Summary
Præsenteret her er en beskrivelse af den ligetil og relativt hurtige isolering af Caenorhabditis elegans genomisk DNA fra et eller nogle få dyr ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt vævssæt. Det resulterende gDNA-præparat er en passende skabelon til PCR.
Abstract
Genomisk DNA-ekstraktion fra enkelte eller nogle få Caenorhabditis elegans har mange nedstrøms applikationer, herunder PCR til genotekypinglinjer, kloning og sekventering. De traditionelle proteinase K-baserede metoder til genomisk DNA-ekstraktion fra C. elegans tager flere timer. Kommercielle ekstraktionssæt, der effektivt bryder C. elegans neglebånd og ekstrakt genomisk DNA, er begrænsede. En nem, hurtigere (~ 15 min) og omkostningseffektiv metode til ekstraktion af C. elegans genomisk DNA, der fungerer godt til klasseværelses- og forskningsapplikationer, rapporteres her. Denne DNA-ekstraktionsmetode er optimeret til at anvende enkelte eller nogle få senlarver (L4) eller voksne nematoder som udgangsmateriale til opnåelse af en pålidelig skabelon til udførelse af PCR. Resultaterne tyder på, at DNA-kvaliteten er egnet til at forstærke genmål af forskellig størrelse ved PCR, hvilket tillader genotypning af enkelte eller nogle få dyr selv ved fortyndinger til en halvtredsindstyvende del af det genomiske DNA fra en enkelt voksen pr. reaktion. De rapporterede protokoller kan pålideligt bruges til hurtigt at producere DNA-skabelon fra en enkelt eller en lille prøve af C. elegans til PCR-baserede applikationer.
Introduction
Her præsenteres to relaterede protokoller for lysis af Caenorhabditis elegans for at gøre DNA tilgængeligt for PCR-baserede applikationer. PCR er en almindeligt anvendt molekylær teknik, der anvendes til mange applikationer, herunder genotypning og forstærkning af DNA-fragmenter til kloning og sekventering, blandt andre. Den lille (1 mm), fritlevende rundorm C. elegans er et populært dyresystem til biologisk forskning. Opnåelse af egnet genomisk DNA fra et enkelt dyr eller nogle få dyr er tilstrækkeligt til at forstærke sekvensen ved PCR. Sene L4 larver og voksne indeholder kun ~ 1.000 somatiske celler (herunder nogle multi-nukleare, polyploide celler), kimceller og (hvis dyret er en gravid hermafrodit) afkom i utero1. Disse dyr er dog beskyttet af en neglebånd, der skal forstyrres for at ekstrahere det genomiske DNA2. Standardmetoder til fremstilling af nematode genomisk DNA-skabelon til PCR involverer flere trin og tager flere timer. Dyrene fryses først i ormelysebuffer indeholdende proteinase K (-70 °C eller derunder) i mindst 15-45 minutter (længere anbefales i nogle protokoller)3,4,5,6. Dette trin revner åbne dyrene.
Efter frysning inkuberes dyrene i 1 time ved 60-65 °C, så proteinasen K virker, hvorefter enzymet inaktiveres i 15-30 min ved 95 °C. Proteinasen K ødelægger nukleaserne, der nedbryder DNA. Inaktivering af proteinase K før PCR er vigtig for at forhindre, at proteinasen K nedbryder DNA-polymerasen. De to kitbaserede protokoller, der er beskrevet her, er hurtige, pålidelige og omkostningseffektive metoder til at udtrække genomisk DNA fra enten et enkelt dyr eller et par nematoder til daglig forskning og undervisning i laboratorieapplikationer. Det anvendte sæt blev oprindeligt optimeret af producenten til at udtrække DNA fra animalsk væv, spyt og hår7. Det bruger en proprietær vævsforberedelsesopløsning og ekstraktionsopløsning til at lyse celler og gøre genomisk DNA tilgængeligt. En proprietær neutraliseringsopløsning neutraliserer derefter de komponenter, der kan hæmme PCR (f.eks. Salte, ioner og Mg2 + -bindende molekyler).
