Summary
Hier presenteren we een protocol om de schacht van het dijbeen van Wistar albinoratten iatrogenisch te breken en de ontwikkeling van het eelt op te volgen. Dit femur osteotomiemodel kan onderzoekers helpen het proces van fractuurgenezing te evalueren en te bestuderen hoe een medicijn de genezing van fracturen kan beïnvloeden.
Abstract
Fractuurgenezing is een fysiologisch proces dat resulteert in de regeneratie van botdefecten door de gecoördineerde werking van osteoblasten en osteoclasten. Osteoanabolische geneesmiddelen hebben het potentieel om het herstel van fracturen te vergroten, maar hebben beperkingen zoals hoge kosten of ongewenste bijwerkingen. Het botgenezend vermogen van een geneesmiddel kan in eerste instantie worden bepaald door in vitro studies, maar in vivo studies zijn nodig voor de uiteindelijke proof of concept. Ons doel was om een femur osteotomie knaagdiermodel te ontwikkelen dat onderzoekers zou kunnen helpen de ontwikkeling van eeltvorming na fractuur van de schacht van het dijbeen te begrijpen en dat zou kunnen helpen vaststellen of een potentieel medicijn botgenezende eigenschappen heeft. Volwassen mannelijke Wistar albino ratten werden gebruikt na goedkeuring van de Institutional Animal Ethics Committee. De knaagdieren werden verdoofd en onder aseptische omstandigheden werden volledige dwarse fracturen in het midden van een derde van de schachten van de dijbenen gemaakt met behulp van open osteotomie. De fracturen werden verminderd en intern gefixeerd met behulp van intramedullaire K-draden, en secundaire fractuurgenezing mocht plaatsvinden. Na de operatie werden intraperitoneale analgetica en antibiotica gedurende 5 dagen gegeven. Sequentiële wekelijkse röntgenfoto's beoordeelden de eeltvorming. De ratten werden geofferd op basis van radiologisch vooraf bepaalde tijdspunten en de ontwikkeling van de fractuur callus werd radiologisch en met behulp van immunohistochemie geanalyseerd.
Introduction
Bot is een dicht bindweefsel dat bestaat uit botvormende cellen, de osteoblasten en botresorberende cellen, de osteoclasten. Fractuurgenezing is een fysiologisch proces dat resulteert in de regeneratie van botdefecten door de gecoördineerde werking van osteoblasten en osteoclasten1. Wanneer er een fractuur is, zijn osteoblastische en osteoclastische activiteit op de fractuurplaats enkele van de belangrijke factoren die de botgenezing bepalen2. Wanneer fractuurgenezing afwijkt van zijn normale beloop, resulteert dit in een vertraagde vereniging, malunion of nonunion. Van een fractuur wordt gezegd dat deze zich in non-union bevindt wanneer er gedurende 9 maanden een falen van de vereniging van de fractuur is, zonder progressie van herstel in de laatste 3 maanden3. Ongeveer 10%-15% van alle fracturen ondervindt een vertraging in het herstel die kan evolueren naar nonunion4. Het nonunionpercentage voor alle fracturen is 5% -10% en varieert afhankelijk van het betrokken bot en de plaats van fractuur5.
Het huidige regime voor de behandeling van fractuur nonunion omvat chirurgische en/of medische modaliteiten. Momenteel kan vertraagde of niet-bevestiging van fracturen worden overwonnen door chirurgische strategieën zoals bottransplantatie. Bottransplantatie heeft echter zijn beperkingen en complicaties zoals de beschikbaarheid van transplantaatweefsel, pijn op de donorplaats, morbiditeit en infectie6. Medische behandeling omvat osteoanabolische geneesmiddelen zoals botmorfogenetisch eiwit (BMP) en teriparatide (parathormone analoog). Momenteel gebruikte osteoanabolische middelen hebben het potentieel om het herstel van fracturen te vergroten, maar hebben beperkingen zoals exorbitante kosten of ongewenste bijwerkingen7. Daarom is er ruimte voor het identificeren van kosteneffectieve, niet-chirurgische alternatieven voor botgenezing. Het botgenezend vermogen van een geneesmiddel kan in eerste instantie worden bepaald door in vitro studies, maar in vivo studies zijn nodig voor de uiteindelijke proof of concept. Een geneesmiddel waarvan bekend is dat het de botgenezing verbetert, moet in vitro worden geëvalueerd en, indien veelbelovend bevonden, kan worden gebruikt voor in vivo diermodelstudies. Als het medicijn botvorming en remodellering in het in vivo model blijkt te bevorderen, kan het doorgaan naar de volgende fase (d.w.z. klinische onderzoeken).
