Summary
يظهر هنا وصف للعزل المباشر والسريع نسبيا للحمض النووي الجينومي Caenorhabditis elegans من واحد أو عدد قليل من الحيوانات باستخدام مجموعة أنسجة متاحة تجاريا. إعداد gDNA الناتج هو قالب مناسب ل PCR.
Abstract
استخراج الحمض النووي الجينومي من واحد أو عدد قليل من Caenorhabditis elegans له العديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك PCR لخطوط التنميط الجيني والاستنساخ والتسلسل. تستغرق الطرق التقليدية القائمة على البروتين K لاستخراج الحمض النووي الجيني من C. elegans عدة ساعات. مجموعات الاستخراج التجارية التي تكسر بشكل فعال بشرة C. elegans واستخراج الحمض النووي الجينومي محدودة. يتم الإبلاغ هنا عن طريقة سهلة وأسرع (~ 15 دقيقة) وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجينومي C. elegans الذي يعمل بشكل جيد لتطبيقات الفصول الدراسية والبحوث. تم تحسين طريقة استخراج الحمض النووي هذه لاستخدام اليرقات المتأخرة (L4) أو الديدان الخيطية البالغة كمادة أولية للحصول على قالب موثوق به لأداء PCR. تشير النتائج إلى أن جودة الحمض النووي مناسبة لتضخيم الأهداف الجينية ذات الأحجام المختلفة بواسطة PCR ، مما يسمح بالتنميط الجيني لحيوان واحد أو عدد قليل حتى عند التخفيف إلى واحد من خمسين من الحمض النووي الجيني من شخص بالغ واحد لكل تفاعل. يمكن استخدام البروتوكولات المبلغ عنها بشكل موثوق لإنتاج قالب الحمض النووي بسرعة من عينة واحدة أو صغيرة من C. elegans للتطبيقات القائمة على PCR.
Introduction
هنا ، يتم تقديم بروتوكولين مرتبطين بتحلل Caenorhabditis elegans لجعل الحمض النووي متاحا للتطبيقات القائمة على PCR. PCR هي تقنية جزيئية شائعة الاستخدام تستخدم للعديد من التطبيقات ، بما في ذلك التنميط الجيني وتضخيم شظايا الحمض النووي للاستنساخ والتسلسل ، من بين أمور أخرى. الدودة المستديرة الصغيرة (1 مم) التي تعيش بحرية C. elegans هي نظام حيواني شائع للبحوث البيولوجية. الحصول على الحمض النووي الجينومي المناسب من واحد أو عدد قليل من الحيوانات يكفي لتضخيم التسلسل بواسطة PCR. تحتوي يرقات L4 المتأخرة والبالغين على حوالي 1000 خلية جسدية فقط (بما في ذلك بعض الخلايا متعددة النواة ومتعددة الصبغيات) ، والخلايا الجرثومية ، و (إذا كان الحيوان خنثى محبوذا) ذرية في الرحم1. ومع ذلك ، فإن هذه الحيوانات محمية بواسطة بشرة يجب تعطيلها لاستخراج الحمض النووي الجينومي2. تتضمن الطرق القياسية لإعداد قالب الحمض النووي الجيني الخيطي ل PCR خطوات متعددة وتستغرق عدة ساعات. يتم تجميد الحيوانات أولا في مخزن تحلل الدودة الذي يحتوي على بروتين K (-70 درجة مئوية أو أقل) لمدة 15-45 دقيقة على الأقل (يوصى ببعض البروتوكولات بفترة أطول) 3،4،5،6. هذه الخطوة الشقوق فتح الحيوانات.
