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Biology

Extracción a pequeña escala de ADN genómico de Caenorhabditis elegans

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/63716
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Texas Woman’s University

Summary

Aquí se presenta una descripción del aislamiento directo y relativamente rápido del ADN genómico de Caenorhabditis elegans de uno o unos pocos animales utilizando un kit de tejido disponible comercialmente. La preparación de gDNA resultante es una plantilla adecuada para PCR.

Abstract

La extracción de ADN genómico de uno o unos pocos Caenorhabditis elegans tiene muchas aplicaciones posteriores, incluida la PCR para líneas de genotipado, clonación y secuenciación. Los métodos tradicionales basados en la proteinasa K para la extracción de ADN genómico de C. elegans tardan varias horas. Los kits de extracción comerciales que rompen efectivamente la cutícula de C. elegans y extraen ADN genómico son limitados. Aquí se informa un método fácil, más rápido (~ 15 min) y rentable de extracción de ADN genómico de C. elegans que funciona bien para aplicaciones en el aula y la investigación. Este método de extracción de ADN está optimizado para utilizar nematodos monolarvales tardíos (L4) o adultos como material de partida para obtener una plantilla confiable para realizar PCR. Los resultados indican que la calidad del ADN es adecuada para amplificar objetivos genéticos de diferentes tamaños mediante PCR, lo que permite el genotipado de uno o varios animales incluso en diluciones a una quincuagésima parte del ADN genómico de un solo adulto por reacción. Los protocolos informados se pueden utilizar de manera confiable para producir rápidamente una plantilla de ADN a partir de una sola o una pequeña muestra de C. elegans para aplicaciones basadas en PCR.

Introduction

Aquí, se presentan dos protocolos relacionados para la lisis de Caenorhabditis elegans para hacer que el ADN sea accesible para aplicaciones basadas en PCR. La PCR es una técnica molecular de uso común utilizada para muchas aplicaciones, incluyendo el genotipado y la amplificación de fragmentos de ADN para clonación y secuenciación, entre otras. El pequeño (1 mm) gusano redondo de vida libre C. elegans es un sistema animal popular para la investigación biológica. La obtención de ADN genómico adecuado de un solo animal o de unos pocos animales es suficiente para amplificar la secuencia mediante PCR. Las larvas y adultos L4 tardíos contienen solo ~ 1,000 células somáticas (incluidas algunas células poliploides multinucleares), células germinales y (si el animal es un hermafrodita grávido) descendencia en el útero1. Sin embargo, estos animales están protegidos por una cutícula que debe ser interrumpida para extraer el ADN genómico2. Los métodos estándar para preparar la plantilla de ADN genómico de nematodos para PCR implican múltiples pasos y toman varias horas. Los animales se congelan primero en tampón de lisis de lombrices que contiene proteinasa K (-70 °C o menos) durante al menos 15-45 min (algunos protocolos recomiendan más tiempo)3,4,5,6. Este paso abre los animales.

Después de la congelación, los animales se incuban durante 1 h a 60-65 ° C para que la proteinasa K funcione, luego la enzima se inactiva durante 15-30 min a 95 ° C. La proteinasa K destruye las nucleasas que degradan el ADN. La inactivación de la proteinasa K antes de la PCR es importante para evitar que la proteinasa K degrade la ADN polimerasa. Los dos protocolos basados en kits descritos aquí son métodos rápidos, confiables y rentables para extraer ADN genómico de un solo animal o de unos pocos nematodos para aplicaciones diarias de laboratorio de investigación y enseñanza. El kit utilizado fue optimizado originalmente por el fabricante para extraer ADN de tejido animal, saliva y cabello7. Utiliza una solución patentada de preparación de tejidos y una solución de extracción para lisar las células y hacer que el ADN genómico sea accesible. Una solución de neutralización patentada neutraliza los componentes que pueden inhibir la PCR (por ejemplo, sales, iones y moléculas de unión a Mg2+).

