Summary
Her presenterer vi en protokoll for å oppdage bakteriell motilitet basert på en fargereaksjon. Viktige fordeler med denne metoden er at den er enkel å evaluere og mer nøyaktig, og krever ikke spesialutstyr.
Abstract
Bakteriell motilitet er avgjørende for bakteriell patogenisitet, biofilmdannelse og stoffresistens. Bakteriell motilitet er avgjørende for invasjon og/eller spredning av mange sykdomsfremkallende arter. Derfor er det viktig å oppdage bakteriell motilitet. Bakterielle vekstforhold, som oksygen, pH og temperatur, kan påvirke bakterievekst og uttrykket av bakteriell flagella. Dette kan føre til redusert motilitet eller til og med tap av motilitet, noe som resulterer i unøyaktig evaluering av bakteriell motilitet. Basert på fargereaksjonen av 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) ved intracellulære dehydrogenaser av levende bakterier, ble TTC tilsatt til tradisjonell semisolid agar for bakteriell motilitetsdeteksjon. Resultatene viste at denne TTC halvfaste agarmetoden for påvisning av bakteriell motilitet er enkel, enkel å betjene og ikke involverer store og dyre instrumenter. Resultatene viste også at den høyeste motiliteten ble observert i halvfast medium fremstilt med 0,3% agar. Sammenlignet med det tradisjonelle halvfaste mediet er resultatene lettere å evaluere og mer nøyaktige.
Introduction
Bakteriell motilitet spiller en kritisk rolle i bakteriell patogenisitet, biofilmdannelse og stoffresistens1. Bakteriell motilitet er nært forbundet med patogenisitet og er nødvendig for bakteriell kolonisering under tidlig infeksjon av vertsceller2. Biofilmdannelse er nært knyttet til bakteriell motilitet, hvor bakterier fester seg til overflaten av faste medier gjennom motilitet. Bakteriell motilitet har lenge vært ansett for å være positivt korrelert med biofilmdannelse. En høy grad av bakteriell legemiddelresistens på grunn av biofilm kan føre til vedvarende infeksjoner som er en trussel mot menneskers helse 3,4,5. Derfor er det viktig å oppdage bakteriell motilitet. Den bakterielle motilitetstesten brukes hovedsakelig til å undersøke motiliteten til forskjellige former for bakterier i levende tilstand, som indirekte kan bestemme tilstedeværelsen eller fraværet av flagella og dermed har en viktig rolle i identifiseringen av bakterier.
Det er direkte og indirekte metoder for å oppdage bakteriell motilitet6. Som bakterier med flagella viser motilitet, er det mulig å oppdage om bakterier er bevegelige indirekte ved å oppdage tilstedeværelse eller fravær av flagella. For eksempel er det mulig å oppdage motilitet indirekte ved elektronmikroskopi og flagellar farging for å indikere at bakterier er bevegelige. Det er også mulig å oppdage ved direkte metoder, for eksempel suspensjonsfall og semisolid punkteringsmetoder.
Den semisolide punkteringsmetoden som vanligvis brukes i bachelormikrobiologiske laboratorier for å oppdage bakteriell motilitet, inokulerer bakteriene i punkteringen i det halvfaste agarmediet som inneholder 0,4-0,8% agar, i henhold til retningen for bakterievekst. Hvis bakteriene vokser langs punkteringslinjen for å spre seg rundt, vises skylignende (børstelignende) vekstspor, noe som indikerer tilstedeværelsen av flagella og derfor motilitet. Hvis det ikke er noen punkteringslinjevekstspor, er bakterien verken flagellert eller bevegelig.
Denne metoden har imidlertid sine ulemper: bakteriene er fargeløse og gjennomsiktige, flagellar aktiviteten påvirkes av de fysiologiske egenskapene til levende bakterier og andre faktorer, og konsentrasjonen av agar og den lille diameteren av reagensrøret. Videre er aerobe bakterier bare egnet for vekst på agaroverflaten, noe som påvirker observasjonen av bakteriell motilitet. Derfor, for å forbedre dette eksperimentet, ble 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) (fargeløs) tilsatt til mediet for å etablere en mer pålitelig og intuitiv metode for å bestemme bakteriell motilitet enn den nåværende direkte punkteringsmetoden ved bruk av intracellulære dehydrogenaser for å katalysere dannelsen av et rødt produkt av TTC 7,8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av halvfast medium
- Tradisjonell halvfast agar
- Forbered den tradisjonelle halvfaste agar i henhold til bakteriell motilitetstestmediumoppskrift ved hjelp av de grunnleggende ingrediensene11. Løs opp 10 g tryptose, 15 g NaCl, 4 g agar i nok destillert vann, juster pH til 7,2 ± 0,2 og utgjør det endelige volumet til 1000 ml.
- Autoklav agaren ved 121 °C i 20 minutter, og dispenser den i 10 ml reagensrør som et 3 cm høyt halvfast medium.
- Tradisjonell halvfast agar med TTC
- Etter autoklavering av det konvensjonelle halvfaste mediet, avkjøl det til 50 °C, tilsett 5 ml steril 1 % TTC-oppløsning til 100 ml medium, bland og dispenser det i 10 ml reagensrør for å danne et 3 cm høyt halvfast medium.
2. Bakterielle stammer
MERK: Åtti stammer ble isolert fra vannmiljøet og identifisert ved hjelp av et automatisert bakterieidentifikasjonsinstrument (se materialfortegnelsen), inkludert Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae og Aeromonas hydrophila (tabell 1). Staphylococcus aureus (se materialfortegnelsen) ble brukt som en negativ ikke-bevegelig kontroll; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa og Salmonella typhimurium (se materialtabellen) ble brukt som positive kontrollstammer.
