Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para fraturar iatrogenicamente a diáfise do fêmur de ratos albinos Wistar e acompanhar o desenvolvimento do calo. Este modelo de osteotomia do fêmur pode ajudar os pesquisadores a avaliar o processo de cicatrização da fratura e estudar como uma droga pode influenciar a cicatrização da fratura.
Abstract
A cicatrização de fraturas é um processo fisiológico que resulta na regeneração de defeitos ósseos pela ação coordenada de osteoblastos e osteoclastos. As drogas osteoanabólicas têm o potencial de aumentar o reparo de fraturas, mas têm restrições como altos custos ou efeitos colaterais indesejáveis. O potencial de cicatrização óssea de uma droga pode inicialmente ser determinado por estudos in vitro , mas estudos in vivo são necessários para a prova final de conceito. Nosso objetivo era desenvolver um modelo de roedor de osteotomia do fêmur que pudesse ajudar os pesquisadores a entender o desenvolvimento da formação de calos após a fratura da diáfise do fêmur e que pudesse ajudar a estabelecer se uma droga potencial tem propriedades curativas ósseas. Ratos albinos Wistar machos adultos foram utilizados após liberação do Comitê de Ética Animal Institucional. Os roedores foram anestesiados e, em condições assépticas, fraturas transversais completas no terço médio das hastes dos fêmures foram criadas por osteotomia aberta. As fraturas foram reduzidas e fixadas internamente usando fios K intramedulares, e a cicatrização secundária da fratura foi permitida. Após a cirurgia, analgésicos intraperitoneais e antibióticos foram administrados por 5 dias. Raios-x semanais sequenciais avaliaram a formação de calos. Os ratos foram sacrificados com base em pontos de tempo radiologicamente pré-determinados, e o desenvolvimento do calo de fratura foi analisado radiologicamente e usando imuno-histoquímica.
Introduction
O osso é um tecido conjuntivo denso que consiste em células formadoras de osso, os osteoblastos, e células de reabsorção óssea, os osteoclastos. A cicatrização de fraturas é um processo fisiológico que resulta na regeneração de defeitos ósseos pela ação coordenada de osteoblastos e osteoclastos1. Quando há fratura, a atividade osteoblástica e osteoclástica no local da fratura são alguns dos fatores importantes que determinam a cicatrização óssea2. Quando a cicatrização da fratura se desvia de seu curso normal, resulta em uma união atrasada, desunião ou não união. Diz-se que uma fratura está em não união quando há uma falha de união da fratura por 9 meses, sem progressão do reparo nos últimos 3 meses3. Aproximadamente 10%-15% de todas as fraturas experimentam um atraso no reparo que pode progredir para a não união4. A taxa de não consolidação para todas as fraturas é de 5%-10% e varia dependendo do osso envolvido e do local da fratura5.
O regime atual para o tratamento da não consolidação da fratura compreende modalidades cirúrgicas e/ou médicas. Atualmente, a tardia ou não união de fraturas pode ser superada por estratégias cirúrgicas como o enxerto ósseo. No entanto, o enxerto ósseo tem suas limitações e complicações como disponibilidade de tecido do enxerto, dor no local doador, morbidade e infecção6. O tratamento médico compreende drogas osteoanabólicas como proteína morfogenética óssea (BMP) e teriparatida (análogo do paratormônio). Os agentes osteoanabólicos atualmente utilizados têm o potencial de aumentar o reparo de fraturas, mas apresentam restrições como custos exorbitantes ou efeitos colaterais indesejáveis7. Assim, há espaço para identificar alternativas custo-efetivas e não cirúrgicas para a cicatrização óssea. O potencial de cicatrização óssea de uma droga pode inicialmente ser determinado por estudos in vitro , mas estudos in vivo são necessários para a prova final de conceito. Uma droga que é conhecida por melhorar a cicatrização óssea deve ser avaliada in vitro e, se considerada promissora, pode ser usada para estudos in vivo em modelos animais. Se a droga provar promover a formação óssea e a remodelação no modelo in vivo , ela poderá prosseguir para o próximo estágio (ou seja, ensaios clínicos).
