Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att iatrogent bryta axeln på lårbenet hos Wistar albino råttor och följa upp utvecklingen av callus. Denna osteotomimodell för lårben kan hjälpa forskare att utvärdera processen för frakturläkning och att studera hur ett läkemedel kan påverka frakturläkning.
Abstract
Frakturläkning är en fysiologisk process som resulterar i regenerering av bendefekter genom samordnad verkan av osteoblaster och osteoklaster. Osteoanabola läkemedel har potential att öka reparationen av frakturer men har begränsningar som höga kostnader eller oönskade biverkningar. Benläkningspotentialen hos ett läkemedel kan initialt bestämmas genom in vitro-studier , men in vivo-studier behövs för det slutliga beviset på konceptet. Vårt mål var att utveckla en lårben osteotomi gnagare modell som kan hjälpa forskare att förstå utvecklingen av kallusbildning efter fraktur av lårbenets axel och som kan hjälpa till att fastställa om ett potentiellt läkemedel har benläkande egenskaper. Vuxna manliga Wistar albino råttor användes efter godkännande av institutionella djurförsöksetiska kommittén. Gnagarna bedövades, och under aseptiska förhållanden skapades fullständiga tvärgående frakturer i mitten en tredjedel av lårbenens axlar med öppen osteotomi. Frakturerna reducerades och fixerades internt med hjälp av intramedullära K-trådar, och sekundär frakturläkning tilläts ske. Efter operationen gavs intraperitoneala analgetika och antibiotika i 5 dagar. Sekventiell röntgen varje vecka bedömde kallusbildning. Råttorna offrades baserat på radiologiskt förutbestämda tidpunkter, och utvecklingen av frakturkallusen analyserades radiologiskt och med hjälp av immunohistokemi.
Introduction
Ben är en tät bindväv som består av benbildande celler, osteoblasterna och benresorberande celler, osteoklasterna. Frakturläkning är en fysiologisk process som resulterar i regenerering av bendefekter genom samordnad verkan av osteoblaster och osteoklaster1. När det finns en fraktur är osteoblastisk och osteoklastisk aktivitet vid frakturstället några av de viktiga faktorer som bestämmer benläkning2. När frakturläkning avviker från sin normala kurs resulterar det i en försenad union, malunion eller nonunion. En fraktur sägs vara i icke-förening när det finns ett misslyckande av förening av frakturen i 9 månader, utan någon utveckling av reparation under de senaste 3 månaderna3. Cirka 10%-15% av alla frakturer upplever en fördröjning i reparationen som kan utvecklas till nonunion4. Nonunionfrekvensen för alla frakturer är 5% -10% och varierar beroende på benet som är involverat och platsen för fraktur5.
Den nuvarande behandlingen för behandling av frakturförening omfattar kirurgiska och / eller medicinska metoder. För närvarande kan fördröjd eller icke-förening av frakturer övervinnas genom kirurgiska strategier som bentransplantation. Bentransplantation har dock sina begränsningar och komplikationer som tillgänglighet av transplantatvävnad, smärta vid donatorplatsen, sjuklighet och infektion6. Medicinsk behandling omfattar osteoanabola läkemedel som benmorfogenetiskt protein (BMP) och teriparatid (parathormonanalog). För närvarande används osteoanabola agenter har potential att öka reparationen av frakturer men har begränsningar som orimliga kostnader eller oönskade biverkningar7. Därför finns det utrymme för att identifiera kostnadseffektiva, icke-kirurgiska alternativ för benläkning. Benläkningspotentialen hos ett läkemedel kan initialt bestämmas genom in vitro-studier , men in vivo-studier behövs för det slutliga beviset på konceptet. Ett läkemedel som är känt för att förbättra benläkning bör utvärderas in vitro och, om det visar sig lovande, kan användas för in vivo djurmodellstudier. Om läkemedlet visar sig främja benbildning och ombyggnad i in vivo-modellen kan det gå vidare till nästa steg (dvs. kliniska prövningar).
