서 48시간 동안 인큐베이션한다.
- 배지를 DOX가 없는 신선한 선호 배지로 교체한다(세포로부터 Cas9 단백질을 제거하기 위해). 세포를 37°C, 5% CO2에서 또 다른 24-48 h 동안 회수하도록 허용한다.
- 형질감염된 세포를 수확(trypsinization)하고 지노타이핑 및 단일 세포 희석을 준비한다.
주: 세포는 형질감염된 CRISPR 유전자 편집 및 형질감염되지 않은 야생형 세포를 함유하는 혼합 집단을 나타낸다. 이 단계는 단일 세포 콜로니 확장에 시간/자원을 투자하기 전에 CRISPR 편집의 효율성을 결정합니다.- 세포를 1 mL의 인산완충식염수(PBS)로 1x 세척한다. 세포를 37°C, 5%CO2 에서 5분 동안 100 μL의 트립신으로 인큐베이션하고, 세포를 배지 1 mL를 함유하는 깨끗한 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
- 세포를 20°C에서 200 × g 에서 5분 동안 마이크로원심분리하여 혼합하고 역전시킨다. 배지를 제거하고 세포 펠릿을 PBS 1 mL에 재현탁시켰다.
- 세척된 세포를 20°C에서 200 × g 에서 5분 동안 마이크로원심분리한다. PBS를 제거하고 세포 펠릿을 150 μL의 바람직한 배지에 재현탁시켰다.
- 혈구측정기 또는 자동화된 세포 계수 도구를 사용하여 재현탁된 150 μL의 마이크로리터당 세포 수를 결정한다.
- 150 μL의 재현탁된 세포를 세 부분으로 분리한다.
- 형질감염된 세포(50 μL)의 1/3을 배지에 플러스 10% DMSO(최종 부피 150 μL)를 향후 확장/장기 보관을 위해 냉동 상태로 동결시킨다.
- 형질감염된 세포(50 μL)의 1/3을 유전자형을 위해 깨끗한 0.2 mL PCR 튜브로 옮긴다.
- 세포를 4°C에서 200 × g 에서 5분 동안 마이크로원심분리하고 배지를 제거하였다.
- 세포 펠릿을 100 μL의 PBS에 재현탁시킨다.
- 세포를 4°C에서 200 × g 에서 5분 동안 마이크로원심분리하고 PBS를 제거하였다. 혼합-집단 세포 펠릿을 -80°C에서 장기간 저장한다.
- 섹션 4의 워크플로우를 사용하여 지노타이핑을 위한 세포 펠릿을 처리합니다.
- 희석을 위해 최종 1/3 세포(50 μL)를 준비하고, 96-웰 플레이트 포맷으로 도금하여 단일 세포 콜로니를 생성한다.
- 단계 3.7.의 세포 카운트에 기초하여, 96-웰 플레이트의 웰 당 100 μL의 배지에서 10, 5, 2 및 1 세포(들)를 달성하는 데 필요한 희석물을 계산한다.
- 12-채널 다중 피펫터 및 멸균 시약 저장소를 사용하여, 웰당 희석된 세포 100 μL를 각 희석물(웰당 10, 5, 2 또는 1 셀)에 대해 플레이트의 2행(총 24웰)에 첨가한다. 세포가 단일 세포 콜로니 확장을위한 합류점으로 성장할 때까지 4-6 주를 허용하십시오. 매주 광학 현미경으로 세포를 관찰하고 콜로니가 단일 또는 다중 세포 콜로니를 나타내는지 확인하십시오.
- 지노타이핑을 위해 ~10-15개의 단세포 콜로니를 수집한다(섹션 4). 각각의 표적화된 miRNA 유전자좌에 대해 적어도 세 개의 독립적인, 녹아웃, 단일 세포 콜로니 라인을 동정한다. 야생형 단일 세포주를 대조군으로 유지한다.
참고: 스크리닝 번호는 세포주 유형 및 miRNA 녹아웃 표현형이 세포 성장/생존력에 미치는 영향에 따라 달라집니다.
4. 조세포 용해물을 이용한 CRISPR 세포주의 PCR 유전자형 분석
- 96-웰 플레이트의 거의 합류하는 우물에서 개별적인 단일 세포 콜로니를 수확하십시오.
참고: 이 단계에 설명된 배지/PBS의 제거는 생물안전 캐비닛의 진공 흡입기를 사용하여 수동으로 수행할 수 있지만 교차 오염을 피해야 합니다. 흡인 시 96-웰 플레이트의 각 웰에 대해 새로운 멸균 "노란색" 200 μL 피펫만 팁을 사용하고, 여기서 교환된 각 노란색 팁은 진공 흡인기에 부착된 멸균 유리 목초지 피펫의 끝에 단단히 배치된다.- 웰을 1x 100 μL의 PBS로 세척한다. PBS를 흡인한다.
- 50 μL의 트립신을 첨가하고, 37°C, 5% CO2에서2-5분 동안 인큐베이션한다.
- 부드럽게 위아래로 피펫팅하고 재현탁된 세포를 배지 1 mL가 들어있는 1.5 mL 원심분리 튜브 내로 옮긴다.
- 세포를 20°C에서 200 × g 에서 5분 동안 마이크로원심분리기에서 부드럽게 펠릿화하여 혼합한다.
- 배지를 제거하고 PBS 1 mL를 첨가한다. 튜브를 부드럽게 흔들어 펠릿을 파괴하고 여러 번 뒤집어 혼합하십시오.
- 20°C에서 200 × g 에서 5분 동안 마이크로원심분리하여 세포를 펠릿화하였다.
- PBS를 제거하고 펠렛을 300 μL의 신선한 PBS에 재현탁시켰다.
- 300 μL 샘플을 두 부분으로 나눕니다.
- 200 μL의 세포(펠렛의 2/3)를 1 mL의 바람직한 배지를 함유하는 24-웰 플레이트의 웰로 옮긴다. 유전자형이 검증되면, 이들 세포를 사용하여 기능적 분석을 위해 CRISPR 매개 녹아웃 세포주를 확장시킨다.
- 100 μL의 세포 (펠렛의 1/3)를 0.2 mL PCR 튜브로 옮긴다. 4°C에서 3,000 x g 에서 5분 동안 마이크로원심분리한다. PBS를 제거합니다. 펠렛을 -80°C에서 보관한다.