Avaliar a cicatrização de fraturas em animais é um passo lógico para avaliar um novo agente introduzido para a cicatrização óssea antes de passar por testes em humanos. Para estudos in vivo de modelos animais de cicatrização de fraturas, os roedores tornaram-se um modelo cada vez mais popular8. Os modelos de roedores têm gerado crescente interesse devido aos baixos custos operacionais, à necessidade limitada de espaço e ao menor tempo necessário para a cicatrização óssea9. Além disso, os roedores possuem um amplo espectro de anticorpos e alvos gênicos, que permitem estudos sobre os mecanismos moleculares de cicatrização e regeneração óssea10. Uma reunião de consenso destacou de forma abrangente vários modelos de cicatrização óssea de pequenos animais e enfocou os diferentes parâmetros que influenciam a cicatrização óssea, além de enfatizar vários modelos e implantes de fraturas de pequenos animais11.
Os modelos básicos de fratura podem ser amplamente divididos em modelos abertos ou fechados. Os modelos de fratura fechada usam uma força de flexão de três ou quatro pontos no osso e não requerem uma abordagem cirúrgica convencional. Levam a fraturas oblíquas ou espirais, assemelhando-se a fraturas de ossos longos em humanos, mas a falta de padronização da localização e das dimensões da fratura pode atuar como fator de confusão nelas12. Os modelos de fratura exposta requerem acesso cirúrgico para osteotomia óssea, ajudam a alcançar um padrão de fratura mais consistente no local da fratura, mas estão associados à cicatrização tardia em comparação com os modelos fechados13. A escolha do osso utilizado para estudar a cicatrização da fratura continua sendo principalmente a tíbia e o fêmur devido às suas dimensões e acessibilidade. A escolha do local da fratura é geralmente a diáfise ou metáfise. A região metafisária é especialmente escolhida nos casos em que a cicatrização da fratura é estudada em indivíduos osteoporóticos, pois a metáfise é mais afetada pela osteoporose14. Vários implantes como pinos intramedulares e fixadores externos podem ser utilizados para estabilizar a fratura11,15.
O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo de roedores simples e fácil de seguir que pudesse ajudar os pesquisadores não apenas a entender o desenvolvimento do calo após a fratura do fêmur, mas também a determinar se uma droga potencial tem propriedades curativas ósseas, entendendo o mecanismo pelo qual ela age.
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Protocol
Experimentos com animais foram feitos após aprovação ética do Comitê Institucional de Ética Animal (IAEC), AIIMS, Nova Delhi, Índia (286/IAEC-1/2021).
1. Procedimento pré-operatório
- Ratos albinos Wistar machos domésticos de 6 a 8 semanas de idade, pesando entre 150-200 g cada, em uma Central Animal Facility (CAF) em gaiolas individuais separadas. Isso garante que não haja lesão cirúrgica/no local da fratura quando vários ratos compartilham gaiolas.
- Manter os ratos a uma temperatura de 23 °C ± 2 °C num ambiente com humidade controlada com humidade de 50% ± 5%, expô-los a um ciclo escuro/claro de 12 h e dar acesso ad libitum a alimentos (dieta semissintética padrão): dieta de pellets (seca) e água. A composição da dieta semissintética padrão é a seguinte: farinha de grama de Bengala torrada (60%), farinha de trigo (22%), caseína (4%), leite em pó desnatado (5%), óleo refinado (4%), mistura de sal com amido (4,8%) e mistura de colina vitamínica com amido (0,2%).
- Aclimatar os ratos por um período de pelo menos 48 h antes da cirurgia.
- Pese cada rato em uma balança digital e anote o peso.
- Administrar injeções intraperitoneais (IP) de cefuroxima (100 mg/kg de peso corporal), tramadol (25 mg/kg de peso corporal) e uma combinação de cetamina (75 mg/kg de peso corporal) com xilazina (10 mg/kg de peso corporal) aos ratos 15 min antes de iniciar o procedimento cirúrgico. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o olho seco.
