Summary
여기에서 우리는 Wistar 흰둥이 쥐의 대퇴골 축을 의원 발생 적으로 파괴하고 굳은 살의 발달에 대한 후속 조치를 취하는 프로토콜을 제시합니다. 이 대퇴골 절골술 모델은 연구자들이 골절 치유 과정을 평가하고 약물이 골절 치유에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Abstract
골절 치유는 조골 세포와 파골 세포의 조정 된 작용에 의해 뼈 결함을 재생시키는 생리적 과정입니다. 골동화 작용 약물은 골절 복구를 강화할 가능성이 있지만 높은 비용이나 바람직하지 않은 부작용과 같은 제약이 있습니다. 약물의 뼈 치유 잠재력은 처음에는 시험관 내 연구에 의해 결정될 수 있지만 최종 개념 증명을 위해서는 생체 내 연구가 필요합니다. 우리의 목표는 연구자들이 대퇴골 축 골절 후 굳은 살 형성의 발달을 이해하는 데 도움이 될 수 있고 잠재적 약물이 뼈 치유 특성을 가지고 있는지 여부를 확인하는 데 도움이 될 수 있는 대퇴골 절골술 설치류 모델을 개발하는 것이었습니다. 성체 수컷 Wistar 흰둥이 쥐는 기관 동물 윤리위원회 승인 후 사용되었습니다. 설치류는 마취되었고, 무균 조건 하에서, 대퇴골 축의 중간 1/3에서 완전한 횡단 골절이 개방 절골술을 사용하여 생성되었다. 골절은 골수 내 K- 와이어를 사용하여 축소되고 내부적으로 고정되었으며 2 차 골절 치유가 이루어 졌다. 수술 후 복강 내 진통제와 항생제를 5 일 동안 투여했습니다. 매주 순차적으로 엑스레이를 통해 굳은살 형성을 평가했습니다. 쥐를 방사선 학적으로 미리 결정된 시점을 기준으로 희생 시켰고, 골절 캘러스의 발달은 면역 조직 화학을 사용하여 방사선 학적으로 분석되었습니다.
Introduction
뼈는 뼈 형성 세포, 조골 세포 및 뼈 흡수 세포인 파골 세포로 구성된 조밀한 결합 조직입니다. 골절 치유는 조골 세포와 파골 세포의 조정 된 작용에 의해 뼈 결함을 재생시키는 생리적 과정입니다1. 골절이있을 때, 골절 부위의 조골 세포 및 파골 세포 활성은 뼈 치유를 결정하는 중요한 요소 중 일부입니다2. 골절 치유가 정상적인 과정에서 벗어나면 지연된 결합, 부결합 또는 비유합이 발생합니다. 골절은 9개월 동안 골절의 유합이 실패하고 최근 3개월 동안 수리가 진행되지 않은 경우 비유합 상태라고 합니다3. 모든 골절의 약 10%-15%는 비유합으로 진행될 수 있는 수리 지연을 경험합니다4. 모든 골절에 대한 비유합률은 5%-10%이며 관련된 뼈와 골절 부위5에 따라 다릅니다.
골절 비유합 치료를 위한 현재 요법은 수술 및/또는 의료 양식을 포함합니다. 현재 골절의 지연 또는 비결합은 뼈 이식과 같은 수술 전략으로 극복할 수 있습니다. 그러나 뼈 이식에는 이식 조직의 가용성, 기증자 부위 통증, 이환율 및 감염과 같은 한계와 합병증이 있습니다6. 의학적 치료는 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 및 테리파라타이드(파라트호르몬 유사체)와 같은 골동화 약물로 구성됩니다. 현재 사용되는 골동화 작용제는 골절 복구를 증가시킬 가능성이 있지만 과도한 비용이나 바람직하지않은 부작용과 같은 제약이 있습니다7. 따라서 뼈 치유를 위한 비용 효율적인 비수술적 대안을 식별할 수 있는 여지가 있습니다. 약물의 뼈 치유 잠재력은 처음에는 시험관 내 연구에 의해 결정될 수 있지만 최종 개념 증명을 위해서는 생체 내 연구가 필요합니다. 뼈 치유를 향상시키는 것으로 알려진 약물은 시험관 내에서 평가되어야하며, 유망한 것으로 밝혀지면 생체 내 동물 모델 연구에 사용할 수 있습니다. 약물이 생체 내 모델에서 골 형성 및 리모델링을 촉진하는 것으로 입증되면 다음 단계 (즉, 임상 시험)로 진행할 수 있습니다.
