Summary
Shotgun 質量分析ベースのリピドミクスは、さまざまなげっ歯類組織からの 1 回の測定で、幅広い脂質クラスの高感度定量スナップショットを同時に提供します。
Abstract
脂質は、すべての原核細胞および真核細胞の必須成分として重要な役割を果たしています。質量分析の絶え間ない技術的進歩により、リピドミクスは、恒常性および疾患状態における組織リピドーム組成をモニタリングするための強力な分析ツールになりました。この論文では、さまざまな組織および生体液サンプル中の数百の分子脂質種の同時検出と定量をハイスループットでサポートするショットガン脂質分析方法のステップバイステップのプロトコルを提示します。この方法は、クロマトグラフィー分離なしで標識された内部標準を添加した総脂質抽出物を高分解能質量分析装置に自動ナノフロー直接注入します。齧歯動物組織のサブマイクログラム量から始めて、MS分析はサンプルあたり10分かかり、マウス肺組織の14の脂質クラスから最大400の脂質をカバーします。ここで紹介する方法は、疾患メカニズムを研究し、げっ歯類組織内の初期の毒性または有益な効果を示すバイオマーカーを特定および定量化するのに適しています。
Introduction
タバコの煙(CS)は、肺癌、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの肺の慢性炎症性疾患の発症に関連する主要な危険因子として認識されています1。肺への影響を超えて、CS曝露は、アテローム硬化性冠動脈疾患や末梢血管疾患などの他の疾患の発症に重要な役割を果たします1。心血管疾患は、COPDとともに、それぞれ世界で1番目と3番目に多い死因です。毒物学的リスク評価アプローチは、歴史的にげっ歯類などの動物モデルの使用に依存してきました。 in vivo 鼻のみまたは全身ラットおよびマウスモデルは、CSへの曝露の長期的影響を研究するために一般的に使用されます。
たとえば、一般に、6か月の煙曝露は、肺気腫、気道リモデリング、肺高血圧症などの人間の病気の異常を模倣するマウス肺の組織学的および機能的異常を誘発しますが、その変化は長期の人間の喫煙者で観察されたものと比較して比較的軽度です2。動物と人間の両方の組織で、酸化ストレス反応、炎症、構造組織の変化など、CS曝露に応答する幅広い分子変化が研究によって観察されています3,4。当然のことながら、CS曝露は、界面活性剤脂質、脂質シグナル伝達メディエーター、および構造脂質への影響を含む、肺リピドームに広範囲にわたる影響を与えることも報告されています4、5、6。
マウス肺の長期CS曝露によって誘発されるバルク脂質変化を特徴付けるために、我々は迅速かつ定量的なショットガン直接注入質量分析分析を行った。2005年にショットガンリピドミクス法が導入されて以来7、この方法は、酵母11、カエノラブディティスエレガンス12、ショウジョウバエメラノガスター13などのモデル系、および細胞株14などの幅広い哺乳類サンプルタイプで、脂質細胞代謝8,9,10に関する知識を拡張するために効果的に使用されてきました。 15、16種々のヒト17、18およびげっ歯類組織19、20および体液21、22。
過去数十年にわたって、研究は、何千もの相互接続されたタンパク質、脂質、および代謝物を含む、環境変化に対する細胞応答の複雑さを明らかにしてきました。これにより、分子機構の詳細なビューを取得し、外因性の生理学的影響の全規模を明らかにするには、最先端の分析技術を使用することが不可欠であることが明らかになりました。これに関連して、ショットガンリピドミクスアプローチによって生成された包括的で定量的な脂質フィンガープリントは、脂質細胞代謝に関する知識を効果的に追加することができます8,9,10。
いくつかの疾患の危険因子としてのCS曝露に関して、毒物学的リスク評価アプローチは歴史的にげっ歯類などの動物モデルの使用に依存してきました。ショットガンリピドミクスMSは、さまざまなサンプルタイプのリピドーム摂動を評価するための、高速で高感度の定量分析ツールを提供します。ショットガンリピドミクスのユニークな特徴は、エレクトロスプレーイオン化(ESI)ナノスプレー23を生成する導電性ナノチップを使用して、クロマトグラフィー分離なしで、標識された内部標準を添加した全脂質抽出物を高分解能MS装置に自動直接注入分析することです。
MS1モードで同時に取得される質量電荷比情報は、すべての無傷の内因性脂質の総脂質フットプリントを提供します。オプションで、親脂質分子を断片化して分析するMS2/MS3モードは、追加の構造情報を提供します。データ解析には特殊なソフトウェアが必要であり、脂質同定と推定化学構造の解明につながるプールスペクトルのスペクトルのデコンボリューションとピーク割り当てが含まれます。さらに、絶対定量は、目的の脂質クラスごとに少なくとも1つの脂質標準物質を含む標識内部標準混合物をスパイクすることによって行うことができる。全体として、本技術では、サンプルあたり数分かかるMS分析は、げっ歯類組織における14の脂質クラス24 から最大800の脂質の同定および定量をカバーできる。
Protocol
動物が関与するすべての手順は、実験動物ケア国際評価認定協会によって認定され、シンガポールの農業食品獣医局によって認可され、施設動物管理および使用委員会の承認を得て、科学的目的のための動物の世話と使用に関する実験動物研究ガイドラインのための全国諮問委員会(NACLAR、 2004).