Al genotipar, se puede probar un solo animal. Al determinar si una cepa es homocigota, la prueba de seis o más crías de un solo animal da una gran confianza en que una línea es homocigota o no (hay una probabilidad del 0,02% de elegir al azar seis progenies mutantes homocigotas de un padre heterocigoto [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Este método 1) es sencillo, con menos pasos que el método de la proteinasa K, y 2) disminuye el tiempo de preparación de la plantilla a 15 min. Los resultados de este trabajo demuestran que el protocolo desarrollado funciona de manera robusta en la extracción de ADN genómico de uno o varios gusanos, que se pueden usar de manera confiable para aplicaciones posteriores que no requieren ADN altamente purificado, incluida la PCR.

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Protocol

1. Mantenimiento de C. elegans

NOTA: Las cepas N2 (tipo salvaje) y blmp-1(tm548) C. elegans se mantuvieron en placas estándar de medios de crecimiento de nematodos (NGM) a 20 °C.

  1. Preparar placas NGM disolviendo 23.005 g de polvo NGM en 973 mL de agua en un matraz de 2 L. Cubra la abertura del matraz con papel de aluminio (o tapa autoclavable que permite la ventilación) y asegure la cubierta con cinta de autoclave. Autoclave para disolver el polvo y esterilizar el contenido con un ciclo de esterilización de al menos 30 min.
  2. Enfríe el medio a 60 °C en un baño de agua.
  3. Al medio enfriado, agregue 25 ml de tampón estéril de fosfato de 1 M (KH2PO4), pH 6.0; 1 ml de solución de cloruro de calcio de 1 M; y 1 ml de solución de sulfato de magnesio de 1 M.
  4. Revuelva el medio en una placa de agitación magnética para obtener una mezcla homogénea y evitar el enfriamiento y la solidificación desiguales (~ 5 min). Asegúrese de que la barra de agitación gire lo suficientemente rápido como para crear un vórtice, pero no tan rápido como para que se introduzcan burbujas (~ 250-300 rpm).
  5. Vierta ~ 25 ml del medio en cada placa de Petri de 10 cm (~ 40 placas en total). Seque las placas a temperatura ambiente durante la noche (típicamente 16-25 ° C).
  6. Cultive una colonia de Escherichia coli OP50 en 30-50 ml de caldo LB durante la noche a 37 ° C.
  7. Sembrar cada placa con 500 μL de cultivo de E. coli OP50 y dejar secar a temperatura ambiente antes de su uso (típicamente 16-25 °C)8. Guarde las placas a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
  8. Transfiera C. elegans a placas sembradas utilizando un pico de alambre u otro método y déjelos crecer a L4 o etapa adulta a la temperatura requerida para la cepa (típicamente 16-25 ° C, 1-2 días si los animales fueron chapados hambrientos como dauers, 3-4 días si los animales fueron chapados como embriones)8.

2. Extracción de ADN de un solo gusano

NOTA: Este método es útil para extraer ADN de un solo gusano (un gusano en 1,8 μL de volumen total). Se puede hacer una mezcla maestra si se lisan varios gusanos a la vez.

  1. Programe un termociclador para un ciclo a 55 °C durante 10 min seguido de 95 °C durante 3 min (programa de lisis).
  2. Alícuota 0,8 μL de la solución de extracción del kit en la pared interior de un tubo pcr de 0,2 ml sobre hielo. Agregue 0,2 μL de la solución de preparación de tejidos del kit a la gota de la solución de extracción. Mezclar por pipeteo.
  3. Identificar un animal L4 o adulto bajo un microscopio de disección9. Para identificar hermafroditas L4, busque una vulva característica que sea visible como un semicírculo pálido en el medio del animal. Identifique hermafroditas adultos buscando los animales más grandes en la placa que puedan tener embriones ovalados visibles en su útero.
  4. Usando una selección de alambre de platino, transfiera el animal seleccionado a la solución10.
  5. Centrifugar el tubo brevemente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g) a temperatura ambiente para recoger el contenido en la parte inferior del tubo.
  6. Coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis establecido en el paso 2.1.
  7. Cuando se complete el programa, centrífique brevemente el tubo y colóquelo sobre hielo. Agregue 0.8 μL de la solución de neutralización del kit a la mezcla. Mezclar por pipeteo.
  8. Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
  9. Utilice directamente el lisado para PCR o guárdelo a 4 °C o -20 °C para su uso futuro.
    NOTA: El ADN extraído es estable a 4 °C o -20 °C durante al menos 6 meses7.