Het beoordelen van fractuurgenezing bij dieren is een logische stap voorwaarts om een nieuw middel te evalueren dat is geïntroduceerd voor botgenezing voordat het menselijke proeven ondergaat. Voor in vivo diermodelstudies van fractuurgenezing zijn knaagdieren een steeds populairder model8 geworden. De knaagdiermodellen hebben steeds meer belangstelling gegenereerd vanwege de lage operationele kosten, de beperkte behoefte aan ruimte en minder tijd die nodig is voor botgenezing9. Bovendien hebben knaagdieren een breed spectrum van antilichamen en gendoelen, die studies mogelijk maken naar de moleculaire mechanismen van botgenezing en regeneratie10. Een consensusbijeenkomst belichtte uitgebreid verschillende botgenezingsmodellen voor kleine dieren en concentreerde zich op de verschillende parameters die van invloed zijn op botgenezing, evenals de nadruk op verschillende fractuurmodellen en implantaten voor kleine dieren11.
Basisbreukmodellen kunnen grofweg worden onderverdeeld in open of gesloten modellen. Gesloten fractuurmodellen gebruiken een drie- of vierpunts buigkracht op het bot en vereisen geen conventionele chirurgische aanpak. Ze leiden tot schuine of spiraalfracturen, die lijken op lange botbreuken bij mensen, maar het gebrek aan standaardisatie van fractuurlocatie en -afmetingen kan in hen als een verstorende factor werken12. Open fractuurmodellen vereisen chirurgische toegang voor osteotomie van het bot, helpen om een consistenter fractuurpatroon op de fractuurplaats te bereiken, maar worden geassocieerd met vertraagde genezing in vergelijking met de gesloten modellen13. De keuze van het bot dat wordt gebruikt om fractuurgenezing te bestuderen, blijft voornamelijk het scheenbeen en het dijbeen vanwege hun afmetingen en toegankelijkheid. De keuze van de plaats van de fractuur is meestal de diafyse of metafyse. Het metafysaire gebied wordt speciaal gekozen in gevallen waarin fractuurgenezing wordt bestudeerd bij osteoporotische proefpersonen, omdat de metafyse meer wordt beïnvloed door osteoporose14. Verschillende implantaten zoals intramedullaire pinnen en externe fixators kunnen worden gebruikt om de fractuur11,15 te stabiliseren.
Het doel van deze studie was om een eenvoudig en gemakkelijk te volgen knaagdiermodel te ontwikkelen dat onderzoekers niet alleen zou kunnen helpen de ontwikkeling van het eelt na een fractuur van het dijbeen te begrijpen, maar ook zou kunnen helpen bepalen of een potentieel medicijn botgenezende eigenschappen heeft door het mechanisme te begrijpen waarmee het werkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven werden uitgevoerd na ethische goedkeuring van de Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), AIIMS, New Delhi, India (286/IAEC-1/2021).
1. Preoperatieve procedure
- Huis mannelijke Wistar albino ratten van 6-8 weken oud, met een gewicht tussen 150-200 g per stuk, in een Central Animal Facility (CAF) in afzonderlijke individuele kooien. Dit zorgt ervoor dat er geen chirurgisch /fractuurletsel is wanneer meerdere ratten kooien delen.