Ved genotypning kan et enkelt dyr testes. Når det skal afgøres, om en stamme er homozygot, giver test af seks eller flere afkom fra et enkelt dyr stor tillid til, at en linje er homozygot eller ej (der er 0,02% chance for tilfældigt at vælge seks homozygote mutante afkom fra en heterozygot forælder [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Denne metode 1) er ligetil, med færre trin end proteinase K-metoden, og 2) reducerer skabelonforberedelsestiden til 15 min. Resultaterne i dette arbejde viser, at den udviklede protokol fungerer robust ved ekstraktion af genomisk DNA fra enkelte eller nogle få orme, som pålideligt kan bruges til downstream-applikationer, der ikke kræver stærkt oprenset DNA, herunder PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C. elegans vedligeholdelse
BEMÆRK: N2 (vildtype) og blmp-1(tm548) C. elegans stammer blev opretholdt på standard nematode vækstmedier (NGM) plader ved 20 °C.
- NGM-plader fremstilles ved at opløse 23,005 g NGM-pulver i 973 ml vand i en 2 L kolbe. Dæk kolbeåbningen med aluminiumsfolie (eller autoklaverbar hætte, der tillader udluftning) og fastgør belægningen med autoklavetape. Autoklave for at opløse pulveret og sterilisere indholdet med en steriliseringscyklus på mindst 30 minutter.
- Afkøl mediet til 60 °C i et vandbad.
- Til det afkølede medium tilsættes 25 ml steril 1 M phosphat (KH2PO4) buffer, pH 6,0; 1 ml 1 M calciumchloridopløsning; og 1 ml 1 M magnesiumsulfatopløsning.
- Rør mediet på en magnetisk omrøringsplade for at opnå en homogen blanding og for at forhindre ujævn afkøling og størkning (~ 5 min). Sørg for, at omrøringsstangen drejer hurtigt nok til at skabe en hvirvel, men ikke så hurtigt, at der indføres bobler (~ 250-300 o / min).
- Hæld ~ 25 ml af mediet i hver 10 cm Petri-plade (~ 40 plader i alt). Pladerne tørres ved stuetemperatur natten over (typisk 16-25 °C).
- Dyrk en koloni af Escherichia coli OP50 i 30-50 ml LB bouillon natten over ved 37 °C.
- Frø hver plade med 500 μL E. coli OP50-kultur og lad dem tørre ved stuetemperatur inden brug (typisk 16-25 °C)8. Opbevar pladerne ved 4 °C i op til 3 uger.
- Overfør C. elegans til podede plader ved hjælp af en trådplukker eller anden metode, og lad dem vokse til L4 eller voksenstadiet ved den temperatur, der kræves for stammen (typisk 16-25 °C, 1-2 dage, hvis dyr blev belagt sultet som dauers, 3-4 dage, hvis dyr blev belagt som embryoner)8.
2. DNA-ekstraktion med en enkelt orm
BEMÆRK: Denne metode er nyttig til ekstraktion af DNA fra en enkelt orm (en orm i 1,8 μL af det samlede volumen). En masterblanding kan laves, hvis flere orme vil blive lyseret ad gangen.
- Programmer en termocyklist til en cyklus ved 55 °C i 10 minutter efterfulgt af 95 °C i 3 minutter (lysisprogram).
- Aliquot 0,8 μL af ekstraktionsopløsningen fra sættet på indersiden af et 0,2 ml PCR-rør på is. Der tilsættes 0,2 μL af vævspræparatopløsningen fra sættet til dråben af ekstraktionsopløsningen. Bland ved pipettering.
- Identificer et L4 eller voksent dyr under et dissekerende mikroskop9. For at identificere L4 hermafroditter skal du kigge efter en karakteristisk vulva, der er synlig som en bleg halvcirkel midt i dyret. Identificer voksne hermafroditter ved at kigge efter de største dyr på pladen, der kan have ovale embryoner synlige i livmoderen.
- Brug et platintrådvalg til at overføre det valgte dyr til opløsningen10.
- Centrifugering af røret kort (2-3 s, ≤6.000 o / min / 2.000 × g) ved stuetemperatur for at opsamle indholdet i bunden af røret.
- Placer røret i termocyklisten, og kør lysisprogrammet, der er indstillet til trin 2.1.
- Når programmet er færdigt, centrifugeres røret kort og placeres på is. Der tilsættes 0,8 μL af neutraliseringsopløsningen fra sættet til blandingen. Bland ved pipettering.
- Centrifugering af røret kortvarigt ved stuetemperatur (2-3 s, ≤6.000 omdr./min./2.000 × g).
- Brug lysatet direkte til PCR, eller opbevar det ved 4 °C eller -20 °C til fremtidig brug.
BEMÆRK: Ekstraheret DNA er stabilt ved 4 °C eller -20 °C i mindst 6 måneder7.