- Remova o pelo do membro inferior direito, da região do flanco até a articulação do joelho, com a aplicação tópica de um creme depilatório.
NOTA: O sangue (0,5 mL) pode ser coletado da veia caudal de cada rato para a análise basal de diferentes parâmetros. O sangue pode ser coletado novamente a cada 2 semanas após a cirurgia.
2. Procedimento cirúrgico para a criação de fratura transversa completa através de osteotomia exposta
NOTA: Utilize uma sala de operações designada com uma mesa de operação e temperatura ambiente ideal (26 °C) para a realização do procedimento.
- Coloque o bloco de cera (bandeja de alumínio 30 cm x 30 cm x 4 cm contendo cera até uma profundidade de 2,5 cm) na mesa de operação e cubra-o com cortinas estéreis. O bloco de cera impede qualquer alteração na posição do animal durante a cirurgia.
- Confirme o início da anestesia (verificando a perda de beliscões do dedo do pé). Coloque o rato anestesiado em uma cortina estéril na posição lateral esquerda. Peça a um assistente para segurar o membro inferior direito (joelho e quadril) em extensão. Mantenha um suporte duro estéril (bloco de mármore) sob a perna direita para apoiar o fêmur. Limpe o local cirúrgico com álcool e betadine.
- Injete anestesia local (0,25 mL de lignocaína a 1%) no local da incisão (aspecto lateral da coxa direita), corte um orifício em outra cortina estéril e exponha apenas a perna direita do rato através dela para cirurgia.
- Dê uma incisão vertical de pele de 1 cm no lado lateral da coxa direita e estenda-a conforme a necessidade com uma lâmina cirúrgica nº 15.
- Expor o músculo vasto lateral separando a fáscia profunda usando uma tesoura Metzenbaum. Divida o vasto lateral de acordo com as fibras musculares usando pinça arterial até que a diáfise do fêmur seja atingida.
- Liberte o osso dos músculos ligados a ele usando o elevador periosteal.
- Injete anestesia local (0,2 mL de lignocaína a 1%) dentro e ao redor do periósteo para prevenir o reflexo vasovagal.
- Crie um recuo no terço médio do eixo do fêmur usando a lâmina cirúrgica no.15 e frature o osso no terço médio do eixo (fratura completa) colocando um cinzel na indentação feita (para que o cinzel não escorregue) e batendo suavemente no cinzel com um martelo. Use o suporte rígido estéril (bloco de mármore) para apoiar o osso enquanto o fratura para garantir uma ruptura limpa.
NOTA: O suporte duro estéril geralmente não causa uma lesão significativa nos músculos por baixo. - Fixe internamente a fratura usando um fio K estéril (1,0 mm) mantido com a ajuda de uma furadeira elétrica operada por bateria. Passe o fio K para o canal medular do fragmento distal através do local da fratura. Em seguida, perfure o fio K através da extremidade distal do fêmur usando a furadeira elétrica operada por bateria.
NOTA: Desinfete a superfície da furadeira elétrica com álcool antes de usar. Troque as luvas depois que o fio K for fixado. - Após a redução da fratura, avançar o fio K da extremidade distal para o canal do fragmento proximal até obter a compra na região trocantérica. Corte a parte distal do fio K que se projeta através da pele usando um cortador de fio.
- Dobre a ponta do fio K a cerca de 90° usando um alicate e use uma bandagem de gaze embebida em betadine para curativo no local do alfinete. O fio K atua como uma tala intramedular para manter a fratura em uma posição reduzida.
- Certifique-se de hemostasia completa antes de fechar a pele usando uma sutura de nylon 3-0. Aplique pressão sobre a área de sangramento usando gaze estéril ou pinça arterial para parar qualquer sangramento.
- Limpe a ferida com betadine e cubra-a com gaze estéril e fita adesiva de microporos.
3. Cuidados pós-operatórios
- Devolver os ratos às suas gaiolas, permitir a deambulação normal e continuar a dar uma dieta semissintética padrão até os sacrificar, bem como antibióticos (injeção cefuroxima 100 mg/kg) e analgésicos (injeção tramadol 25 mg/kg/dia em duas doses fracionadas) por via intraperitoneal durante 5 dias após o procedimento.