Att bedöma frakturläkning hos djur är ett logiskt steg framåt för att utvärdera ett nytt medel som introducerats för benläkning innan det genomgår mänskliga försök. För in vivo djurmodellstudier av frakturläkning har gnagare blivit en allt populärare modell8. Gnagarmodellerna har genererat ökande intresse på grund av de låga driftskostnaderna, det begränsade behovet av utrymme och mindre tid som behövs för benläkning9. Dessutom har gnagare ett brett spektrum av antikroppar och genmål, vilket möjliggör studier av de molekylära mekanismerna för benläkning och regenerering10. Ett konsensusmöte belyste omfattande olika benläkningsmodeller för smådjur och fokuserade på de olika parametrar som påverkar benläkning, samt betonade flera smådjursfrakturmodeller och implantat11.
Grundläggande sprickmodeller kan i stort sett delas in i öppna eller slutna modeller. Slutna frakturmodeller använder en tre- eller fyrpunkts böjkraft på benet och kräver inte ett konventionellt kirurgiskt tillvägagångssätt. De leder till sneda eller spiralfrakturer, som liknar långa benfrakturer hos människor, men bristen på standardisering av frakturplats och dimensioner kan fungera som en förvirrande faktor i dem12. Öppna frakturmodeller kräver kirurgisk åtkomst för benets osteotomi, hjälper till att uppnå ett mer konsekvent frakturmönster vid frakturstället, men är förknippade med fördröjd läkning jämfört med de slutna modellerna13. Valet av ben som används för att studera frakturläkning förblir huvudsakligen tibia och lårben på grund av deras dimensioner och tillgänglighet. Valet av platsen för fraktur är vanligtvis diafys eller metafys. Den metafysala regionen är speciellt vald i fall där frakturläkning studeras hos osteoporotiska ämnen, eftersom metafysen påverkas mer av osteoporos14. Flera implantat som intramedullära stift och externa fixatorer kan användas för att stabilisera frakturen11,15.
Målet med denna studie var att utveckla en enkel och lätt att följa gnagarmodell som kunde hjälpa forskare att inte bara förstå utvecklingen av kallus efter lårbenets fraktur utan kan hjälpa till att avgöra om ett potentiellt läkemedel har benläkande egenskaper genom att förstå mekanismen genom vilken det verkar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök gjordes efter etiskt godkännande från Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), AIIMS, New Delhi, Indien (286/IAEC-1/2021).
1. Preoperativt förfarande
- Hushane Wistar albino råttor 6-8 veckors ålder, väger mellan 150-200 g vardera, på en Central Animal Facility (CAF) i separata individuella burar. Detta säkerställer ingen kirurgisk / frakturskada när flera råttor delar burar.
- Håll råttorna vid en temperatur på 23 °C ± 2 °C i en fuktkontrollerad miljö med en relativ luftfuktighet på 50 % ± 5 %, utsätt dem för en 12 timmars mörk/ljus cykel och ge ad libitum tillgång till mat (standard halvsyntetisk kost): pelletsdiet (torr) och vatten. Sammansättningen av den vanliga halvsyntetiska kosten är som följer: rostat Bengal grammjöl (60%), vetemjöl (22%), kasein (4%), skummjölkspulver (5%), raffinerad olja (4%), saltblandning med stärkelse (4,8%) och vitaminkolinblandning med stärkelse (0,2%).
- Acklimatisera råttorna under en period av minst 48 timmar före operationen.
- Väg varje råtta på en digital våg och notera vikten.
- Administrera intraperitoneala (IP) injektioner av cefuroxim (100 mg/kg kroppsvikt), tramadol (25 mg/kg kroppsvikt) och en kombination av ketamin (75 mg/kg kroppsvikt) med xylazin (10 mg/kg kroppsvikt) till råttorna 15 min innan det kirurgiska ingreppet påbörjas. Applicera oftalmisk salva på båda ögonen för att förhindra torra ögon.
- Ta bort håret från höger underben, från flankområdet upp till knäleden, med topisk applicering av en hårborttagningskräm.