3. DNA-ekstraktion af nogle få individer
BEMÆRK: Denne metode er nyttig til ekstraktion af DNA fra et par orme. En masterblanding kan fremstilles, hvis flere stammer vil blive lyseret ad gangen.
- Programmere termocyklisten til en cyklus ved 55 °C i 10 minutter efterfulgt af 95 °C i 3 minutter (lysisprogram).
- Aliquot 2,0 μL af ekstraktionsopløsningen fra sættet på indersiden af et 0,2 ml PCR-rør på is. Der tilsættes 0,5 μL af vævspræparatopløsningen fra sættet til dråben af ekstraktionsopløsningen. Bland ved pipettering.
- Identificer L4 eller voksne dyr under et dissekerende mikroskop9. L4 hermafroditter har en karakteristisk vulva, der er synlig som en bleg halvcirkel midt i dyret. Voksne hermafroditter er de største dyr på pladen og kan have ovale embryoner synlige i livmoderen.
- Ved hjælp af et platintrådspluk overføres et par dyr til opløsningen: 9 dyr giver 1 animalsk ækvivalent af genomisk DNA pr. 0,5 μL lysat, og 16 dyr giver ~ 1 animalsk ækvivalent af genomisk DNA i 0,25 μL (3,5 nematoder / μL)10.
BEMÆRK: Det er svært at overføre mere end 16 dyr til dette volumen. - Centrifugering af røret kortvarigt ved stuetemperatur (2-3 s, ≤6.000 omdr./min./2.000 × g).
- Placer røret i termocyklisten, og kør lysisprogrammet, der er indstillet til trin 3.1.
- Når programmet er færdigt, centrifugeres røret kort og placeres på is. Der tilsættes 2 μL af neutraliseringsopløsningen fra sættet til blandingen. Bland ved pipettering.
- Centrifugering af røret kortvarigt ved stuetemperatur (2-3 s, ≤6.000 omdr./min./2.000 × g).
- Brug lysen direkte til PCR eller opbevar den ved 4 °C eller -20 °C til fremtidig brug.
BEMÆRK: Ekstraheret DNA er stabilt ved 4 °C eller -20 °C i mindst 6 måneder7.
4. PCR-reaktion
BEMÆRK: En downstream-anvendelse af denne ormlyseteknik, der detekterer en deletionsmutation ved hjælp af en hurtig polymerase, er beskrevet. Effektiviteten af de to ormlyseprotokoller til fremstilling af genomisk skabelon-DNA til vellykket PCR ved fortyndinger til 1/50af en orm pr. reaktion er også påvist.
- Uddrag DNA fra en enkelt orm og 16 orme ved hjælp af vildtype N2 og mutante stammer, som beskrevet ovenfor i trin 2 og trin 3.
- Forbered 2-, 10-, 20- og 50-foldige fortyndinger af enkeltorm-DNA fra vildtype N2-dyr.
- Konfigurer PCR-reaktioner efter producentens protokol ved hjælp af primere, der er specifikke for sekvensen af interesse og hot-start PCR-mastermix (tabel 1 og tabel 2). Brug 1 μL ufortyndet DNA eller 2 μL fortyndet DNA som skabelon i hver reaktion.
- Bekræft PCR-produkterne ved gelelektroforese og billeddannelse11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genomisk DNA fra en enkelt eller et par vildtypevoksne blev ekstraheret ved hjælp af det kommercielle kit eller den traditionelle lysisprotokol for at sammenligne effektiviteten af disse to metoder. Disse lysater blev derefter brugt som skabeloner til PCR for at forstærke enten et større mål på ~ 2.100 bp (kodning af blmp-1) eller et mindre mål på ~ 500 bp (kodning af en del af sma-10). Begge metoder gav med succes passende PCR-produkter (figur 1A).
Dernæst blev evnen af kit-ekstraheret genomisk DNA til at tjene som skabelon for en række DNA-polymeraser demonstreret. Ekstraheret genomisk DNA blev brugt som skabelon til forstærkning af et 0,5 kb produkt ved hjælp af fire polymeraser, der besidder forskellige evner (herunder hastighed, troskab og produktstørrelse). Produkter af forventede størrelser blev genereret af disse polymeraser ved hjælp af skabelon fra en enkeltvoksen lysis eller en ni-voksen lysis (figur 1B). Skabelonsekvensen og troskaben af PCR-polymeraserne for korrekt forstærkning af skabelonsekvensen kan bekræftes ved sekventering (supplerende figur S1). Dette resultat viser, at det genomiske DNA, der ekstraheres fra kitprotokollerne, giver en passende skabelon til en række polymeraser.