동물의 골절 치유를 평가하는 것은 인간 실험을 거치기 전에 뼈 치유를 위해 도입 된 새로운 약제를 평가하기위한 논리적 단계입니다. 골절 치유의 생체내 동물 모델 연구를 위해, 설치류는 점점 더 인기 있는 모델8이 되었다. 설치류 모델은 낮은 운영 비용, 제한된 공간 필요성 및 뼈 치유에 필요한 시간 감소로 인해 관심이 증가하고 있습니다9. 또한 설치류는 광범위한 항체와 유전자 표적을 가지고있어 뼈 치유 및 재생의 분자 메커니즘에 대한 연구를 가능하게합니다10. 합의 회의는 다양한 작은 동물 뼈 치유 모델을 종합적으로 강조하고 뼈 치유에 영향을 미치는 다양한 매개 변수에 초점을 맞추고 몇 가지 작은 동물 골절 모델 및 임플란트를 강조했습니다11.
기본 파괴 모델은 크게 개방 또는 폐쇄 모델로 나눌 수 있습니다. 폐쇄 골절 모델은 뼈에 3점 또는 4점 굽힘력을 사용하며 기존의 외과적 접근이 필요하지 않습니다. 그들은 인간의 긴 뼈 골절과 유사한 비스듬한 또는 나선형 골절로 이어지지 만, 골절 위치 및 치수의 표준화 부족은12에서 교란 요인으로 작용할 수 있습니다. 개방 골절 모델은 뼈의 절골술을 위한 외과적 접근을 필요로 하고, 골절 부위에서 보다 일관된 골절 패턴을 달성하는 데 도움이 되지만, 폐쇄형 모델(13)에 비해 지연된 치유와 관련된다. 골절 치유를 연구하는 데 사용되는 뼈의 선택은 주로 크기와 접근성으로 인해 경골과 대퇴골로 남아 있습니다. 골절 부위의 선택은 일반적으로 골간 또는 골단입니다. 골단 영역은 골다공증 환자에서 골절 치유가 연구되는 경우에 특별히 선택되는데, 이는 골다공증이 골다공증14의 영향을 더 많이 받기 때문입니다. 골수 내 핀 및 외부 고정 장치와 같은 여러 임플란트를 사용하여 골절(11,15)을 안정화시킬 수 있습니다.
이 연구의 목적은 연구자들이 대퇴골 골절 후 굳은 살의 발달을 이해하는 데 도움이 될뿐만 아니라 잠재적 인 약물이 작용하는 메커니즘을 이해함으로써 뼈 치유 특성을 가지고 있는지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수있는 간단하고 따라하기 쉬운 설치류 모델을 개발하는 것이 었습니다.
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Protocol
동물 실험은 인도 뉴델리에 있는 AIIMS(286/IAEC-1/2021)에 있는 기관 동물 윤리 위원회(IAEC)의 윤리적 승인을 받은 후 수행되었습니다.
1. 수술 전 절차
- 집 수컷 Wistar 흰둥이 쥐 6-8 주령, 무게는 각각 150-200g 사이이며 중앙 동물 시설 (CAF)에서 별도의 개별 케이지에 있습니다. 이것은 여러 쥐가 새장을 공유 할 때 수술 / 골절 부위 부상을 보장하지 않습니다.