1. サンプル収集
- ApoE-/- マウスの曝露の3か月および6か月後にマウス肺解離を実行します。曝露後16〜24時間で組織を収集し、液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存してからリピドミクスワークフローを開始します。各「オミクス」解剖グループから合計9つのサンプルを確実に収集します。
2.組織 - サンプルの粉砕
- 組織研削用の磁気ハンマーと消耗品を準備します。予冷組織ポーチ、鉗子、キャップ付きキャップ付き組織移送チューブ、「V」プラスチックヘラ、およびドライアイス上の2mLプラスチック収集チューブ。対応するチューブホルダーを磁気ハンマー機器に取り付けます。磁気ハンマーのスイッチを入れ、衝撃力を 高に設定します。
- サンプルをティッシュポーチに入れます。必要に応じて、予冷した鉗子を使用して、ティッシュポーチの上部開口部からサンプルを挿入します。サンプルをフレキシブルポーチの中央、端から離して置きます。
- 予冷した収集チューブをティッシュポーチの上部にねじ込んで、ティッシュポーチを密封します。
- フレキシブルポーチを液体窒素に10秒間浸して、サンプルを急速凍結します。
- 収集チューブを通気します。磁気ハンマーが衝撃したときにポーチが破裂しないように、通気のためにチューブを1/4回転緩めます。
- 凍結ティッシュポーチを磁気ハンマーにロードします。
- アクティベートボタンを押して磁気ハンマーを適用し、サンプルを粉砕します。粉砕されていない組織片がポーチに残っている場合は、サンプルを液体窒素で再度急速凍結し、2回目の衝撃を繰り返します。
- ティッシュポーチをマグネチティブハンマーから取り出し、粉砕したサンプルを底に保ちます。サンプルが溶けないようにするには、すぐに再度スナップフリーズしてください。
- サンプルを収集チューブに移します。ティッシュポーチが上になるようにチューブをすばやく反転させ、ポーチをタップして組織粒子を収集チューブの下部に移します。
注意: このステップは、組織の融解を避けるために迅速に実行する必要があります。 - さらなるリピドミック分析のために10 mgの組織アリコートを2 mLチューブに移し、さらなるステップが実行されるまでサンプルを-80°Cで保存します。
3.組織の均質化
- ティッシュライザー装置のスイッチを入れ、振とう周波数を30Hz、振とう時間を2分に設定します。組織ホモジナイズ緩衝液:水中の150 mM重炭酸アンモニウム、pH~8.2を調製します。
- 貯蔵冷凍庫からサンプルを取り出し、氷の上に置き、組織粉末を含むチューブに4つのステンレス鋼ビーズを追加します。各サンプルに0.5 mLの150 mM重炭酸アンモニウムバッファーを追加します。
- サンプルチューブをティッシュライザーホルダーに入れます。両方のホルダーを同じ数のチューブで相殺します。ホルダーをティッシュライザー保持アームに固定します。組織を破壊します。
- チューブを氷の上に置き、チューブ内に組織凝集体が残っていないことを目視で確認します。組織破壊が不完全な場合(凝集体が見られる場合)、別の治療サイクルを実行して破壊プロセスを繰り返します。サンプルを氷の上に置きます。
- タンパク質測定専用の1.5 mLチューブに100 μLのサンプルの アリコート1 を作成します。18,200 × g で10°Cで5分間遠心分離します。
- ブラッドフォードアッセイによって アリコート1 のタンパク質含有量を決定します(セクション4を参照)。サンプルを氷上に保管します。
- 脂質抽出用の新しい2 mLマイクロチューブに20〜100 μLのストックホモジネートの アリコート2 を作成します(セクション5を参照)。サンプルがすぐに分析されない場合は、抽出が行われるまで氷上に保管してください。
注:最終的な抽出量は、総タンパク質量に基づいて定義する必要があります。総アリコートあたり0.015〜0.045 mgのタンパク質の範囲でなければなりません。
4. ブラッドフォードタンパク質測定アッセイ
注:研究サンプルは分析の開始前にランダム化する必要があり、ランダム化はサンプル処理のすべてのステップで尊重されます。
- 遠心分離した アリコート1 上清を重炭酸アンモニウム緩衝液で2倍に希釈する。
注:希釈係数は、組織ホモジネートの濃度によって異なります。より濃縮された溶液の場合は、決定された濃度がアッセイのダイナミックレンジに入るように、より高い係数を適用します。 - 表1に従ってウシ血清アルブミン(BSA)標準曲線を作製した。標準チューブをボルテックスします。チューブを18,200 × gで室温で15秒間遠心分離します。
- 予め調製した標準チューブから、ブランクおよび標準チューブそれぞれ6 μLを、 図1に示すプレートレイアウトに従って96ウェル平底プレートに移します。
- 事前に調製したサンプルを、 図1に記載のプレートレイアウトに従って96ウェル平底プレートに移します。
- マルチチャンネルピペットを使用して250 μLのブラッドフォード試薬を各ウェルに加え、混合します。5分間インキュベートします。
- プレートリーダーを使用して595nmの波長での吸光度を測定します。
- 検量線に基づいてアリコート中のタンパク質濃度を計算します。
注:タンパク質濃度を計算する際には、手順の最初に使用する希釈係数を考慮する必要があります。
5.ブメ抽出
注:強力な有機溶媒は可塑剤を放出し、サンプル分析中に強力なバックグラウンドを作成するため、リピドミクス抽出に低結合プラスチックチューブの使用は避けてください。
- 10サンプルの各セットの間に1つのQCサンプルが配置されていることを考慮して、総ブランク(TB)、内部標準ブランク(ISB)、および品質管理サンプル(QC)の各チューブに100 μLの重炭酸アンモニウム溶液を含む1.5 mLチューブを準備します。すべてのサンプルを氷上に保管してください。
- プールしたヒト血漿10 μLをすべてのQCサンプルに加えます。10 μLの内部標準溶液をすべてのISB、QC、および研究サンプル(つまり、TBを除くすべてのサンプル)にスパイクします。
注:品質管理材料には、プールされた市販のK2EDTAプラズマを使用してください。受領時に上記のプロトコルを使用してプール血漿中の脂質濃度を定量し、QC材料が使用されるすべての分析の参照としてこれらの範囲を保持します。NIST血漿は、アッセイの精度に対処する必要がある、よりターゲットを絞ったアプリケーションまたはグローバルなメソッド検証にのみ使用してください。 - 各サンプルに300 μLの-20°Cブタノール/メタノール混合物(3/1、v/v)を加えます。サーモミキサーで室温で450 × g で10分間振とうします。