بعد التجميد ، يتم تحضين الحيوانات لمدة 1 ساعة عند 60-65 درجة مئوية حتى يعمل البروتين K ، ثم يتم تعطيل الإنزيم لمدة 15-30 دقيقة عند 95 درجة مئوية. البروتيناز K يدمر النوكليز الذي يتحلل الحمض النووي. يعد تعطيل البروتين K قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل أمرا مهما لمنع البروتين K من تدهور بوليميراز الحمض النووي. البروتوكولان القائمان على المجموعة الموصوفان هنا هما طريقتان سريعتان وموثوقتان وفعالتان من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجيني من واحد أو عدد قليل من الديدان الخيطية للبحث اليومي وتدريس التطبيقات المختبرية. تم تحسين المجموعة المستخدمة في الأصل من قبل الشركة المصنعة لاستخراج الحمض النووي من الأنسجة الحيوانية واللعاب والشعر7. ويستخدم حل إعداد الأنسجة الملكية وحل استخراج لتحليل الخلايا وجعل الحمض النووي الجينومي في متناول اليد. ثم يقوم حل تحييد الملكية بتحييد المكونات التي قد تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل (على سبيل المثال ، الأملاح والأيونات والجزيئات المرتبطة ب Mg2+).
عند التنميط الجيني ، يمكن اختبار واحد. عند تحديد ما إذا كانت السلالة متماثلة الزيجوت ، فإن اختبار ستة أو أكثر من النسل من واحد يعطي ثقة عالية بأن الخط متماثل الزيجوت أم لا (هناك فرصة بنسبة 0.02٪ لاختيار ستة ذرية متحولة متماثلة الزيجوت عشوائيا من أحد الوالدين غير المتجانسين [(1/4)6 × 100٪ = 0.02٪]). هذه الطريقة 1) مباشرة ، مع خطوات أقل من طريقة proteinase K ، و 2) تقلل من وقت إعداد القالب إلى 15 دقيقة. تظهر النتائج في هذا العمل أن البروتوكول المطور يعمل بقوة في استخراج الحمض النووي الجيني من ديدان مفردة أو قليلة ، والتي يمكن استخدامها بشكل موثوق في التطبيقات النهائية التي لا تتطلب الحمض النووي عالي النقاء ، بما في ذلك PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C. صيانة elegans
ملاحظة: تم الحفاظ على سلالات N2 (النوع البري) و blmp-1 (tm548) C. elegans على لوحات وسائط نمو الديدان الخيطية القياسية (NGM) عند 20 درجة مئوية.
- تحضير لوحات NGM عن طريق إذابة 23.005 غرام من مسحوق NGM في 973 مل من الماء في قارورة 2 لتر. قم بتغطية فتحة القارورة بورق الألومنيوم (أو غطاء قابل للتعقيم يسمح بالتهوية) وقم بتأمين الغطاء بشريط الأوتوكلاف. الأوتوكلاف لإذابة المسحوق وتعقيم المحتويات بدورة تعقيم لا تقل عن 30 دقيقة.
- تبريد المتوسطة إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي.
- إلى الوسط المبرد ، أضف 25 مل من الفوسفات المعقم 1 م (KH2PO4) المخزن المؤقت ، الرقم الهيدروجيني 6.0 ؛ 1 مل من محلول كلوريد الكالسيوم 1 م ؛ و 1 مل من محلول كبريتات المغنيسيوم 1 م.
- حرك الوسط على صفيحة تحريك مغناطيسية للحصول على خليط متجانس ولمنع التبريد والتصلب غير المتكافئين (~ 5 دقائق). تأكد من أن شريط التحريك يدور بسرعة كافية لإنشاء دوامة ولكن ليس بسرعة كبيرة بحيث يتم إدخال فقاعات (~ 250-300 دورة في الدقيقة).
- صب ~ 25 مل من الوسط في كل لوحة بتري 10 سم (~ 40 لوحة في المجموع). جفف الألواح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها (عادة 16-25 درجة مئوية).