- 단계 1.3에서 설계된 PCR 프라이머를 사용하여 유전자형 분석 및 서열 분석을 위한 조세포 용해물을 준비한다. 야생형 양성 대조군으로서 사용하기 위해 이들 실험에서 형질감염되지 않은 세포로부터 제조된 세포 용해물을 포함시킨다.
- 세포 펠릿을 4μL의 5x DNA 중합효소 완충액( 물질 표 참조, 최종 농도 1x 참조), 프로테이나제 K 1μL(20ng/mL 스톡), RNase A 1μL(10ng/mL 스톡), 뉴클레아제 프리 물 20μL까지 재현탁한다.
- 세포를 PCR 프로그램을 사용하여 열순환기에서 용해시킨다: 30분 동안 56°C 및 5분 동안 96°C. 세포 용해물을 -20°C에서 저장한다.
- 가이드 RNA 5' 및 3' 가이드 RNA 표적 부위를 플랭크하는 설계된 PCR 프라이머(앞으로, 역방향)를 이용하여 PCR 반응을 수행한다(표 1).
참고: DNA 중합효소 완충액 및 열순환기 조건은 PCR 반응에 사용되는 Taq DNA 중합효소에 따라 달라집니다. 이 프로토콜은 Phusion HF DNA 중합효소에 대해 최적화되었다.- 5x DNA 중합효소 버퍼 5 μL, 0.5 μL의 정방향 PCR 프라이머 (10 μM 스톡), 0.5 μL의 역방향 PCR 프라이머 (10 μM 스톡), 0.5 μL의 10 mM dNTPs, 0.25 μL의 DNA 중합효소, 1-4 μL의 세포 용해물, 및 25 μL의 뉴클레아제가 없는 물.
- 프로그램을 사용하여 열순환기에서 PCR 반응을 실행한다: 98°C에서 3분 동안, 98°C의 35 사이클을 10 s, 15 s에 대해 62°C, 15 s에 대해 72°C, 그리고 나서 10분 동안 72°C. 4°C에서 유지하십시오. 참고 4.2.3을 참조하십시오. 위.
- PCR 산물을 전기영동 분석을 위해 1% 아가로스 겔 상에 로딩한다.
- 녹아웃(및 야생형) 유전자형에 대해 예측된 분자 크기의 단리된 PCR 단편으로부터 DNA를 추출한다. DNA 시퀀싱을 위해 샘플을 준비합니다.
- CRISPR 반응이 성공적이었음을 검증하고, 분리된 PCR 단편의 DNA 시퀀싱을 수행하여 Cas9 절단 부위를 확인하고 miRNA 유전자좌 결실을 확인한다.
- CRISPR에 의해 표적화된 각각의 miRNA 유전자좌에 대해 적어도 세 개의 독립적인 녹아웃 세포주를 단리한다. 야생형(및 이형접합체) 세포주를 보유하여 하류 기능 연구에서 대조군으로 사용한다.
- qRT-PCR 또는 노던 블롯 분석을 수행하여 녹아웃 세포주가 결실된 유전자좌에 대해 성숙 miRNA를 발현하지 않는지 확인합니다.
참고: 전체 게놈 시퀀싱(WGS)은 CRISPR 유전자 편집 및 오프 타겟팅을 검증하는 가장 확실한 방법입니다. - 계산적으로 예측된 PCR에 의한 CRISPR 오프 타겟팅 효과를 테스트합니다 (1.2.3 단계). 24,25,26,27.
- 광범위한 단일 세포 콜로니 스크리닝이 이형접합체 유전자형만을 초래하는 경우, 단일 세포 이형접합 라인에서 가이드 RNA 형질감염을 반복한다.
참고: 동형접합성 녹아웃 세포주를 얻을 수 없는 것은 추가 분석이 필요한 부모 세포주의 miRNA 손실 또는 고유한 게놈 복잡성(예: 염색체 복제/융합)으로 인한 치명적인 효과를 나타낼 수 있습니다.
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Representative Results
이 고처리량 CRISPR 결실 프로토콜은 전립선암의 맥락에서 연구된 miR-888 클러스터를 표적화하는 합성 올리고뉴클레오티드 가이드 RNA와 함께 Cas9 유도성 LNCaP 및 PC3-ML 인간 암 세포주의 형질감염을 사용하여 성공적으로 채택되었다. miR-888 클러스터는 발현 프로파일링 스크린에서 저등급 및 비암 환자 9,10명에 비해 고등급 질환을 가진 전립선암 환자에서 상승되는 것으로 초기에 확인되었다. 35,124 bp에 걸친 miR-888 클러스터는 인간 염색체 Xq27.3 상의 7개의 miRNA(miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b 및 -891a)로 구성된다(그림 2A). 이 유전자좌는 HPCX1 (유전성 전립선 암, X 연결 1, Xq27-28) 내에 있으며, 이는 유전성 전립선 암11,12,13,14,15,29와 관련이 있습니다. miR-888, -890, -892a, -892b, 및 -892c는 서열 상동성을 공유하고, 포유동물-보존된 miR-743 패밀리에 속한다. 클러스터 멤버 miR-891a 및 miR-891b는 단지 서로 서열 상동성을 공유하고, 영장류 특이적 miR-891 패밀리에 속한다. miR-888 클러스터의 게놈 조직은 영장류에 걸쳐 보존되며, 이는 중요한 신호전달 네트워크(30)의 기능적 보존을 의미한다.
개별 miR-888 클러스터 부재 활성을 평가하기 위한 실험적 과발현(miRNA 모방) 및 억제(안티센스 올리고뉴클레오티드) 연구를 사용한 이전 연구는 Matrigel Boyden 챔버 어세이를 사용하여 전립선암 세포 침습성을 증진시키는 모든 miR-888 클러스터 구성원에 대해 중첩되는 역할을 밝혀냈다 9,10. 가장 주목할 만하게, miR-888 및 miR-891a는 유사하게 기능하여 전립선 세포 성장 (WST-1 분석)을 유도하고, 마우스 이종이식편에서 전립선 종양 부하를 가속화하고, 공통 표적 (예를 들어, TIMP-2)9,10을 조절한다. 그러나이 작업은 miR-888 클러스터 멤버 간에보다 복잡한 상호 작용을 제안했습니다. 예를 들어, miR-888 및 miR-891a는 PC3-N 전립선 세포 증식 촉진에 상승 효과를 보인 반면, miR-890 및 miR-892c 모두 WST-1 검정9를 사용하여 성장 억제 효과를 나타냈다. 따라서, 이 고처리량 CRISPR 프로토콜은 전립선암의 맥락에서 miR-888 클러스터 네트워크를 유전적으로 조사하기 위해 사용되었다.