PCR-effekten blev testet ved hjælp af forskellige koncentrationer af det genomiske DNA ekstraheret fra et enkelt dyr ved hjælp af det kommercielle kit. DNA blev fortyndet med 2-, 10-, 20- eller 50 gange, og svarende til ca. halvdelen, en tiendedel, en tyvendedel og en halvtredsindstyvendedel af en orm pr. Reaktion blev anvendt til PCR'er. Disse DNA-skabelonkoncentrationer understøttede amplifikationen af enten et større mål på ~ 2,1 kb eller et mindre mål på ~ 0,5 kb (figur 1C) 12. Mens der blev observeret et DNA-koncentrationsafhængigt udbytte af 0,5 kb PCR-produktet, syntes 2,1 kb PCR-produktudbyttet ækvivalent i alle reaktioner.
For at demonstrere, at disse protokoller producerer genomisk DNA fra C. elegans, der er egnet til PCR-genotypning, blev genomisk DNA ekstraheret fra enkelt- og 16 vildtype- og blmp-1 tab-af-funktionsmutanter (blmp-1 (tm548)). Blmp-1-genet koder for en transkriptionsfaktor med vigtige roller i distal tipcellemigration, kropsstørrelse og udvikling 12,13,14,15,16. Blmp-1-mutanten har en 810 bp-deletion, der fjerner dele af exon 3 og intron 315. Primere blev designet, der resulterer i et 2.134 bp produkt, når vildtype DNA-skabelonen anvendes, og et 1.324 bp produkt, hvis blmp-1 (-) DNA anvendes. PCR-produkter af passende størrelse blev påvist ved anvendelse af 1 μL enten enkeltorm (ca. 0,5 orme pr. reaktion) eller 16-ormlyse fra L4-iscenesatte dyr (3,5 orme pr. reaktion) (figur 1D). Dette resultat viser, at kit-ekstraheret genomisk DNA ved hjælp af begge protokoller giver lige så effektive skabeloner til PCR til genotypelinjer.
Disse resultater viser, at C. elegans genomiske DNA-præparater ved hjælp af et kommercielt vævs-DNA-ekstraktionssæt fra enkelte og flere dyr pålideligt kan anvendes som skabeloner til PCR.
Figur 1: DNA-præparater ved hjælp af et kommercielt kit fra enkelte nematoder og flere nematoder tillader robust amplifikation ved PCR. PCR-produkter blev indlæst på 1% agarosegel i 1x TAE-buffer (5 μL (A,B) eller 10 μL (C,D) og kørt ved 90-100 V i 30 min til 2 timer. En 2-log DNA-stige blev brugt til alle geler. (A) Sammenligning af DNA-lysis efter kit med traditionelle proteinase K-metoder til at skabe skabelon ved hjælp af to primersæt. Vildtypevoksne blev lyseret, og det, der svarer til et dyr, blev brugt som skabelon for alle reaktioner. Baner 1-4, 2,1 kb produkt. Bane 1, PCR fra enkeltormslyse ved proteinase K. Lane 2, PCR fra enkeltormslyse ved kitmetoden. Bane 3, PCR fra ni-orm orm lysis af proteinase K. Lane 4, PCR fra ni-orm orm lysis ved kit metoden. Baner 5-8, 0,5 kb produkt. Lane 5, PCR fra single-worm lysis af proteinase K. Lane 6, PCR fra single-worm lysis ved kit metoden. Lane 7, PCR fra ni-orm orm lysis af proteinase K. Lane 8, PCR fra ni-orm orm lysis ved kit metoden. (B) Kitmetoden til DNA-lysis giver en passende skabelon for PCR ved flere polymeraser. Vildtypevoksne blev lyseret ved hjælp af kitmetoden, og hvad der svarer til halvdelen af et dyr blev brugt som PCR-skabelon for et 0,5 kb produkt. Se materialetabellen for polymerasedetaljer. Bane 1, PCR fra en enkeltormlyse med en højhastighedspolymerase. Bane 2, PCR fra en ni-orm lysis med en højhastighedspolymerase. Bane 3, PCR fra en enkeltormslyse med en Taq-polymerase . Bane 4, PCR fra en ni-orm lysis med en Taq polymerase. Bane 5, PCR fra en enkeltormlyse med en high-fidelity polymerase. Bane 6, PCR fra en ni-orm lysis med en high-fidelity polymerase. Lane 7, PCR fra en enkeltormlyse med en højhastighedspolyse med høj fi-fi-polymerase. Lane 8, PCR fra en ni-orm lysis med en højhastigheds, high-fidelity polymerase. (C) Fortyndinger af en vildtype L4 ormlyse giver skabelon for PCR. Baner 1-5, 2,1 kb produkt. Baner 6-10, 0,5 kb mål. Bane 1 og bane 6, ufortyndet DNA. Bane 2 og bane 7, 2 gange fortyndet DNA. Bane 3 og bane 8, 10 gange fortyndet DNA. Bane 4 og bane 9, 20 gange fortyndet DNA. Bane 5 og bane 10, 50 gange fortyndet DNA. D) Genotypning af blmp-1-locus ved hjælp af PCR ved hjælp af 1 μL enkelt- og 16-orm-DNA-præparater som skabelon. Bane 1, PCR fra vildtype single-worm lysis. Bane 2, PCR fra blmp-1(-) enkeltormslyse. Bane 3, PCR fra vildtype 16-orm lysis. Bane 4, PCR fra blmp-1(-) 16-orm lysis. Forkortelser: prep = fremstillingsmetode; kb = kilobase; st. = nematode fase; dil. = fortynding af DNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Mål | Primer navn | Sekvens | ||