- 상대 습도가 50 % ± 5 % 인 습도가 조절 된 환경에서 쥐를 23 ° C ± 2 ° C의 온도로 유지하고 12 시간의 어둠 / 빛주기에 노출시키고 음식 (표준 반합성 식단) 에 자유롭게 접근 할 수 있도록하십시오 : 펠렛 다이어트 (건조) 및 물. 표준 반합성 식단의 구성은 다음과 같습니다 : 볶은 벵골 그램 가루 (60 %), 밀가루 (22 %), 카제인 (4 %), 탈지유 (5 %), 정제유 (4 %), 전분과의 소금 혼합물 (4.8 %) 및 전분과 비타민 콜린 혼합물 (0.2 %).
- 수술 전 최소 48 시간 동안 쥐를 순응시킵니다.
- 디지털 저울로 각 쥐의 무게를 측정하고 무게를 기록하십시오.
- 수술 시작 15분 전에 쥐에게 세푸록심(100mg/kg 체중), 트라마돌(25mg/kg 체중) 및 케타민(75mg/kg 체중)과 자일라진(10mg/kg 체중)의 조합의 복강(IP) 주사를 투여합니다. 안구 건조증을 예방하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
- 우측하지에서 옆구리에서 무릎 관절까지 머리카락을 제거하고 제모 크림을 국소 적으로 바르십시오.
참고: 혈액(0.5mL)은 다양한 매개변수의 기준선 분석을 위해 각 쥐의 꼬리 정맥에서 수집할 수 있습니다. 수술 후 2 주마다 혈액을 다시 채취 할 수 있습니다.
2. 개방 절골술을 통한 완전 횡단 골절 수술
참고: 수술대를 갖추고 최적의 주변 온도(26°C)가 있는 지정된 수술실을 사용하여 절차를 수행하십시오.
- 왁스 블록 (알루미늄 트레이 30cm x 30cm x 4cm, 깊이 2.5cm까지 왁스를 담은 4cm)을 수술대에 놓고 멸균 커튼으로 덮으십시오. 왁스 블록은 수술 중 동물의 위치 변화를 방지합니다.
- 마취의 시작을 확인하십시오 (발가락 핀치의 손실을 확인하여). 마취 된 쥐를 왼쪽 측면 위치의 멸균 드레이프에 놓습니다. 보조자에게 오른쪽하지(무릎과 엉덩이)를 확장하도록 요청하십시오. 대퇴골을지지하기 위해 오른쪽 다리 아래에 멸균 된 하드 지지대 (대리석 블록)를 유지하십시오. 알코올과 베타 딘으로 수술 부위를 청소하십시오.
- 절개 부위 (오른쪽 허벅지의 측면)에 국소 마취 (1 % 리그 노 카인 0.25mL)를 주사하고 다른 멸균 드레이프에 구멍을 뚫고 수술을 위해 쥐의 오른쪽 다리 만 노출시킵니다.
- 오른쪽 허벅지 옆쪽에 수직 1cm 피부 절개를 하고 15번 수술용 칼날로 필요에 따라 확장합니다.
- Metzenbaum 가위를 사용하여 깊은 근막을 분리하여 광대 한 측면 근육을 노출시킵니다. 대퇴골의 축에 도달 할 때까지 동맥 집게를 사용하여 근육 섬유와 일치하도록 광대 한 외측을 나눕니다.
- 골막 엘리베이터를 사용하여 뼈에 부착 된 근육에서 뼈를 제거하십시오.
- 혈관 미주신경 반사를 방지하기 위해 골막 안팎에 국소 마취 (1 % 리그 노 카인 0.2mL)를 주사하십시오.
- 15번 수술용 칼날을 사용하여 대퇴골 축의 중간 1/3에 움푹 들어간 곳을 만들고, 움푹 들어간 곳에 끌을 놓고(끌이 미끄러지지 않도록) 망치로 끌을 가볍게 두드려 축의 중간 1/3에 있는 뼈를 골절(완전 골절)합니다. 멸균 하드 지지대(대리석 블록)를 사용하여 뼈를 지지하는 동안 뼈를 파쇄하여 깨끗한 파손을 보장합니다.