- Identifiser test bakteriestammer som skal brukes til motilitetsanalyse.
- Inkluder negative ikke-bevegelige kontroller og motile positive kontrollstammer.
3. TTC-forbedret bakteriell motilitetsobservasjon
- Velg enkeltkolonier av testbakterier fra agarplater og inokuler dem i de to ovennevnte halvfaste mediene (trinn 1.1.2 og 1.2.1) ved punktering ved hjelp av inokulerende nåler.
- Dyrk rørene ved 37 ° C i inkubatoren i 24-48 timer for å observere resultatene.
- Vær oppmerksom på veksttilstanden: karakteriser bakteriene som ikke-bevegelige (-) hvis bare punkteringslinjen er rød. Karakteriser bakteriene som bevegelige (+) hvis den røde fargen sprer seg lett utover langs punkteringslinjen12.
4. Effekt av forskjellige agarkonsentrasjoner på bakteriell motilitet
- Klargjør halvfaste medier inneholdende 0,3%, 0,5% og 0,8% agar og inokuler dem ved punktering, som beskrevet ovenfor. Vær oppmerksom på resultatene etter 24-48 timer inkubasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Både standardstammer og isolerte stammer ble sammenlignet for motilitetsdeteksjon, og resultatene er vist i tabell 1. På grunn av fravær av flagella vokste Staphylococcus aureus og Klebsiella pneumoniae bare langs den inokulerte linjen på både tradisjonelle og TTC halvfaste medier. I kontrast viste Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli og Salmonella typhimurium vekst i alle retninger rundt inokulert linje etter dyrkning i 24 timer på TTC halvfast medium. Dette var enda tydeligere etter 48 timers kultur (figur 1). Selv om bakteriene vokste i alle retninger i det tradisjonelle halvfaste mediet, var det mye vanskeligere å visualisere enn i TTC-medium på grunn av det lille antallet bakterier på ytre siden av den inokulerte linjen.
Figur 1: Motilitetstestresultater ved bruk av TTC halvfast medium. Staphylococcus aureus til venstre, Escherichia coli til høyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Belastning | Halvfast medium med 0,4 % agar | Halvfast medium med 0,4 % agar og 0,005 % TTC | |||
| 24 timer | 48 timer | 24 timer | 48 timer | ||
| P. aeruginosa ATCC27853 | + | + | + | + | |
| E. coli ATCC25922 | + | + | + | + | |
| S. typhimurium ATCC14028 | + | + | + | + | |
| S. aureus ATCC25923 | - | - | - | - | |
| E. coli (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| Salmonella spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. hydrophila (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| Vibrio spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. aeruginosa (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| K. pneumoniae (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| Tall angir antall positive stammer (+) og negative flekker (-). | |||||
Tabell 1: Sammenligning av bakteriell motilitet.
Figur 2: Observasjon av Escherichia coli-motilitetsaktivitet ved ulike agarkonsentrasjoner. Fra venstre mot høyre: 0,3 %, 0,5 %, 0,8 % agar. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Påvirkningen av agarkonsentrasjon på bakteriell motilitet er vist i figur 2. Vi fant at den høyeste motiliteten ble observert i halvfast medium fremstilt med 0,3% agar. Middelfargen i røret ble nesten helt rød. I kontrast ble arealet av rød diffusjon redusert, og diffusjonen ble forlenget med økende agarkonsentrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Påvisning av bakteriell motilitet ved semisolid medium-metoden påvirkes av mange faktorer13,14. Bakterielle vekstbetingelser, som oksygen (aerob på agaroverflate, ikke-aerob i bunnen av røret med det halvfaste medium), pH og temperatur, kan påvirke levedyktigheten til bakteriell flagella, noe som kan føre til redusert motilitet eller til og med tap av motilitet15. I tillegg kan noen slim-type bakterier som deres motilitet påvirkes av produksjon av podokonjugater.
Tilsetningen av TTC til det halvfaste medium hjelper observasjonen av motilitet. De fermentative bakteriene med motivkraft kan vokse i alle retninger langs punkteringslinjen etter inkubasjon. Derfor blir mediet rundt punkteringslinjen rødt. De ikke-fermentative bakteriene med motivkraft har lavt oksygeninnhold i den nedre delen av mediet. Derfor vokser disse bakteriene dårlig, slik at bare det øvre laget av mediet er rødt. Bakterier uten motivkraft kan bare vokse på inokulasjonslinjen, og bare punkteringslinjen vises rød.
Ved påvisning av bakteriell motilitet med TTC-semisolid medium, jo lengre kulturtid, desto tydeligere er resultatene, spesielt med lavere agarkonsentrasjoner. Hvis resultatet er vanskelig å tolke, bør kulturtiden forlenges på riktig måte. Dette kan være relatert til agarkonsentrasjonen av det halvfaste medium, antall bakterier og deres motilitet16. I tillegg viste denne metoden at noen stammer av E. coli og P. aeruginosa ikke kunne vokse rundt på konvensjonelt halvfast agarmedium og viste bare en svak rød farge på overflaten av mediet på TTC halvfast agarmedium. Dette kan skyldes produksjon av kapsler av slike stammer, noe som påvirker deres motilitet17. Dette fenomenet forekommer også i Neisseria meningitidis18 på grunn av kapselen. Avslutningsvis reduserer deteksjon av bakteriell motilitet ved bruk av et kromogent halvfast medium inneholdende TTC påvirkning av bakterielle faktorer på testresultatene og gjør resultatene lettere å observere med det blotte øye. Fordelen med en høy deteksjonsrate gjør dette til en effektiv metode som kan erstatte det tradisjonelle halvfaste mediet for å oppdage bakteriell motilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) og Teaching Reform Research Project of China Pharmaceutical University (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D.
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W.
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