3. Extracción de ADN de unos pocos individuos

NOTA: Este método es útil para extraer ADN de algunos gusanos. Se puede preparar una mezcla maestra si se lisan varias cepas a la vez.

  1. Programe el termociclador para un ciclo a 55 °C durante 10 min seguido de 95 °C durante 3 min (programa de lisis).
  2. Alícuota 2,0 μL de la solución de extracción del kit en la pared interior de un tubo PCR de 0,2 ml sobre hielo. Agregue 0,5 μL de la solución de preparación de tejidos del kit a la gota de la solución de extracción. Mezclar por pipeteo.
  3. Identificar L4 o animales adultos bajo un microscopio de disección9. Los hermafroditas L4 tienen una vulva característica que es visible como un semicírculo pálido en el medio del animal. Los hermafroditas adultos son los animales más grandes en la placa y pueden tener embriones ovalados visibles en su útero.
  4. Usando una selección de alambre de platino, transfiera algunos animales a la solución: 9 animales producen 1 equivalente animal de ADN genómico por 0.5 μL de lisado, y 16 animales producen ~ 1 equivalente animal de ADN genómico en 0.25 μL (3.5 nematodos / μL)10.
    NOTA: Es difícil transferir más de 16 animales a este volumen.
  5. Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
  6. Coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis establecido en el paso 3.1.
  7. Cuando se complete el programa, centrífique brevemente el tubo y colóquelo sobre hielo. Agregue 2 μL de la solución de neutralización del kit a la mezcla. Mezclar por pipeteo.
  8. Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
  9. Utilice directamente la lisis para PCR o guárdela a 4 °C o -20 °C para su uso futuro.
    NOTA: El ADN extraído es estable a 4 °C o -20 °C durante al menos 6 meses7.

4. Reacción de PCR

NOTA: Se describe una aplicación posterior de esta técnica de lisis de gusanos, detectando una mutación de deleción utilizando una polimerasa rápida. También se demuestra la efectividad de los dos protocolos de lisis de gusanos en la producción de ADN de plantilla genómica para PCR exitosa en diluciones a 1/50 de un gusano por reacción.

  1. Extraiga ADN de un solo gusano y 16 gusanos utilizando cepas mutantes y N2 de tipo salvaje, como se describe anteriormente en los Pasos 2 y 3.
  2. Prepare diluciones de 2, 10, 20 y 50 veces de ADN de un solo gusano de animales N2 de tipo salvaje.
  3. Configure las reacciones de PCR siguiendo el protocolo del fabricante utilizando cebadores específicos para la secuencia de interés y la mezcla maestra de PCR de arranque en caliente (Tabla 1 y Tabla 2). Utilice 1 μL de ADN sin diluir o 2 μL de ADN diluido como plantilla en cada reacción.
  4. Confirme los productos de PCR mediante electroforesis en gel e imágenes11.

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Representative Results

El ADN genómico de uno o varios adultos de tipo salvaje se extrajo utilizando el kit comercial o el protocolo de lisis tradicional para comparar la eficacia de estos dos métodos. Estos lisados se utilizaron como plantillas para PCR para amplificar un objetivo más grande de ~ 2,100 bp (codificación blmp-1) o un objetivo más pequeño de ~ 500 bp (codificando una parte de sma-10). Ambos métodos produjeron con éxito productos de PCR apropiados (Figura 1A).