- 300 μLのヘプタン/酢酸エチル混合物(3/1、v/v)を加えます。サーモミキサーで室温で450 × g で10分間振とうします。
- 300 μLの1%酢酸混合物を加える。サーモミキサーで室温で450 × g で5分間振とうします。室温で2,800 × g で5分間遠心分離します。上相360 μLを新しい2 mLセルフロックチューブ2に移します。
注意: 液液抽出では、サンプルに応じて相境界の位置がずれる可能性があり、その結果、上相の体積がわずかに不一致になる可能性があります。必要に応じて、上相の収集量を調整します。 - 320 μLのヘプタン/酢酸エチル(3/1、v/v)を水相チューブ1に加えます。サーモミキサーで室温で450 × g で5分間振とうします。室温で2,800 × g で5分間遠心分離します。320 μLの上相を移し、ステップ5.11の画分と混ぜ合わせます。
注意: 必要に応じて、上相の収集量を調整します。 - 250 μLのヘプタン/酢酸エチル(3/1、v/v)をチューブ1の水相に加えます。サーモミキサーで室温で450 × g で5分間振とうします。室温で5分間、2,800 × g で遠心分離します。200 μLの上相を移し、ステップ5.11およびステップ5.15のフラクションとチューブ2で結合します。
注意: 必要に応じて、上相の収集量を調整します。 - 真空濃縮器で35°Cで蒸発乾固する。
注:乾燥サンプルは、必要に応じて分析するまで-20°Cで保存できます。 - 300 μLのMS混合溶液(イソプロパノール/メタノール/クロロホルム中の7.5 mM酢酸アンモニウム、4:2:1溶液)に再溶解します。各チューブを5秒間渦巻き、すべてが溶解することを確認します。18,200 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 正イオン化モード分析用の 図2 のプレートレイアウトに従って50 μLのアリコートをマイクロリットルプレートに移し(カラム1〜6)、50 μLのMSミックス溶液で希釈します。
- 負イオン化モード分析用の 図2 のプレートレイアウトに従って20 μLのアリコートをMTPプレートに移し(カラム7〜12)、80 μLのMSミックスで希釈します。プレートをホイルで包み、分析前に4°Cに保ちます。
6. MS分析
- 質量分析計(MS)をポジティブモードとネガティブモードの両方で、分析の5日以内に製造元の指示に従って校正します。
- 直接注入ナノソースを前もって取り付け、MSの転写キャピラリーに対して適切に位置合わせされていることを確認します。 4.1 μmノズルチップをチップホルダーに取り付け、ソフトウェアで構成します。
- ポジティブモードとネガティブモードのメソッド設定には、次のパラメータを使用します:ガス圧1.25psi;1.1kVのソース電圧;5 μLのサンプル注入量;出力接点閉鎖Rel1を2.5秒間;5分の配達時間。プレート冷却は4°C。
- ポジティブモードの直接注入ロボットの分析シーケンスキューを設定します。
- 次のMS設定を使用して、 ポジティブモード のMSメソッドを設定します。
- キャピラリー温度を250°C、SレンズのRFレベルを65.0に設定します。1 ×106の自動ゲイン制御と50 msの最大注入時間により、140,000の分解能で550〜1000 m/zの範囲で0〜1分のフルスキャンMS取得を実行します。ロック質量680.48022を適用します。
- データに依存しないMS/MS取得方法を、17,500の分解能で1〜5分の時間範囲で設定し、最初の質量を250 m/zに固定します。MS2 の自動ゲイン制御を 1 × 105、最大射出時間64 ms、衝突エネルギー 20 NCE、絶縁ウィンドウ 1 m/z で使用します。550〜1,000 m/zの介在質量リストを使用し、質量ステップは1 Daです。
- ネガティブモードでアクイジションする場合は、MSチューンファイルでキャピラリー温度を250°C、SレンズRFレベルを65.0に設定します。
- 次のMSメソッド設定を使用します:400〜940 m / zの範囲をカバーする140,000の解像度で0〜1分のフルスキャン取得モード、1×106の自動ゲイン制御。50msの最大注入時間;ロック質量 529.46262 を使用します。
- DIAモードでのMS2取得を、17,500の分解能で17,500分の分解能で150 m / zに固定します。 1 × 105の自動ゲイン制御。最大射出時間64ms。衝突エネルギーの35NCE。400から940までの包含質量リストを1Daの質量ステップで使用します。
- MSソフトウェアで ポジティブ モードで分析シーケンスキューを作成します。各サンプルの直接注入ロボットからのコンタクトクロージャ信号によってサンプル取得がトリガーされるのを待ちます。
- ポジティブモード解析が完了したら、 ネガティブ モードの直接注入ロボットのシーケンスキューを作成します。
- MSソフトウェアの解析シーケンスキューを ネガティブ モードで設定します。
7. データ処理
- データファイルをポジティブモードとネガティブモードから.raw形式から.mzML形式に変換するには、コンバータソフトウェアを使用します。
注:正モードと負モードのデータファイルは、別々に変換する必要があります(集録設定とノイズしきい値が異なるため)。- ファイル変換を実行するには、次の設定を入力します:ノイズしきい値係数は、MSとMS2でそれぞれ3と5です。MSとMS2の両方のノイズ除去機能、データ圧縮、平均MS2スキャン、およびピークピッキングを有効にします。正モードと負モードのTICスレッショルドを設定します(たとえば、10,000と5,000、特定の機器によって生成された特定のサンプルのノイズレベルに基づいて定義されます)。 処理の最後に XLC および PDF レポートを生成します。
- 脂質同定を行う。次の(例の)ファイルインポート設定パラメータを定義します:選択ウィンドウ±0.5 Da(MSメソッドの選択ウィンドウに依存します)。時間範囲2〜300秒(MS法のスキャン時間に依存)。MSおよびMS2のキャリブレーション質量はありません。ピークバイピークソフトウェアメタデータファイル(最小質量[MS])および(最小質量[MS2])から質量範囲を転送および切り上げます。MSとMS2でそれぞれ3ppmと10ppmの許容誤差。MSおよびMS2スレッショルドフィールド、周波数フィルタ、MS1オフセット、およびPMOを空のままにします。MSおよびMS2の同位体補正が選択されました。コンバーターメタデータファイルから解像度グラデーションを(解像度線形フィット[MS])および(解像度線形フィット[MS2])として転送します。