- Houd de ratten op een temperatuur van 23 °C ± 2 °C in een vochtigheid gecontroleerde omgeving met een relatieve vochtigheid van 50% ± 5%, stel ze bloot aan een 12 uur donkere/lichte cyclus en geef ad libitum toegang tot voedsel (standaard semi-synthetisch dieet): pelletdieet (droog) en water. De samenstelling van het standaard semi-synthetische dieet is als volgt: geroosterd Bengaals grammeel (60%), tarwebloem (22%), caseïne (4%), magere melkpoeder (5%), geraffineerde olie (4%), zoutmengsel met zetmeel (4,8%) en vitamine choline mengsel met zetmeel (0,2%).
- Acclimatiseren de ratten gedurende een periode van ten minste 48 uur vóór de operatie.
- Weeg elke rat op een digitale weegschaal en noteer het gewicht.
- Dien intraperitoneale (IP) injecties van cefuroxim (100 mg/kg lichaamsgewicht), tramadol (25 mg/kg lichaamsgewicht) en een combinatie van ketamine (75 mg/kg lichaamsgewicht) met xylazine (10 mg/kg lichaamsgewicht) toe aan de ratten 15 minuten voordat de chirurgische ingreep wordt gestart. Breng oogzalf aan op beide ogen om droge ogen te voorkomen.
- Verwijder het haar van de rechter onderste ledemaat, van het flankgebied tot aan het kniegewricht, met topische toepassing van een ontharingscrème.
OPMERKING: Bloed (0,5 ml) kan worden verzameld uit de staartader van elke rat voor de basisanalyse van verschillende parameters. Bloed kan elke 2 weken na de operatie opnieuw worden afgenomen.
2. Chirurgische procedure voor het creëren van een volledige transversale fractuur door open osteotomie
OPMERKING: Gebruik een aangewezen operatiekamer met een operatietafel en een optimale omgevingstemperatuur (26 °C) voor het uitvoeren van de procedure.
- Plaats het wasblok (aluminium bakje 30 cm x 30 cm x 4 cm met was tot een diepte van 2,5 cm) op de operatietafel en bedek het met steriele gordijnen. Het wasblok voorkomt elke verandering in de positie van het dier tijdens de operatie.
- Bevestig het begin van de anesthesie (door het verlies van teenknijpen te controleren). Plaats de verdoofde rat op een steriel gordijn in de linker laterale positie. Vraag een assistent om de rechter onderste ledemaat (knie en heup) in extensie te houden. Houd een steriele harde steun (marmerblok) onder het rechterbeen om het dijbeen te ondersteunen. Reinig de operatieplaats met alcohol en betadine.
- Injecteer lokale anesthesie (0,25 ml 1% lignocaïne) op de plaats van incisie (lateraal aspect van de rechterdij), snijd een gat in een ander steriel gordijn en stel alleen het rechterbeen van de rat erdoorheen voor een operatie.
- Geef een verticale huidincisie van 1 cm aan de zijkant van de rechterdij en verleng deze indien nodig met een chirurgisch mesje nr. 15.
- Leg de vastus lateralis spier bloot door de diepe fascia te scheiden met behulp van een Metzenbaum schaar. Splits de vastus lateralis in lijn met de spiervezels met behulp van een slagadertang totdat de schacht van het dijbeen is bereikt.
- Bevrijd het bot van de spieren die eraan vastzitten met behulp van de periostale lift.
- Injecteer lokale anesthesie (0,2 ml lignocaïne) in en rond het botvlies om vasovagale reflex te voorkomen.
- Maak een inkeping in het middelste derde deel van de schacht van het dijbeen met behulp van het chirurgische mes nr.15 en breek het bot in het middelste derde deel van de schacht (volledige breuk) door een beitel op de gemaakte inkeping te plaatsen (zodat de beitel niet wegglijdt) en zachtjes met een hamer op de beitel te tikken. Gebruik de steriele harde ondersteuning (marmerblok) om het bot te ondersteunen terwijl u het breekt om een schone breuk te garanderen.