CRISPR Cas9 유전자 편집을 위한 설명된 워크플로우(도 1)는 24-웰 포맷을 사용하는 단일 실험에서 32개의 고유한 CRISPR 가이드 RNA 형질감염 반응을 시험할 수 있게 하였다. 이 프로토콜은 전체 miR-888 클러스터, 특이적 miRNA 클러스터 멤버 조합 및 개별 miRNA 부재에 대한 결실을 수반하는 인간 전립선암 녹아웃 세포주의 패널의 성공적인 동정을 가져왔다. 안정한 유도성 Cas9 세포주의 생성이 최초로 확립되었다. 간략하게, PC3-ML 및 LNCaP 인간 전립선암 세포를 DOX 유도성 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 렌티바이러스 벡터(Lenti-iCas9; EditR 유도성 렌티바이러스 hEF1aBlastCas9 뉴클레아제 입자; MOI 0.3) 동안 6 h (LNCaP) 또는 하룻밤 (PC3-ML) 동안 바이러스 독성에 대한 내재된 세포주 감수성에 의존한다.
감염된 세포주는 이어서 블라스티시딘 선별 (7.5 μg / mL) 및 단일 세포 콜로니 확장을 거쳤다. 웨스턴 블롯 연구는 DOX 유도 시간 과정에 기초하여 가장 강력한 Cas9 발현을 나타내는 단일 콜로니 PC3-ML 및 LNCaP Lenti-iCas9 세포주를 선택하는데 사용되었다(도 2A). 이러한 렌티바이러스 Cas9 유도성 시스템은 단단히 조절되었고, 120시간 동안 DOX 철수시, 대부분의 Cas9 단백질이 세포로부터 제거되었다(도 2A). DOX 농도 곡선은 250 ng/mL DOX가 이러한 Lenti-iCas9 전립선 세포주에서 강력한 Cas9 단백질 발현을 유도하는 최적의 용량임을 확인했습니다(도 2B). 온라인 crRNA 설계 도구(23)를 사용하여, 고유한 crRNA(각각 계획된 miRNA 녹아웃 유전자좌를 플랭킹하는 두 개의 5' 및 2개의 3' crRNAs)가 네 개의 가능한 5' 및 3' 가이드 RNA 조합을 허용하도록 설계되었다. miR-743 제품군 또는 miR-891 제품군 내의 더 작은 클러스터 조합; 개별 miRNA 결실 (miR-888, -891a) 뿐만 아니라 (도 3A). CRISPR 실험을 수행할 때, 인간 전립선암 Lenti-iCas9 세포주를 Cas9 발현을 유도하기 위해 48시간 동안 250 ng/mL DOX가 보충된 배지에서 성장시켰다.
이어서, 세포를 5' 및 3' 게놈 부위 특이적 crRNAs의 독특한 세트로 복합체화된 합성 범용 tracrRNA 복합체(1:1 몰비)로 24-웰 플레이트 포맷으로 형질감염시켰다(표 2). DOX를 형질감염 후 48시간 후에 세포 배양 배지로부터 제거하여 전립선암 세포로부터 Cas9 단백질을 제거하였다. 웰을 48시간 후(형질감염 후 96시간) 수확하고, 수확된 각 세포 펠릿의 3분의 1을 조세포 용해물을 사용하여 PCR 유전자형을 위해 제조하였다(표 3). PCR 반응의 겔 전기영동 분석은 녹아웃 유전자형을 나타내는 예측된 DNA 단편 크기가 각각의 CRISPR 형질감염에 대해 증폭되었음을 나타내었다(도 3B). 이들 단리된 녹아웃 PCR 단편의 DNA 시퀀싱은 형질감염된 5' 및 3' 가이드 RNA가 PAM 부위의 상류에서 Cas9 절단/라이게이션을 지시하고 표적화된 miRNA 유전자좌의 게놈 손실을 검증한다는 것을 확인하였다 (대표적인 예는 도 4C에 나타남). miR-888 클러스터가 염색체 X의 인터제닉 영역 (단백질 코딩 유전자와는 거리가 멀다)에 상주하기 때문에, NHEJ로 인해 Cas9 절단 부위에서 종종 INDEL을 보유하고있는 녹아웃 세포주가 하류 인공 효과를 일으킬 것으로 예상되지 않았다.
CRISPR 형질감염 반응이 성공적이었지만(도 3B), 형질감염된 세포는 형질감염된(knockout) 및 형질감염되지 않은(야생형) 세포의 혼합된 세포 집단을 나타내었다. 이 집단은 또한 표적화된 miRNA 유전자좌에 대해 동형접합성 및 이형접합체 결실을 운반하는 세포의 혼합물을 나타내었다. LNCaP 및 PC3 전립선암 세포주는 두 개의 X 염색체31,32를 포함하는 비정상적인 핵형을 소유한 남성으로부터 유래된다. 따라서, 각 세포 형질감염 반응의 일부를 96-웰 플레이트 포맷으로 연속 희석하여 단일 세포 콜로니 라인을 얻었다. 이들 콜로니를 PCR에 의해 스크리닝하여 표적화된 miRNA 유전자좌의 모든 카피가 결여된 동형접합성 세포주를 선택하였다.