OBS: Blod (0,5 ml) kan samlas in från svansvenen hos varje råtta för baslinjeanalys av olika parametrar. Blod kan samlas in igen var 2: e vecka efter operationen.
2. Kirurgiskt ingrepp för att skapa fullständig tvärgående fraktur genom öppen osteotomi
OBS: Använd ett särskilt operationsrum med ett operationsbord och optimal omgivningstemperatur (26 °C) för att utföra proceduren.
- Placera vaxblocket (aluminiumbricka 30 cm x 30 cm x 4 cm innehållande vax upp till ett djup av 2,5 cm) på operationsbordet och täck det med sterila draperier. Vaxblocket förhindrar förändring i djurets position under operationen.
- Bekräfta uppkomsten av anestesi (genom att kontrollera förlust av tå nypa). Placera den bedövade råttan på ett sterilt draperi i vänster sidoläge. Be en assistent att hålla höger underben (knä och höft) i förlängning. Håll ett sterilt hårt stöd (marmorblock) under höger ben för att stödja lårbenet. Rengör operationsområdet med alkohol och betadin.
- Injicera lokalbedövning (0,25 ml 1% lignokain) på snittstället (lateral aspekt av höger lår), skär ett hål i ett annat sterilt draperi och exponera endast råttans högra ben genom det för operation.
- Ge ett 1 cm vertikalt hudsnitt på sidosidan av höger lår och förläng det efter behov med ett kirurgiskt blad nr 15.
- Exponera vastus lateralis-muskeln genom att separera den djupa fascian med Metzenbaum-saxen. Dela vastus lateralis i linje med muskelfibrerna med hjälp av artärtång tills lårbenets axel har uppnåtts.
- Frigör benet från musklerna som är fästa vid det med hjälp av periostealhissen.
- Injicera lokalbedövning (0,2 ml 1% lignokain) i och runt periosteum för att förhindra vasovagal reflex.
- Skapa en indragning i den mellersta tredjedelen av lårbenets axel med hjälp av operationsbladet nr 15 och fraktur benet i mitten av axeln (fullständig fraktur) genom att placera en mejsel på den indragning som gjorts (så att mejseln inte glider) och knacka försiktigt på mejseln med en hammare. Använd det sterila hårda stödet (marmorblocket) för att stödja benet medan du spricker det för att säkerställa en ren paus.
OBS: Det sterila hårda stödet orsakar vanligtvis inte en betydande skada på musklerna under. - Fixera frakturen internt med en steril K-tråd (1,0 mm) som hålls med hjälp av en batteridriven borrmaskin. För K-tråden in i medullärkanalen i det distala fragmentet genom sprickstället. Borra sedan ut K-tråden genom lårbenets distala ände med hjälp av den batteridrivna borrmaskinen.
OBS: Desinficera ytan på borrmaskinen med alkohol före användning. Byt handskar efter att K-tråden är fixerad. - Efter att ha minskat frakturen, avancera K-tråden från den distala änden till kanalen i det proximala fragmentet tills det erhåller köp i den trochanteriska regionen. Klipp av den distala delen av K-tråden som sticker ut genom huden med en trådskärare.
- Böj spetsen på K-tråden till cirka 90 ° med en tång och använd ett gasbindband indränkt i betadin för pin-site dressing. K-tråden fungerar som en intramedullär skena för att hålla frakturen i reducerat läge.
- Se till att du har fullständig hemostas innan du stänger huden med en 3-0 nylonsutur. Applicera tryck på blödningsområdet med steril gasväv eller artärtång för att stoppa blödning.
- Rengör såret med betadin och täck det med steril gasbindning och mikropor tejp.
3. Postoperativ vård
- Återför råttorna till burarna, tillåt normal ambulation och fortsätt att ge en vanlig halvsyntetisk diet tills du offrar dem, samt antibiotika (injektionscefuroxim 100 mg/kg) och smärtstillande medel (injektion tramadol 25 mg/kg/dag i två uppdelade doser) intraperitonealt i 5 dagar efter ingreppet.
