Summary
La lipidómica basada en espectrometría de masas de escopeta ofrece una instantánea cuantitativa sensible de un amplio espectro de clases de lípidos simultáneamente en una sola medición de varios tejidos de roedores.
Abstract
Los lípidos juegan un papel vital como componentes esenciales de todas las células procariotas y eucariotas. Las constantes mejoras tecnológicas en la espectrometría de masas han hecho de la lipidómica una poderosa herramienta analítica para monitorear las composiciones de lipidomas tisulares en estados homeostáticos y de enfermedad. Este documento presenta un protocolo paso a paso para un método de análisis de lípidos de escopeta que admite la detección y cuantificación simultáneas de unos pocos cientos de especies de lípidos moleculares en diferentes muestras de tejidos y biofluidos a alto rendimiento. Este método aprovecha la inyección directa automatizada de nanoflujo de un extracto lipídico total enriquecido con estándares internos marcados sin separación cromatográfica en un instrumento de espectrometría de masas de alta resolución. A partir de cantidades inferiores a microgramos de tejido de roedores, el análisis de EM toma 10 minutos por muestra y cubre hasta 400 lípidos de 14 clases de lípidos en tejido pulmonar de ratón. El método presentado aquí es muy adecuado para estudiar los mecanismos de la enfermedad e identificar y cuantificar biomarcadores que indican toxicidad temprana o efectos beneficiosos dentro de los tejidos de roedores.
Introduction
El humo del cigarrillo (SC) es reconocido como un principal factor de riesgo asociado al desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas del pulmón, incluyendo carcinoma pulmonar, bronquitis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)1. Más allá del impacto pulmonar, la exposición al SC juega un papel significativo en el desarrollo de otras enfermedades como la enfermedad arterial coronaria aterosclerótica y la enfermedad vascular periférica1. Las enfermedades cardiovasculares, junto con la EPOC, son la primera y tercera causa de muerte en todo el mundo, respectivamente. Los enfoques de evaluación del riesgo toxicológico se han basado históricamente en el uso de modelos animales como los roedores. Los modelos in vivo de ratas y ratones de cuerpo completo o solo nariz se usan comúnmente para estudiar los efectos a largo plazo de la exposición al CS.
Por ejemplo, generalmente, 6 meses de exposición al humo inducen anomalías histológicas y funcionales en los pulmones murinos que imitan a los de la enfermedad humana, incluyendo enfisema, remodelación de las vías respiratorias e hipertensión pulmonar, aunque los cambios son relativamente leves en comparación con los observados en fumadores humanos a largo plazo2. Tanto en tejidos animales como humanos, los estudios han observado una amplia gama de cambios moleculares en respuesta a la exposición a la CS, incluyendo respuestas al estrés oxidativo, inflamación y cambios estructurales en los tejidos 3,4. No es sorprendente que la exposición a SC también haya sido reportada para tener un impacto de gran alcance en el lipidoma pulmonar, incluyendo efectos sobre los lípidos surfactantes, mediadores de señalización lipídica y lípidos estructurales 4,5,6.
Para caracterizar los cambios lipídicos masivos inducidos por la exposición a largo plazo a SC de los pulmones de ratón, realizamos un análisis de espectrometría de masas de infusión directa rápida y cuantitativa. Después de la introducción del método lipidómico de escopeta en 20057, este método se ha utilizado eficazmente para ampliar nuestro conocimiento sobre el metabolismo celular lipídico 8,9,10 en sistemas modelo como la levadura 11, Caenorhabditis elegans12 y Drosophila melanogaster13, así como en una amplia gama de tipos de muestras de mamíferos como las líneas celulares 14, 15,16 varios humanos17,18 y tejidos de roedores19,20 y fluidos corporales21,22.
En las últimas décadas, los estudios han revelado la complejidad de las respuestas celulares a los cambios ambientales, involucrando miles de proteínas, lípidos y metabolitos interconectados. Esto ha dejado claro que el uso de técnicas analíticas de vanguardia es esencial para obtener una visión en profundidad de las maquinarias moleculares y para descubrir la magnitud total de los impactos fisiológicos exógenos. En este contexto, las huellas dactilares lipídicas exhaustivas y cuantitativas producidas por los enfoques lipidómicos de escopeta pueden aumentar efectivamente nuestro conocimiento sobre el metabolismo celular lipídico 8,9,10.
Con respecto a la exposición a la CS como factor de riesgo para varias enfermedades, los enfoques de evaluación del riesgo toxicológico se han basado históricamente en el uso de modelos animales como los roedores. Shotgun lipidomics MS proporciona una herramienta analítica rápida, sensible y cuantitativa para evaluar la perturbación del lipidoma en numerosos tipos de muestras. La característica única de la lipidómica de escopeta es el análisis automatizado de inyección directa de un extracto lipídico total, enriquecido con estándares internos marcados, sin separación cromatográfica en un instrumento de EM de alta resolución mediante el uso de un nanochip conductor que genera un nanospray de ionización por electrospray (ESI)23.
La información de la relación masa-carga que se adquiere simultáneamente en el modo MS1 proporciona la huella lipídica total de todos los lípidos endógenos intactos. Opcionalmente, el modo MS2/MS3, en el que las moléculas lipídicas originales se fragmentan y analizan, proporciona información estructural adicional. El análisis de datos requiere un software especializado e incluye la deconvolución de espectros y asignaciones de picos en espectros agrupados que conducen a la identificación de lípidos y la elucidación putativa de la estructura química. Además, la cuantificación absoluta se puede realizar mediante la introducción de una mezcla de patrones internos etiquetados que contenga al menos un patrón lipídico por clase de lípidos de interés. En general, con la técnica actual, el análisis de EM que toma unos minutos por muestra puede cubrir la identificación y cuantificación de hasta 800 lípidos de 14 clases de lípidos24 en tejidos de roedores.
Protocol
Todos los procedimientos con animales se realizaron en una instalación acreditada por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International y autorizada por la Autoridad Agroalimentaria y Veterinaria de Singapur, con la aprobación de un Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y de conformidad con las Directrices del Comité Asesor Nacional para la Investigación con Animales de Laboratorio sobre el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos (NACLAR, 2004).
1. Recogida de muestras
- Realizar disecciones pulmonares de ratón después de 3 meses y 6 meses de exposición de ratones ApoE−/− . Recoja los tejidos 16-24 h después de la exposición, congélelos rápidamente en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C antes de iniciar el flujo de trabajo de lipidómica. Asegurar la recolección de un total de nueve muestras de cada grupo de disección "ómica".