NOTA: Os ratos podem ser divididos em grupos de tratamento e controle para testar um determinado medicamento. Se a droga é solúvel em água, pode ser administrada por via oral através de gavagem. O peso dos animais individuais pode ser anotado para calcular a dose do medicamento a ser usado. Critérios de inclusão e exclusão podem ser seguidos para garantir a homogeneidade dos grupos de animais. - Abrigar os animais em gaiolas individuais em condições semelhantes ao período pré-operatório. Inspecione o local cirúrgico todos os dias para procurar quaisquer sinais de dor pós-operatória, infecção da ferida, escorregamento de suturas ou qualquer inchaço ou desconforto abdominal.
- Avalie a cicatrização óssea por raio-X do local fraturado uma vez por semana.
4. Procedimento radiológico
- Antes da radiografia, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (50 mg/kg de peso corporal) e xilazina (5 mg/kg de peso corporal).
- Manter a articulação do quadril do rato em uma posição flexionada e abduzida, enquanto a articulação do joelho é mantida semi-flexionada para fazer a radiografia do membro fraturado com as seguintes configurações de exposição: Ref. kVp ≈ 62; Ref. mAS = 6,4; e configurações de exposição automática (Ref. mA=160).
NOTA: As radiografias foram realizadas no início do estudo (1 dia após a cirurgia) e depois uma vez por semana até o sacrifício ou 5 semanas.
5. Eutanásia animal e recuperação de calos
- Sacrificar os ratos por uma overdose de dióxido de carbono (administrar 100% de CO2 a uma taxa de fluxo de 7-8 L/min por 1 min, seguido por um período de espera de 4-5 min), em dois pontos de tempo previamente determinados, com base na aparência radiológica de calos de ponte macia e dura, respectivamente.
- Incida a pele paralela ao fêmur e separe os músculos sobrejacentes cuidadosamente para evitar danos ao tecido do calo.
- Fratura do osso entre a articulação do quadril e o tecido do calo usando um martelo e cinzel. Da mesma forma, fratura do osso entre o calo e a articulação do joelho. Remova o fio K e limpe o pedaço ósseo em solução salina para remover coágulos sanguíneos e tecidos moles.
- Transfira o calo imediatamente para um recipiente rotulado com formalina tamponada neutra a 10% (20 mL por amostra) e mantenha-o por 3 dias à temperatura ambiente (RT).
6. Descalcificação do tecido ósseo e calo
- Pegue o tecido calo da formalina e mantenha-o em RT em solução de ETDA a 20%, pH 7, para descalcificação do tecido ósseo.
- Troque a solução fresca de EDTA a cada 2 dias por aproximadamente 3 semanas e verifique se há descalcificação óssea cutucando o osso com uma agulha sem perturbar o tecido caloso. A descalcificação ideal é denotada pela perda da sensação normal de areia do tecido ósseo.
- Após a descalcificação completa, corte a seção sagital do calo e prepare blocos de parafina do tecido do calo. Corte cortes de 4 μm de espessura do tecido caloso para histopatológico16 e qualquer outra análise comparativa17.
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Representative Results
Este estudo foi realizado para desenvolver um modelo de osteotomia do fêmur em ratos albinos Wistar. Este modelo pode ser usado para avaliar a cicatrização óssea, bem como o efeito osteogênico de uma droga osteoanabólica promissora na cicatrização óssea. Precauções e protocolos cirúrgicos padrão foram seguidos. Aventais estéreis, cortinas e equipamentos cirúrgicos foram utilizados para o procedimento (Figura 1). O equipamento (Tabela 1) foi esterilizado 48 h antes da cirurgia. Anestésicos, analgésicos e antibióticos foram usados de acordo com o protocolo para garantir que os animais fossem mantidos livres de dor e infecção em todos os momentos. O sangue (0,5 mL) pode ser coletado da veia caudal de cada rato para análise basal e acompanhamento comparativo cronológico sequencial de diferentes parâmetros à medida que ocorre a cicatrização da fratura. Os pelos foram retirados da região do flanco até a região do joelho com creme depilatório (Figura 2). O procedimento de osteotomia levou aproximadamente 10 minutos para ser concluído (desde a primeira incisão até a sutura). A infecção e a mortalidade foram insignificantes após as precauções assépticas. Uma incisão foi realizada após anestesia local (lignocaína), e a diáfise do fêmur foi exposta após retração das fibras do vasto lateral (Figura 3). Um recuo (sulco) foi criado no osso usando uma lâmina cirúrgica para garantir que o cinzel não escorregasse. Suporte rígido estéril (bloco de mármore) foi utilizado para apoiar o osso enquanto o fraturava para garantir uma ruptura limpa (Figura 1). Uma fratura transversal completa foi induzida no terço médio da diáfise do fêmur com cinzel e martelo (Figura 4).