이 절차는 과거 데이터가 종양 세포 성장 및 질병 공격성을 촉진시키는 miR-888 클러스터에 대한 역할을 나타냈기 때문에 적시에 따르는 것이 중요했습니다. miR-888 클러스터 구성원에 대한 CRISPR 결실을 운반하는 암 세포는 야생형 세포보다 느리게 성장할 것으로 예측되었다. 유효한 우려는 시간이 지남에 따라 miRNA 녹아웃과 야생형 세포의 혼합 집단을 포함하는 가이드 RNA 형질감염된 웰이 야생형 세포가 배양물에서 손상된 돌연변이 세포보다 빠르게 경쟁하게 될 것이라는 것이었다. 이것은 발생하는 것으로 주목되었고, 특히 매우 공격적인 PC3-ML 세포주를 사용한 실험에서 두드러졌다. 따라서, 단일 세포 콜로니 라인 또는 냉동 저장을 위한 세포 준비를 생성하기 위해 연속 희석을 수반하는 단계는 혼합 집단 샘플에서 녹아웃 세포를 보존하기 위해 CRISPR 형질감염 실험을 수행한 후 48-72 h 이내에 수행되었다.
miR-888 클러스터에 대한 CRISPR 워크플로우에서 가장 힘든 부분은 동형접합성, 단일 세포 콜로니 miRNA 결실의 생성이었다. 이 과정에서 한 가지 과제는 배양된 LNCaP 및 PC3-ML 세포가 일반적으로 단일 세포 밀도로 플레이팅될 때 잘 번성하지 않았다는 것이었다. 또한, 세포 성장은 miR-888 클러스터 부재의 조합 손실시 표현형적으로 손상된 것으로 나타났다 (및 세포주의 공격성과 상관관계가 있다). 따라서, 특정 miRNA 유전자좌 조합을 표적으로 하는 일부 형질감염 반응의 경우, 유전자형을 위한 충분한 단일 세포 콜로니 라인을 생성하기 위해 추가적인 세포 희석물(96-웰 포맷 사용)이 요구되었다. 전기영동 겔 이미징에 의해 단일 세포 콜로니의 유전자형을 스크리닝할 때, 녹아웃 PCR 단편과 비교하여 야생형의 밴드 강도를 비교하고, 세포주가 이형접합체(동일 밴드 강도) 또는 다세포 콜로니(불평등 밴드 강도)를 나타내는지를 결정하는 것이 도움이 되었으며, 이는 단일 세포 희석의 추가 라운드로부터 이익을 얻을 것이다. 세포 콜로니가 비정상적인 크기의 PCR 단편을 보유하고 야생형 또는 녹아웃 유전자형과 일치하지 않는 것으로 밝혀진 경우, 이들 라인은 연구에서 제거되었다.
야생형 및 녹아웃 유전자형에 대해 일관된 단리된 PCR 단편의 DNA 시퀀싱을 각각의 확립된 단일 세포 콜로니에 대해 재검증하고 독립적인 방법(즉, QRT-PCR, WGS)을 사용하여 확인하였다. 이들 실험에서 동형접합성 널 세포주를 생성하는 전형적인 효율의 측면에서, 이것은 표적화된 miRNA 유전자좌 및 사용된 세포 유형에 따라 다양하였다. 예를 들어, LNCaP를 사용하여 단일 콜로니 mir-891a 녹아웃 라인을 얻는 효율은 30%였지만 PC3-ML 세포에서는 ~7%로 떨어졌다. 이러한 차이는 내재된 세포 유형 차이 때문일 수 있다(예를 들어, PC3-ML 세포는 LNCaP 세포보다 더 높은 분열 속도/전이 전위를 갖는다). CRISPR 효율 차이는 또한 miRNA 손실의 기능적 영향을 반영할 수 있고(예를 들어, miR-891a는 세포 성장 및 공격성 9,10을 촉진함), 따라서, 녹아웃 표현형은 PC3-ML과 같은 보다 공격적인 세포주에서 확대될 수 있다. miR-888 클러스터의 더 큰 miRNA 유전자좌 결실을 위한 단일 콜로니 라인을 획득하는 것은 감소된 효율을 나타내었다. 우리는 이것이 DNA의 더 큰 영역을 녹아웃했기 때문인지 또는 전립선 암 세포에서 miR-888 구성원의 필수적이고 겹치는 기능적 역할을 강조했기 때문인지 여부를 결정할 수 없었습니다.
이 워크플로우로부터 생성된 단일 세포 콜로니-확장 녹아웃 miR-888 클러스터 세포주의 상세한 설명 및 표현형 분석은 진행 중이며 다른 곳에 공개될 예정이다. 이들 CRISPR 유전자 편집 연구에서 생성된 miRNA 결실의 대표적인 결과로서, 개별 mir-891a 결실을 운반하는 LNCaP 전립선암 세포에 대한 소견이 제시된다. 단세포 콜로니를 PCR에 의해 유전자형화하고 서열을 검증하였다(도 4A-C). 비정상적으로 크기가 큰 PCR 단편을 나타내는 세포주는 분석되지 않았다 (예를 들어, 도 4D에 나타낸 클론 L14 H7). 일단 mir-891a 유전자좌에 대한 녹아웃 및 야생형 단세포 콜로니가 얻어지면, 기능적 연구가 수행되었다. 과거의 연구는 miR-891a (miRNA 모방 렌티바이러스 벡터)의 과발현이 전립선 세포 성장을 유도한다는 것을 보여 주었고9 따라서 miR-891a 손실은 상호 효과를 나타낼 것으로 예측되었습니다. mir-891a 녹아웃과 야생형 세포를 비교한 WST-1 증식 분석은 이러한 가설을 확인하였고, miR-891a 손실은 느린 성장을 가져왔다(도 4D, E).