2. Tejido - pulverización de las muestras
- Prepare el martillo magnético y los consumibles para la molienda de tejidos. Bolsas de tejido preenfriadas, fórceps, tubos de transferencia de tejido tapados con tapas, una espátula de plástico en "V" y tubos de recolección de plástico de 2 ml en hielo seco. Instale el soporte de tubo correspondiente en un instrumento de martillo magnético. Encienda el martillo magnético y ajuste la potencia de impacto a Alta.
- Cargue la muestra en una bolsa de tejido; Inserte la muestra a través de la abertura superior de la bolsa de tejido con pinzas preenfriadas si es necesario. Coloque la muestra en el centro de la bolsa flexible, lejos de los bordes.
- Selle la bolsa de tejido atornillando un tubo de recolección preenfriado en la parte superior de la bolsa de pañuelo.
- Congele la muestra sumergiendo la bolsa flexible en nitrógeno líquido durante 10 s.
- Ventile el tubo de recolección; Afloje el tubo durante 1/4 de vuelta para ventilar y evitar romper la bolsa cuando el martillo magnético impacte.
- Cargue la bolsa de tejido congelado en el martillo magnético.
- Aplique el martillo magnético presionando el botón de activación para pulverizar la muestra. Si quedan trozos de tejido no pulverizados en la bolsa, congele la muestra en nitrógeno líquido nuevamente y repita para un segundo impacto.
- Retire la bolsa de tejido del martillo magnético, manteniendo la muestra pulverizada en la parte inferior. Para evitar que la muestra se derrita, vuelva a congelarla inmediatamente.
- Transfiera la muestra a un tubo de recolección. Invierta rápidamente el tubo para que la bolsa de tejido esté en la parte superior y golpee la bolsa para transferir las partículas de tejido a la parte inferior del tubo de recolección.
NOTA: Este paso debe hacerse rápidamente para evitar la fusión del tejido. - Transfiera una alícuota tisular de 10 mg a un tubo de 2 ml para su posterior análisis lipidómico y almacene la muestra a -80 °C hasta que se realicen los pasos adicionales.
3. Homogeneización tisular
- Encienda el instrumento de lisor tisular y ajuste la frecuencia de agitación a 30 Hz y la duración de agitación a 2 min. Preparar la solución tampón de homogeneización tisular: 150 mM de bicarbonato de amonio en agua, con un pH de ~8.2.
- Saque las muestras del congelador de almacenamiento, colóquelas en hielo y agregue cuatro perlas de acero inoxidable en los tubos que contienen el polvo de tejido. Agregue 0.5 ml de tampón de bicarbonato de amonio de 150 mM a cada muestra.
- Coloque los tubos de muestra en los soportes del lisor de tejido. Contrapeso ambos soportes con el mismo número de tubos. Fije los soportes en el brazo de sujeción del lisor de tejido. Alterar el tejido.
- Coloque los tubos sobre hielo y verifique visualmente que no haya agregados de tejido sobrantes en el tubo. Si la alteración tisular es incompleta (se observan agregados), repita el proceso de interrupción realizando otro ciclo de tratamiento. Coloque las muestras en hielo.
- Crear una alícuota 1 de 100 μL de la muestra en un tubo de 1,5 ml dedicado a la determinación de proteínas. Centrifugarlo a 18.200 × g durante 5 min a 10 °C.
- Determinar el contenido proteico de alícuota 1 mediante el ensayo de Bradford (ver sección 4). Almacene las muestras en hielo.
- Crear una alícuota 2 de 20-100 μL del material de homogeneización en un nuevo microtubo de 2 ml para la extracción de lípidos (ver sección 5). Si las muestras no se analizan inmediatamente, manténgalas en hielo hasta que se realice la extracción.
NOTA: El volumen final de extracción debe definirse sobre la base de la cantidad total de proteína. Debe estar en el rango de 0.015-0.045 mg de proteína por alícuota total.
4. Ensayo de determinación de proteínas Bradford
NOTA: Las muestras del estudio deben ser aleatorizadas antes del comienzo del análisis, y la aleatorización se respeta para todos los pasos del procesamiento de la muestra.
- Alícuota 1 sobrenadante centrifugado diluido 2x con tampón bicarbonato de amonio.
NOTA: El factor de dilución depende de la concentración del homogeneizado tisular. Para soluciones más concentradas, aplique un factor más alto para que la concentración determinada caiga en el rango dinámico del ensayo. - Preparar una curva estándar de albúmina sérica bovina (BSA) de acuerdo con la Tabla 1. Vórtice los tubos estándar. Centrifugar los tubos a 18.200 × g durante 15 s a temperatura ambiente.
- A partir de los tubos estándar previamente preparados, transfiera 6 μL cada uno de los espacios en blanco y los patrones a una placa de fondo plano de 96 pocillos de acuerdo con el diseño de la placa que se muestra en la Figura 1.
- Transfiera las muestras previamente preparadas a la placa de fondo plano de 96 pocillos de acuerdo con el diseño de la placa descrito en la Figura 1.
- Añadir 250 μL del reactivo Bradford a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal y mezclar. Incubar durante 5 min.
- Mida la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm utilizando un lector de placas.
- Calcular las concentraciones de proteínas en las alícuotas basándose en la curva estándar.
NOTA: El factor de dilución utilizado al comienzo del procedimiento debe tenerse en cuenta al calcular las concentraciones de proteínas.
5. Extracción BUME
NOTA: Evite el uso de tubos de plástico de baja unión para la extracción lipidómica, ya que los solventes orgánicos fuertes liberan plastificantes y crean un fondo sólido durante el análisis de la muestra.
- Prepare tubos de 1,5 ml con 100 μL de solución de bicarbonato de amonio en cada tubo de las muestras en blanco total (TB), en blanco estándar interno (ISB) y de control de calidad (QC), considerando que se coloca 1 muestra de QC entre cada conjunto de 10 muestras. Mantenga todas las muestras en hielo.
- Añadir 10 μL de plasma humano agrupado a todas las muestras de control de calidad. Introduzca 10 μL de solución patrón interna en todas las muestras de ISB, QC y de estudio (es decir, todas las muestras excepto TB).
NOTA: Para el material de control de calidad, utilice cualquier plasmaK2EDTA disponible comercialmente agrupado. Cuantificar la concentración de lípidos en plasma agrupado utilizando el protocolo mencionado en el momento de la recepción y mantener estos rangos como referencias para todos los análisis en los que se utiliza el material de control de calidad. Utilice plasma NIST solo para aplicaciones más específicas o para la verificación global del método, donde se debe abordar la precisión del ensayo. - Añadir 300 μL de una mezcla de butanol/metanol a -20 °C (3/1, v/v) a cada muestra. Agitar a 450 × g durante 10 min a temperatura ambiente en el termomezclador.