알림: 멸균 하드 지지대는 일반적으로 아래 근육에 심각한 부상을 입히지 않습니다. - 배터리로 작동되는 파워 드릴을 사용하여 멸균 된 K- 와이어 (1.0mm)를 사용하여 내부적으로 골절을 고정하십시오. K- 와이어를 골절 부위를 통해 원위 조각의 수질 운하로 통과시킵니다. 그런 다음 배터리로 작동되는 전동 드릴을 사용하여 대퇴골의 말단부를 통해 K-와이어를 뚫습니다.
알림: 사용하기 전에 전동 드릴 표면을 알코올로 소독하십시오. K-와이어를 고정한 후 장갑을 교체하십시오. - 골절을 줄인 후, K- 와이어를 말단부에서 근위 조각의 운하로 전진시켜 trochanteric 영역에서 구입할 때까지 전진시킵니다. 와이어 커터를 사용하여 피부를 통해 튀어 나온 K- 와이어의 말단 부분을 잘라냅니다.
- 플라이어를 사용하여 K-와이어 끝을 약 90°로 구부리고 핀 사이트 드레싱을 위해 베타딘에 적신 거즈 붕대를 사용합니다. K- 와이어는 골절을 감소 된 위치로 유지하기위한 골수 내 부목 역할을합니다.
- 3-0 나일론 봉합사를 사용하여 피부를 닫기 전에 완전한 지혈을 확인하십시오. 멸균 거즈 또는 동맥 집게를 사용하여 출혈 부위에 압력을 가하여 출혈을 멈추십시오.
- 베타딘으로 상처를 닦고 멸균 거즈와 미세 기공 접착 테이프로 덮으십시오.
3. 수술 후 관리
- 쥐를 새장으로 돌려 보내고, 정상적인 보행을 허용하고, 항생제 (주사 세푸 록심 100 mg / kg) 및 진통제 (주사 트라마돌 25 mg / kg / 일)를 희생 할 때까지 표준 반합성 식단을 계속 제공하십시오 시술 후 5 일 동안 복강 내.
참고: 쥐는 특정 약물을 테스트하기 위해 치료 그룹과 대조군으로 나눌 수 있습니다. 약물이 수용성인 경우 위관영양을 통해 경구 투여할 수 있습니다. 개별 동물의 무게는 사용되는 약물의 투여량을 계산하기 위해 기록될 수 있다. 동물 그룹의 동질성을 보장하기 위해 포함 및 제외 기준을 따를 수 있습니다. - 수술 전 기간과 비슷한 조건에서 개별 케이지에 동물을 수용하십시오. 수술 후 통증, 상처 감염, 봉합사 미끄러짐, 복부 부종이나 불편함의 징후를 찾기 위해 매일 수술 부위를 검사하십시오.
- 일주일에 한 번 골절 부위의 X- 레이로 뼈 치유를 평가하십시오.
4. 방사선 절차
- X- 레이 전에 케타민 (50mg / kg 체중)과 자일 라진 (5mg / kg 체중)을 복강 주사하여 쥐를 마취시킵니다.
- 쥐의 고관절을 구부리고 외전 된 자세로 유지하면서 무릎 관절은 다음과 같은 노출 설정으로 골절 된 사지의 X- 레이를 촬영하기 위해 반 구부러진 상태로 유지합니다 : 참조 kVp ≈ 62; 참조 mAS = 6.4; 및 자동 노출 설정(참조 mA=160).
참고: X-레이는 기준선(수술 후 1일)에 촬영한 다음 희생될 때까지 또는 5주까지 매주 한 번 촬영했습니다.
5. 동물 안락사 및 굳은 살 회수
- 부드럽고 단단한 브리징 굳은 살의 방사선 학적 외관에 따라 이전에 결정된 두 시점에서 이산화탄소 과다 복용 (1 분 동안 7-8 L / min의 유속으로 100 % CO2 투여, 4-5 분의 대기 기간)으로 쥐를 희생하십시오.
- 대퇴골과 평행하게 피부를 절개하고 굳은 살이 살의 손상을 피하기 위해 위에 놓인 근육을 조심스럽게 분리하십시오.