A continuación, se demostró la capacidad del ADN genómico extraído por el kit para servir como plantilla para una variedad de ADN polimerasas. El ADN genómico extraído se utilizó como plantilla para amplificar un producto de 0,5 kb utilizando cuatro polimerasas que poseen diferentes capacidades (incluida la velocidad, la fidelidad y el tamaño del producto). Los productos de tamaños esperados fueron generados por estas polimerasas utilizando una plantilla de una lisis de un solo adulto o una lisis de nueve adultos (Figura 1B). La secuencia de la plantilla y la fidelidad de las polimerasas pcr para amplificar correctamente la secuencia de la plantilla se pueden confirmar mediante secuenciación (Figura suplementaria S1). Este resultado demuestra que el ADN genómico extraído de los protocolos del kit proporciona una plantilla adecuada para una gama de polimerasas.

La eficacia de la PCR se probó utilizando diferentes concentraciones del ADN genómico extraído de un solo animal utilizando el kit comercial. El ADN se diluyó en 2, 10, 20 o 50 veces, y el equivalente a aproximadamente la mitad, una décima, una vigésima y una quincuagésima parte de un gusano por reacción se utilizó para las PCR. Estas concentraciones de plantillas de ADN admitían la amplificación de un objetivo más grande de ~2,1 kb o un objetivo más pequeño de ~0,5 kb (Figura 1C)12. Mientras que se observó un rendimiento dependiente de la concentración de ADN del producto de PCR de 0,5 kb, el rendimiento del producto de PCR de 2,1 kb parecía equivalente en todas las reacciones.

Para demostrar que estos protocolos producen ADN genómico a partir de C. elegans que es adecuado para el genotipado de PCR, se extrajo ADN genómico de mutantes de pérdida de función únicos y 16 de tipo salvaje y blmp-1 (blmp-1 (tm548)). El gen blmp-1 codifica un factor de transcripción con importantes funciones en la migración celular de la punta distal, el tamaño corporal y el desarrollo 12,13,14,15,16. El mutante blmp-1 tiene una deleción de 810 pb que elimina partes del exón 3 y el intrón 315. Se diseñaron cebadores que dan como resultado un producto de 2.134 pb cuando se utiliza la plantilla de ADN de tipo salvaje y un producto de 1.324 pb si se utiliza ADN blmp-1(-). Se detectaron productos de PCR de los tamaños apropiados utilizando 1 μL de lisis de un solo gusano (aproximadamente 0,5 gusanos por reacción) o 16-gusano de animales con etapas L4 (3,5 gusanos por reacción) (Figura 1D). Este resultado muestra que el ADN genómico extraído por kit utilizando cualquiera de los protocolos proporciona plantillas igualmente efectivas para la PCR y las líneas de genotipo.

Estos resultados muestran que las preparaciones de ADN genómico de C. elegans utilizando un kit comercial de extracción de ADN tisular de animales individuales y múltiples se pueden usar de manera confiable como plantillas para PCR.