그림 1: miRNA 클러스터 결실을 생성하기 위한 CRISPR 유전자 편집 워크플로우. (A) 가이드 RNA는 어닐링된 합성 crRNA 및 tracrRNA 올리고뉴클레오티드(혼합 1:1 몰비)로 구성됩니다. 상기 crRNA 올리고뉴클레오티드는 표적화된 게놈 DNA 부위에 상보적인 독특한 5'-말단 20 nt 가이드 서열(황색)을 함유하도록 설계되고, 이어서 tracrRNA 올리고뉴클레오티드와 염기쌍을 이루는 불변의 22 nt 스트렙토코커스 pyogenes 반복 서열(녹색)이 뒤따른다. 빨간색 화살표는 PAM의 전형적으로 3 nt 상류에 위치한 Cas9 효소 이중 가닥 DNA 절단 부위를 나타낸다. (B) 이 실험 워크플로우는 24-웰 플레이트의 단일 웰을 묘사한다. DOX 유도성 Cas9 렌티바이러스 벡터(Lenti-iCas9, MOI 0.3)로 감염된 세포는 Cas9 단백질 발현을 유도하기 위해 48시간 동안 DOX가 있는 배지에서 성장한다. 두 개의 합성 가이드 RNA (crRNA의 혼합 1:1 몰비::tracrRNA)는 Cas9-유도 세포로 형질감염된다. 가이드 RNA는 Cas9를 게놈 DNA 부위 (5' 및 3')로 호위시켜 제거를 표적으로 하는 miRNA 클러스터 영역을 플랭킹한다. 세포는 PCR 유전자형 분석 및 하류 표현형 분석을 위한 단일 세포 콜로니를 생성하기 위해 96-웰 포맷을 사용하여 희석을 위해 형질감염 후 48시간 동안 제조된다. 약어: CRISPR = 클러스터링된 규칙적으로 간격이 짧은 팰린드로믹 반복; miRNA = 마이크로RNA; crRNA = CRISPR RNA; tracrRNA = 트랜스-활성화 CRISPR RNA; nt = 뉴클레오티드; Cas9 = CRISPR-관련 엔도뉴클레아제; PAM = 프로토스페이서 인접 모티프; DOX = 독시사이클린; MOI = 감염의 다양성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 타이트한 Cas9 단백질 조절을 나타내는 독시사이클린 유도성 Cas9 렌티바이러스 카세트를 담지한 암 세포주. (A) 웨스턴 블롯 분석은 Lenti-iCas9 벡터에 감염된 인간 전립선암 PC3-ML 세포주(EditR 유도성 렌티바이러스 hEF1aBlastCas9 뉴클레아제 입자, MOI 0.3)를 250ng/mL DOX를 함유하는 배지에서 48시간 동안 성장하여 최적의 Cas9 단백질 수준을 나타냈다는 것을 보여주었다. Cas9 발현은 GAPDH 발현으로 정규화되었다. (b) 48시간 및 120시간 동안 250ng/mL DOX가 있는 배지에서 성장한 PC3-ML 세포는 강력한 Cas9 단백질 발현을 보였다. 120 h (120 h post) 동안 배지 (-DOX)로부터의 DOX 제거는 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정 된 바와 같이 Cas9 단백질 클리어런스를 초래했다. LNCaP Lenti-iCas9 세포주를 생성할 때 유사한 결과가 얻어졌다(도시되지 않음). 약어: CRISPR = 클러스터링된 규칙적으로 간격이 짧은 팰린드로믹 반복; Cas9 = CRISPR-관련 엔도뉴클레아제; DOX = 독시사이클린; MOI = 감염의 다중성; GAPDH = 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 단일 실험에서 다중 miR-888 클러스터 결실 조합을 생성하기 위한 고처리량 CRISPR 실험 설계. (A) 인간 염색체 Xq27.3 상에 위치한 miR-888 클러스터의 다이어그램으로, 포유동물 보존된 miR-743 패밀리 멤버 mir-892c, -890, -888, -892a, 및 -892b(블루 박스) 및 영장류-특이적 miR-891 패밀리 멤버 miR-891a 및 -891b(마룬 박스)를 나타낸다. 독특한 합성 crRNA 올리고뉴클레오티드 (녹색 화살표)를 사용하여 miR-888 클러스터 넉아웃 조합을 생성하였다. 정방향 및 역방향 PCR 프라이머 (작은 적색 사각형)를 유전자형 세포 및 녹아웃에 대해 스크리닝하도록 설계하였다. (B) 이 대표적인 결과는 단일 실험에서 다양한 miR-888 클러스터 녹아웃 조합을 표적으로 한 트랜스펙션된 PC3-ML 세포(Lenti-iCas9)에서의 25개의 CRISPR 반응을 보여준다. 24-웰 플레이트의 각각의 형질감염된 웰은 표적화된 miRNA 게놈 유전자좌(Δ)의 5' 및 3' 측면을 플랭킹하는 2개의 독특한 gRNA를 함유하였다(표 2에 열거된 바와 같이). 조 세포 용해물을 각각의 CRISPR 반응 및 PCR 유전자형화에 대해 제조하였다. 겔 전기영동에 의해 예측된 녹아웃 크기에서 이동하는 단리된 PCR 단편을 DNA-시퀀싱하고, 표적화된 Cas9 절단 및 miRNA 유전자좌 제거에 대해 검증하였다. 예측된 WT PCR 단편 bp 크기는 괄호 안에 표시되고, 원하는 CRISPR KO PCR 단편 크기가 겔의 하단에 표시된다. 약어: CRISPR = 클러스터링된 규칙적으로 간격이 짧은 팰린드로믹 반복; Cas9 = CRISPR-관련 엔도뉴클레아제; gRNA = 가이드 RNA; DOX = 독시사이클린; bp = 염기쌍; WT = 야생형; KO = 녹아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 억제된 증식을 나타내는 CRISPR 유전자 편집을 사용하여 mir-891a에 대해 결실된 전립선암 세포. (A) mir-891a 유전자(녹색)를 플랭킹하는 게놈 서열을 표적으로 하는 PCR 프라이머(보라색) 및 두 개의 5' 및 두 개의 3' 가이드 RNA(오렌지색)를 설계한다. (b) 지시된 5' 및 3' 가이드 RNA로 형질감염된 LNCaP 세포의 PCR 유전자형은 네 개의 가이드 RNA 조합 모두에 대해Δmir-891a 결실이 얻어졌음을 확인하였다. 세포 용해물은 형질감염 후 48시간 혼합된 세포 집단으로부터 제조되었다. (c) PCR 단편을 시퀀싱하고 검증하였다. 대표적인 예는 5A(891a) 및 3B(891a) 가이드 RNA로 처리된 형질감염된 세포의 DNA 서열을 보여주며, 그 결과 예측된 Cas9 절단 부위(PAM 부위의 3 nt 상류) 및 CRISPR Δmir-891a 결실이 초래된다. (d) 단세포 콜로니를 수득하고 PCR-유전자형화하였다. 클론 L14 G9는 서열-mir-891a 유전자에 대한 WT로서 KO 및 클론 L14 G9로서 검증되었다. (e) miR-891a는 이전에 전립선암 세포 성장을 유도하는 것으로 나타났으며, 따라서, miR-891a 손실은 상호 표현형을 갖는 것으로 예측되었다. mir-891a에 대해 결실된 전립선암 세포의 WST-1 검정 (L14 G9 [KO], 파란색)은 WT 세포 (L14 G9 [WT], 적색)에 비해 증식 억제를 보였다. 약어: CRISPR = 클러스터링된 규칙적으로 간격이 짧은 팰린드로믹 반복; Cas9 = CRISPR-관련 엔도뉴클레아제; WT = 야생형; KO = 녹아웃; WST-1 = 수용성 테트라졸륨염-1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| PCR 반응은 얼음 위에 설치된다. | ||
| 구성 요소 | 25 μL 반응 | 최종 집중 |
| 5x DNA 중합효소 버퍼 | 5 μL | 1배 |
| 정방향 PCR 프라이머 (10 μM) | 0.5 μL | 0.2 μM |
| 역방향 PCR 프라이머 (10 μM) | 0.5 μL | 0.2 μM |
| 10 mM dNTPs | 0.5 μL | 200 μM |
| DNA 중합효소 (2 U/μL) | 0.25 μL | 0.125 U/ 25 μL |
| 조질 세포 용해물 | 1 - 4 μL | 변수 |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 최대 25μL | |
| PCR 반응을 위한 열순환기 조건: | ||
| 걸음 | 온도 | 시간 |
| 초기 변성 | 98 도 | 3 분 |
| 98 도 | 10초 | |
| 35 사이클 | 62 °C | 15초 |
| 72 °C | 15초 | |
| 최종 확장 | 72 °C | 10 분 |
| 들다 | 4 °C |
표 1: 조 용해물 지노타이핑을 위한 PCR 반응 조건. 약어: dNTP = 데옥시뉴클레오타이드.