- Añadir 300 μL de mezcla de heptano/acetato de etilo (3/1, v/v). Agitar a 450 × g durante 10 min a temperatura ambiente en el termomezclador.
- Añadir 300 μL de mezcla de ácido acético al 1%. Agitar durante 5 min a 450 × g a temperatura ambiente en el termomezclador. Centrifugar a 2.800 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Transfiera 360 μL de la fase superior a un nuevo tubo autoblocante 2 de 2 ml.
NOTA: La extracción líquido-líquido puede dar lugar a cambios de posición del límite de fase de una manera dependiente de la muestra, lo que puede dar lugar a una ligera discrepancia de volumen para la fase superior. Ajuste el volumen de recolección para la fase superior si es necesario. - Añadir 320 μL de heptano/acetato de etilo (3/1, v/v) al tubo de fase acuosa 1. Agitar a 450 × g durante 5 min a temperatura ambiente en el termomezclador. Centrifugar a 2.800 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Transfiera 320 μL de la fase superior y combínela con la fracción del paso 5.11.
NOTA: Ajuste el volumen de recolección para la fase superior si es necesario. - Añadir 250 μL de heptano/acetato de etilo (3/1, v/v) a la fase acuosa del tubo 1. Agitar a 450 × g durante 5 min a temperatura ambiente en el termomezclador. Centrifugar a 2.800 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Transfiera 200 μL de la fase superior y combínelo con las fracciones del paso 5.11 y el paso 5.15 en el tubo 2.
NOTA: Ajuste el volumen de recolección para la fase superior si es necesario. - Evaporar a sequedad a 35 °C en un concentrador de vacío.
NOTA: Las muestras secas pueden almacenarse a -20 °C hasta el análisis, si es necesario. - Volver a disolver en 300 μL de solución de mezcla MS (7,5 mM de acetato de amonio en isopropanol/metanol/cloroformo, solución 4:2:1). Vórtice cada tubo durante 5 s para asegurarse de que todo se disuelva. Centrifugar a 18.200 × g durante 5 min a 4 °C.
- Transfiera una alícuota de 50 μL a la placa de microlitro de acuerdo con el diseño de la placa en la Figura 2 para el análisis del modo de ionización positiva (columnas 1-6) y diluya con 50 μL de solución de mezcla MS.
- Transfiera una alícuota de 20 μL a la placa MTP de acuerdo con el diseño de la placa en la Figura 2 para el análisis del modo de ionización negativa (columnas 7-12) y diluya con 80 μL de mezcla MS. Envolver la placa con papel de aluminio y conservar a 4 °C antes del análisis.
6. Análisis de MS
- Calibre un espectrómetro de masas (MS) tanto en modo positivo como negativo de acuerdo con las instrucciones del fabricante 5 días o menos antes del análisis.
- Instale la nanofuente de infusión directa por adelantado, asegurándose de que esté correctamente alineada contra el capilar de transferencia de la EM. Instale un chip de boquilla de 4,1 μm en el soporte del chip y configúrelo en el software.
- Utilice los siguientes parámetros para la configuración del método de modo positivo y negativo: presión de gas de 1,25 psi; tensión de fuente de 1,1 kV; 5 μL de volumen de inyección de muestra; cierre de contacto de salida Rel1 durante 2,5 s; 5 min de tiempo de entrega; refrigeración de placas a 4 °C.
- Configure la cola de secuencia de análisis para el robot de infusión directa en modo positivo.
- Configure el método MS para el modo positivo utilizando los siguientes ajustes de MS:
- Ajuste la temperatura capilar a 250 °C y el nivel de RF de la lente S a 65,0. Realice la adquisición de MS de escaneo completo de 0 a 1 minuto en el rango de 550-1000 m/z a una resolución de 140.000 con control de ganancia automatizado de 1 ×106 y tiempo máximo de inyección de 50 ms. Aplique una masa de bloqueo de 680.48022.
- Establezca el método de adquisición MS/ MS independiente de los datos entre el intervalo de tiempo de 1 y 5 minutos a una resolución de 17.500 con una primera masa fija de 250 m/z. Utilice un control de ganancia automatizado para MS2 a 1 × 105 y un tiempo máximo de inyección de 64 ms, una energía de colisión de 20 NCE y una ventana de aislamiento de 1 m/z. Utilice la lista de masa de inclusión de 550 a 1.000 m/z, con un paso de masa de 1 Da.
- Para la adquisición en modo negativo, ajuste la temperatura capilar a 250 °C y el nivel de RF de la lente S a 65,0 en el archivo de sintonización de MS.
- Utilice los siguientes ajustes del método MS: modo de adquisición de escaneo completo de 0 a 1 minuto a una resolución de 140.000 que cubre el rango de 400-940 m/z, control de ganancia automatizado de 1 × 106; tiempo máximo de inyección de 50 ms; Utilice una masa de bloqueo de 529.46262.
- Ajuste la adquisición MS2 en modo DIA entre 1 y 5 min de la carrera a una resolución de 17.500 con una primera masa fija de 150 m/z; control de ganancia automatizado de 1 × 105; 64 ms de tiempo máximo de inyección; y 35NCE de energía de colisión. Utilice la lista de masa de inclusión de 400 a 940 con un paso de masa de 1 Da.
- Cree la cola de secuencia de análisis en el software MS en modo positivo . Espere a que la adquisición de la muestra se active mediante una señal de cierre de contacto proveniente del robot de infusión directa para cada muestra.
- Cuando se complete el análisis de modo positivo, cree la cola de secuencia para el robot de infusión directa en modo negativo .
- Configure la cola de secuencia de análisis en el software MS en modo negativo .
7. Tratamiento de datos
- Para convertir los archivos de datos de los modos positivo y negativo del formato .raw al formato .mzML, utilice el software convertidor.
NOTA: Los archivos de datos de los modos positivo y negativo deben convertirse por separado (debido a sus diferentes configuraciones de adquisición y diferentes umbrales de ruido).- Rellene los siguientes ajustes para realizar la conversión de archivos: el factor umbral de ruido es 3 y 5 para MS y MS2, respectivamente; active la función de eliminación de ruido para MS y MS2, compresión de datos, escaneos MS2 promedio y selección de picos. Establecer umbrales TIC para los modos positivo y negativo (por ejemplo, 10.000 y 5.000; que se definirán en función del nivel de ruido de la muestra particular producida por un instrumento específico). Genere informes XLC y PDF al final del procesamiento.