| blmp-1 | fremad | GCGTCAGGTAAGTTGTGATA | ||
| omvendt | CAGTTATTGCGGCTGTTGTT | |||
| sma-10 | fremad | AATGTGTGGCAAGGAATCG | ||
| omvendt | TGTCTGTCCAACGAGAAGTG | |||
| Sekventering | 1 | CACATCCCGGACGCCTTAAT | ||
| 2 | CTAATTGTTTTCTACCTGGC | |||
Tabel 1: Liste over primere.
| En. | Pol A, Pol B, Pol D | Pol E |
| PCR Master Mix | 12,5 μL | 12,5 μL |
| Fremadrettet primer | 0,2 μM (endelig koncentration) | 0,5 μM (endelig koncentration) |
| Omvendt grunning | 0,2 μM (endelig koncentration) | 0,5 μM (endelig koncentration) |
| skabelon DNA | variabel | 1 μL |
| Nukleasefrit vand | til 25 μL | til 25 μL |
| B. | Pol C |
| PCR 5x buffer | 2,5 μL |
| 10 mM dNTP'er | 2,0 μL |
| Fremadrettet primer | 0,2 μM (endelig koncentration) |
| Omvendt grunning | 0,2 μM (endelig koncentration) |
| skabelon DNA | variabel |
| Polymerase | 0,5 μL |
| Nukleasefrit vand | til 25 μL |
| C. PCR-program, der anvendes til figur 1B | ||
| temperatur | Tidspunkt | Cykler |
| 98 °C | 2 minutter | 1 |
| 98 °C | 1 minut | 30 |
| 55 °C | 1 minut | |
| 72 °C | 1 minut | |
| 72 °C | 1 minut | 1 |
| 4 °C | holde | |
| D. PCR-program, der anvendes til supplerende figur S1 | ||
| temperatur | Tidspunkt | Cykler |
| 98 °C | 30 s | 1 |
| 98 °C | 10 s | 30 |
| 57 °C | 20 s | |
| 72 °C | 50 s | |
| 72 °C | 2 minutter | 1 |
| 4 °C | holde | |
Tabel 2: PCR-reaktionskomponenter.
Supplerende figur S1: Sekventering til bekræftelse af kvaliteten af genomisk DNA fremstillet med et kommercielt kit. Resultaterne fra to sekventeringsreaktioner svarer fuldstændigt til den forventede sekvens af over 1.600 nukleotider DNA amplificeret af en højhastighedspolymerase med høj troskab (Pol E) fra en lysis med 16 orme (tabel 1, tabel 2A og tabel 2D). Sekventering af læseender blev trimmet for at fjerne basislæsninger af lav kvalitet. Justering blev udført ved hjælp af EMBL-EBI multiple sequence alignment tool MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestemmelse af genotyperne af C. elegans er et vigtigt skridt, mens du udfører genetiske kryds for at skabe nye C. elegans stammer. Genomisk DNA-ekstraktion ved hjælp af en enkelt eller få C. elegans er et afgørende skridt i genotypning af C. elegans. Denne protokol beskriver genomisk DNA-ekstraktion fra C. elegans ved hjælp af et kommercielt kit. Denne metode er hurtig og fungerer robust. Det genomiske DNA, der ekstraheres ved hjælp af denne metode, kan bruges til downstream-applikationer, herunder genotypning, sekventering og kloning. Den beskrevne DNA-ekstraktionsmetode er optimeret til genotypning af C. elegans genetiske kryds ved hjælp af enkelte og nogle få L4 eller voksne dyr som udgangsmateriale til DNA-skabelonen. Svarende til en halvtredsindstyvende del af et dyr (figur 1C) til 3,5 dyr (figur 1D) udgjorde en passende skabelon til forstærkning af mål-DNA-sekvenser ved HJÆLP AF PCR. Denne protokol (med fortynding) giver tilstrækkelig skabelon (ved 2 μL/reaktion) til højst 45 reaktioner fra en enkelt orm og til 100 reaktioner fra 16 dyr. Selv ved hjælp af en orm pr. Reaktion giver disse protokoller en omkostningseffektiv måde at udtrække DNA fra C. elegans på. I betragtning af protokollens enkelhed, robusthed og hurtighed er den velegnet til både forsknings- og klasseværelsesapplikationer.