- تنمو مستعمرة من الإشريكية القولونية OP50 في 30-50 مل من مرق LB بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
- قم بزرع كل طبق يحتوي على 500 ميكرولتر من ثقافة E. coli OP50 واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام (عادة 16-25 درجة مئوية)8. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
- انقل C. elegans إلى ألواح البذور باستخدام معول سلكي أو طريقة أخرى واتركها تنمو إلى L4 أو مرحلة البالغين عند درجة الحرارة المطلوبة للسلالة (عادة 16-25 درجة مئوية ، 1-2 أيام إذا كانت الحيوانات مطلية جوعا كداور ، 3-4 أيام إذا كانت الحيوانات مطلية كأجنة)8.
2. استخراج الحمض النووي للدودة الواحدة
ملاحظة: هذه الطريقة مفيدة لاستخراج الحمض النووي من دودة واحدة (دودة واحدة في 1.8 ميكرولتر من الحجم الكلي). يمكن عمل مزيج رئيسي إذا تم تحليل ديدان متعددة في وقت واحد.
- قم ببرمجة دورة حرارية لدورة واحدة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (برنامج التحلل).
- Aliquot 0.8 ميكرولتر من محلول الاستخراج من المجموعة على الجدار الداخلي لأنبوب PCR 0.2 مل على الجليد. أضف 0.2 ميكرولتر من محلول تحضير الأنسجة من المجموعة إلى قطرة محلول الاستخراج. اخلط عن طريق السحب.
- تحديد L4 أو بالغ تحت المجهر تشريح9. لتحديد خنثى L4 ، ابحث عن فرج مميز مرئي كنصف دائرة شاحبة في منتصف الحيوان. تحديد الخنثى البالغ من خلال البحث عن أكبر الحيوانات على اللوحة التي قد تحتوي على أجنة بيضاوية مرئية في رحمها.
- باستخدام اختيار سلك بلاتيني ، انقل الحيوان المحدد إلى الحل10.
- قم بالطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم) في درجة حرارة الغرفة لجمع المحتويات في أسفل الأنبوب.
- ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج التحلل المعين في الخطوة 2.1.
- عند اكتمال البرنامج ، قم بطرد مركزي الأنبوب لفترة وجيزة ووضعه على الجليد. أضف 0.8 ميكرولتر من محلول التحييد من المجموعة إلى الخليط. اخلط عن طريق السحب.
- قم بطرد الأنبوب لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم).
- استخدم الليزات مباشرة لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو قم بتخزينه عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
ملاحظة: الحمض النووي المستخرج مستقر عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل7.
3. استخراج الحمض النووي لعدد قليل من الأفراد
ملاحظة: هذه الطريقة مفيدة لاستخراج الحمض النووي من عدد قليل من الديدان. يمكن تحضير مزيج رئيسي إذا تم تحليل سلالات متعددة في وقت واحد.
- قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري لدورة واحدة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق متبوعا ب 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (برنامج التحلل).
- Aliquot 2.0 ميكرولتر من محلول الاستخراج من المجموعة على الجدار الداخلي لأنبوب PCR 0.2 مل على الجليد. أضف 0.5 ميكرولتر من محلول تحضير الأنسجة من المجموعة إلى قطرة محلول الاستخراج. اخلط عن طريق السحب.
- تحديد L4 أو الحيوانات البالغة تحت المجهر تشريح9. يحتوي الخنثى L4 على فرج مميز مرئي كنصف دائرة شاحبة في منتصف الحيوان. الخنثى البالغ هو أكبر الحيوانات على الصفيحة وقد يكون لديه أجنة بيضاوية مرئية في رحمه.
- باستخدام اختيار سلك بلاتيني ، انقل بعض الحيوانات إلى المحلول: 9 تنتج ما يعادل حيوانا واحدا من الحمض النووي الجينومي لكل 0.5 ميكرولتر من الليزات ، و 16 حيوانا ينتج ~ 1 مكافئ حيواني من الحمض النووي الجينومي في 0.25 ميكرولتر (3.5 نيماتودا / ميكرولتر) 10.