OPMERKING: De steriele harde ondersteuning veroorzaakt meestal geen significante verwonding aan de spieren eronder. - Herstel de breuk intern met behulp van een steriele K-draad (1,0 mm) die wordt vastgehouden met behulp van een boormachine op batterijen. Steek de K-draad in het medullaire kanaal van het distale fragment door de breukplaats. Boor vervolgens de K-draad door het distale uiteinde van het dijbeen met behulp van de accu-aangedreven boormachine.
OPMERKING: Desinfecteer het oppervlak van de boormachine met alcohol voor gebruik. Wissel handschoenen nadat de K-draad is bevestigd. - Nadat de fractuur is verminderd, brengt u de K-draad van het distale uiteinde naar het kanaal van het proximale fragment totdat deze in het trochanterische gebied wordt gekocht. Knip het distale deel van de K-draad af dat door de huid steekt met behulp van een draadsnijder.
- Buig de punt van de K-draad tot ongeveer 90° met behulp van een tang en gebruik een gaasverband gedrenkt in betadine voor pin-site dressing. De K-draad fungeert als een intramedullaire spalk om de breuk in een gereduceerde positie te houden.
- Zorg voor volledige hemostase voordat u de huid sluit met behulp van een 3-0 nylon hechtdraad. Oefen druk uit op het bloedingsgebied met behulp van steriel gaas of een slagadertang om eventuele bloedingen te stoppen.
- Reinig de wond met betadine en bedek deze met steriel gaas en micropore plakband.
3. Postoperatieve zorg
- Breng de ratten terug naar hun kooien, laat normale ambulatie toe en blijf een standaard semi-synthetisch dieet geven totdat ze worden opgeofferd, evenals antibiotica (injectie cefuroxim 100 mg / kg) en pijnstillers (injectie tramadol 25 mg / kg / dag in twee verdeelde doses) intraperitoneaal gedurende 5 dagen na de procedure.
OPMERKING: De ratten kunnen worden onderverdeeld in behandelings- en controlegroepen om een bepaald medicijn te testen. Als het medicijn in water oplosbaar is, kan het oraal via een maagsonde worden toegediend. Het gewicht van de individuele dieren kan worden genoteerd om de dosis van het te gebruiken medicijn te berekenen. Er kunnen in- en uitsluitingscriteria worden gevolgd om de homogeniteit van de diergroepen te waarborgen. - Huis de dieren in individuele kooien onder vergelijkbare omstandigheden als de preoperatieve periode. Inspecteer de chirurgische site elke dag om te zoeken naar tekenen van postoperatieve pijn, wondinfectie, uitglijden van hechtingen of zwelling of ongemak van de buik.
- Beoordeel de botgenezing door eenmaal per week een röntgenfoto van de gebroken plaats.
4. Radiologische procedure
- Verdoof de ratten vóór de röntgenfoto met een intraperitoneale injectie van ketamine (50 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (5 mg/kg lichaamsgewicht).
- Houd het heupgewricht van de rat in een gebogen en ontvoerde positie terwijl het kniegewricht semi-gebogen wordt gehouden om de röntgenfoto van de gebroken ledemaat te maken met de volgende blootstellingsinstellingen: Ref. kVp ≈ 62; MAS = 6,4; en automatische belichtingsinstellingen (Ref. mA=160).
OPMERKING: Röntgenfoto's werden gemaakt bij baseline (1 dag na de operatie) en vervolgens eenmaal per week tot opoffering of 5 weken.
5. Dierlijke euthanasie en eelt ophalen
- Offer de ratten op door een overdosis koolstofdioxide (100% CO2 toedienen bij een stroomsnelheid van 7-8 L / min gedurende 1 minuut, gevolgd door een wachttijd van 4-5 minuten), op twee eerder bepaalde tijdstippen, gebaseerd op het radiologische uiterlijk van respectievelijk zacht en hard overbruggend eelt.
- Snijd de huid parallel aan het dijbeen en scheid de bovenliggende spieren zorgvuldig om schade aan het eeltweefsel te voorkomen.