| CRISPR 대상 삭제 사이트 | 가이드 RNA 조합 | 야생형(bp) | 녹아웃(bp) | PCR 프라이머 쌍 |
| ∆ 전체 클러스터 | 5A (891a) + 3A (892c) 5B (891a) + 3A (892c) 5A (891a) + 3B (892c) 5B (891a) + 3B (892c) |
35,664 | 389 496 378 485 |
891a FWD 892c 리브 |
| ∆892c/890/888 | 5A'(888)+3A(892c) 5B'(888)+3A(892c) 5A'(888)+3B(892c) 5B'(888)+3B(892c) |
2,739 | 478 487 467 476 |
888 FWD 892c 리브 |
| ∆892c/890 | 3A'(888)+3A(892c) 3B'(888)+3A(892c) 3A'(888)+3B(892c) 3B'(888)+3B(892c) |
2,739 | 710 754 699 743 |
888 FWD 892c 리브 |
| ∆892b/892a | 5A'(888)+5A(892b) 5B'(888)+5A(892b) 5A'(888)+5B(892b) 5B'(888)+5B(892b) |
2,938 | 554 547 573 566 |
892b FWD 888 리브 |
| ∆892b/892a/888 | 5A(892b)+3A'(888) 5A(892b)+3B'(888) 5B (892b) + 3A '(888) |
2,938 | 322 278 341 |
892b FWD 888 리브 |
| ∆743 제품군 | 5A (892b) + 3A (892c) 5B (892b) + 3A (892c) 5A (892b) + 3B (892c) 5B (892b) + 3B (892c) |
5,015 | 370 389 359 378 |
892b FWD 892c 리브 |
| ∆891 제품군 | 5A (891a) + 3A (891b) 5B (891a) + 3A (891b) |
27,294 | 330 270 |
891a FWD 891b 리브 |
| ∆891a | 5A (891a) + 3A (891a) 5A (891a) + 3B (891a) 5B (891a) + 3A (891a) 5B (891a) + 3B (891a) |
554 | 333 273 454 394 |
891a FWD 891a 리브 |
표 2: miR-888 클러스터 녹아웃 조합을 생성하는데 사용되는 CRISPR 가이드 RNAs. 약어: CRISPR = 클러스터링된 규칙적으로 간격이 짧은 팰린드로믹 반복; bp = 염기쌍; FWD = 앞으로; REV = 역방향.
| 입문서 | 순서 | Tm (°C) |
| 888 FWD | AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG | 52.2 |
| 888 리브 | CTGGATGATGGCCAAGACAAG | 55.9 |
| 891a FWD | TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA | 53.9 |
| 891a 리브 | TTCATCTTGCTGCTACCTGTC | 54.8 |
| 891b 리브 | TCATCTTGCTGCTATACGTCCT | 55.6 |
| 892b FWD | GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA | 53.5 |
| 892b 리브 | CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC | 53.5 |
| 892c FWD | TGTGAGCACCTACAGGTTAG | 53.9 |
| 892c 리브 | CACTCTCACTTGGCTTCATG | 53.5 |
표 3: 유전자형에 사용되는 PCR 프라이머. 약어: FWD = 앞으로; REV = 역; Tm = 용융 온도.
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Discussion
이 CRISPR 유전자 편집 절차를 통해 조사자는 독특한 miRNA 클러스터 결실 조합을 운반하는 세포주의 전체 패널을 신속하게 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 합성 tracrRNA (1:1 몰비)로 어닐링된 5' 및 3' 게놈 부위 특이적 crRNA로 구성된 합성 가이드 RNA의 형질감염은 시간이 많이 걸리는 플라스미드 벡터 서브클로닝을 방지하고 24-웰 포맷을 사용하여보다 유연하고 높은 처리량의 실험 설계를 가능하게합니다. DOX 유도성 Cas9 렌티바이러스 카세트를 운반하는 세포주의 생성은 가이드 RNA의 세포 형질감염 동안 단단히 DOX 조절되고 강력한 Cas9 발현을 가능하게 하고, 후속 단계에서 배양 배지로부터 DOX 철수시 이 박테리아 단백질의 신속한 제거를 가능하게 한다. 이 절차는 또한 분석을 위해 최소한의 세포 물질을 필요로하고 비용이 많이 들고 노동 집약적 인 실리카 컬럼 DNA 정제 방법의 사용이나 분광 광도계를 사용하여 핵산 농도를 측정 할 필요성을 피하고 조사자를위한 방법을 더욱 간소화하는 PCR 유전자형에 대한 조세포 용해물에 의존합니다.