ملاحظة: من الصعب نقل أكثر من 16 حيوانا إلى هذا المجلد. - قم بطرد الأنبوب لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم).
- ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج التحلل المعين في الخطوة 3.1.
- عند اكتمال البرنامج ، قم بطرد مركزي الأنبوب لفترة وجيزة ووضعه على الجليد. أضف 2 ميكرولتر من محلول التحييد من المجموعة إلى الخليط. اخلط عن طريق السحب.
- قم بطرد الأنبوب لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (2-3 ثوان ، ≤6000 دورة في الدقيقة / 2000 × جم).
- استخدم التحلل مباشرة لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو قم بتخزينه عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
ملاحظة: الحمض النووي المستخرج مستقر عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل7.
4. تفاعل البوليميراز المتسلسل
ملاحظة: يتم وصف أحد التطبيقات النهائية لتقنية تحلل الدودة هذه ، وهو اكتشاف طفرة حذف باستخدام بوليميراز سريع. كما تم إثبات فعالية بروتوكولي تحلل الدودة في إنتاج الحمض النووي لقالب الجينوم لنجاح تفاعل البوليميراز المتسلسل عند التخفيف إلى 1/50 منالدودة لكل تفاعل.
- استخراج الحمض النووي من دودة واحدة و 16 دودة باستخدام النوع البري N2 والسلالات المتحولة ، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2 والخطوة 3.
- قم بإعداد تخفيفات 2 و 10 و 20 و 50 ضعفا من الحمض النووي أحادي الدودة من الحيوانات البرية N2.
- قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام الاشعال الخاصة بتسلسل الاهتمام والمزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (الجدول 1 والجدول 2). استخدم 1 ميكرولتر من الحمض النووي غير المخفف أو 2 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف كقالب في كل تفاعل.
- تأكد من منتجات PCR عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي والتصوير11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخراج الحمض النووي الجيني من شخص واحد أو عدد قليل من البالغين من النوع البري باستخدام المجموعة التجارية أو بروتوكول التحلل التقليدي لمقارنة فعالية هاتين الطريقتين. ثم تم استخدام هذه الليزات كقوالب ل PCR لتضخيم إما هدف أكبر من ~ 2,100 bp (ترميز blmp-1) أو هدف أصغر من ~ 500 bp (ترميز جزء من sma-10). وأسفرت كلتا الطريقتين بنجاح عن منتجات PCR مناسبة (الشكل 1 ألف).
بعد ذلك ، تم إثبات قدرة الحمض النووي الجينومي المستخرج من المجموعة على العمل كقالب لمجموعة متنوعة من بوليميراز الحمض النووي. تم استخدام الحمض النووي الجينومي المستخرج كقالب لتضخيم منتج 0.5 كيلو بايت باستخدام أربعة بوليميراز تمتلك قدرات مختلفة (بما في ذلك السرعة والإخلاص وحجم المنتج). تم إنشاء منتجات ذات أحجام متوقعة بواسطة هذه البوليميراز باستخدام قالب من تحلل شخص بالغ واحد أو تحلل تسعة أشخاص بالغين (الشكل 1B). يمكن تأكيد تسلسل القالب ودقة بوليميراز PCR لتضخيم تسلسل القالب بشكل صحيح عن طريق التسلسل (الشكل التكميلي S1). توضح هذه النتيجة أن الحمض النووي الجينومي المستخرج من بروتوكولات المجموعة يوفر نموذجا مناسبا لمجموعة من البوليمرات.