- Breek het bot tussen het heupgewricht en het eeltweefsel met behulp van een hamer en beitel. Breek op dezelfde manier het bot tussen het eelt en het kniegewricht. Verwijder de K-draad en reinig het botstuk in zoutoplossing om bloedstolsels en zacht weefsel te verwijderen.
- Breng het eelt onmiddellijk over naar een gelabelde container met 10% neutraal gebufferd formaline (20 ml per monster) en bewaar het gedurende 3 dagen bij kamertemperatuur (RT).
6. Ontkalking van bot- en eeltweefsel
- Neem het eeltweefsel van formaline en houd het op RT in 20% ETDA-oplossing, pH 7, voor ontkalking van het botweefsel.
- Vervang elke 2 dagen gedurende ongeveer 3 weken verse EDTA-oplossing en controleer op botontkalking door het bot met een naald te prikken zonder het eeltweefsel te verstoren. Optimale ontkalking wordt aangegeven door het verlies van het normale korrelige gevoel van het botweefsel.
- Snijd na volledige ontkalking het sagittale gedeelte van het eelt en bereid paraffineblokken van het eeltweefsel voor. Snijd 4 μm dikke delen van het eeltweefsel voor histopathologische16 en elke andere vergelijkende analyse17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze studie werd uitgevoerd om een femur osteotomie model te ontwikkelen bij Wistar albino ratten. Dit model kan worden gebruikt om botgenezing te evalueren, evenals het osteogene effect van een veelbelovend osteoanabolisch medicijn bij botgenezing. Standaard chirurgische voorzorgsmaatregelen en protocollen werden gevolgd. Steriele jassen, gordijnen en chirurgische apparatuur werden gebruikt voor de procedure (figuur 1). De apparatuur (tabel 1) werd 48 uur voor de operatie gesteriliseerd. Anesthetica, pijnstillende en antibiotica werden gebruikt volgens het protocol om ervoor te zorgen dat dieren te allen tijde pijn- en infectievrij werden gehouden. Bloed (0,5 ml) kan worden verzameld uit de staartader van elke rat voor baseline-analyse en sequentiële chronologische vergelijkende follow-up van verschillende parameters naarmate fractuurgenezing optreedt. Het haar werd van het flankgebied naar het kniegebied verwijderd met behulp van ontharingscrème (figuur 2). De osteotomieprocedure duurde ongeveer 10 minuten (van de eerste incisie tot de hechting). Infectie en mortaliteit waren verwaarloosbaar na het volgen van aseptische voorzorgsmaatregelen. Een incisie werd gemaakt na lokale anesthesie (lignocaïne) en de schacht van het dijbeen werd blootgesteld na het intrekken van de vezels van de vastus lateralis (figuur 3). Een inkeping (groef) werd in het bot gemaakt met behulp van een chirurgisch mes om ervoor te zorgen dat de beitel niet wegglijdt. Steriele harde ondersteuning (marmerblok) werd gebruikt om het bot te ondersteunen terwijl het werd gebroken om een schone breuk te garanderen (figuur 1). Een volledige dwarse breuk werd geïnduceerd in het middelste derde deel van de schacht van het dijbeen met behulp van een beitel en hamer (figuur 4).
De breuk werd inwendig gefixeerd met behulp van een steriele K-draad (1,0 mm). De K-draad werd via de breukplaats in het medullaire kanaal van het distale fragment gebracht. De K-draad werd vervolgens door het distale uiteinde van het dijbeen uitgeboord. De fractuur werd verminderd en vervolgens werd de K-draad van het distale uiteinde in het kanaal van het proximale fragment geschoven totdat het aankoop in het trochanterische gebied kreeg. Het distale deel van de K-draad dat door de huid stak, werd afgesneden. De K-draad fungeerde als een intramedullaire spalk om de breuk in een gereduceerde positie te houden (figuur 5).
Een röntgenfoto van het gebroken gebied werd 1 dag na de operatie en daarna wekelijks gemaakt om het verschijnen van het eelt (begin van de fractuurgenezing) en het verschijnen van het overbruggings-eelt (het eerste tijdstip waarop de fractuurkloof werd genezen) te evalueren, zoals geëvalueerd door de radioloog (figuur 6). Twee radiologische tijdstippen voor vergelijkende evaluatie van fractuurgenezing waren het verschijnen (visualisatie) van het (zachte) eelt en het verschijnen van het overbruggen (harde) eelt.