Figure 1
Figura 1: Las preparaciones de ADN que utilizan un kit comercial de nematodos individuales y nematodos múltiples permiten una amplificación robusta por PCR. Los productos de PCR se cargaron en gel de agarosa al 1% en 1 tampón TAE (5 μL (A, B) o 10 μL (C, D) y funcionaron a 90-100 V durante 30 min a 2 h. Se utilizó una escalera de ADN de 2 troncos para todos los geles. (A) Comparación de la lisis de ADN por kit con los métodos tradicionales de proteinasa K para crear plantillas utilizando dos conjuntos de cebadores. Se lisaron adultos de tipo salvaje, y se utilizó el equivalente a un animal como plantilla para todas las reacciones. Carriles 1-4, producto de 2.1 kb. Lane 1, PCR de lisis de un solo gusano por proteinasa K. Lane 2, PCR de lisis de un solo gusano por el método del kit. Lane 3, PCR de lisis de gusano de nueve gusanos por proteinasa K. Lane 4, PCR de lisis de gusano de nueve gusanos por el método del kit. Carriles 5-8, 0.5 kb producto. Lane 5, PCR de lisis de un solo gusano por proteinasa K. Lane 6, PCR de lisis de un solo gusano por el método del kit. Lane 7, PCR de lisis de gusano de nueve gusanos por proteinasa K. Lane 8, PCR de lisis de gusano de nueve gusanos por el método del kit. (B) El método del kit para la lisis del ADN proporciona una plantilla adecuada para la PCR por polimerasas múltiples. Los adultos de tipo salvaje se lisaron utilizando el método del kit, y el equivalente a la mitad de un animal se utilizó como plantilla de PCR para un producto de 0,5 kb. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre la polimerasa. Carril 1, PCR de una lisis de un solo gusano con una polimerasa de alta velocidad. Lane 2, PCR de una lisis de nueve gusanos con una polimerasa de alta velocidad. Lane 3, PCR de una lisis de un solo gusano con una polimerasa Taq . Lane 4, PCR de una lisis de nueve gusanos con una polimerasa Taq . Lane 5, PCR a partir de una lisis de un solo gusano con una polimerasa de alta fidelidad. Lane 6, PCR de una lisis de nueve gusanos con una polimerasa de alta fidelidad. Lane 7, PCR a partir de una lisis de un solo gusano con una polimerasa de alta velocidad y alta fidelidad. Lane 8, PCR de una lisis de nueve gusanos con una polimerasa de alta velocidad y alta fidelidad. (C) Las diluciones de una lisis de gusano L4 de tipo salvaje proporcionan una plantilla para la PCR. Carriles 1-5, 2.1 kb producto. Carriles 6-10, objetivo de 0,5 kb. Carril 1 y carril 6, ADN sin diluir. Carril 2 y carril 7, ADN diluido 2 veces. Carril 3 y carril 8, ADN diluido 10 veces. Carril 4 y carril 9, ADN diluido 20 veces. Carril 5 y carril 10, ADN diluido 50 veces. (D) Genotipado del locus blmp-1 mediante PCR utilizando 1 μL de preparaciones de ADN de un solo gusano y 16 como plantilla. Carril 1, PCR de lisis de un solo gusano de tipo salvaje. Carril 2, PCR de lisis de un solo gusano blmp-1(- ). Carril 3, PCR de lisis de 16 gusanos salvajes. Carril 4, PCR de blmp-1(-) lisis de 16 gusanos. Abreviaturas: preparación = método de preparación; kb = kilobase; st. = etapa de nematodo; dil. = dilución del ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Blanco Nombre de la cartilla Secuencia
blmp-1 adelante GCGTCAGGTAAGTTGTGATA
Marcha atrás CAGTTATTGCGGCTGTTGTT
sma-10 adelante AATGTGTGGCAAGGAATCG
Marcha atrás TGTCTGTCCAACGAGAAGTG
secuenciación 1 CACATCCCGGACGCCTTAAT
2 CTAATTGTTTTCTACCTGGC

Tabla 1: Lista de cebadores.