- 망치와 끌을 사용하여 고관절과 굳은 살 조직 사이의 뼈를 골절시킵니다. 마찬가지로 굳은 살과 무릎 관절 사이의 뼈를 골절시킵니다. K-와이어를 제거하고 뼈 조각을 식염수로 청소하여 혈전과 연조직을 제거합니다.
- 캘러스를 즉시 10% 중성 완충 포르말린(샘플당 20mL)이 포함된 라벨이 부착된 용기에 옮기고 실온(RT)에서 3일 동안 보관합니다.
6. 뼈와 굳은 살 조직의 석회질 제거
- 포르말린에서 캘러스 조직을 채취하여 뼈 조직의 석회질 제거를 위해 20 % ETDA 용액 (pH 7)에서 RT로 유지하십시오.
- 약 3주 동안 2일마다 신선한 EDTA 용액을 교체하고 캘러스 조직을 방해하지 않고 바늘로 뼈를 찔러 뼈 석회질 제거를 확인합니다. 최적의 석회 제거는 뼈 조직의 정상적인 거친 감각의 상실로 표시됩니다.
- 석회 제거가 완료되면 캘러스의 시상 부분을 자르고 캘러스 조직의 파라핀 블록을 준비하십시오. 조직 병리학적 16 및 다른 비교 분석17을 위해 캘러스 조직의 4 μm 두께 섹션을 절단합니다.
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Representative Results
이 연구는 Wistar 알비노 쥐에서 대퇴골 절골술 모델을 개발하기 위해 수행되었습니다. 이 모델은 뼈 치유뿐만 아니라 뼈 치유에서 유망한 골동화 작용의 골 형성 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 표준 수술 예방 조치와 프로토콜을 따랐습니다. 멸균 가운, 커튼 및 수술 장비가 절차에 사용되었습니다(그림 1). 장비(표 1)는 수술 48시간 전에 멸균하였다. 마취제, 진통제 및 항생제는 동물이 항상 통증과 감염이 없도록 유지하기 위해 프로토콜에 따라 사용되었습니다. 혈액 (0.5 mL)은 골절 치유가 발생할 때 기준선 분석 및 다른 매개 변수의 순차적 연대순 비교 후속 조치를 위해 각 쥐의 꼬리 정맥에서 수집 할 수 있습니다. 모발은 제모 크림을 이용하여 옆구리에서 무릎 부위로 제거하였다(도 2). 절골술 절차는 완료하는 데 약 10분이 걸렸습니다(첫 번째 절개에서 봉합까지). 감염과 사망률은 무균 예방 조치를 따를 때 무시할 수 있었습니다. 국소 마취 (lignocaine) 후 절개를하고, 대퇴골의 축은 외측 광대 섬유를 수축시킨 후 노출되었습니다 (그림 3). 끌이 미끄러지지 않도록 수술 날을 사용하여 뼈에 움푹 들어간 곳 (홈)을 만들었습니다. 멸균 하드 지지대(대리석 블록)를 사용하여 뼈를 파쇄하면서 뼈를 지지하여 깨끗한 파손을 보장했습니다(그림 1). 끌과 망치를 사용하여 대퇴골 축의 중간 1/3에 완전한 횡단 골절이 유도되었습니다(그림 4).
파단은 멸균 K-와이어(1.0 mm)를 사용하여 내부적으로 고정되었습니다. K- 와이어는 골절 부위를 통해 원위 조각의 수질 운하로 전달되었습니다. 그런 다음 K-와이어를 대퇴골의 말단부를 통해 뚫었습니다. 골절이 감소된 다음 K-와이어가 말단부에서 근위 단편의 운하로 전진하여 트로챈터릭 영역에서 구입을 얻었습니다. 피부를 통해 튀어 나온 K- 와이어의 말단 부분이 잘렸다. K-와이어는 골절을 감소된 위치로 유지하기 위해 골수 내 부목 역할을 했습니다(그림 5).