注:ポジティブモードとネガティブモードでの脂質同定は、取得設定が異なるため、別々に実行する必要があります。 - データがインポートされたら、[ 実行 ] メニューに移動し、脂質識別用の MFQL ファイルをアップロードします。
注:MFQLの構造の詳細については、Herzogらの出版物25を参照してください。https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library で MFQL ファイルの例をいくつか参照し、ディスカッションを参照してください。データ処理に使用されるすべてのMFQLは、補足資料に記載されています。 - 脂質特徴の前駆体質量強度を標識内部標準のそれぞれの強度で割り、次に商に標識内部標準の濃度を掛けることにより、MSレベルで同定された種を定量します。ブラッドフォードアッセイによって測定された総タンパク質量あたりの最終脂質濃度を正規化します。
8. QCチェック手順
注:品質チェック手順は、メソッドの技術的再現性を検証するための重要なステップです。この目的のために、市販のプール血漿を分析して、バッチあたり15の同一のアリコート(合計5バッチ)で5日間にわたる異なる脂質の内因性レベルを決定します。この場合、データ評価パイプラインは、R 統計ソフトウェア環境を使用して Shiny Web アプリケーションとして作成されたことに注意してください。
- 参照許容範囲を、5つのバッチすべて±3標準偏差)について計算された平均値として定義します。
- 各分析バッチに「合格」受け入れ規則を適用する:1つの参照化合物が1つの脂質クラスを表すことを考慮して、参照ターゲットの90%が合格する必要があります。たとえば、QC 検証に 15 個の参照ターゲットが含まれている場合は、バッチが受け入れられるために 13 個のターゲットが合格することを確認します。
注:言い換えれば、この脂質クラスのデータが受け入れられるには、参照化合物あたりのQCサンプルの68%が合格する必要があります。 - スタディバッチがQCチェックの受け入れ基準を満たしていない場合は、手順を繰り返します。
9.(相対)共役脂肪酸量の推定
- 各脂質クラスについて、MS2強度に基づいて共役脂肪酸の量を推定します。
注:断片化とイオン化の違いにより、導出された値は、たとえば、脂質クラスの共役脂肪酸プール全体に対する特定の脂肪酸の相対的な寄与を推定するのではなく、サンプルグループ間の相対的な存在量の比較のみを目的としていました。 - 脂肪酸フラグメントのMS2強度を、対応する内部標準の脂肪酸フラグメントの平均強度で正規化する。内部標準物質の濃度と測定された組織重量に基づいて、共役脂肪酸の「正規化濃度」を導き出します。脂質クラスごとにこれらの値を合計して、サンプルあたりの各共役脂肪酸の総量を推定します。
10.統計分析
- 統計分析を実行します。各条件と対応する対照群の線形モデルを適合し、log2変換されたデータの t統計量からp値を計算します。ベンジャミニ-ホッホベルク偽発見率法を使用して、複数の検定効果を補正します。
注:調整されたp値が0.05<脂質は、差的に豊富であると見なされます。ここでは、R統計環境26で統計解析を行った。
Representative Results
ここでは、代表的な結果として、ショットガンリピドミクスを使用してマウスの肺に対するCSの影響を研究する方法を示すデータを提示します。ショットガン脂質分析プロトコルは、2つのサンプルグループの比較分析のためのin vivo研究に成功しました:CSに曝露された9匹の雌Apoe-/-マウス(3R4Fグループ;ポジティブコントロール)から解剖された肺組織と、3か月で収集されたネガティブコントロールとして新鮮な空気条件下で維持された同数のマウス(偽グループ)。 4か月、および6か月の曝露時点。動物を濾過し、2°C±温度および55%±15%の湿度で新鮮な空気を調節し、ガンマ線照射ペレット飼料を与えた。光環境は1日あたり12時間に維持された。各ケージあたり最大8匹のマウスを飼育した。暴露処理用の3R4F参照紙巻きたばこをケンタッキー大学から購入し、28μgのニコチン/Lに相当する目標ばく露濃度の3R4F CSエアロゾル(総粒子状物質TPM/Lエアロゾル600μg)を生成した.CS フィリップスらによると、3R4F紙巻きたばこからの煙は30台のポートロータリー喫煙機を使用して製造されました27.カナダ保健省の集中喫煙プロトコルに基づいて、十分な曝露を提供するために、55 mLのパフ量、30秒ごとに1パフ、および通気孔の100%閉塞が3R4Fタバコに適用されました。研究デザインに関するすべての追加詳細は以前に報告されています27,28。
全体として、最も豊富な14の脂質クラスから~400の分子脂質種が同定され、定量されました(図3)。クラスあたりの正規化脂質濃度の合計は、PE、PEO、PC、PCO、PI、およびPG脂質クラスでわずかに上昇し、SM、LPE、およびPA脂質ではいくらかのダウンレギュレーションが観察されましたが(図3A)、TAGおよびPSでは差は見られませんでした。 興味深いことに、CS群におけるPCOおよびPEOプラズマローゲン脂質のレベルの上昇が炎症細胞で報告されています29。.プラズマローゲン脂質の細胞内機能の1つは抗酸化活性です。活性酸素(ROS)および窒素種(RNS)への曝露下で、ジアシルリン脂質と比較したプラズマローゲンの選択的酸化が報告された30。プラズマローゲンの化学構造におけるエニル-エーテル結合は、酸化ストレスに対するラジカル攻撃に敏感です31。ラジカル攻撃の主な生成物は、ヒドロキシル化エイコサテトラエン酸、2-モノアシルグリセロールリン脂質、ペンタデカノール、ギ酸、さまざまな鎖長のα-ヒドロキシアルデヒド、1-ホルミル-2-アラキドノイルグリセロリン脂質、およびリゾリン脂質です。
これらの結果は、全分子式に基づく分子特徴のうち、100〜120の化合物がCS曝露によって有意に影響されたことを示しています(図3D)。MS2フラグメンテーション情報の詳細なデコンボリューションとフラグメントシグナル強度の正規化により、各脂質クラスで表される各共役脂肪酸(FA)の総量のおおよその定義(図3E)と、曝露群と対照群の間でこれらのデータの比較が可能になりました。完全に飽和したFAと、主にリゾ脂質の文脈で、不飽和度がわずかのFAの両方で明らかな減少が観察されました。対照的に、PC、PE、およびPGリン脂質クラスの組成中の多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、すべての時点でCS群で上昇しました。エイコサペンタン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)と結合したPCおよびPGの極端な症例は、3R4F CS曝露群でのみ検出されました(図3E、赤色)。