Un. Pol A, Pol B, Pol D Pol E
Mezcla maestra de PCR 12,5 μL 12,5 μL
Imprimación delantera 0,2 μM (concentración final) 0,5 μM (concentración final)
Imprimación inversa 0,2 μM (concentración final) 0,5 μM (concentración final)
ADN de plantilla variable 1 μL
Agua libre de nucleasas hasta 25 μL hasta 25 μL
B. Pol C
Búfer PCR 5x 2,5 μL
DNTP de 10 mM 2,0 μL
Imprimación delantera 0,2 μM (concentración final)
Imprimación inversa 0,2 μM (concentración final)
ADN de plantilla variable
polimerasa 0,5 μL
Agua libre de nucleasas hasta 25 μL
C. Programa de PCR utilizado para la Figura 1B
temperatura Hora Ciclos
98 °C 2 min 1
98 °C 1 min 30
55 °C 1 min
72 °C 1 min
72 °C 1 min 1
4 °C sostener
D. Programa de PCR utilizado para la Figura Suplementaria S1
temperatura Hora Ciclos
98 °C 30 s 1
98 °C 10 s 30
57 °C 20 s
72 °C Años 50 s
72 °C 2 min 1
4 °C sostener

Tabla 2: Componentes de reacción de PCR.

Figura suplementaria S1: Secuenciación para la confirmación de la calidad del ADN genómico preparado con un kit comercial. Los resultados de dos reacciones de secuenciación coinciden completamente con la secuencia esperada de más de 1.600 nucleótidos de ADN amplificados por una polimerasa de alta velocidad y alta fidelidad (Pol E) de una lisis de 16 gusanos (Tabla 1, Tabla 2A y Tabla 2D). Los extremos de lectura de secuenciación se recortaron para eliminar las lecturas base de baja calidad. La alineación se realizó utilizando la herramienta de alineación de secuencias múltiples EMBL-EBI MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Determinar los genotipos de C. elegans es un paso importante al realizar cruces genéticos para crear nuevas cepas de C. elegans . La extracción de ADN genómico utilizando uno o pocos C. elegans es un paso crucial en el genotipado de C. elegans. Este protocolo describe la extracción de ADN genómico de C. elegans utilizando un kit comercial. Este método es rápido y funciona de manera robusta. El ADN genómico extraído utilizando este método se puede utilizar para aplicaciones posteriores, incluido el genotipado, la secuenciación y la clonación. El método de extracción de ADN descrito se ha optimizado para genotipar cruces genéticos de C. elegans utilizando animales L4 o adultos como material de partida para la plantilla de ADN. El equivalente de una quincuagésima parte de un animal (Figura 1C) a 3,5 animales (Figura 1D) proporcionó una plantilla adecuada para amplificar las secuencias de ADN objetivo mediante PCR. Este protocolo (con dilución) produce suficiente plantilla (a 2 μL/reacción) para un máximo de 45 reacciones de un solo gusano y para 100 reacciones de 16 animales. Incluso utilizando un gusano por reacción, estos protocolos proporcionan una forma rentable de extraer ADN de C. elegans. Dada la simplicidad, robustez y rapidez del protocolo, es muy adecuado tanto para la investigación como para las aplicaciones en el aula.

Como el protocolo implica pipetear pequeños volúmenes de reactivos, se recomienda la preparación de una mezcla maestra para múltiples reacciones, una buena técnica de pipeteo y el uso de pipetas bien calibradas para garantizar la consistencia. El uso de 0.5-1 μL de plantilla de ADN sin diluir de lisas de animales individuales o 9-16 generalmente funciona para una reacción de PCR de 25 μL utilizando una mezcla maestra de PCR de inicio en caliente, pero se puede requerir la optimización de la concentración de la plantilla. Los reactivos deben mantenerse en hielo durante la duración del experimento. Para evitar la congelación y descongelación repetida de las soluciones de extracción de ADN, lo que puede reducir el rendimiento enzimático, se recomienda que los reactivos se aliquoted y almacenen a -20 °C.