A fratura foi fixada internamente com fio K estéril (1,0 mm). O fio K foi passado para o canal medular do fragmento distal através do local da fratura. O fio K foi então perfurado através da extremidade distal do fêmur. A fratura foi reduzida e, em seguida, o fio K avançou da extremidade distal para o canal do fragmento proximal até obter compra na região trocantérica. A parte distal do fio K que se projetava através da pele foi cortada. O fio K atuou como tala intramedular para manter a fratura em posição reduzida (Figura 5).
Uma radiografia da área fraturada foi realizada 1 dia após a cirurgia e, posteriormente, semanalmente, para avaliar a aparência do calo (início da cicatrização da fratura) e a aparência do calo de ponte (o primeiro momento em que o gap da fratura foi cicatrizado), conforme avaliado pelo radiologista (Figura 6). Dois pontos de tempo radiológicos para avaliação comparativa da cicatrização da fratura foram o aparecimento (visualização) do calo (macio) e o aparecimento do calo de ponte (duro).
Após o sacrifício, o fêmur foi cuidadosamente preservado em formol, seguido do protocolo de descalcificação óssea (Figura 7). O fio K foi removido durante o sacrifício, tomando cuidado para não perturbar o calo. Após a descalcificação completa, o osso foi cortado em cortes sagitais e preservado em blocos de parafina para seccionamento (cortes de 4 μm de espessura) conforme e quando necessário. Uma seção corada com hematoxilina e eosina do local da fratura e do calo confirmou cartilagem e nova formação óssea ao final de 5 semanas (Figura 8).
Figura 1: Instrumentos cirúrgicos estéreis mantidos na cortina cirúrgica sobre a mesa cirúrgica. O cirurgião está pronto para iniciar o procedimento cirúrgico em um ambiente estéril com instrumentos estéreis. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Rato anestesiado mantido na mesa de operação. Depois de dar anestesia ao rato e remover o pelo ao redor do local da incisão, ele é mantido na mesa de operação em posição lateral esquerda, expondo a perna direita à osteotomia. Outra cortina cirúrgica é usada para passar a perna direita através de um orifício nessa cortina para garantir que apenas a perna esteja exposta, minimizando assim as infecções da ferida. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Procedimento cirúrgico: Exposição da diáfise do fêmur de rato. Durante a osteotomia, depois que o vasto lateral é exposto, ele é dividido de acordo com as fibras musculares para expor a diáfise do fêmur. O osso é liberado dos músculos anexados usando o elevador periosteal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Criação de uma osteotomia transversal completa no terço médio da diáfise do fêmur usando um cinzel e martelo. Uma fratura transversal completa é criada no terço médio do eixo do fêmur, batendo suavemente no cinzel com o martelo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O fio K atua como uma tala intramedular para manter a fratura em uma posição reduzida. O fio K é passado para o canal medular do fragmento distal através do local da fratura. O fio K é então perfurado através da extremidade distal do fêmur. A fratura é reduzida e, em seguida, o fio K é avançado da extremidade distal para o canal do fragmento proximal até obter compra na região trocantérica. Isso é feito usando uma furadeira elétrica operada por bateria. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Radiografia do fêmur do rato com o fio K in situ . (A) Antes de induzir a fratura e (B) 1 dia após a cirurgia. A cicatrização da fratura é monitorada radiologicamente por meio da realização de radiografias semanais sequenciais do local operado para avaliar radiologicamente a formação de calos. A fratura permanece reduzida e imobilizada com o fio K intramedular. Os dados representativos antes e depois não são do mesmo animal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Osso com calo (após descalcificação ótima) obtido após o sacrifício do animal em um ponto de tempo pré-determinado. (A) Calo intacto; (B) Secção sagital do calo. Após o sacrifício do animal, a área do local da fratura é obtida, preservada e descalcificada usando a metodologia descrita. O calo é intermitentemente avaliado para garantir a descalcificação ideal antes de avaliá-lo por quaisquer outras técnicas (escala de referência em centímetros). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Seção corada com hematoxilina e eosina do local da fratura mostrando um calo duro com a formação de cartilagem e osso novo. (A) Baixa ampliação; (B) Alta ampliação. Os cortes corados com hematoxilina e eosina do local da fratura mostram um calo duro com formação de cartilagem (setas pretas) e osso novo (setas amarelas) (A: 40x; B: 100x). A seta azul mostra a extremidade da fratura do osso, e a seta vermelha mostra a segunda região cortical. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este método descreve com lucidez os detalhes necessários para desenvolver um modelo de osteotomia de fratura em ratos albinos Wistar. Este modelo pode ser usado para avaliar o efeito osteogênico de uma droga osteoanabólica promissora na cicatrização de fraturas, bem como compreender os meandros da cicatrização óssea. A característica saliente deste método é que ele é simples e não precisa de muito tempo ou equipamentos sofisticados. Neste método, ratos albinos Wistar machos adultos foram selecionados como modelo de roedores para os experimentos. O gênero uniforme foi selecionado para remover qualquer fator de confusão na cicatrização óssea relacionada aos hormônios sexuais.
Este estudo seguiu o procedimento de osteotomia aberta, que é semelhante ao seguido por outros grupos, bem como outros modelos de pequenos animais11,18,19. A vantagem da osteotomia aberta seguida neste método sobre outros modelos de cicatrização óssea é que a lesão induzida (fratura óssea cortical completa) se assemelha a uma fratura regular de osso longo, e a cicatrização de fratura neste método se assemelha à de uma fratura regular, onde há cicatrização óssea secundária (ossificação encondral) por formação de calo, em comparação com a lesão óssea de furo de perfuração, onde há cicatrização óssea primária (ossificação intramembranosa)20. O método de osteotomia aberta também é melhor do que o método de osteotomia fechada ou indutor de pressão de três pontos, onde há possibilidade de quebra óssea e grande disparidade na linha de fratura, levando à diferença na cicatrização da fratura21. A osteotomia aberta aumenta a chance de infecção da ferida em comparação com a osteotomia fechada, mas, semelhante a outros estudos, observamos que, com as devidas precauções, a infecção da ferida foi insignificante22. Também foi observado nesta metodologia que a criação de um sulco (recuo) no osso com uma lâmina antes de fraturá-lo com um cinzel e martelo serviu para criar uma linha de fratura uniforme e evitou o deslizamento do cinzel no osso. Outra modificação que introduzimos neste método foi manter um bloco duro e estéril abaixo do osso a ser fraturado. Isso não só forneceu uma contraforça ao criar a fratura, mas também ajudou a evitar a quebra, esmagamento ou uma linha de fratura irregular. Isso geralmente não causa nenhuma lesão significativa nos músculos por baixo.
Nosso estudo usou raios-X para determinar os pontos de tempo de sacrifício com base na aparência radiológica do calo como o primeiro ponto de tempo e a aparência do calo de ponte (duro) como o segundo ponto de tempo nos animais antes de iniciar o experimento completo. Todo o grupo comparativo de animais deve ser sacrificado quando qualquer grupo de tratamento ou controle atingir um determinado ponto de tempo para comparar seus calos usando análise imuno-histoquímica de marcadores osteoblásticos e osteoclásticos. Isso garantirá uma comparação imparcial entre os diferentes grupos de tratamento e controle. A radiografia do local fraturado dos ratos deve ser feita em intervalos semanais, e amostras de sangue (veia da cauda) devem ser colhidas em intervalos de 2 semanas até atingirem os respectivos pontos de tempo de sacrifício. Raios-x semanais foram realizados (sob anestesia) para avaliar a formação de calos pelo radiologista (que estava cego para os grupos controle e tratamento). Os raios-X também ajudaram a substanciar e corroborar os parâmetros biológicos da cicatrização óssea.