図1:ブラッドフォードアッセイにおけるサンプル分配のためのプレートレイアウト。 ブランクサンプルと標準サンプルは、列1〜3の3連に配置されます。不明なサンプルは、列 4 から 11 に重複して配置されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ショットガン質量分析用の96ウェルマイクロタイタープレートのプレートレイアウト。 正イオン化モードで取得するためのブランク、標準、未知、およびQCサンプルの分布は、プレートの左側(列1〜6)にマッピングされています。負イオン化モードのすべてのサンプルは右側に配置されます(列7〜12)。略語:pos =ポジティブ。QC =品質管理;neg = 負;TB = 合計ブランク。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:タバコの煙にさらされたマウス肺のショットガンリピドミクス分析。 Apoe−/− マウスを、3R4F基準タバコまたは新鮮な空気(偽)からのCSに曝露した。(A)脂質クラス濃度とクラスあたりの脂質種の数。各クラスについて、定量化された脂質種の数が括弧内に示されている。各脂質クラスの平均および95%信頼区間、ばく露タイプごとに個別(3つの時点にわたって集計)。(B)3つの時点での3R4F CSと偽の比較について、定量化された脂質種の効果サイズ(log2倍変化)と有意性(-log10FDR調整p値)を示す火山プロット。著しく上昇した脂質は黄色でマークされています。有意に減少した脂質はシアンでマークされています(FDR調整p値<0.05)。(C)絶対平均倍率が最大の25種の差の存在量の変化。3R4F CSと偽の比較のLog2倍の変化は色分けされており、統計的有意性が示されています:*:FDR調整されたp値<0.01;X:FDR調整されたp値は0.05<。(D)比較プロット。フォールド変化比較の相関係数を色分けし、共有差的に豊富な脂質の数を示します(余白の総数)。円グラフは、同じ変化方向(FC記号)を持つ共有差的に豊富な脂質の割合を示しています。アスタリスクは、差次的に豊富な脂質の有意な重複を示す。(E)脂質クラスごとのコンジュゲートFAの存在量の差。3つの時点すべてで3R4Fと偽曝露の間に有意な存在量差がある共役脂肪酸のパネル C のようなヒートマップ(FDR調整p値<0.05)。脂質クラスあたりの各脂肪酸の量は、脂肪酸フラグメントのMS2強度に基づいて推定されました。略語:CS =タバコの煙;FDR =偽発見率。FC =フォールド変更。FA =脂肪酸;PC =ホスファチジルコリン;PS =ホスファチジルセリン;タグ=トリアシルグリセロール;SM =スフィンゴミエリン;PEO =プラズマローゲンホスファチジルエタノールアミン;PE =ホスファチジルエタノールアミン;PG =ホスファチジルグリセロール;PI =ホスファチジルイノシトール;DAG =ジアシルグリセロール;SE =ステロール/コレステリルエステル;PCO =プラズマローゲンホスファチジルコリン;LPC = リゾホスファチジルコリン;LPE =リゾホスファチジルエタノールアミン;PA =ホスファチジン酸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| BSAの最終濃度 (mg/mL) | 2 mg/mL (μL) の BSA 溶液 | 炭酸水素アンモニウムバッファー (μL) |
| 1 | 50 | 50 |
| 0.75 | 37.5 | 62.5 |
| 0.5 | 25 | 75 |
| 0.25 | 12.5 | 87.5 |
| 0.125 | 12.5 | 187.5 |
| 0.0625 | 0.125 mg/mL 溶液 50 個 | 50 |
| 0 | 0 | 100 |
表1:ブラッドフォードアッセイの検量線のためのBSA内部標準の希釈スキーム。 略称:BSA =ウシ血清アルブミン。
補足情報:脂質Xplorer脂質同定に使用されるMFQLファイル。 .zipパッケージは、個々の必要な MFQL ファイルで構成され、それぞれが次のパターンに従って名前が付けられています: <脂質クラスの省略形>_<イオン化モード>_MS2.mfql (例: PE_neg_MS2.mfql)。標識された内部標準識別用のファイル名には、<脂質の略語>のD7(D9)タグが含まれます(例:PED7_neg_MS2.mfql)。これらのMFQLファイルは、内部標準中の重水素の量を検証するために使用されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
MSの進歩により、多くの脂質種を正確にモニタリングするためのさまざまな方法が生まれましたが、さまざまな哺乳類組織の以前の脂質プロファイリングでは一貫した結果が得られず、その結果、脂質の特定の組織特異的機能は不明のままです。特定の化合物の発現をノックアウトするためのより堅牢なアプローチが利用可能なタンパク質機能解析と比較して、大部分の脂質を選択的にオフにしたり、組織内で過剰発現させたりすることができないため、脂質の機能評価が困難になります。組織リピドーム濃度の高度なプロファイリングは、循環脂質とヒト疾患との関連を特定するための代替アプローチを提供する可能性があります。
あらゆるマウス組織の内因性脂質プロファイルを定性的および定量的にカバーできる包括的なリピドミクス法を評価する際には、ショットガンリピドミクス法を優先しました。一般に、サンプル分析には、液体クロマトグラフィー(LC)ベースの分離を使用した脂質の完全ノンターゲットスクリーニングと、サンプルの総脂質の複雑さを明らかにするためのさらなる質量分析検出、または目的の特定の脂質の非常に正確な定量を可能にするターゲットアプローチの2つの反対のタイプが可能です。対照的に、提示されたショットガンリピドミクスワークフローの強力な特徴は、事前定義された脂質クラスからの数百の内因性脂質の迅速で包括的なカバレッジであり、これは依然として堅牢な半定量的な方法で実行できます。
異なる脂質クラスのイオン化効率は構造に依存し、異なる実験イオン化条件に応じて大きく変化する可能性があります。LCベースの分離方法とは対照的に、ショットガン分析は、同じイオン化条件下で脂質抽出物全体をMS装置に直接同時に注入するため、これらの違いを最小限に抑えます。同位体標識脂質類似体または構造的に類似した非内因性標準物質の使用は、すべての脂質クラスの半定量を可能にする。ショットガンリピドミクスは、MS分析中のラン間およびラン内の変動性が低いです。その結果、この方法は、適切な定量のために複数の標準を必要とする非標的液体クロマトグラフィーベースの方法よりも低い変動係数21 を生成します。重要なことに、現在の方法では外部検量線が使用されていませんが、この方法は依然として完全に定量的であると考えられています32。