تم اختبار فعالية تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام تركيزات مختلفة من الحمض النووي الجينومي المستخرج من واحد باستخدام المجموعة التجارية. تم تخفيف الحمض النووي بمقدار 2 أو 10 أو 20 أو 50 ضعفا ، وتم استخدام ما يعادل حوالي نصف وعشر وعشرين وخمسينيات دودة لكل تفاعل لتفاعل البوليميراز المتسلسل. دعمت تركيزات قالب الحمض النووي هذه تضخيم إما هدف أكبر يبلغ ~ 2.1 كيلو بايت أو هدف أصغر يبلغ ~ 0.5 كيلو بايت (الشكل 1C)12. في حين لوحظ عائد يعتمد على تركيز الحمض النووي لمنتج PCR 0.5 كيلو بايت ، بدا أن عائد منتج PCR البالغ 2.1 كيلو بايت متساو في جميع التفاعلات.
لإثبات أن هذه البروتوكولات تنتج الحمض النووي الجينومي من C. elegans المناسب للتنميط الجيني PCR ، تم استخراج الحمض النووي الجيني من طفرات أحادية و 16 من النوع البري و blmp-1 لفقدان الوظيفة (blmp-1 (tm548)). يشفر جين blmp-1 عامل نسخ له أدوار مهمة في هجرة الخلايا الطرفية البعيدة وحجم الجسم والتطور12،13،14،15،16. يحتوي المتحور blmp-1 على حذف 810 نقطة أساس يزيل أجزاء من exon 3 و intron 315. تم تصميم الاشعال التي تنتج منتجا 2,134 نقطة أساس عند استخدام قالب الحمض النووي من النوع البري ومنتج 1,324 نقطة أساس إذا تم استخدام الحمض النووي blmp-1(-). تم الكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ذات الأحجام المناسبة باستخدام 1 ميكرولتر من الدودة المفردة (حوالي 0.5 ديدان لكل تفاعل) أو تحلل 16 دودة من الحيوانات المرحلية L4 (3.5 ديدان لكل تفاعل) (الشكل 1D). تظهر هذه النتيجة أن الحمض النووي الجينومي المستخرج من المجموعة باستخدام أي من البروتوكولين يوفر قوالب فعالة بنفس القدر لخطوط PCR إلى النمط الوراثي.
تظهر هذه النتائج أن مستحضرات الحمض النووي الجينومي C. elegans باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي للأنسجة التجارية من واحدة ومتعددة يمكن استخدامها بشكل موثوق كقوالب ل PCR.
الشكل 1: تسمح مستحضرات الحمض النووي باستخدام مجموعة تجارية من الديدان الخيطية المفردة والديدان الخيطية المتعددة بتضخيم قوي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تحميل منتجات PCR على هلام الأغاروز بنسبة 1٪ في مخزن مؤقت TAE 1x (5 ميكرولتر (A ، B) أو 10 ميكرولتر (C ، D) وتشغيلها عند 90-100 فولت لمدة 30 دقيقة إلى 2 ساعة. تم استخدام سلم الحمض النووي 2-log لجميع المواد الهلامية. (أ) مقارنة تحلل الحمض النووي بواسطة المجموعة بالطرق التقليدية للبروتين K لإنشاء قالب باستخدام مجموعتين تمهيديتين. تم تحليل البالغين من النوع البري ، وتم استخدام ما يعادل واحد كقالب لجميع ردود الفعل. الممرات 1-4 ، منتج 2.1 كيلو بايت. Lane 1 ، PCR من تحلل الدودة الواحدة