Da protokollen involverer pipettering af små mængder reagenser, anbefales det at forberede en masterblanding til flere reaktioner, god pipetteringsteknik og anvendelse af velkalibrerede pipetter for at sikre konsistens. Brug af 0,5-1 μL ufortyndet DNA-skabelon fra enten enkelt- eller 9-16-dyrelys fungerer normalt for en 25 μL PCR-reaktion ved hjælp af en hot-start PCR-masterblanding, men optimering af skabelonkoncentrationen kan være påkrævet. Reagenserne skal opbevares på is under hele forsøget. For at undgå gentagen fryseoptøning af DNA-ekstraktionsopløsningerne, som kan reducere enzymets ydeevne, anbefales det, at reagenserne aliciteres og opbevares ved -20 °C.
For downstream-applikationer, der kræver PCR, reducerer brugen af en hot-start, højhastigheds PCR-masterblanding yderligere den samlede tid sammenlignet med PCR-reaktionsblandingen, der leveres i det kommercielle vævssæt. Højhastighedspolymeraser kan forstærke produkter på mindre end 1 kb i 5-10 s (se materialetabellen og tabel 2 for polymerasebeskrivelser), mens kittets PCR-reaktionsblanding bruger en Taq DNA-polymerase med en amplifikationshastighed på ~ 1 kb / min7. Produkter fra nogle PCR'er kan indlæses direkte i en agarosegel til elektroforese, hvilket yderligere reducerer trin og tid. Denne reaktionsbuffer er også kompatibel med restriktionsenzymfordøjelsen. HIGH-fidelity DNA-polymeraser fungerer også robust med DNA ekstraheret ved hjælp af denne protokol (figur 1B). Mens de anvendte polymeraser konsekvent fungerede ved hjælp af kit-ekstraheret skabelon, kan brugen af andre polymeraser give bedre resultater afhængigt af skabelonen, primersætegenskaberne, produktstørrelsen og den krævede troskab. Hvis der opstår problemer efter PCR, såsom intet målbånd amplificeret eller yderligere bånd amplificeret, kan yderligere optimering af primerens arbejdsvilkår eller DNA-skabelonkoncentration være påkrævet. Det anbefales på det kraftigste, at der anvendes passende kontroller, herunder vildtype-DNA-skabelon og anvendelse af primere, der har vist sig at virke.
Denne metode vil ikke være egnet til applikationer, der kræver stærkt oprenset eller et højt udbytte af DNA-skabelon. Selv om antallet af tilberedte dyr og reaktionsvolumenet kan opskaleres, er det DNA, der fremstilles ved hjælp af denne metode, ikke adskilt fra organismeaffald og er muligvis ikke rent nok til meget følsomme anvendelser såsom helgenomsekventering.
De største fordele ved denne metode i forhold til de eksisterende traditionelle genomiske DNA-ekstraktionsmetoder inkluderer den kortere tid og enklere, lettere trin. I fremtiden kan denne metode skaleres op, tilpasses til at udtrække C. elegans genomisk DNA til andre downstream-applikationer og bruges til at udtrække DNA fra andre nematodearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
N2-stammen og E. coli OP50-bakterierne blev opnået fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Blmp-1 (tm548) stammen blev opnået fra National Bioresource Project, Japan. Forfatterne takker WormBase. Dette arbejde blev støttet af NIH R01GM097591 til T.L.G., intern finansiering fra Texas Woman's University til T.L.G og TWU's Center for Student Research til M.F.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L.
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
- Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
- Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
- Stiernagle, T.
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