실제로, 여기에 공유된 대표적인 결과는 단일 실험에서 32개의 독특한 가이드 RNA 조합으로 인간 전립선암 세포주를 형질감염시키고, ~35kb miR-888 클러스터 영역 전체에 대한 결실을 운반하는 다중 단일 세포 콜로니 녹아웃 라인을 생성하기 위해 이 방법의 성공적인 적응을 보여주었다; miR-743 및 miR-891a 패밀리에 속하는 miR-888 클러스터 멤버에 대한 더 작은 삭제 조합; 뿐만 아니라 miR-888 클러스터 내의 개별 miRNA 부재에 대한 결실. 이 워크플로우는 인간 전립선 질환의 맥락에서 miR-888 클러스터 네트워크를 분자적으로 해부하기 시작하고 miR-888 클러스터 구성원이 전립선 종양 성장, 암 공격성 및 약물 내성을 조절하기 위해 기능적으로 겹치거나 서로 시너지 / 길항적으로 상호 작용하는 방법을 결정하는 데 귀중한 세포주 자원을 생성했습니다 (다른 곳에서 출판 됨). 이 연구는 전립선 암의 진행성 및 전이성 형태의 환자를 치료하기위한 진단 및 치료 응용 프로그램으로 이동함에 따라 중요 할 것입니다.
이 고처리량 CRISPR 유전자 편집 프로토콜에는 조사관이 다른 질병 맥락에서 추가적인 miRNA 클러스터 네트워크를 연구하기 위해 이 방법을 적용할 때 신중하게 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 이 과정에서 가장 중요한 단계는 CRISPR 약제 제거를 위해 miRNA 클러스터를 측면으로 배치하는 가이드 RNA의 신중한 설계뿐만 아니라 개별 miRNA 또는 miRNA 클러스터 구성원의 조합을 삭제하기 위한 추가적인 가이드 RNA입니다. 조사자는 특히 miRNA 클러스터가 유전자 인트론 내에 있거나 다른 유전자에 대한 안티센스에 위치하는 경우 주변 유전자 또는 조절 요소를 방해하지 않도록 신중하게 고려해야 합니다. CRISPR 오프-표적화 예측 자원24,25,26,27이 이용가능하며, 이는 연구자가 합성할 가장 차별적인 crRNA 올리고뉴클레오티드를 선택할 때 도움을 줄 수 있다. 이 워크플로우는 CRISPR 형질감염 단계에서 네 개의 고유한 가이드 RNA 조합을 시험하고 원하는 녹아웃 세포주를 생성할 가능성을 증가시킬 수 있도록 하는 각각의 표적화된 miRNA 유전자좌를 플랭킹하는 두 개의 5' 및 두 개의 3' crRNA의 설계를 기술한다. 그러나, 조사자는 특정 miRNA 유전자 유전자좌를 교란시키기 위해 성공적으로 작동하기 위해 이러한 가이드 RNA 조합 중 하나만 필요로 한다.
둘째, 조사자는 CRISPR 유전자 편집을 위해 세포에 Cas9를 전달하기 위한 가장 적절한 방법을 결정해야 한다. 이 절차는 DOX 유도성 Cas9 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하였지만, Cas9 단백질 생산을 위한 대안적인 접근법 (예를 들어, Cas9 재조합 단백질, Cas9 mRNA 전달, 또는 통상적인 Cas9 발현 플라스미드 벡터 시스템의 사용)은 이러한 프로토콜에 용이하게 적응될 수 있다. 예를 들어, 실험적 고려사항은 안정한 렌티바이러스 발현 세포주를 생성하는 것에 비해 Cas9 일시적 발현의 사용, Cas9를 구동하는데 사용되는 프로모터(유비쿼터스, 세포 유형 특이적, 유도성), 및 Cas9 발현 벡터가 관심있는 세포로의 전달을 보장하기 위한 양성/음성 선택 시스템의 혼입을 지시할 수 있다(즉, 항생제 내성).
셋째, miRNA 클러스터의 손실이 세포의 생존 가능성 / 성장에 부정적인 영향을 미칠 수있는 경우 가이드 RNA 전달 후 48-72 시간 이내에 신속하게 유전자형 혼합 집단 형질감염된 세포를 신속하게 유전자형화하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 전립선암 세포주에서 miR-891a와 같은 종양 촉진 인자를 삭제할 때, 이러한 mir-891a 녹아웃 세포는 처리되지 않은 세포보다 느리게 성장하고, 이어서 야생형 세포가 세포 집단을 빠르게 추월한다는 것이 주목되었다. 마지막으로, 유전자형 스크리닝 과정 동안, 특히 더 큰 게놈 결실을 위해 miRNA 유전자좌 제거를 보장하기 위해 추가적인 검증 방법을 통합하는 것이 중요하다. 이러한 측정에는 야생형 대립유전자가 존재하는 경우에만 검출되는 내부 PCR 유전자형 조절기를 사용하고 녹아웃 세포주가 표적화된 miRNA를 발현하지 않는지 확인하기 위해 단일 세포 콜로니에 대해 qRT-PCR 분석을 수행하는 것이 포함됩니다. 이러한 모든 고려 사항은 조사관에게 성공적인 결과를 보장합니다.
이 CRISPR 기술을 실험실에 통합 할 때 직면 한 몇 가지 명백한 한계가있었습니다. 예를 들어, 다중 miRNA 클러스터 결실 조합을 신속하게 생성하기 위해 이 프로토콜에 기술된 가이드 RNA 형질감염 단계의 높은 처리량 특성에도 불구하고, 이 절차의 속도-제한 단계는 각각의 CRISPR-매개된 miRNA 결실에 대한 단일 콜로니 세포주의 유전자형 스크리닝 및 확장이었다. 이 프로토콜에 긍정적 인 선택 전략을 통합하는 것이 이점이 될 것입니다. 그러나 96-웰 형식으로 자란 단일 세포 콜로니에서 라인을 확장하는 데 ~ 3-4 주가 걸릴 것입니다. 실제로, miRNA 유전자좌 녹아웃 플러스 야생형 세포 당 적어도 세 개의 독립적인 단일 콜로니 세포주를 수집하면 분석된 표현형이 아티팩트/오프 타겟팅 효과로 인한 것이 아닌지 확인하는 데 도움이 될 것이지만, 이는 다시 이 절차의 시간 소모적인 특성을 더한다. 조사자는 또한 동형접합성 널 세포주를 얻기 위해 CRISPR 유전자 편집의 다중 라운드를 수행할 필요가 있을 수 있다. 이것은 종종 염색체 재배열과 비정상적인 핵형의 복잡한 게놈 풍경을 보유하고있는 확립 된 불멸화 된 암 세포주를 사용하는 연구에서 특히 두드러집니다.