방사선 전문의가 평가한 바와 같이 수술 후 1일 후와 그 후 매주 골절 부위의 X-레이를 촬영하여 굳은살의 모양(골절 치유 시작)과 가교 굳은살의 모양(골절 간격이 치유된 첫 번째 시점)을 평가했습니다(그림 6). 골절 치유의 비교 평가를 위한 두 가지 방사선학적 시점은 (부드러운) 굳은살의 출현(시각화)과 가교(단단한) 굳은살의 출현이었다.
희생 후, 대퇴골은 포르말린에서 조심스럽게 보존되었고, 뼈 석회화를위한 프로토콜이 뒤 따랐다(그림 7). K- 와이어는 굳은 살을 방해하지 않도록주의하면서 희생 중에 제거되었습니다. 완전한 석회질 제거 후, 뼈를 시상 절편으로 절단하고 필요에 따라 절편 (4 μm 두께 절편)을 위해 파라핀 블록에 보존했다. 골절 부위와 굳은살의 헤마톡실린 및 에오신 염색 부분은 5주 후에 연골과 새로운 뼈 형성을 확인했습니다(그림 8).
그림 1: 수술대의 수술용 드레이프에 보관된 멸균 수술 기구. 외과의 사는 멸균기구로 멸균 환경에서 수술 절차를 시작할 준비가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수술대에 보관된 마취된 쥐. 쥐에게 마취를하고 절개 부위 주변의 머리카락을 제거한 후 수술대에 왼쪽 측면 위치에 보관하여 절골술을 위해 오른쪽 다리를 노출시킵니다. 또 다른 수술용 드레이프는 오른쪽 다리를 해당 드레이프의 구멍을 통과시켜 다리만 노출되도록 하여 상처 감염을 최소화하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 수술 절차 : 쥐 대퇴골의 축 노출. 절골술 중에 외측광대가 노출된 후 근육 섬유와 나란히 분할되어 대퇴골의 축을 노출시킵니다. 뼈는 골막 엘리베이터를 사용하여 부착 된 근육에서 해방됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 끌과 망치를 사용하여 대퇴골 축의 중간 1/3에 완전한 횡단 절골술을 만듭니다. 완전한 횡단 골절은 망치로 끌을 부드럽게 두드려 대퇴골 축의 중간 1/3에 생성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: K-와이어는 골절을 감소된 위치로 유지하기 위한 골수 내 부목 역할을 합니다. K- 와이어는 골절 부위를 통해 원위 조각의 수질 운하로 전달됩니다. 그런 다음 K- 와이어는 대퇴골의 말단부를 통해 뚫립니다. 골절이 감소된 다음 K-와이어는 말단부에서 근위 조각의 운하로 전진하여 trochanteric 영역에서 구입을 얻습니다. 이것은 배터리로 작동되는 파워 드릴을 사용하여 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: K-와이어를 사용한 쥐의 대퇴골의 X선 (A) 골절 유도 전 및 (B) 수술 후 1일. 골절 치유는 굳은 살 형성을 방사선 학적으로 평가하기 위해 수술 부위의 순차적 인 주간 X- 레이를 촬영하여 방사선 학적으로 모니터링됩니다. 골절은 골수 내 K- 와이어로 감소되고 고정되어 있습니다. 전후 대표 데이터는 동일한 동물에서 나온 것이 아닙니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 미리 결정된 시점에서 동물을 희생한 후 얻은 굳은살이 있는 뼈(최적의 석회질 제거 후). (A) 온전한 캘러스; (B) 굳은 살의 시상 부분. 동물을 희생시킨 후, 골절 부위의 면적을 얻어지고, 보존하고, 설명 된 방법론을 사용하여 석회질을 제거합니다. 캘러스는 다른 기술(센티미터 단위의 기준 척도)로 평가하기 전에 최적의 석회질 제거를 보장하기 위해 간헐적으로 평가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 헤마톡실린-및-에오신-염색된 골절 부위의 부분은 연골 및 신생 뼈의 형성과 함께 단단한 굳은살을 보여준다. (A) 저배율; (B) 고배율. 골절 부위의 헤마톡실린 및 에오신 염색 부분은 연골(검은색 화살표)과 새로운 뼈(노란색 화살표)가 형성되는 단단한 굳은살을 보여줍니다(A: 40x; B: 100x). 파란색 화살표는 뼈의 골절 끝을 나타내고 빨간색 화살표는 두 번째 피질 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법은 Wistar 알비노 쥐에서 골절 절골술 모델을 개발하는 데 필요한 세부 사항을 명쾌하게 설명합니다. 이 모델은 골절 치유에서 유망한 골동화 작용 약물의 골 형성 효과를 평가하고 뼈 치유의 복잡성을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 두드러진 특징은 간단하고 너무 많은 시간이나 정교한 장비가 필요하지 않다는 것입니다. 이 방법에서는 성체 수컷 Wistar 알비노 랫트를 실험을 위한 설치류 모델로 선정하였다. 성 호르몬과 관련된 뼈 치유에 대한 교란 요인을 제거하기 위해 균일 한 성별이 선택되었습니다.