脂質クラス当たり1レベルの標識内部標準物質(または内因的に発現していない非標識標準物質)は、ほとんどの脂質の定量に十分である。ショットガンリピドミクス法の部分的な方法検証を報告している出版物はごくわずかです。例えば、Gryzbek et al.17およびSurmaら21では、内部標準物質および一定量のサンプルマトリックスを用いて逆検量線を調製した。直線性は、対数変換された脂質量およびそれらの強度の線形回帰によって評価され、それぞれR2および傾きとして報告された。検出限界(LOD)と定量限界(LOQ)は、LODの信号対雑音比3とLOQの10に基づく重み付き線形回帰によって決定されました。ほとんどの脂質クラスについて、LOQは脂肪組織では2〜9.8 pmol、血漿では0.05〜5μMの間で定義されていました。どちらの場合も、クラスごとの非内因性の単一の内部標準を使用して、クラス内のすべての脂質の推定値を導き出しました。ただし、この研究では、内因性マトリックスが化合物フリーではなく、組織の代理マトリックスが利用できないといういくつかの懸念からLOD/LOQを提供していません。純粋な標準物質が存在せず、同位体標識脂質の入手可能性が非常に限られているため、同一の同位体標識標準物質で正規化された特定の化合物の検量線シリーズを使用する古典的な標的定量アプローチは実行しません。Orbitrap検出器は、フーリエ変換を適用して過渡信号の変換を自動的に実行し、一部の信号はすでに置換されているため、低濃度範囲は最小信号まで直線的になり、それ以下では分子は検出できなくなります。Xcaliburソフトウェアの信号対雑音比は、分子のm/z比に依存します。その結果、脂肪酸の異なる組み合わせを含む各脂質クラスの化合物は、異なるノイズ値を有することになる。さらに、LOQ/LOQ値はマトリックスの種類と厳密に関連しており、異なるげっ歯類組織でリピドームの定量を行う場合は、各組織タイプのLOQを個別に評価することによって反映する必要があります。
実際、この方法は、最大4桁33の高い線形動的定量範囲と、最も重要な内因性構造脂質をカバーする非常に優れた感度を提供し、MS取得32の技術的改善によってさらに高めることができます。平均脂質濃度の変動係数はほとんどが15%未満であり、ショットガンリピドミクスは、グッドラボラトリープラクティス(GLP)およびグッドクリニカルプラクティス(GCLP)研究で考慮すべき方法として食品医薬品局(FDA)の要件に準拠していることを意味します34。
ただし、極性が異なるため、一部の脂質クラスは特定のコンジュゲートFAの寄与によってはるかに影響を受けることに注意する必要があります。これは、広範囲の共役FAを含む等モル混合物における強度応答の歪みをもたらし、リン脂質クラスについてKoivusaloら35 によって強調されているように、定量化バイアスをもたらす。注目すべきことに、これらの著者は、実際の生物学的サンプルの状況を反映していない可能性が高い、24〜48の鎖長からの幅広いFAのデータを提示しました。多価不飽和種に対する応答は、完全に飽和した種に対する応答よりも40%高かったが、この効果は高濃度でのみ観察された。混合物を徐々に希釈すると、不飽和の影響は徐々に減少し、種あたり0.1 pmol/μLで事実上消失しました。.さらに、すべての測定はイオントラップおよびトリプル四重極装置で行われ、Q-Exactive機器では行われませんでした。
提示されたワークフローのもう一つの利点は、特定のプロジェクト要件に適応できる技術的な柔軟性です。例えば、任意の脂質抽出プロトコル(修飾Bligh and Dyer36、メチルtert-ブチルエーテル37、またはブタノール-メタノール38メソッドなど)を使用して、MS分析前に総脂質抽出物を調製できます。クロロホルム - メタノール抽出の主な制限は、下相が脂質画分を含むことであり、これは日常業務、特に自動化を複雑にする。さらに、クロロホルムの毒性を考慮する必要があります。tert-ブチルエーテル抽出は、血漿サンプルの脂質分析に広く使用されており37、自動化バージョンが提案されています21。この場合、BUME法を選択した理由は、スパイクPG、PI、PA、およびPS脂質クラス38の回収率がさらに向上し、溶媒消費量が少なく、自動化の可能性が39であり、3つの方法すべてで抽出された組織サンプルの定量化された全体的な濃度が同等であったためです。さらに、サンプル抽出は現在の作業では手動で行われていましたが、96ウェルフォーマットでの自動サンプル調製および脂質抽出によって、大規模なサンプルセットから再現性のある正確な結果を得ることもできます40,41。これにより、大規模な臨床および毒物学的研究においてリピドミクス解析を実施することができます。
現在の研究では、Schuhmannら42で説明されているように、極性を切り替えることなく、正モードと負モードのMS取得を別々に実行しました。ナノメイトシグナルの安定性は、ポジティブモードよりもわずかに濃度の低い溶液のネガティブモードで優れています。さらに、.rawファイルからmzMLへのコンバータソフトウェアを使用して完全に追跡可能な手順を開発し、LipidXplorerソフトウェアで指定する値を提供します-これにより、手動の分解能勾配計算は必要ありません。また、ポジティブモードではスペクトルのノイズレベルがネガティブモードよりも高いため、さまざまなノイズ設定の置換を適用しました。すべてのステップは、トレーサブルでハイスループットのルーチン分析用に最適化されています。
同定のために、ショットガンリピドミクス分析は、異なる極性モードで固有の付加体を形成する異なる脂質クラスの固有の挙動を利用することができる。この方法では、正イオン化モードで重複する同じ分子量のPC種とPE種を負イオン化モードで完全に分離することができ、PCは酢酸塩またはギ酸付加物を形成し、PEは脱プロトン化形態でイオン化されます。また、分子式だけでなくバルク脂肪酸構造も利用した方法では(部分的な)構造デコンボリューションが可能です。たとえば、総炭素および総不飽和数のレベルでのFA同定は、すべてのリン脂質、DAG、TAG、およびリゾリン脂質に対して機能します。各異性体形態のボトムアップ定量は、リン脂質クラス43 の一部では部分的に実行できますが、MS2スペクトル内の異なるFAのシグナル応答が等しくないため、DAGおよびTAGでははるかに複雑です。