OBS: Råttorna kan delas in i behandlings- och kontrollgrupper för att testa ett visst läkemedel. Om läkemedlet är vattenlösligt kan det ges oralt genom sondmatning. Vikten av de enskilda djuren kan noteras för att beräkna dosen av läkemedlet som ska användas. Inklusions- och uteslutningskriterier kan följas för att säkerställa att djurgrupperna är homogena. - Hus djuren i enskilda burar under liknande förhållanden som den preoperativa perioden. Inspektera operationsområdet varje dag för att leta efter tecken på postoperativ smärta, sårinfektion, glidning av suturer eller buksvullnad eller obehag.
- Bedöm benläkning genom röntgen av det frakturerade stället en gång i veckan.
4. Radiologiskt förfarande
- Före röntgen bedöva råttorna med en intraperitoneal injektion av ketamin (50 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (5 mg/kg kroppsvikt).
- Håll råttans höftled i ett böjt och bortfört läge medan knäleden hålls halvböjd för att ta röntgen av den brutna lemmen med följande exponeringsinställningar: Ref≈. mAS = 6,4; och automatiska exponeringsinställningar (Ref. mA = 160).
OBS: Röntgen togs vid baslinjen (1 dag efter operationen) och sedan en gång i veckan fram till offret eller 5 veckor.
5. Djurdödshjälp och callushämtning
- Offra råttorna genom en överdos av koldioxid (administrera 100 %CO2 med en flödeshastighet på 7–8 l/min i 1 min, följt av en väntetid på 4–5 min) vid två tidigare bestämda tidpunkter, baserat på det radiologiska utseendet hos mjuka respektive hårda överbryggande förhårdnader.
- Skär huden parallellt med lårbenet och separera de överliggande musklerna försiktigt för att undvika skador på kallusvävnaden.
- Fraktur benet mellan höftleden och kallusvävnaden med hjälp av en hammare och mejsel. På samma sätt frakturera benet mellan callus och knäleden. Ta bort K-tråden och rengör benstycket i saltlösning för att ta bort blodproppar och mjukvävnad.
- Överför kallusen omedelbart till en märkt behållare med 10% neutralt buffrat formalin (20 ml per prov) och förvara den i 3 dagar vid rumstemperatur (RT).
6. Dekalcifiering av ben- och kallusvävnad
- Ta kallusvävnaden från formalin och förvara den vid RT i 20% ETDA-lösning, pH 7, för avkalkning av benvävnaden.
- Byt färsk EDTA-lösning var 2: e dag i cirka 3 veckor och kontrollera om det finns benavkalkning genom att peta benet med en nål utan att störa kallusvävnaden. Optimal avkalkning betecknas med förlusten av den normala grusiga känslan av benvävnaden.
- Efter fullständig avkalkning, skär den sagittala delen av callus och förbered paraffinblock av callusvävnaden. Skär 4 μm tjocka delar av kallusvävnaden för histopatologisk16 och alla andra jämförande analyser17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie genomfördes för att utveckla en lårben osteotomimodell i Wistar albino råttor. Denna modell kan användas för att utvärdera benläkning, liksom den osteogena effekten av ett lovande osteoanaboliskt läkemedel vid benläkning. Standard kirurgiska försiktighetsåtgärder och protokoll följdes. Sterila klänningar, draperier och kirurgisk utrustning användes för proceduren (figur 1). Utrustningen (tabell 1) steriliserades 48 timmar före operationen. Bedövningsmedel, smärtstillande medel och antibiotika användes enligt protokollet för att säkerställa att djur hölls smärt- och infektionsfria hela tiden. Blod (0,5 ml) kan samlas in från svansvenen hos varje råtta för baslinjeanalys och sekventiell kronologisk jämförande uppföljning av olika parametrar när frakturläkning sker. Hår avlägsnades från flankregionen till knäregionen med hårborttagningskräm (figur 2). Osteotomiproceduren tog cirka 10 minuter att slutföra (från det första snittet till suturen). Infektion och dödlighet var försumbar vid aseptiska försiktighetsåtgärder. Ett snitt gjordes efter lokalbedövning (lignokain), och lårbenets axel exponerades efter att fibrerna i vastus lateralis dragits tillbaka (figur 3). En indragning (spår) skapades i benet med hjälp av ett kirurgiskt blad för att säkerställa att mejseln inte gled. Sterilt hårt stöd (marmorblock) användes för att stödja benet medan det sprack för att säkerställa en ren brytning (figur 1). En fullständig tvärgående fraktur inducerades i den mellersta tredjedelen av lårbenets axel med hjälp av en mejsel och hammare (figur 4).