Para aplicaciones posteriores que requieren PCR, el uso de una mezcla maestra de PCR de alta velocidad y arranque en caliente reduce aún más el tiempo total en comparación con la mezcla de reacción de PCR proporcionada en el kit de tejido comercial. Las polimerasas de alta velocidad pueden amplificar productos de menos de 1 kb en 5-10 s (consulte la Tabla de materiales y la Tabla 2 para obtener descripciones de la polimerasa), mientras que la mezcla de reacción de PCR del kit utiliza una ADN polimerasa Taq con una tasa de amplificación de ~ 1 kb / min7. Los productos de algunas PCR se pueden cargar directamente en un gel de agarosa para la electroforesis, reduciendo aún más los pasos y el tiempo. Este tampón de reacción también es compatible con la digestión de enzimas de restricción. Las ADN polimerasas de alta fidelidad también funcionan de manera robusta con el ADN extraído utilizando este protocolo (Figura 1B). Si bien las polimerasas utilizadas funcionaron consistentemente utilizando una plantilla extraída del kit, el uso de otras polimerasas puede proporcionar mejores resultados dependiendo de la plantilla, las propiedades del conjunto de imprimación, el tamaño del producto y la fidelidad requerida. Si se encuentran problemas después de la PCR, como que no hay banda objetivo amplificada o bandas adicionales amplificadas, es posible que se requiera una mayor optimización de las condiciones de trabajo de la imprimación o la concentración de la plantilla de ADN. Se recomienda encarecidamente que se utilicen los controles apropiados, incluida la plantilla de ADN de tipo salvaje y el uso de cebadores que se ha demostrado que funcionan.

Este método no será adecuado para aplicaciones que requieran una plantilla de ADN altamente purificada o de alto rendimiento. Si bien el número de animales preparados y el volumen de reacción pueden ampliarse, el ADN preparado con este método no se separa de los desechos del organismo y puede no ser lo suficientemente puro para aplicaciones altamente sensibles, como la secuenciación del genoma completo.

Las principales ventajas de este método en comparación con los métodos tradicionales de extracción de ADN genómico existentes incluyen el tiempo más corto y los pasos más simples y fáciles. En el futuro, este método podría ampliarse, adaptarse para extraer ADN genómico de C. elegans para otras aplicaciones posteriores y utilizarse para extraer ADN de otras especies de nematodos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

La cepa N2 y la bacteria E. coli OP50 se obtuvieron del Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). La cepa blmp-1(tm548) se obtuvo del National Bioresource Project, Japón. Los autores agradecen a WormBase. Este trabajo fue apoyado por NIH R01GM097591 a T.L.G., financiamiento interno de Texas Woman's University a T.L.G, y el Centro de Investigación Estudiantil de TWU a M.F.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoclave tape Defend 43237-2
aluminium foil, heavy duty Reynolds Wrap 2182934
calcium chloride Millipore Sigma 102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) Sigma-Aldrich Co. LLC XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer Fisher Scientific 11-100-495H
LB media, Lennox, capsules MP Biomedicals, LLC 3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous Thermo Scientific AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge Labnet International, Inc. PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs, Inc. M0515S "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder US Biological Life Sciences N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs, Inc. M0531S "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers Integrated DNA Technologies custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase Takara Bio Inc. R050B "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) New England Biolabs, Inc. N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix Takara Bio Inc. RR350A "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix Sigma-Aldrich Co. LLC P4600 "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler Applied Biosystems A24812
stir bar Fisher Scientific 14-512-126
vortex mixer Fisher Scientific 2215365
worm pick Genesee Scientific Corporation 59-AWP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
  2. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
  3. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
  4. Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
  5. Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
  6. Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
  7. Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).
  9. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
  10. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
  11. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
  12. Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
  13. Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
  14. Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
  15. Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
  16. Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
  17. Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
  18. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).

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Biología Número 184 Extracción de ADN Caenorhabditis elegans lisis de gusanos genotipado ADN genómico PCR
Extracción a pequeña escala de ADN genómico de <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Madhu, B., Lakdawala, M. F.,… More

Madhu, B., Lakdawala, M. F., Gumienny, T. L. Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA. J. Vis. Exp. (184), e63716, doi:10.3791/63716 (2022).

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