- Realizar la identificación lipídica. Defina los siguientes parámetros de configuración de importación de archivos (ejemplo): ventana de selección ±0,5 Da (depende de la ventana de selección en el método MS); rango de tiempo 2-300 s (depende del tiempo de escaneo en el método MS); sin masas de calibración para MS y MS2; transferir y redondear el rango de masa de los archivos de metadatos del software Peak by Peak (masa mínima [MS]) y (masa mínima [MS2]); tolerancia de 3 ppm y 10 ppm para MS y MS2, respectivamente; mantener vacío el campo de umbral MS y MS2 , el filtro de frecuencia, el desplazamiento MS1 y la PMO; Corrección isotópica para MS y MS2 seleccionadas; transfiera el gradiente de resolución desde el archivo de metadatos del convertidor como (ajuste lineal de resolución [MS]) y como (ajuste lineal de resolución [MS2]).
NOTA: La identificación de lípidos en los modos positivo y negativo debe realizarse por separado debido a sus diferentes configuraciones de adquisición. - Después de importar los datos, vaya al menú Ejecutar y cargue los archivos MFQL para la identificación de lípidos.
NOTA: Para obtener información detallada sobre la estructura de las MFQL, véase la publicación de Herzog et al.25. Vea algunos ejemplos de archivos MFQL en https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library y vea la discusión. Todos los MFQL utilizados para el procesamiento de datos se proporcionan en los Materiales complementarios. - Cuantificar las especies identificadas a nivel de MS dividiendo la intensidad de masa precursora de la característica lipídica por la intensidad respectiva del estándar interno marcado y luego multiplicando el cociente por la concentración del patrón interno marcado. Normalizar la concentración lipídica final por cantidad de proteína total medida por el ensayo de Bradford.
8. Procedimiento de control de calidad
NOTA: Un procedimiento de control de calidad es un paso esencial para verificar la reproducibilidad técnica del método. Con este fin, se analiza un plasma comercial agrupado para determinar los niveles endógenos de diferentes lípidos durante 5 días en 15 alícuotas idénticas por lote (total de cinco lotes). Tenga en cuenta que, en este caso, se creó una canalización de evaluación de datos como una aplicación web Shiny utilizando el entorno de software estadístico R.
- Defina el rango de aceptación de referencia como el valor promedio calculado para los cinco lotes ±3 desviaciones estándar.
- Aplicar las reglas de aceptación de "pasar" para cada lote analítico: el 90% de los objetivos de referencia deben pasar, considerando que un compuesto de referencia representa una clase de lípidos. Por ejemplo, si se incluyen 15 objetivos de referencia en la verificación de control de calidad, asegúrese de que pasen 13 objetivos para que el lote sea aceptado.
NOTA: En otras palabras, el 68% de las muestras de control de calidad por compuesto de referencia deben pasar para que los datos de esta clase de lípidos sean aceptados. - Si el lote del estudio no cumple los criterios de aceptación para la verificación de control de calidad, repita el procedimiento.
9. Estimación de las cantidades (relativas) de ácidos grasos conjugados
- Para cada clase de lípidos, estime las cantidades de ácidos grasos conjugados en función de sus intensidades MS2.
NOTA: Debido a las diferencias de fragmentación e ionización, los valores derivados solo estaban destinados a comparaciones de abundancia relativa entre grupos de muestra en lugar de, por ejemplo, estimar la contribución relativa de un ácido graso específico al conjunto general de ácidos grasos conjugados de una clase de lípidos. - Normalizar las intensidades MS2 de los fragmentos de ácidos grasos por la intensidad media de los fragmentos de ácidos grasos del patrón interno correspondiente. Sobre la base de la concentración del patrón interno y el peso del tejido medido, derivar una "concentración normalizada" para los ácidos grasos conjugados. Suma estos valores por clase de lípidos para estimar la cantidad total de cada ácido graso conjugado por muestra.
10. Análisis estadístico
- Realizar análisis estadísticos. Ajuste un modelo lineal para cada condición y el grupo de control correspondiente, y calcule los valores de p a partir de una estadística t para datos transformados log2. Utilice el método de tasa de descubrimiento falso de Benjamini-Hochberg para corregir múltiples efectos de prueba.
NOTA: Los lípidos con valores de p ajustados < 0,05 se consideran diferencialmente abundantes. Aquí, el análisis estadístico fue realizado en el entorno estadístico R26.
Representative Results
Aquí, como resultados representativos, presentamos datos que ilustran cómo se puede utilizar la lipidómica de escopeta para estudiar los efectos del SC en los pulmones de ratones. El protocolo de análisis de lípidos de escopeta se aplicó con éxito para un estudio in vivo para el análisis comparativo de dos grupos de muestras: tejidos pulmonares disecados de nueve ratones hembra Apoe−/− expuestos a SC (grupo 3R4F; control positivo) y un número igual de ratones mantenidos en condiciones de aire fresco (grupo simulado) como control negativo recogido a los 3 meses, Puntos de tiempo de exposición de 4 meses y 6 meses. Los animales se mantuvieron bajo aire fresco filtrado y acondicionado a 22 °C ± 2 °C de temperatura y 55% ± 15% de humedad y se alimentaron con una dieta de pellets irradiados con rayos gamma. El régimen de luz se mantuvo a las 12 h por día. Se alojaron hasta ocho ratones por cada jaula. Los cigarrillos de referencia 3R4F para el tratamiento de exposición se compraron a la Universidad de Kentucky para generar el aerosol 3R4F CS (600 μg de partículas totales de aerosol TPM / L) para una concentración de exposición objetivo equivalente a 28 μg de nicotina / L.CS el humo de los cigarrillos 3R4F se produjo utilizando máquinas de fumar rotativas de 30 puertos según Phillips et al.27 . Según el Protocolo de Tabaquismo Intensivo de Health Canada, se aplicaron 55 ml de volumen de inhalación, una inhalación por cada 30 s y un bloqueo del 100% de los orificios de ventilación a los cigarrillos 3R4F para proporcionar una exposición suficiente. Todos los detalles adicionales sobre el diseño del estudio han sido reportados previamente27,28.
En general, se identificaron y cuantificaron ~ 400 especies de lípidos moleculares de las 14 clases de lípidos más abundantes (Figura 3). La concentración total normalizada de lípidos por clase fue ligeramente elevada para las clases de lípidos PE, PEO, PC, PCO, PI y PG, y se observó cierta regulación a la baja para los lípidos SM, LPE y PA (Figura 3A), mientras que no se observaron diferencias para TAGs y PS. Curiosamente, se han reportado niveles elevados de PCO y lípidos plasmalógenos PEO en el grupo CS en células inflamatorias29 . Una de las funciones intracelulares de los lípidos plasmalógenos es la actividad antioxidante. Bajo exposición a especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS), se reportó oxidación selectiva de plasmalógenos en comparación con fosfolípidos diacil30. El enlace enil-éter en la estructura química de los plasmalógenos es sensible al ataque radical sobre el estrés oxidativo31. Los principales productos del ataque radical son ácidos eicosatetraenoicos hidroxilados, fosfolípidos de 2-monoacilglicerol, pentadecanol, ácidos fórmicos, α-hidroxialdehídos de varias longitudes de cadena, 1-formil-2-araquidonoilglicerofosfolípido y lisofosfolípidos.