Na het offer werd het dijbeen zorgvuldig bewaard in formaline, gevolgd door het protocol voor botontkalking (figuur 7). De K-draad werd tijdens het offer verwijderd, waarbij ervoor werd gezorgd dat het eelt niet werd verstoord. Na volledige ontkalking werd het bot in sagittale secties gesneden en bewaard in paraffineblokken voor sectie (4 μm dikke secties) indien en wanneer nodig. Een met hematoxyline en eosine gekleurd gedeelte van de fractuurplaats en eelt bevestigde kraakbeen en nieuwe botvorming aan het einde van 5 weken (figuur 8).
Figuur 1: Steriele chirurgische instrumenten bewaard op het chirurgische gordijn op de operatietafel. De chirurg is klaar om de chirurgische procedure te starten in een steriele omgeving met steriele instrumenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verdoofde rat op de operatietafel. Na het geven van anesthesie aan de rat en het verwijderen van het haar rond de incisieplaats, wordt het op de operatietafel gehouden in een linker laterale positie, waardoor het rechterbeen wordt blootgesteld aan osteotomie. Een ander chirurgisch gordijn wordt gebruikt om het rechterbeen door een gat in dat gordijn te laten gaan om ervoor te zorgen dat alleen het been wordt blootgesteld, waardoor wondinfecties worden geminimaliseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Chirurgische ingreep: Blootstelling van de schacht van het rattendijbeen. Tijdens osteotomie, nadat de vastus lateralis is blootgesteld, wordt deze gesplitst in lijn met de spiervezels om de schacht van het dijbeen bloot te leggen. Het bot wordt bevrijd van de aangehechte spieren met behulp van de periostale lift. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het creëren van een volledige transversale osteotomie in het middelste derde deel van de schacht van het dijbeen met behulp van een beitel en hamer. Een volledige dwarse breuk ontstaat in het middelste derde deel van de schacht van het dijbeen door zachtjes met de hamer op de beitel te tikken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: K-draad fungeert als een intramedullaire spalk om de fractuur in een gereduceerde positie te houden. De K-draad wordt via de breukplaats in het medullaire kanaal van het distale fragment geleid. De K-draad wordt vervolgens door het distale uiteinde van het dijbeen uitgeboord. De breuk wordt verminderd en vervolgens wordt de K-draad van het distale uiteinde in het kanaal van het proximale fragment geschoven totdat het aankoop in het trochanterische gebied heeft verkregen. Dit gebeurt met behulp van een accu-aangedreven boormachine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Röntgenfoto van het dijbeen van de rat met de K-draad in situ. (A) Voor het induceren van de fractuur en (B) 1 dag na de operatie. De fractuurgenezing wordt radiologisch gecontroleerd door opeenvolgende wekelijkse röntgenfoto's van de geopereerde plaats te maken om de eeltvorming radiologisch te beoordelen. De fractuur blijft verminderd en geïmmobiliseerd met de intramedullaire K-draad. De voor en na representatieve gegevens zijn niet van hetzelfde dier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Bot met eelt (na optimale ontkalking) verkregen na het offeren van het dier op een vooraf bepaald tijdstip. (A) Intact eelt; (B) Sagittale sectie van het eelt. Na het offeren van het dier wordt het gebied van de fractuurplaats verkregen, bewaard en ontkalkt met behulp van de beschreven methodologie. Het eelt wordt met tussenpozen beoordeeld om een optimale ontkalking te garanderen voordat het met andere technieken wordt geëvalueerd (referentieschaal in centimeters). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Hematoxyline-en-eosine-gekleurd deel van de fractuurplaats met een hard eelt met de vorming van kraakbeen en nieuw bot. (A) Lage vergroting; (B) Hoge vergroting. De met hematoxyline en eosine bevlekte delen van de breukplaats vertonen een hard eelt met de vorming van kraakbeen (zwarte pijlen) en nieuw bot (gele pijlen) (A: 40x; B: 100x). De blauwe pijl toont het breukeinde van het bot en de rode pijl toont het tweede corticale gebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode beschrijft helder de details die nodig zijn om een fractuur osteotomiemodel te ontwikkelen bij Wistar albino ratten. Dit model kan worden gebruikt om het osteogene effect van een veelbelovend osteoanabolisch medicijn bij fractuurgenezing te evalueren en de fijne kneepjes van botgenezing te begrijpen. Het opvallende kenmerk van deze methode is dat het eenvoudig is en niet te veel tijd of geavanceerde apparatuur nodig heeft. In deze methode werden volwassen mannelijke Wistar albino ratten geselecteerd als het knaagdiermodel voor de experimenten. Uniform geslacht werd geselecteerd om elke verstorende factor op botgenezing gerelateerd aan de geslachtshormonen te verwijderen.