Este método envolve a aplicação de um fio K como uma tala intramedular para manter a fratura imobilizada em uma posição reduzida. No entanto, a fixação intramedular do pino não fornece estabilidade absoluta à fratura, assim como o revestimento e os fixadores externos, e às vezes pode estar associada a complicações como infecção da ferida, migração do pino, perfuração do córtex da diáfise do fêmur, etc. Nosso estudo também sugere que é melhor injetar lignocaína dentro e ao redor do periósteo, que é extremamente sensível à dor. Isso evita dor intensa e a possibilidade de choque neurogênico durante a osteotomia. Observou-se também que manter o volume de injeções intraperitoneais baixo ajudou a minimizar o desconforto respiratório subsequente nos ratos. Analgésicos e antibióticos foram continuados por 5 dias após a cirurgia para prevenir qualquer dor ou infecção. Para este estudo, o fêmur foi escolhido para induzir fratura por ser de fácil acesso, fácil de quebrar de forma limpa e devido ao seu contorno reto, o que facilita a inserção de K-wire. Deve-se ter cautela quando o fio K é avançado para o fragmento proximal do fêmur, pois há risco de sangramento por lesão da artéria femoral. Observou-se que os ratos tendem a puxar o fio K se muito fio residual for deixado saliente para fora da pele.
Os parâmetros do resultado da cicatrização óssea são marcadores osteoblásticos e osteoclásticos no sangue e calo dos animais (de vários grupos e diferentes pontos de tempo). Para marcadores osteoblásticos, osteocalcina, Col1A1, RANKL, P1NP e fosfatase alcalina óssea específica podem ser selecionados, enquanto CTX e RANK podem ser avaliados para avaliar a atividade osteoclástica. Alguns desses parâmetros podem ser avaliados no soro, enquanto outros podem ser avaliados por imuno-histoquímica no tecido caloso. Esses parâmetros fornecem uma visão holística da remodelação óssea, avaliando simultaneamente a atividade osteoblástica e osteoclástica.
A limitação deste estudo é que ele não avalia a resistência à tração do calo. Idealmente, os estudos biomecânicos agregam valor aos dados. É necessário ter cautela ao processar o calo e o tecido ósseo adjacente para descalcificação, pois a descalcificação incompleta não dará resultados ótimos na imuno-histoquímica.
Este protocolo para avaliar a cicatrização de fraturas usando o modelo de roedores será útil para todos os grupos que estão tentando avaliar drogas promissoras com atividade osteoanabólica. É um modelo simples para avaliar com precisão a cicatrização óssea e de fraturas no modelo de roedores, avaliando a atividade osteoblástica e osteoclástica e o remodelamento ósseo, que fornecem insights mecanicistas úteis. Se forem permitidos recursos e logística que giram em torno do número de animais, os indicadores biológicos também podem ser reforçados pela avaliação radiológica da cicatrização da fratura, bem como pela comparação da resistência à tração, que avalia a estatura mecânica do osso cicatrizado. Estudos que elucidam o mecanismo de ação são preferidos a estudos puramente observacionais.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem quaisquer conflitos de interesse ou quaisquer outras divulgações financeiras.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Conselho Central de Pesquisa em Homeopatia (CCRH), Ministério da AYUSH, Governo da Índia, pelo financiamento da pesquisa. Os autores são gratos pela ajuda e apoio da Central Animal Facility, AIIMS, Nova Delhi, por sua ajuda e apoio com os experimentos com animais e CMET, AIIMS, Nova Delhi, por sua ajuda e apoio em fotografia e videografia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
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