Estos resultados muestran que, entre las características moleculares basadas en la fórmula molecular total, 100-120 compuestos se vieron significativamente afectados por la exposición a CS (Figura 3D). La deconvolución detallada de la información de fragmentación MS2 y la normalización de las intensidades de señal del fragmento permitieron la definición aproximada de la cantidad total de cada ácido graso conjugado (FA) representado en cada clase lipídica (Figura 3E) y la comparación de estos datos entre los grupos expuestos y control. Se observó una clara disminución tanto en los FA completamente saturados como en los que tienen solo unas pocas insaturaciones, principalmente en el contexto de los lisolípidos. En contraste, los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en la composición de las clases de fosfolípidos PC, PE y PG se elevaron en el grupo CS para todos los puntos temporales. Los casos extremos de PC y PG conjugados con eicosapentanoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA) se detectaron exclusivamente en el grupo de exposición a 3R4F CS (Figura 3E, color rojo).
Figura 1: Diseño de la placa para la distribución de muestras en el ensayo de Bradford. Las muestras en blanco y estándar se colocan por triplicado en las columnas 1-3; Las muestras desconocidas se colocan por duplicado en las columnas 4-11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diseño de placas de la placa de microtitulación de 96 pocillos para análisis de espectrometría de masas de escopeta. La distribución de muestras en blanco, estándar, desconocidas y de control de calidad para su adquisición en el modo de ionización positiva se mapea en el lado izquierdo de la placa (columnas 1-6); Todas las muestras para el modo de ionización negativa se colocan a la derecha (columnas 7-12). Abreviaturas: pos = positivo; QC = control de calidad; neg = negativo; TB = total en blanco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis lipidómico de escopeta de pulmones de ratón expuestos al humo del cigarrillo. Los ratones Apoe−/− fueron expuestos a CS del cigarrillo de referencia 3R4F o aire fresco (simulado). A) Concentraciones de clase lipídica y número de especies lipídicas por clase. Para cada clase, el número de especies lipídicas cuantificadas se indica entre paréntesis. Media e intervalos de confianza del 95% para cada clase de lípidos, por separado para cada tipo de exposición (agregados a lo largo de tres puntos temporales). (B) Gráficos de volcanes que muestran el tamaño del efecto (cambio log2 veces) y la significación (-log10 valor p ajustado por FDR) de las especies lipídicas cuantificadas para la comparación 3R4F CS versus simulada en los tres puntos temporales. Los lípidos significativamente elevados están marcados en amarillo; Los lípidos significativamente disminuidos se marcan en cian (valor de p ajustado por FDR < 0,05). (C) Abundancia diferencial de las 25 especies lipídicas con los mayores cambios absolutos medios en el pliegue. Los cambios en el pliegue log2 para la comparación 3R4F CS versus simulado están codificados por colores, y se indica significación estadística: *: valor de p ajustado por FDR < 0.01; X: El valor de p ajustado por FDR < 0,05. (D) Gráficos de comparación. Los coeficientes de correlación para las comparaciones de cambio de pliegue están codificados por colores, y se indica el número de lípidos diferencialmente abundantes compartidos (números totales en los márgenes). Los gráficos circulares muestran el porcentaje de lípidos diferencialmente abundantes compartidos con la misma dirección de cambio (signo FC). El asterisco indica una superposición significativa de los lípidos diferencialmente abundantes. (E) Abundancia diferencial de AF conjugados por clase lipídica. Mapa de calor como en el panel C para ácidos grasos conjugados con diferencias significativas de abundancia entre 3R4F y exposición simulada en los tres puntos de tiempo (valor de p ajustado por FDR < 0.05). La cantidad de cada ácido graso por clase lipídica se estimó en función de las intensidades MS2 de los fragmentos de ácidos grasos. Abreviaturas: CS = humo de cigarrillo; FDR = tasa de descubrimiento falso; FC = cambio de pliegue; FA = ácidos grasos; PC = fosfatidilcolina; PS = fosfatidilserina; TAG = triacilglicerol; SM = esfingomielina; PEO = fosfatidiletanolamina plasmalógena; PE = fosfatidiletanolamina; PG = fosfatidilglicerol; IP = fosfatidilinositol; DAG = diacilglicerol; SE = ésteres de esteroles/colesterilos; PCO = fosfatidilcolina plasmalógena; LPC = liso fosfatidilcolina; LPE = liso fosfatidiletanolamina; PA = ácido fosfatídico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Concentración final de BSA (mg/ml) | Solución de BSA a 2 mg/ml (μL) | Tampón bicarbonato de amonio (μL) |
| 1 | 50 | 50 |
| 0.75 | 37.5 | 62.5 |
| 0.5 | 25 | 75 |
| 0.25 | 12.5 | 87.5 |
| 0.125 | 12.5 | 187.5 |
| 0.0625 | 50 de solución de 0,125 mg/ml | 50 |
| 0 | 0 | 100 |
Tabla 1: Esquema de dilución del patrón interno BSA para la curva de calibración para el ensayo Bradford. Abreviatura: BSA = albúmina sérica bovina.
Información complementaria: Archivos MFQL utilizados para la identificación de lípidos LipidXplorer. El paquete .zip consta de los archivos MFQL individuales requeridos, cada uno nombrado siguiendo este patrón:
Discussion
Aunque los avances en la EM han producido una variedad de métodos para monitorear con precisión muchas especies de lípidos, el perfil lipídico anterior de varios tejidos de mamíferos no mostró resultados consistentes y, en consecuencia, las funciones específicas de los lípidos en los tejidos siguen sin estar claras. En comparación con el análisis funcional de proteínas, para el cual se dispone de enfoques más robustos para eliminar la expresión de compuestos particulares, la mayoría de los lípidos no pueden apagarse selectivamente o sobreexpresarse en los tejidos, lo que dificulta la evaluación funcional de los lípidos. El perfil avanzado de las concentraciones tisulares de lipidomas puede proporcionar un enfoque alternativo para identificar asociaciones entre los lípidos circulantes y las enfermedades humanas.