بواسطة proteinase K. Lane 2 ، PCR من تحلل الدودة الواحدة بطريقة المجموعة. Lane 3 ، PCR من تحلل دودة الدودة التسعة بواسطة proteinase K. Lane 4 ، PCR من تحلل دودة الدودة التسعة بطريقة المجموعة. الممرات 5-8 ، 0.5 كيلو بايت المنتج. Lane 5 ، PCR من تحلل الدودة الواحدة بواسطة proteinase K. Lane 6 ، PCR من تحلل الدودة الواحدة بطريقة المجموعة. Lane 7 ، PCR من تحلل دودة الدودة التسعة بواسطة proteinase K. Lane 8 ، PCR من تحلل دودة الدودة التسعة بطريقة المجموعة. (ب) توفر طريقة مجموعة تحلل الحمض النووي نموذجا مناسبا ل PCR بواسطة بوليميراز متعددة. تم تحليل البالغين من النوع البري باستخدام طريقة المجموعة ، وتم استخدام ما يعادل نصف كقالب PCR لمنتج 0.5 كيلو بايت. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل البوليميراز. حارة 1 ، PCR من تحلل دودة واحدة مع بوليميراز عالي السرعة. حارة 2 ، PCR من تحلل تسع ديدان مع بوليميراز عالي السرعة. حارة 3 ، PCR من تحلل دودة واحدة مع بوليميراز Taq . حارة 4 ، PCR من تحلل تسع ديدان مع بوليميراز Taq . حارة 5 ، PCR من تحلل دودة واحدة مع بوليميراز عالي الدقة. حارة 6 ، PCR من تحلل تسع ديدان مع بوليميراز عالي الدقة. حارة 7 ، PCR من تحلل دودة واحدة مع بوليميراز عالي السرعة وعالي الدقة. حارة 8 ، PCR من تحلل تسع ديدان مع بوليميراز عالي السرعة وعالي الدقة. (ج) توفر التخفيفات لتحلل دودة L4 من النوع البري نموذجا ل PCR. الممرات 1-5 ، منتج 2.1 كيلو بايت. الممرات 6-10 ، 0.5 كيلو بايت الهدف. حارة 1 وحارة 6 ، الحمض النووي غير المخفف. حارة 2 وحارة 7 ، 2 أضعاف الحمض النووي المخفف. حارة 3 وحارة 8 ، 10 أضعاف الحمض النووي المخفف. حارة 4 وحارة 9 ، 20 أضعاف الحمض النووي المخفف. حارة 5 وحارة 10 ، 50 أضعاف الحمض النووي المخفف. (د) التنميط الجيني لموضع blmp-1 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام 1 ميكرولتر من مستحضرات الحمض النووي أحادية الدودة و 16 دودة كقالب. حارة 1 ، PCR من تحلل دودة واحدة من النوع البري. حارة 2 ، PCR من blmp-1 (-) تحلل دودة واحدة. حارة 3 ، PCR من تحلل 16 دودة من النوع البري. حارة 4 ، PCR من blmp-1 (-) 16-دودة التحلل. الاختصارات: الإعدادية = طريقة التحضير. كيلو بايت = كيلو بيس ؛ st. = مرحلة الديدان الخيطية. dil. = تخفيف الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| هدف | اسم التمهيدي | تسلسل | ||
| بلمب-1 | أمامي | GCGTCAGGTAAGTTGTGATA | ||
| عكس | CAGTTATTGCGGCTGTTGTT | |||
| سما-10 | أمامي | AATGTGTGGCAAGGAATCG | ||
| عكس | TGTCTGTCCAACGAGAAGTG | |||
| التسلسل | 1 | CACATCCCGGACGCCTTAAT | ||
| 2 | CTAATTGTTTTTTCTACCTGGC | |||
الجدول 1: قائمة الاشعال .