この分野における最近のイニシアチブと完全に一致した適切な品質管理手順を実施する必要性を強調することも重要です44。ラボ間およびラボ内での適切なデータのトレーサビリティと再現性を確保したいため、分析のすべてのステップでサンプルを適切にランダム化すること、サプライヤー認定の標準混合物を使用した作業、品質管理サンプルを含めること、バッチの合格または拒否を検証する手順、QCパフォーマンスを長期的に追跡するための内部データベースの作成など、多くのステップが講じられています。また、これらのイニシアチブと一致しているのは、サンプルの安定性に対処するための標準化された方法の必要性です。一般に、構造脂質の大部分は脂質酸化の影響を受けないため、オキシリピン、酸化脂質、および多価不飽和脂肪酸に関連しているため、保管および取り扱い条件にはるかに敏感です。ただし、サンプルの安定性を正しく評価することは、依然として技術的に困難な作業です。
ただし、このプロトコルには、化合物の分子内レベルの決定に関しては制限があります。全抽出物の分離がないことを考慮して、同じ分子量で異なる脂肪酸組成を有する脂質のすべてのアイソフォームがMS分析にマージされます。ほとんどのクラスでは、MS2の残留脂肪酸フラグメントのフラグメンテーション比を使用して、構造の部分的なデコンボリューションを達成することが可能です。ただし、各アイソフォームの独立した定量は、異なるアイソフォームのフラグメンテーション挙動に大きな違いがあり、純粋な化学標準が補償値を定義するのに十分な種類で利用できないという事実のために、依然として特に困難な作業です。別の制限は、ESIプロセスが必然的にアーティファクトを生成し、その結果、DAG、Pas、FAなどの一部の脂質のピークが人工的に生成され、誤った定量につながる可能性があることです。
次に、私たちの経験に基づいてプロトコルの最も重要な部分を要約します。第1のものは、各マウス組織タイプが脂質量およびクラス比の両方に関して固有の脂質プロファイルを有するという事実に関連する。これにより、MSシグナルを飽和させず、高濃度での脂質凝集による動的定量範囲を離れないように、抽出前の総タンパク質含有量に基づく組織の開始量を慎重に決定する必要があります33 、または-反対の極端-各脂質クラスの主要な脂質化合物をカバーするのに十分なMSシグナルを提供します。
第2の重要な側面は、直接注入ナノソースチップ出口の位置と質量分析計の転写キャピラリーとの適切な位置合わせを確実にすることである。両方のモードでの質量分析計の完全なキャリブレーションが毎週実行されることを考えると、キャリブレーションソースとナノソースチップのセットアップの交換は、設置中のミスアライメントによる信号強度の劇的な変動の原因となる可能性があります。
プロトコルのもう一つの重要な部分は、内部標準ミックスの慎重な取り扱いです。この混合物には大量のジクロロメタンが含まれているため、開封すると、長期間の保管や蒸発や人為的な濃度変化につながる複数の使用を避けるために、迅速に消費する必要があります。さらに、温度差がエアクッションピペットでのピペッティング中に容量の不一致につながる可能性があるため、-20°Cの保管から取り出した後の標準混合物の一貫した取り扱いが重要です。標準的な再懸濁バッファー中のジクロロメタンを純粋なメタノールに置き換えることで、取り扱いの利便性が向上する可能性がありますが、一部の脂質クラスの溶解度に悪影響を及ぼし、これらの脂質クラスの定量精度が低下する可能性があります。
最後の重要な部分はデータ処理です。データ処理ワークフローは、.rawから.mzML形式へのPeak by Peakソフトウェア変換、MS2スキャン平均化、MS1およびMS2ノイズフィルタリングの適用、およびピークピッキングとデータ圧縮を組み合わせています。別の方法として、Proteowizardソフトウェアをデータ変換にも使用できますが、この場合、LipidXplorerのいくつかの設定を手動で定義する必要があります。ショットガンリピドミクスの全ての複雑さは、特に直接注入MS1およびMS2スペクトルのデコンボリューションのステップに集中している。オープンソースのLipidXplorerソフトウェアは、質量精度、質量分解能、およびm / zの増加に伴うその変化の傾きに基づいて、mzMLファイル形式から変換されたスペクトルをインポートします。このソフトウェアは、分析実行で取得した複数の個別のMSおよびMS/MSスペクトルをマージします。その後、異なるサンプルラン内で個々のピークを整列させ、整列したピークの各クラスターで、それらの質量を単一の強度加重平均質量に置き換えますが、各データファイル内の存在量は変更されません。整列したピーククラスターの代表的な質量と個々のピーク強度は、マスタースキャンデータベースに保存されます。マスタースキャンデータベースには、バッチ内のすべてのサンプルに対して生成されたすべてのMS1およびMS2スペクトルが含まれており、分子フラグメンテーションクエリ言語(MFQL)で記述されたクエリによって脂質識別にデコンボリューションできます。
全体として、この方法は、ポジティブモードに基づくDAG、TAG、およびSE脂質の同定、およびネガティブモード取得に基づくPC、PE、PS、PI、PA、PG、SM、LPC、およびLPE脂質の同定をカバーしています。脂質同定中、MS1およびMS2に対して同位体補正が行われ、調整された強度が.xlsx出力ファイルに報告されます。あるいは、ALEX45 やLipidHunter46など、ショットガンデータを処理するために他のいくつかのソフトウェアが利用可能です。
脂肪酸 - 主要な核および細胞膜成分 - は、生理活性分子へのさらなる変換のためにリン脂質の形で貯蔵される。それらは、リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ酵素によって、Lands経路47を介してリゾリン脂質に変換され得る。LPCAT3酵素は、例えば、AAをリゾホスファチジルコリンやリゾホスファチジルセリン中間体に取り込む高い特異性を示すことが知られている。これらの酵素の比較的高い発現は、肺胞マクロファージや気管支上皮細胞などの炎症細胞内で報告されており47、これらの細胞ではAA含有リン脂質の相対的な割合が大きく放出されています。しかしながら、ホスホリパーゼA2による膜リン脂質からの遊離に続いて、PUFAの様々なタイプの脂質メディエーターへの変換は、多くの酵素によって触媒される48。さらに、これらのPUFAは、シクロオキシゲナーゼ(COX)−1およびCOX-2酵素の作用 を介して 、炎症誘発性および抗炎症性プロスタグランジンの産生のための基質となり得る47。リン脂質は、これらのメディエーターが生物学的効果を実証するために必要な特定の場所で放出される脂質メディエーターの供給源の1つです。