예를 들어, 이 대표적인 연구는 LNCaP 및 PC3 유래 인간 전립선암 세포주를 사용하여 miR-888 클러스터에 대한 결실을 생성하고, X 염색체에 매핑하였다. 이러한 남성 유래 전립선암 세포주는 비정상적인 핵형을 가지고 있고 두 개의 X 염색체를 가지고 있다는 것을 인식하는 것이 중요했다 (그리고 PC3 세포는 또한 다른 오토솜에 부분 X 염색체 전좌를 갖는다)31,32. 이러한 조건에도 불구하고, CRISPR 유전자 편집은 이들 전립선 세포주를 사용하여 동형접합성 녹아웃을 생성하기에 충분히 강력하였다. 그러나, 비정상적인 핵형(예를 들어, 삽입, 결실, 역전, 복제)을 갖는 조사자의 세포주가 설계된 PCR 프라이머/가이드 RNA를 사용하여 성공적인 검출에 필요한 요소들이 누락되어 표적화된 유전자 유전자좌의 두 번째(또는 그 이상) 카피의 검출을 흐리게 하는 "보이지 않는 돌연변이"를 보유할 수 있는 경우가 있을 수 있다. 이는 기능적 분석을 수행하기 전에 독립적인 방법(즉, qRT-PCR, 노던 블롯, WGS)을 사용하여 동형접합성 널 CRISPR 세포주를 검증하는 것의 중요성을 강조한다. 마지막으로, 이 프로토콜은 서로 인접하여 매핑되는 miRNA 클러스터 조합만 녹아웃하도록 설계되었습니다. 연구자가 다른 miRNA 유전자 사이에 분리된 miRNA를 녹아웃하고자 하는 경우, CRISPR 트랜스펙션의 여러 라운드가 필요하므로 신중한 유전자형과 검증이 필요합니다.
이러한 도전에도 불구하고, 이러한 기술된 프로토콜을 사용하여 임의의 주어진 miRNA 클러스터에 대한 miRNA 결실 조합의 완전한 패널을 신속하게 생성하는 능력은 miRNA 연구 툴박스에서의 기존 방법에 비해 큰 이점이다. 비코딩 RNA 기능을 특성화하기 위해 miRNA 모방체를 이용한 과발현 연구는 의도하지 않은 아티팩트 또는 세포 독성을 초래할 수 있다. 마찬가지로, 안티센스 안티미르 올리고뉴클레오티드 억제제를 사용하여 기능 상실 표현형을 결정하는 것은 안티미르가 일반적으로 miRNA 활성의 완전한 제거가 아닌 녹다운을 초래하기 때문에 어려울 수 있다. miRNA 클러스터 네트워크 신호전달을 밝히기 위해 miRNA 모방체 또는 miRNA 안티미르의 조합을 사용하려고 시도하는 것은 힘들고 해석하기 어려운 것으로 입증되었다. 따라서 주어진 비코딩 게놈 클러스터 내에서 miRNA 구성원이 어떻게 상호 작용하는지 조사하기 위해 CRISPR 유전자 편집 기술을 통합하면 연구원은 비 코딩 RNA가 질병 신호 전달 경로에 어떻게 영향을 미치는지 더 명확하게 이해할 수 있으며 진단 및 약물 발견 분야에 큰 영향을 미칠 것을 약속합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
PC3-ML 세포주는 Mark Stearn(Drexel University College of Medicine)에 의해 친절하게 제공되었다. 저스틴 톡시는 PCR 유전자형을 도왔다. 이 작업은 Breedan Adams Foundation Grant, Ryan Translational Research Fund 및 Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20)가 AE-K에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes, flat cap | Fisher | 14-230-225 | Plasticware |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Plasticware |
| 24-well tissue culture plate | Corning Costar | 09761146 | Plasticware |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | PCR reagent, genotyping |
| 6-well tissue culture plate | Fisher | FB012927 | Plasticware |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 08-772-2C | Plasticware |
| Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal | AbCam | ab191468 | Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200 |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | Tisuue culture reagent |
| BLAST nucleotide search engine | National Center for Biotechnology Information | NA | Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | A50298 | Equipment; Cell counter |
| Cryogenic tubes | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR Design Tool | Horizon Discovery Ltd. | NA | Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231100 | Tisuue culture reagent |
| DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10013CV | Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells |
| Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | Tisuue culture reagent |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed | Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides |
| Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol |
Dharmacon, Inc. | crRNA-460XXX | CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides |
| EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system |
| Ensembl genomic viewer | Ensembl | NA | Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences. |
| GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500 |
| Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit | IBI Scientific | IB47010 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000044 | Tisuue culture reagent |
| Hexadimethrine bromide | MilliporeSigma | H9268 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | MilliporeSigma | IPFL10100 | Western blot reagent; nitrocellulose |
| Intercept (TBS) Blocking Buffer | LI-COR | 927-60001 | Western blot reagent |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | Western blot reagent |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | Western blot reagent |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5425 R | Plasticware |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb. |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | Western blot reagent |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | CLx | Equipment; Western blot imaging |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Transfection reagent |
| Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System | Owl | D2-BP | Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system |
| PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) | Integrated DNA Technology | NA | PCR reagent, genotyping |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Scientific | F530S | PCR reagent, genotyping |
| RIPA Lysis Buffer 10x | MilliporeSigma | 20-188 | Western blot reagent |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Invitrogen | 25530049 | PCR reagent, genotyping |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | PCR reagent, genotyping |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | MT10041CV | Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA | Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12563029 | Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | 4375305 | Equipment |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | Equipment; Protein gel electrophoresis system |
References
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