Frakturen fixerades internt med en steril K-tråd (1,0 mm). K-tråden fördes in i medullärkanalen i det distala fragmentet genom sprickstället. K-tråden borrades sedan ut genom lårbenets distala ände. Frakturen reducerades, och sedan avancerades K-tråden från den distala änden in i kanalen i det proximala fragmentet tills den erhöll köp i den trochanteriska regionen. Den distala delen av K-tråden som stack ut genom huden skars av. K-tråden fungerade som en intramedullär skena för att hålla frakturen i reducerat läge (figur 5).
En röntgen av det frakturerade området togs 1 dag efter operationen och varje vecka därefter för att utvärdera utseendet på callus (början av frakturläkning) och utseendet på den överbryggande kallusen (den första gången då frakturgapet läktes), som utvärderats av radiologen (figur 6). Två radiologiska tidpunkter för jämförande utvärdering av frakturläkning var utseendet (visualiseringen) av (mjuk) kallus och utseendet på den överbryggande (hårda) kallusen.
Efter offret bevarades lårbenet noggrant i formalin, följt av protokollet för benavkalkning (figur 7). K-tråden togs bort under offret och var noga med att inte störa callusen. Efter fullständig avkalkning skars benet i sagittala sektioner och bevarades i paraffinblock för sektionering (4 μm tjocka sektioner) vid behov. En hematoxylin-och-eosinfärgad del av frakturstället och callus bekräftade brosk och ny benbildning i slutet av 5 veckor (figur 8).
Figur 1: Sterila kirurgiska instrument som förvaras på operationsbordet på operationsbordet. Kirurgen är redo att starta det kirurgiska ingreppet i en steril miljö med sterila instrument. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bedövad råtta som hålls på operationsbordet. Efter att ha gett anestesi till råttan och tagit bort håret runt snittplatsen hålls det på operationsbordet i vänster sidoläge och utsätter höger ben för osteotomi. Ett annat kirurgiskt draperi används för att passera höger ben genom ett hål i draperiet för att säkerställa att endast benet exponeras, vilket minimerar sårinfektioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kirurgiskt ingrepp: Exponering av axeln på råttans lårben. Under osteotomi, efter att vastus lateralis har exponerats, delas den i linje med muskelfibrerna för att exponera lårbenets axel. Benet befrias från de bifogade musklerna med hjälp av periostealhissen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Skapa en komplett tvärgående osteotomi i den mellersta tredjedelen av lårbenets axel med hjälp av en mejsel och hammare. En fullständig tvärgående fraktur skapas i mitten en tredjedel av lårbenets axel genom att försiktigt knacka på mejseln med hammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: K-tråd fungerar som en intramedullär skena för att hålla frakturen i reducerat läge. K-tråden förs in i medullärkanalen i det distala fragmentet genom sprickstället. K-tråden borras sedan ut genom lårbenets distala ände. Frakturen reduceras och sedan avanceras K-tråden från den distala änden in i kanalen i det proximala fragmentet tills den erhöll köp i den trochanteriska regionen. Detta görs med hjälp av en batteridriven borrmaskin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Röntgen av lårbenet på råttan med K-tråden in situ . (A) Innan frakturen induceras och (B) 1 dag efter operationen. Frakturläkningen övervakas radiologiskt genom att ta sekventiella röntgenstrålar varje vecka från den opererade platsen för att radiologiskt bedöma kallusbildning. Frakturen förblir reducerad och immobiliserad med den intramedullära K-tråden. De representativa uppgifterna före och efter kommer inte från samma djur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Ben med kallus (efter optimal avkalkning) erhållen efter att ha offrat djuret vid en förutbestämd tidpunkt. (A) Intakt kallus; (B) Sagittal del av callus. Efter att ha offrat djuret erhålls området på sprickstället, bevaras och avkalkas med hjälp av den beskrivna metoden. Callus utvärderas intermittent för att säkerställa optimal avkalkning innan den utvärderas med andra tekniker (referensskala i centimeter). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Hematoxylin-och-eosinfärgad del av frakturstället som visar en hård kallus med bildandet av brosk och nytt ben. A) Låg förstoring. (B) Hög förstoring. De hematoxylin-och-eosinfärgade delarna av frakturstället visar en hård kallus med bildandet av brosk (svarta pilar) och nytt ben (gula pilar) (A: 40x; B: 100x). Den blå pilen visar benets frakturände och den röda pilen visar den andra kortikala regionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod beskriver tydligt de detaljer som behövs för att utveckla en fraktur osteotomi modell i Wistar albino råttor. Denna modell kan användas för att utvärdera den osteogena effekten av ett lovande osteoanaboliskt läkemedel vid frakturläkning, samt förstå komplikationerna med benläkning. Det framträdande med denna metod är att den är enkel och inte behöver för mycket tid eller sofistikerad utrustning. I denna metod valdes vuxna manliga Wistar-albinoråttor som gnagarmodell för experimenten. Enhetligt kön valdes för att ta bort alla förvirrande faktorer på benläkning relaterade till könshormonerna.
Denna studie följde proceduren för öppen osteotomi, som liknar den som följs av andra grupper, liksom andra smådjursmodeller11,18,19. Fördelen med den öppna osteotomi som följs i denna metod jämfört med andra benläkningsmodeller är att den skadeinducerade (fullständig kortikala benfrakturen) liknar en vanlig lång benfraktur, och frakturläkning i denna metod liknar den för en vanlig fraktur, där det finns sekundär benläkning (enkondral benbildning) genom kallusbildning, jämfört med borrhålsbenskada, där det finns primär benläkning (intramembranös benbildning)20. Metoden för öppen osteotomi är också bättre än den slutna osteotomi eller trepunkts tryckinducerande metoden, där det finns en möjlighet till benkrossning och stor skillnad i frakturlinjen, vilket leder till skillnaden i frakturläkning21. Öppen osteotomi ökar risken för sårinfektion jämfört med sluten osteotomi, men i likhet med andra studier observerade vi att sårinfektion med lämpliga försiktighetsåtgärder var försumbar22. Det observerades också i denna metod att skapa ett spår (indragning) på benet med ett blad innan det sprack med en mejsel och hammare tjänade till att skapa en enhetlig spricklinje och undvek glidning av mejseln på benet. En annan modifiering som vi införde i denna metod var att hålla ett hårt, sterilt block under benet som skulle brytas. Detta gav inte bara en motkraft när frakturen skapades utan hjälpte också till att undvika splittring, krossning eller en oregelbunden spricklinje. Detta orsakar vanligtvis ingen betydande skada på musklerna under.
Vår studie använde röntgenstrålar för att bestämma offertidpunkterna baserat på callusens radiologiska utseende som första tidpunkt och utseendet på den överbryggande (hårda) kallusen som den andra tidpunkten hos djuren innan det fullständiga experimentet påbörjades. Hela jämförelsegruppen av djur bör offras när någon behandlings- eller kontrollgrupp når en viss tidpunkt för att jämföra sina förhårdnader med hjälp av immunohistokemisk analys av osteoblastiska och osteoklastiska markörer. Detta kommer att säkerställa opartisk jämförelse mellan de olika behandlings- och kontrollgrupperna. Röntgen av råttornas frakturerade ställe ska göras varje vecka, och blodprover (svansvenen) ska tas med 2 veckovisa intervall tills de når respektive offertidpunkt. Röntgen varje vecka gjordes (under anestesi) för att utvärdera kallusbildning av radiologen (som var blindad för kontroll- och behandlingsgrupperna). Röntgenstrålarna hjälpte också till att underbygga och bekräfta de biologiska parametrarna för benläkning.