| A. | بول أ، بول ب، بول د | بول إي |
| PCR ماستر ميكس | 12.5 ميكرولتر | 12.5 ميكرولتر |
| التمهيدي الأمامي | 0.2 ميكرومتر (التركيز النهائي) | 0.5 ميكرومتر (التركيز النهائي) |
| التمهيدي العكسي | 0.2 ميكرومتر (التركيز النهائي) | 0.5 ميكرومتر (التركيز النهائي) |
| قالب الحمض النووي | متغير | 1 ميكرولتر |
| مياه خالية من النوكليز | إلى 25 ميكرولتر | إلى 25 ميكرولتر |
| B. | بول سي |
| PCR 5x المخزن المؤقت | 2.5 ميكرولتر |
| 10 mM dNTPs | 2.0 ميكرولتر |
| التمهيدي الأمامي | 0.2 ميكرومتر (التركيز النهائي) |
| التمهيدي العكسي | 0.2 ميكرومتر (التركيز النهائي) |
| قالب الحمض النووي | متغير |
| البوليميراز | 0.5 ميكرولتر |
| مياه خالية من النوكليز | إلى 25 ميكرولتر |
| جيم - برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدم في الشكل 1 باء | ||
| درجة الحرارة | الوقت | دورات |
| 98 درجة مئوية | 2 دقيقة | 1 |
| 98 درجة مئوية | 1 دقيقة | 30 |
| 55 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | 1 |
| 4 درجات مئوية | مسك | |
| دال - برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدم في الشكل التكميلي S1 | ||
| درجة الحرارة | الوقت | دورات |
| 98 درجة مئوية | 30 ثانية | 1 |
| 98 درجة مئوية | 10 ثانية | 30 |
| 57 درجة مئوية | 20 ثانية | |
| 72 درجة مئوية | 50 ثانية | |
| 72 درجة مئوية | 2 دقيقة | 1 |
| 4 درجات مئوية | مسك | |
الجدول 2: مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل.
الشكل التكميلي S1: التسلسل لتأكيد جودة الحمض النووي الجينومي المعد باستخدام مجموعة تجارية. تتطابق النتائج المستخلصة من تفاعلين متتابعين تماما مع التسلسل المتوقع لأكثر من 1600 نيوكليوتيدات من الحمض النووي يتم تضخيمها بواسطة بوليميراز عالي السرعة وعالي الدقة (Pol E) من تحلل 16 دودة (الجدول 1 والجدول 2A والجدول 2D). تم قص نهايات قراءة التسلسل لإزالة القراءات الأساسية منخفضة الجودة. تم إجراء المحاذاة باستخدام أداة محاذاة التسلسل المتعدد EMBL-EBI MUSCLE (مقارنة تسلسل MUltiple بواسطة Log-Expectation)17. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد تحديد الأنماط الجينية ل C. elegans خطوة مهمة أثناء إجراء الصلبان الجينية لإنشاء سلالات C. elegans جديدة. يعد استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام واحد أو عدد قليل من C. elegans خطوة حاسمة في التنميط الجيني C. elegans. يصف هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي الجيني من C. elegans باستخدام مجموعة تجارية. هذه الطريقة سريعة وتعمل بقوة. يمكن استخدام الحمض النووي الجينومي المستخرج باستخدام هذه الطريقة للتطبيقات النهائية ، بما في ذلك التنميط الجيني والتسلسل والاستنساخ. تم تحسين طريقة استخراج الحمض النووي الموصوفة للتنميط الجيني C. elegans الصلبان الجينية باستخدام الحيوانات المفردة وعدد قليل من L4 أو الحيوانات البالغة كمادة أولية لقالب الحمض النووي. قدم ما يعادل واحدا من خمسين من الحيوان (الشكل 1C) إلى 3.5 (الشكل 1D) نموذجا مناسبا لتضخيم تسلسل الحمض النووي المستهدف بواسطة PCR. ينتج عن هذا البروتوكول (مع التخفيف) قالب كاف (عند 2 ميكرولتر / تفاعل) بحد أقصى 45 تفاعلا من دودة واحدة و 100 تفاعل من 16 حيوانا. حتى باستخدام دودة واحدة لكل تفاعل ، توفر هذه البروتوكولات طريقة فعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي من C. elegans. نظرا لبساطة ومتانة وسرعة البروتوكول ، فهو مناسب تماما لكل من تطبيقات البحث والفصول الدراسية.