이 연구는 다른 그룹과 다른 작은 동물 모델11,18,19가 따르는 것과 유사한 개방 절골술 절차를 따랐습니다. 다른 뼈 치유 모델에 비해이 방법에서 따르는 개방 절골술의 장점은 부상 유발 (완전 피질 뼈 골절)이 규칙적인 긴 뼈 골절과 유사하고,이 방법의 골절 치유는 드릴 구멍 뼈 손상에 비해 굳은 살 형성에 의한 2 차 골 치유 (연골 골화)가있는 일반 골절과 유사하다는 것입니다. 일차 뼈 치유가있는 곳 (막 내 골화)20. 개방 절골술의 방법은 또한 폐쇄 절골술 또는 3 점 압력 유도 방법보다 우수하며, 뼈가 부서지고 골절 선의 편차가 커서 골절 치유의 차이를 초래합니다21. 개방성 절골술은 폐쇄성 절골술에 비해 상처 감염 가능성을 증가시키지만 다른 연구와 마찬가지로 적절한 예방 조치를 취하면 상처 감염이 무시할 수 있음을 관찰했습니다.22. 또한이 방법론에서 끌과 망치로 파쇄하기 전에 칼날로 뼈에 홈 (움푹 들어간 곳)을 만들면 균일 한 골절 선을 만들고 뼈에 끌이 미끄러지는 것을 방지 할 수 있습니다. 이 방법에서 도입 한 또 다른 수정 사항은 골절 될 뼈 아래에 단단하고 멸균 된 블록을 유지하는 것이 었습니다. 이것은 골절을 만드는 동안 반력을 제공했을뿐만 아니라 부서 지거나 부서 지거나 불규칙한 골절 선을 피하는 데 도움이되었습니다. 이것은 일반적으로 아래 근육에 심각한 부상을 입히지 않습니다.
우리의 연구는 완전한 실험을 시작하기 전에 동물의 첫 번째 시점으로 굳은 살의 방사선 학적 외관과 두 번째 시점으로 브리징 (단단한) 캘러스의 출현을 기반으로 희생 시점을 결정하기 위해 X- 레이를 사용했습니다. 조골세포 및 파골세포성 마커의 면역조직화학적 분석을 사용하여 그들의 굳은살을 비교하기 위해 임의의 치료 또는 대조군이 특정 시점에 도달할 때 동물의 전체 비교 그룹을 희생시켜야 한다. 이것은 다른 치료 그룹과 대조군 간의 편견없는 비교를 보장합니다. 쥐의 골절 부위의 X 선은 매주 간격으로 수행되어야하며, 혈액 샘플 (꼬리 정맥)은 각각의 희생 시점에 도달 할 때까지 2 주 간격으로 채취해야합니다. 방사선 전문의(대조군 및 치료 그룹에 눈이 멀었음)에 의해 굳은살 형성을 평가하기 위해 매주 엑스레이(마취 하에)를 수행했습니다. X- 레이는 또한 뼈 치유의 생물학적 매개 변수를 입증하고 확증하는 데 도움이되었습니다.