Deze studie volgde de procedure van open osteotomie, die vergelijkbaar is met die gevolgd door andere groepen, evenals andere kleine diermodellen 11,18,19. Het voordeel van de open osteotomie die in deze methode wordt gevolgd ten opzichte van andere botgenezingsmodellen is dat de door letsel geïnduceerde (volledige corticale botbreuk) lijkt op een gewone lange botbreuk, en fractuurgenezing in deze methode lijkt op die van een gewone fractuur, waarbij er secundaire botgenezing (enchondrale ossificatie) is door eeltvorming, vergeleken met botletsel in boorgaten, waar sprake is van primaire botgenezing (intramembraneuze ossificatie)20. De methode van open osteotomie is ook beter dan de gesloten osteotomie of driepuntsdrukinducerende methode, waarbij er een mogelijkheid is van botbreuk en grote ongelijkheid in de breuklijn, wat leidt tot het verschil in fractuurgenezing21. Open osteotomie verhoogt de kans op wondinfectie in vergelijking met gesloten osteotomie, maar, net als bij andere studies, zagen we dat met de juiste voorzorgsmaatregelen de wondinfectie verwaarloosbaar was22. In deze methodologie werd ook waargenomen dat het creëren van een groef (inkeping) op het bot met een mes voordat het met een beitel en hamer werd gebroken, diende om een uniforme breuklijn te creëren en te voorkomen dat de beitel op het bot wegglijdt. Een andere wijziging die we in deze methode hebben geïntroduceerd, was het houden van een hard, steriel blok onder het bot om te worden gebroken. Dit zorgde niet alleen voor een tegenkracht tijdens het creëren van de breuk, maar hielp ook om verbrijzeling, verplettering of een onregelmatige breuklijn te voorkomen. Dit veroorzaakt meestal geen noemenswaardige verwonding aan de spieren eronder.
Onze studie gebruikte röntgenstralen om de tijdstippen van opoffering te bepalen op basis van het radiologische uiterlijk van de eelt als het eerste tijdstip en het verschijnen van het overbruggende (harde) eelt als het tweede tijdstip bij de dieren voordat het volledige experiment werd gestart. De gehele vergelijkende groep dieren moet worden geofferd wanneer een behandelings- of controlegroep een bepaald tijdstip bereikt om hun eelt te vergelijken met behulp van immunohistochemische analyse van osteoblastische en osteoclastische markers. Dit zal zorgen voor een onbevooroordeelde vergelijking tussen de verschillende behandelings- en controlegroepen. Röntgenfoto's van de gebroken plaats van de ratten moeten met wekelijkse tussenpozen worden gemaakt en bloedmonsters (staartader) moeten met tussenpozen van 2 weken worden genomen totdat ze de respectieve tijdstippen van opoffering bereiken. Wekelijks werden röntgenfoto's gemaakt (onder anesthesie) om de eeltvorming te evalueren door de radioloog (die blind was voor de controle- en behandelingsgroepen). De röntgenfoto's hielpen ook bij het onderbouwen en bevestigen van de biologische parameters van botgenezing.