Al evaluar métodos lipidómicos integrales capaces de cubrir cualitativa y cuantitativamente el perfil lipídico endógeno de cualquier tejido de ratón, dimos preferencia al método lipidómico de escopeta. En general, son posibles dos tipos opuestos de análisis de muestras: un cribado completamente no dirigido de lípidos utilizando la separación basada en cromatografía líquida (LC) con detección espectrométrica de masas adicional para revelar la complejidad lipídica total de la muestra, o enfoques específicos, que en su mayoría permiten una cuantificación muy precisa de lípidos específicos de interés. En contraste, la característica fuerte del flujo de trabajo lipidómico de escopeta presentado es la rápida cobertura integral de cientos de lípidos endógenos de clases de lípidos predefinidas, que aún se pueden realizar de manera semicuantitativa robusta.
Las eficiencias de ionización de las diferentes clases de lípidos dependen de la estructura y pueden variar drásticamente dependiendo de las diferentes condiciones experimentales de ionización. A diferencia de los métodos de separación basados en LC, el análisis de escopeta minimiza estas diferencias debido a la infusión simultánea directa de todo el extracto lipídico bajo las mismas condiciones de ionización en el instrumento MS. El uso de análogos lipídicos marcados isotópicamente o patrones no endógenos estructuralmente similares permite la semicuantificación de todas las clases de lípidos. La lipidómica de escopeta proporciona una baja variabilidad entre y dentro de la ejecución durante el análisis de EM; Como resultado, este método produce coeficientes de variación21 más bajos que los métodos basados en cromatografía líquida no dirigida, que requieren múltiples estándares para una cuantificación adecuada. Es importante destacar que, si bien no se utiliza ninguna curva de calibración externa en el método actual, el método todavía se considera completamente cuantitativo32.
Un nivel de estándar interno marcado (o estándar no marcado que no se expresa endógenamente) por clase de lípidos es suficiente para la cuantificación de la mayoría de los lípidos. Solo unas pocas publicaciones han reportado una validación parcial del método para un método lipidómico de escopeta. Por ejemplo, en Gryzbek et al.17 y Surma et al.21, las curvas de calibración invertidas se prepararon utilizando patrones internos y una cantidad fija de matriz de muestra. La linealidad se evaluó mediante la regresión lineal de las cantidades de lípidos transformados logarítmicamente y sus intensidades y se informó como R2 y pendiente, respectivamente. El límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) se determinaron mediante regresión lineal ponderada basada en una relación señal-ruido de 3 para LOD y 10 para LOQ. Para la mayoría de las clases de lípidos, LOQ se definió entre 2-9.8 pmol para tejido adiposo y 0.05-5μM en plasma. En ambos casos, se utilizaron patrones internos únicos no endógenos por clase para derivar estimaciones de todos los lípidos de la clase. Sin embargo, en este trabajo, no proporcionamos LOD/LOQ debido a varias preocupaciones: la matriz endógena no está libre de compuestos, y la matriz sustituta para los tejidos no está disponible, con esto, el pico de pequeñas cantidades conocidas de estándares no es posible. No realizamos un enfoque clásico de cuantificación dirigida con el uso de una serie de curvas de calibración de un compuesto particular normalizado por su patrón idéntico marcado isotópicamente debido a la inexistencia de estándares puros y la disponibilidad muy limitada de lípidos marcados isotópicamente. Los detectores Orbitrap realizan automáticamente la conversión de la señal transitoria aplicando una transformación de Fourier, y alguna señal ya está sustituida; como resultado, el rango de concentración más bajo será solo lineal hasta una señal mínima, por debajo de la cual la molécula ya no será detectable. Los valores de señal-ruido del software Xcalibur dependen de la relación m/z de la molécula; Como resultado, los compuestos de cada clase de lípidos, que contienen diferentes combinaciones de ácidos grasos, tendrán diferentes valores de ruido. Además, los valores de LOQ / LOQ están estrictamente vinculados al tipo de matriz, y cuando la cuantificación del lipidoma se realiza en diferentes tejidos de roedores, debe reflejarse mediante la evaluación de LOQ para cada tipo de tejido individualmente.
De hecho, el método ofrece un alto rango de cuantificación dinámica lineal de hasta cuatro órdenes de magnitud33 y muy buena sensibilidad para cubrir los lípidos estructurales endógenos más importantes, que pueden incrementarse aún más mediante mejoras técnicas en la adquisición de MS32. Los coeficientes de variación de las concentraciones medias de lípidos fueron en su mayoría inferiores al 15%, lo que significa que la lipidómica de escopeta cumple con los requisitos de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) como método a considerar para estudios de buenas prácticas de laboratorio (BPL) y buenas prácticas clínicas (GCLP)34.
Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, debido a su diferente polaridad, algunas clases de lípidos se ven mucho más afectadas por la contribución de AF conjugados específicos. Esto conduce a la distorsión en la respuesta de intensidad en mezclas equimolares que contienen una amplia gama de AF conjugadas, lo que resulta en un sesgo de cuantificación, como lo destacan Koivusalo et al.35 para las clases de fosfolípidos. Cabe destacar que estos autores presentaron datos para una amplia gama de AF, de 24 a 48 de longitud de cadena, lo que probablemente no refleja la situación en una muestra biológica real. La respuesta para las especies poliinsaturadas fue un 40% mayor que para las especies totalmente saturadas, pero este efecto solo se observó para concentraciones más altas. Cuando la mezcla se diluyó progresivamente, el efecto de la insaturación disminuyó gradualmente y prácticamente desapareció a 0,1 pmol/μL por especie. Además, todas las mediciones se realizaron en instrumentos de trampa de iones y cuadrupolos triples y no en equipos Q-Exactive.
Otra ventaja del flujo de trabajo presentado es su flexibilidad técnica, que permite la adaptación a los requisitos específicos del proyecto. Por ejemplo, cualquier protocolo de extracción de lípidos, como los métodos modificados de Bligh y Dyer36, metil terc-butil éter 37 o butanol-metanol38, se puede utilizar para preparar un extracto lipídico total antes del análisis de EM. La principal limitación de la extracción de cloroformo-metanol es que la fase inferior contiene la fracción lipídica, lo que complica el trabajo rutinario y especialmente la automatización; Además, se debe considerar la toxicidad del cloroformo. La extracción de éter terc-butílico es ampliamente utilizada para el análisis lipídico de muestras de plasma37, y se ha propuesto una versión automatizada21. En este caso, elegimos el método BUME porque proporciona recuperaciones aún mejores para las clases de lípidos PG, PI, PA y PS38, menor consumo de disolventes y la posibilidad de automatización39, mientras que las concentraciones generales cuantificadas para muestras de tejido extraídas por los tres métodos fueron comparables. Además, mientras que la extracción de la muestra se realizó manualmente en el trabajo actual, también es posible obtener resultados reproducibles y precisos de grandes conjuntos de muestras mediante la preparación automatizada de muestras y la extracción de lípidos en un formato de 96 pocillos40,41. Esto permite implementar el análisis lipidómico en estudios clínicos y toxicológicos a gran escala.