肺は複数の細胞型からなる複雑な器官であり、それぞれが正常な肺の発達と機能を促進する上で重複したニッチな役割を果たしています。マウスまたはヒトの肺の異なる細胞型(肺胞2型細胞など)を分離してプロファイリングするための研究はごくわずかです49,50;他の主要な肺細胞タイプは特徴付けられていません。.別の興味深い研究51は、マウス肺の内皮、上皮、間葉系、および混合免疫細胞の脂質分析を単離して実行するために実施されました。PCOおよびPGに取り込まれたPUFAの濃度が免疫細胞に富んでいることが観察された。気管支肺胞洗浄(BAL)52によって評価されるように、CSが肺内の免疫細胞の増加(4〜5倍)を誘導するという事実を考慮すると、この研究で観察された総脂質変化は、マウス肺における免疫細胞動員の累積的な増加によって説明できます。
結論として、リン脂質に取り込まれた一価不飽和脂肪酸およびPUFAの観察された歪みは、細胞内の特定のFAの過剰を反映し、および/または酸化ストレスおよび炎症条件下で過剰に産生されるオキシリピン前駆体の細胞内資源を構成する可能性がある。ただし、遊離EPA、DHA、およびその他のオキシリピンに関する追加データは、この点を明確にするために不可欠であり、現在の方法の適用範囲外です。
Disclosures
すべての著者はフィリップモリスインターナショナルの従業員です。フィリップモリスインターナショナルは、このプロジェクトの唯一の資金源であり、スポンサーです。
Acknowledgments
著者らは、研究チームに感謝し、特に、フィリップモリス国際研究所のPMI R&Dのバイオ研究およびエアロゾルチームの技術支援とサポートに感謝したいと思います。Ltd.、シンガポール、およびPMI R&D、Philip Morris Products S.A.、ヌーシャテル、スイス。著者らは、バイオバンキングを管理してくれたSam Ansariに感謝し、原稿の草稿を編集してくれたSindhoora Bhargavi Gopala Reddyの支援を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 5, and 2 mL self-lock tubes | Eppendorf | 30120086, 30120094 | |
| 3 mm stainless still beads | Qiagen | 69997 | |
| 4.1 µm nozzle chip | Advion | HD-D-384 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 45754-100ML-F | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 14267-25G | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830-500G | |
| Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | 23209 | |
| Butanol | Honeywell | 33065-2.5L | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650498-1L | |
| Dichloromethane | Honeywell | 34856-1L | |
| Ethyl acetate | Honeywell | 33211 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma | M9686 | |
| Heptane | Sigma Aldrich | 34873-2.5L | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A456 | |
| Mouse pooled plasma | BioIvt | ||
| Mouse SPLASH standard | Avanti Polar Lipids | 330710X | Internal standard |
| Nunc 96-flat bottom well transparent plates | VWR | 62409-068 | |
| Plastic spatula | Sigma | Z560049-300EA | |
| Quick Start Bradford 1x Dye reagent | BioRad | 5000205 | |
| Serum diluent | Sigma Aldrich | D5197 | |
| Equipment/software | |||
| CryoPrep CP02 impactor instrument | Covaris | Magnetic hammer | |
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | . | Centrifuge |
| ChipSoft 8.3 | Advion Biosciences | . | Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot |
| LipidXplorer 1.2.8.1 | N/A | . | Software to identify lipids |
| Peak By Peak | SpectroSwiss | . | Software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| ProteoWizard | ProteoWizard | . | Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| Q-Exactive MS | Thermo Fisher | . | High resolution orbitrap mass spectrometer |
| Qiagen Tissue Lyser II | Qiagen | . | Tissue lyser |
| SpeedVac SPD140DDA | Thermo Fisher | . | Vacuum concentrator |
| Tecan Infinite M nano plus | Tecan | . | Plate reader |
| ThermoMixer C | Eppendorf | . | Thermomixer |
| TriVersa Nanomate | Advion Biosciences | . | Direct infusion nano-source |
| Xcalibur 4.3 | Thermo Scientific | . | Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS |
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