이 방법은 골절을 감소 된 위치에 고정시키기 위해 K- 와이어를 골수 내 부목으로 적용하는 것을 포함합니다. 그러나 골수 내 핀 고정은 도금 및 외부 고정 장치와 마찬가지로 골절에 절대적인 안정성을 제공하지 않으며 때때로 상처 감염, 핀 이동, 대퇴골 축 피질 천공 등과 같은 합병증과 관련 될 수 있습니다. 우리의 연구는 또한 매우 통증에 민감한 골막 안팎에 리그노카인을 주사하는 것이 더 낫다고 제안합니다. 이것은 절골술 중 심한 통증과 신경 인성 쇼크의 가능성을 예방합니다. 또한 복강 주사량을 낮게 유지하는 것이 쥐의 후속 호흡 곤란을 최소화하는 데 도움이된다는 것이 관찰되었습니다. 통증이나 감염을 예방하기 위해 수술 후 5일 동안 진통제와 항생제를 계속했습니다. 본 연구에서는 접근하기 쉽고, 깨끗하게 부러지기 쉽고, K선 삽입이 용이한 직선 윤곽 때문에 골절을 유도하기 위해 대퇴골을 선택했습니다. K-와이어가 대퇴골의 근위 조각으로 전진할 때는 대퇴 동맥을 손상시켜 출혈의 위험이 있으므로 주의해야 합니다. 쥐는 너무 많은 잔류 와이어가 피부 밖으로 튀어 나오면 K- 와이어를 뽑는 경향이 있음이 관찰되었습니다.
뼈 치유 결과의 매개 변수는 동물의 혈액과 굳은 살 (다양한 그룹 및 다른 시점)의 조골 세포 및 파골 세포 마커입니다. 조골 세포 마커의 경우 오스테오칼신, Col1A1, RANKL, P1NP 및 뼈 특이적 알칼리성 포스파타제를 선택할 수 있고 CTX 및 RANK를 평가하여 파골세포 활성을 평가할 수 있습니다. 이러한 매개 변수 중 일부는 혈청에서 평가할 수 있고 다른 매개 변수는 캘러스 조직에서 면역 조직 화학으로 평가할 수 있습니다. 이러한 매개 변수는 조골 세포 및 파골 세포 활동을 동시에 평가하여 뼈 리모델링에 대한 전체적인 관점을 제공합니다.
이 연구의 한계는 굳은 살의 인장 강도를 평가하지 않는다는 것입니다. 이상적으로 생체 역학 연구는 데이터에 가치를 더합니다. 석회질 제거를 위해 캘러스와 인접한 뼈 조직을 처리하는 동안, 불완전한 석회 제거는 면역 조직 화학에서 최적의 결과를 제공하지 않기 때문에주의를 기울여야합니다.
설치류 모델을 사용하여 골절 치유를 평가하는이 프로토콜은 osteoanabolic 활성을 가진 유망한 약물을 평가하려는 모든 그룹에 유용 할 것입니다. 설치류 모델에서 뼈 및 골절 치유를 정확하게 평가하는 동시에 조골 세포 및 파골 세포 활성과 뼈 리모델링을 평가하는 간단한 모델로, 유용한 기계 론적 통찰력을 제공합니다. 동물의 수를 중심으로 한 자원과 물류가 허용되는 경우, 골절 치유의 방사선 학적 평가와 치유 된 뼈의 기계적 키를 평가하는 인장 강도를 비교하여 생물학적 지표를 강화할 수 있습니다. 작용 메커니즘을 설명하는 연구는 순전히 관찰 연구보다 선호됩니다.
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Disclosures
저자 중 누구도 이해 상충이나 기타 재무 공개가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 동종 요법 연구를위한 중앙 협의회 (CCRH), AYUSH 사역, 인도 정부, 연구 자금에 감사드립니다. 저자는 동물 실험에 대한 도움과 지원에 대해 뉴 델리의 AIIMS에있는 Central Animal Facility의 도움과 지원과 지원에 감사하며, 사진 및 비디오 촬영에 대한 도움과 지원에 대해 뉴 델리의 CMET, AIIMS에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
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