En el trabajo actual, realizamos la adquisición MS de modos positivos y negativos por separado sin cambio de polaridad como lo describen Schuhmann et al.42. La estabilidad de la señal del nanomate es mejor en modo negativo para una solución ligeramente menos concentrada que en modo positivo. Además, desarrollamos un procedimiento totalmente trazable con un software convertidor de archivos .raw a mzML, que proporciona los valores que se especificarán en el software LipidXplorer - con esto, no se requieren cálculos manuales de pendiente de resolución. También aplicamos diferentes sustituciones de ajuste de ruido porque, en modo positivo, los niveles de ruido de los espectros son más altos que en modo negativo. Todos los pasos se optimizaron para análisis rutinarios trazables y de alto rendimiento.
Para la identificación, el análisis lipidómico de escopeta puede explotar el comportamiento único de diferentes clases de lípidos, que forman aductos únicos en diferentes modos de polaridad. En este método, las especies de PC y PE con la misma masa molecular que se superponen en el modo de ionización positiva pueden separarse completamente en el modo de ionización negativa, ya que PC forma aductos de acetato o formiato, y PE se ioniza en forma desprotonada. Además, la deconvolución estructural (parcial) es posible para el método utilizando no solo la fórmula molecular sino también la estructura de ácidos grasos a granel. Por ejemplo, la identificación de AF en el nivel de carbono total y el recuento total de insaturación funciona para todos los fosfolípidos, DAG, TAG y lisofosfolípidos. La cuantificación ascendente de cada forma isomérica se puede realizar parcialmente para algunas de las clases de fosfolípidos43 , pero es mucho más compleja para DAG y TAG debido a la respuesta de señal desigual de diferentes FA en los espectros MS2.
También es importante destacar la necesidad de aplicar procedimientos adecuados de control de calidad, plenamente alineados con las iniciativas recientes en este campo44. Como deseamos garantizar la trazabilidad adecuada de los datos y la reproducibilidad entre y dentro del laboratorio, se han tomado una serie de medidas, como la aleatorización adecuada de las muestras para todos los pasos del análisis, el trabajo con mezclas estándar certificadas por el proveedor, la inclusión de muestras de control de calidad, procedimientos para verificar la aceptación o el rechazo del lote y la creación de una base de datos interna para rastrear el rendimiento del control de calidad a largo plazo. También es consistente con estas iniciativas la necesidad de un método estandarizado para abordar la estabilidad de la muestra. En general, la mayoría de los lípidos estructurales no se ven afectados por la oxidación de lípidos, que es más relevante para las oxilipinas, los lípidos oxidados y los ácidos grasos poliinsaturados que, por lo tanto, son mucho más sensibles a las condiciones de almacenamiento y manipulación. Sin embargo, la evaluación correcta de la estabilidad de la muestra sigue siendo una tarea técnicamente difícil.
Sin embargo, este protocolo tiene una limitación cuando se trata de determinar los niveles submoleculares de los compuestos. Teniendo en cuenta que no hay separación del extracto total, todas las isoformas de lípidos con la misma masa molecular pero diferentes composiciones de ácidos grasos se fusionan en el análisis de MS. Para la mayoría de las clases, es posible lograr la deconvolución parcial de la estructura utilizando las proporciones de fragmentación de fragmentos de ácidos grasos residuales en MS2. Sin embargo, la cuantificación independiente de cada isoforma sigue siendo una tarea particularmente difícil debido a las grandes diferencias en los comportamientos de fragmentación de las diferentes isoformas y al hecho de que los estándares químicos puros no están disponibles en una variedad lo suficientemente grande como para definir los valores de compensación. Otra limitación es que el proceso ESI genera inevitablemente artefactos, lo que resulta en la generación artificial de picos para algunos lípidos como DAG, Pas y FA, lo que puede conducir a una cuantificación errónea.
A continuación, resumimos las partes más críticas del protocolo en función de nuestra experiencia. El primero está relacionado con el hecho de que cada tipo de tejido de ratón tiene un perfil lipídico único en términos de cantidad de lípidos y proporciones de clase. Con esto, las cantidades iniciales del tejido basadas en el contenido total de proteína antes de la extracción deben determinarse cuidadosamente para no saturar la señal de MS y no abandonar el rango de cuantificación dinámica debido a la agregación de lípidos a altas concentraciones33 o, en el extremo opuesto, para proporcionar suficiente señal de MS para cubrir los principales compuestos lipídicos para cada clase de lípidos.
El segundo aspecto crítico es garantizar una alineación adecuada de la posición de la salida del chip de nanofuente de infusión directa con el capilar de transferencia del espectrómetro de masas. Teniendo en cuenta que la calibración completa del espectrómetro de masas en ambos modos se realiza semanalmente, el intercambio entre la fuente de calibración y la configuración del chip de nanofuente puede ser la razón de una variabilidad dramática en la intensidad de la señal debido a la desalineación durante la instalación.
Otra parte crítica del protocolo es el manejo cuidadoso de la mezcla estándar interna. Como esta mezcla contiene una cantidad significativa de diclorometano, una vez abierta, debe consumirse rápidamente para evitar un almacenamiento prolongado y múltiples usos que conducen a la evaporación y al cambio artificial de concentración. Además, es importante una manipulación coherente de la mezcla patrón después de la retirada del almacenamiento a -20 °C, ya que las diferencias de temperatura pueden dar lugar a inconsistencias de volumen durante el pipeteo con pipetas de colchón de aire. Una opción sería reemplazar el diclorometano en el tampón de resuspensión estándar con metanol puro, lo que podría mejorar la conveniencia de manejo, pero podría afectar negativamente la solubilidad de algunas clases de lípidos y, por lo tanto, disminuir la precisión de cuantificación para estas clases de lípidos.