Denna metod innefattar applicering av en K-tråd som en intramedullär skena för att hålla frakturen immobiliserad i reducerat läge. Intramedullär stiftfixering ger emellertid inte absolut stabilitet till frakturen, liksom plätering och externa fixatorer, och kan ibland vara förknippade med komplikationer som sårinfektion, stiftmigration, perforering av lårbensaxelbarken etc. Vår studie tyder också på att det är bättre att injicera lignokain i och runt periosteum, vilket är extremt smärtkänsligt. Detta förhindrar svår smärta och möjligheten till neurogen chock under osteotomi. Det observerades också att hålla volymen av intraperitoneala injektioner låg hjälpte till att minimera efterföljande andningsbesvär hos råttorna. Analgetika och antibiotika fortsatte i 5 dagar efter operationen för att förhindra smärta eller infektion. För denna studie valdes lårbenet för att framkalla fraktur eftersom det var lätt att komma åt, lätt att bryta rent och på grund av dess raka kontur, vilket är lättare för K-trådinsättning. Försiktighet måste iakttas när K-tråden avanceras in i lårbenets proximala fragment, eftersom det finns risk för blödning genom att skada lårbensartären. Det observerades att råttor tenderar att dra ut K-tråden om för mycket kvarvarande tråd lämnas utskjutande ur huden.
Parametrarna för resultatet av benläkning är osteoblastiska och osteoklastiska markörer i djurens blod och kallus (av olika grupper och olika tidpunkter). För osteoblastiska markörer kunde osteokalcin, Col1A1, RANKL, P1NP och benspecifikt alkaliskt fosfatas väljas, medan CTX och RANK kunde bedömas för att utvärdera osteoklastisk aktivitet. Några av dessa parametrar kan utvärderas i serum, medan andra kan utvärderas genom immunohistokemi i kallusvävnad. Dessa parametrar ger en helhetssyn på benombyggnad genom att samtidigt utvärdera osteoblastisk och osteoklastisk aktivitet.
Begränsningen av denna studie är att den inte utvärderar kallusens draghållfasthet. Helst tillför biomekaniska studier värde till data. Försiktighet måste iakttas vid bearbetning av kallus och angränsande benvävnad för avkalkning, eftersom ofullständig avkalkning inte ger optimala resultat i immunhistokemi.
Detta protokoll för att bedöma frakturläkning med hjälp av gnagarmodellen kommer att vara användbart för alla grupper som försöker utvärdera lovande läkemedel med osteoanabol aktivitet. Det är en enkel modell för att noggrant bedöma ben- och frakturläkning i gnagarmodellen samtidigt som man utvärderar osteoblastisk och osteoklastisk aktivitet och benombyggnad, vilket ger användbara mekanistiska insikter. Om resurser och logistik som kretsar kring antalet djur är tillåtna kan biologiska indikatorer också förstärkas genom den radiologiska bedömningen av frakturläkning, samt jämförelse av draghållfasthet, som bedömer det läkta benets mekaniska statur. Studier som belyser verkningsmekanismen föredras framför rent observationsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har några intressekonflikter eller andra finansiella upplysningar.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Central Council for Research in Homoeopathy (CCRH), ministeriet för AYUSH, Indiens regering, för forskningsfinansiering. Författarna är tacksamma för hjälp och stöd från Central Animal Facility, AIIMS, New Delhi, för deras hjälp och stöd med djurförsöken och CMET, AIIMS, New Delhi, för deras hjälp och stöd inom fotografering och videografi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W.
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. Sioud, M. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 5 Suppl 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