Deze methode omvat de toepassing van een K-draad als een intramedullaire spalk om de fractuur in een gereduceerde positie te houden. Intramedullaire pinfixatie biedt echter geen absolute stabiliteit aan de fractuur, net als plating en externe fixators, en kan soms worden geassocieerd met complicaties zoals wondinfectie, pinmigratie, perforatie van de femorale schachtschors, enz. Onze studie suggereert ook dat het beter is om lignocaïne in en rond het botvlies te injecteren, dat extreem pijngevoelig is. Dit voorkomt ernstige pijn en de mogelijkheid van neurogene shock tijdens de osteotomie. Er werd ook waargenomen dat het laag houden van het volume van intraperitoneale injecties hielp om de daaropvolgende ademnood bij de ratten te minimaliseren. Pijnstillers en antibiotica werden gedurende 5 dagen na de operatie voortgezet om pijn of infectie te voorkomen. Voor deze studie werd het dijbeen gekozen voor het induceren van breuk omdat het gemakkelijk toegankelijk was, gemakkelijk schoon te breken en vanwege de rechte contour, wat gemakkelijker is voor het inbrengen van K-draad. Voorzichtigheid is geboden wanneer de K-draad in het proximale fragment van het dijbeen wordt geschoven, omdat er een risico bestaat op bloedingen door de dijbeenslagader te verwonden. Er werd waargenomen dat ratten de neiging hebben om de K-draad eruit te trekken als er te veel restdraad uit de huid steekt.
De parameters van de uitkomst van botgenezing zijn osteoblastische en osteoclastische markers in het bloed en eelt van de dieren (van verschillende groepen en verschillende tijdstippen). Voor osteoblastische markers kunnen osteocalcine, Col1A1, RANKL, P1NP en botspecifieke alkalische fosfatase worden geselecteerd, terwijl CTX en RANK kunnen worden beoordeeld om osteoclastische activiteit te evalueren. Sommige van deze parameters kunnen worden geëvalueerd in serum, terwijl andere kunnen worden geëvalueerd door immunohistochemie in eeltweefsel. Deze parameters geven een holistisch beeld van botremodellering door tegelijkertijd osteoblastische en osteoclastische activiteit te evalueren.
De beperking van deze studie is dat het de treksterkte van de callus niet evalueert. Idealiter voegen biomechanische studies waarde toe aan data. Voorzichtigheid is geboden bij het verwerken van het eelt en het aangrenzende botweefsel voor ontkalking, omdat onvolledige ontkalking geen optimale resultaten zal opleveren in de immunohistochemie.
Dit protocol om fractuurgenezing te beoordelen met behulp van het knaagdiermodel zal nuttig zijn voor alle groepen die veelbelovende geneesmiddelen met osteoanabolische activiteit proberen te evalueren. Het is een eenvoudig model om bot- en fractuurgenezing in het knaagdiermodel nauwkeurig te beoordelen en tegelijkertijd osteoblastische en osteoclastische activiteit en botremodellering te evalueren, die nuttige mechanistische inzichten geven. Als middelen en logistiek rond het aantal dieren zijn toegestaan, kunnen biologische indicatoren ook worden versterkt door de radiologische beoordeling van fractuurgenezing, evenals het vergelijken van treksterkte, die de mechanische gestalte van het genezen bot beoordeelt. Studies die het werkingsmechanisme ophelderen, hebben de voorkeur boven puur observationele studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft belangenconflicten of andere financiële informatie.
Acknowledgments
De auteurs willen de Centrale Raad voor Onderzoek in Homeopathie (CCRH), Ministerie van AYUSH, Govt. van India, bedanken voor onderzoeksfinanciering. De auteurs zijn dankbaar voor de hulp en steun van Central Animal Facility, AIIMS, New Delhi, voor hun hulp en ondersteuning bij de dierproeven en CMET, AIIMS, New Delhi, voor hun hulp en ondersteuning bij fotografie en videografie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W.
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. Sioud, M. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 5 Suppl 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