نظرا لأن البروتوكول يتضمن سحب كميات صغيرة من الكواشف ، يوصى بإعداد مزيج رئيسي لتفاعلات متعددة ، وتقنية سحب جيدة ، واستخدام ماصات معايرة جيدا لضمان الاتساق. عادة ما يعمل استخدام 0.5-1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي غير المخفف من التحلل الفردي أو 9-16 حيوانا على تفاعل PCR 25 ميكرولتر باستخدام مزيج رئيسي من PCR يبدأ على الساخن ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى تحسين تركيز القالب. يجب أن تبقى الكواشف على الجليد طوال مدة التجربة. لتجنب ذوبان الجليد المتكرر لمحاليل استخراج الحمض النووي ، والتي قد تقلل من أداء الإنزيم ، يوصى باقتباس الكواشف وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
بالنسبة للتطبيقات النهائية التي تتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، فإن استخدام مزيج رئيسي من تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي السرعة وعالي السرعة يقلل من الوقت الإجمالي مقارنة بمزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوفر في مجموعة الأنسجة التجارية. يمكن للبوليميراز عالي السرعة تضخيم المنتجات التي تقل عن 1 كيلو بايت في 5-10 ثانية (انظر جدول المواد والجدول 2 للحصول على أوصاف البوليميراز) ، في حين أن مزيج تفاعل PCR الخاص بالمجموعة يستخدم بوليميراز الحمض النووي Taq بمعدل تضخيم ~ 1 كيلو بايت / دقيقة7. يمكن تحميل المنتجات من بعض PCRs مباشرة في هلام الأغاروز للرحلان الكهربائي ، مما يقلل من الخطوات والوقت. هذا المخزن المؤقت للتفاعل متوافق أيضا مع هضم إنزيم التقييد. تعمل بوليميراز الحمض النووي عالية الدقة أيضا بقوة مع الحمض النووي المستخرج باستخدام هذا البروتوكول (الشكل 1B). في حين أن البوليميراز المستخدمة عملت باستمرار باستخدام قالب مستخرج من المجموعة ، فإن استخدام البوليميراز الأخرى قد يوفر نتائج أفضل اعتمادا على القالب وخصائص مجموعة التمهيدي وحجم المنتج والدقة المطلوبة. إذا تمت مواجهة مشاكل بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مثل عدم تضخيم النطاق المستهدف أو تضخيم نطاقات إضافية ، فقد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين لظروف عمل التمهيدي أو تركيز قالب الحمض النووي. يوصى بشدة باستخدام عناصر التحكم المناسبة ، بما في ذلك قالب الحمض النووي من النوع البري واستخدام الاشعال التي ثبت نجاحها.
لن تكون هذه الطريقة مناسبة للتطبيقات التي تتطلب تنقيتها العالية أو إنتاجية عالية من قالب الحمض النووي. في حين يمكن زيادة عدد الحيوانات المحضرة وحجم التفاعل ، فإن الحمض النووي المعد باستخدام هذه الطريقة لا يتم فصله عن الحطام العضوي وقد لا يكون نقيا بما يكفي للتطبيقات الحساسة للغاية مثل تسلسل الجينوم الكامل.
تشمل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بطرق استخراج الحمض النووي الجينومية التقليدية الحالية الوقت الأقصر والخطوات الأبسط والأسهل. في المستقبل ، يمكن توسيع نطاق هذه الطريقة ، وتكييفها لاستخراج الحمض النووي الجينومي C. elegans للتطبيقات الأخرى في المصب ، واستخدامها لاستخراج الحمض النووي من أنواع الديدان الخيطية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
تم الحصول على سلالة N2 وبكتيريا E. coli OP50 من مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، الذي يموله مكتب برامج البنية التحتية البحثية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (P40 OD010440). تم الحصول على سلالة blmp-1 (tm548) من المشروع الوطني للموارد الحيوية ، اليابان. يشكر المؤلفون WormBase. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R01GM097591 إلى T.L.G. ، والتمويل الداخلي من جامعة تكساس للمرأة إلى T.L.G ، ومركز TWU لأبحاث الطلاب إلى M.F.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L.
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
- Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
- Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
- Stiernagle, T.
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