La última parte crítica es el procesamiento de datos. El flujo de trabajo de procesamiento de datos combina la conversión del software Peak by Peak del formato .raw a .mzML, aplicando el promedio de escaneo MS2 y la filtración de ruido MS1 y MS2, así como la selección de picos y la compresión de datos. Como alternativa, el software Proteowizard también se puede utilizar para la conversión de datos, pero, en este caso, varias configuraciones en LipidXplorer deben definirse manualmente. Toda la complejidad de la lipidómica de escopeta se concentra particularmente en el paso de deconvolución de los espectros de inyección directa MS1 y MS2. El software de código abierto LipidXplorer importa los espectros convertidos del formato de archivo mzML en función de la precisión de masa, la resolución de masa y la pendiente de su cambio con el aumento de m / z. El software combina múltiples espectros individuales de MS y MS / MS adquiridos dentro de una ejecución de análisis. Después, alinea picos individuales dentro de diferentes ejecuciones de muestra y, en cada grupo de picos alineados, reemplaza sus masas con su masa promedio ponderada de intensidad única, mientras que sus abundancias en cada archivo de datos permanecen intactas. Las masas representativas de grupos de picos alineados y las intensidades de pico individuales se almacenan en una base de datos de escaneo maestro. La base de datos de exploración maestra contiene todos los espectros MS1 y MS2 generados para todas las muestras del lote y se puede decontorsionar a las identificaciones de lípidos mediante consultas escritas en el lenguaje de consulta de fragmentación molecular (MFQL).
En general, el método cubre la identificación de lípidos DAG, TAG y SE basados en modo positivo y lípidos PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC y LPE basados en la adquisición en modo negativo. Durante la identificación de lípidos, se realiza la corrección isotópica para MS1 y MS2, y las intensidades ajustadas se informan en el archivo de salida de .xlsx. Alternativamente, varios otros programas están disponibles para procesar datos de escopeta, como ALEX45 y LipidHunter46.
Los ácidos grasos, los principales componentes de la membrana nuclear y celular, se almacenan en forma de fosfolípidos para su posterior conversión en moléculas bioactivas. Pueden ser convertidos por enzimas lisofosfolípidas aciltransferasas en lisofosfolípidos a través de la vía de Lands47. Se sabe que la enzima LPCAT3, por ejemplo, muestra una alta especificidad para incorporar AA en los intermediarios de lisofosfatidilcolina y lisofosfatidilserina. La expresión relativamente alta de estas enzimas fue reportada dentro de células inflamatorias, como macrófagos alveolares y células epiteliales bronquiales47, lo que lleva a la liberación de mayores proporciones relativas de fosfolípidos que contienen AA en esas células. Sin embargo, después de su liberación de los fosfolípidos de membrana por la fosfolipasa A2, la conversión de AGPI en varios tipos de mediadores lipídicos es catalizada por muchas enzimas48. Además, estos AGPI pueden convertirse en el sustrato para la producción de prostaglandinas proinflamatorias y antiinflamatorias a través de la acción de las enzimas ciclooxigenasa (COX)-1 y COX-247. Los fosfolípidos son una de las fuentes de mediadores lipídicos liberados en lugares particulares donde se requiere que estos mediadores demuestren sus efectos biológicos.
El pulmón es un órgano complejo que comprende múltiples tipos de células, cada una desempeñando funciones superpuestas y de nicho para facilitar el desarrollo y la función pulmonar normal. Solo se han realizado unos pocos estudios para aislar y perfilar diferentes tipos de células en el pulmón de ratón o humano (p. ej., células alveolares tipo 2)49,50; No se han caracterizado otros tipos importantes de células pulmonares. Otro estudio interesante51 se llevó a cabo para aislar y realizar análisis lipídicos de células inmunes endoteliales, epiteliales, mesenquimales y mixtas en el pulmón del ratón. Se observó que la concentración de AGPI incorporada en PCO y PG se enriqueció en las células inmunes. Teniendo en cuenta el hecho de que el SC induce un aumento de las células inmunes dentro del pulmón (4-5 veces), según lo evaluado por el lavado broncoalveolar (BAL)52, los cambios lipídicos totales observados en este estudio podrían explicarse por un aumento acumulativo en el reclutamiento de células inmunes en el pulmón del ratón.
En conclusión, la distorsión observada de ácidos grasos monoinsaturados y AGPI incorporados en fosfolípidos puede reflejar el exceso de ciertos AF dentro de la célula y / o constituir un recurso intracelular de precursores de oxilipina que se producen en exceso bajo estrés oxidativo y condiciones inflamatorias. Sin embargo, los datos adicionales sobre EPA, DHA y otras oxilipinas libres son esenciales para aclarar este punto y están fuera del alcance de la aplicación del método actual.
Disclosures
Todos los autores son empleados de Philip Morris International. Philip Morris International es la única fuente de financiación y patrocinador de este proyecto.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al equipo de estudio y reconocer especialmente la asistencia técnica y el apoyo de los equipos de bioinvestigación y aerosoles de PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapur, y PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Suiza. Los autores agradecen a Sam Ansari por gestionar el biobanco y agradecen el apoyo de Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy por editar un borrador del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 5, and 2 mL self-lock tubes | Eppendorf | 30120086, 30120094 | |
| 3 mm stainless still beads | Qiagen | 69997 | |
| 4.1 µm nozzle chip | Advion | HD-D-384 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 45754-100ML-F | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 14267-25G | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830-500G | |
| Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | 23209 | |
| Butanol | Honeywell | 33065-2.5L | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650498-1L | |
| Dichloromethane | Honeywell | 34856-1L | |
| Ethyl acetate | Honeywell | 33211 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma | M9686 | |
| Heptane | Sigma Aldrich | 34873-2.5L | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A456 | |
| Mouse pooled plasma | BioIvt | ||
| Mouse SPLASH standard | Avanti Polar Lipids | 330710X | Internal standard |
| Nunc 96-flat bottom well transparent plates | VWR | 62409-068 | |
| Plastic spatula | Sigma | Z560049-300EA | |
| Quick Start Bradford 1x Dye reagent | BioRad | 5000205 | |
| Serum diluent | Sigma Aldrich | D5197 | |
| Equipment/software | |||
| CryoPrep CP02 impactor instrument | Covaris | Magnetic hammer | |
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | . | Centrifuge |
| ChipSoft 8.3 | Advion Biosciences | . | Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot |
| LipidXplorer 1.2.8.1 | N/A | . | Software to identify lipids |
| Peak By Peak | SpectroSwiss | . | Software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| ProteoWizard | ProteoWizard | . | Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| Q-Exactive MS | Thermo Fisher | . | High resolution orbitrap mass spectrometer |
| Qiagen Tissue Lyser II | Qiagen | . | Tissue lyser |
| SpeedVac SPD140DDA | Thermo Fisher | . | Vacuum concentrator |
| Tecan Infinite M nano plus | Tecan | . | Plate reader |
| ThermoMixer C | Eppendorf | . | Thermomixer |
| TriVersa Nanomate | Advion Biosciences | . | Direct infusion nano-source |
| Xcalibur 4.3 | Thermo Scientific | . | Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS |
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