Summary
Die auf Schrotflinten-Massenspektrometrie basierende Lipidomik liefert eine empfindliche quantitative Momentaufnahme eines breiten Spektrums von Lipidklassen gleichzeitig in einer einzigen Messung aus verschiedenen Nagetiergeweben.
Abstract
Lipide spielen eine wichtige Rolle als essentielle Bestandteile aller prokaryotischen und eukaryotischen Zellen. Ständige technologische Verbesserungen in der Massenspektrometrie haben die Lipidomik zu einem leistungsstarken Analysewerkzeug für die Überwachung der Gewebelipidomzusammensetzung sowohl in homöostatischen als auch in Krankheitszuständen gemacht. In diesem Artikel wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für eine Schrotflinten-Lipidanalysemethode vorgestellt, die den gleichzeitigen Nachweis und die Quantifizierung von einigen hundert molekularen Lipidspezies in verschiedenen Gewebe- und Biofluidproben bei hohem Durchsatz unterstützt. Diese Methode nutzt die automatisierte Nano-Flow-Direktinjektion eines Gesamtlipidextrakts, der mit markierten internen Standards ohne chromatographische Trennung versetzt ist, in ein hochauflösendes Massenspektrometriegerät. Ausgehend von Submikrogramm-Mengen an Nagetiergewebe dauert die MS-Analyse 10 Minuten pro Probe und deckt bis zu 400 Lipide aus 14 Lipidklassen im Lungengewebe der Maus ab. Die hier vorgestellte Methode eignet sich gut für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und die Identifizierung und Quantifizierung von Biomarkern, die auf eine frühe Toxizität oder positive Wirkungen im Nagetiergewebe hinweisen.
Introduction
Zigarettenrauch (CS) gilt als Hauptrisikofaktor für die Entwicklung chronisch entzündlicher Erkrankungen der Lunge, einschließlich Lungenkarzinom, Bronchitis und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD)1. Über die Auswirkungen auf die Lunge hinaus spielt die CS-Exposition eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung anderer Krankheiten wie der atherosklerotischen koronaren Herzkrankheit und der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit1. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind zusammen mit COPD die erste bzw. dritthäufigste Todesursache weltweit. Toxikologische Risikobewertungsansätze stützten sich in der Vergangenheit auf die Verwendung von Tiermodellen wie Nagetieren. In-vivo-Nur-Nasen - oder Ganzkörper-Ratten- und Mausmodelle werden häufig verwendet, um die langfristigen Auswirkungen einer CS-Exposition zu untersuchen.
Zum Beispiel induziert eine 6-monatige Rauchexposition im Allgemeinen histologische und funktionelle Anomalien in der murinen Lunge, die denen menschlicher Krankheiten ähneln, einschließlich Emphysem, Atemwegsumbau und pulmonaler Hypertonie, obwohl die Veränderungen im Vergleich zu denen, die bei Langzeitrauchern beobachtet wurden, relativ mild sind2. Sowohl in tierischen als auch in menschlichen Geweben haben Studien eine Vielzahl von molekularen Veränderungen als Reaktion auf CS-Exposition beobachtet, einschließlich oxidativer Stressreaktionen, Entzündungen und struktureller Gewebeveränderungen 3,4. Es überrascht nicht, dass die CS-Exposition auch weitreichende Auswirkungen auf das Lungenlipidom hat, einschließlich Auswirkungen auf Tensidlipide, Lipidsignalmediatoren und Strukturlipide 4,5,6.
Um die Lipidveränderungen zu charakterisieren, die durch die langfristige CS-Exposition der Mauslunge induziert werden, führten wir eine schnelle und quantitative Schrotflinten-Direktinfusions-Massenspektrometrie-Analyse durch. Nach der Einführung der Shotgun-Lipidomics-Methode im Jahr 20057 wurde diese Methode effektiv eingesetzt, um unser Wissen über den Lipidzellstoffwechsel 8,9,10 in Modellsystemen wie Hefe 11, Caenorhabditis elegans12 und Drosophila melanogaster13 sowie in einer Vielzahl von Säugetierprobentypen wie Zelllinien 14 zu erweitern. 15,16 verschiedene menschliche17,18 und Nagetiergewebe19,20 und Körperflüssigkeiten21,22.
In den letzten Jahrzehnten haben Studien die Komplexität zellulärer Reaktionen auf Umweltveränderungen gezeigt, an denen Tausende von miteinander verbundenen Proteinen, Lipiden und Metaboliten beteiligt sind. Dies hat deutlich gemacht, dass der Einsatz modernster Analysetechniken unerlässlich ist, um einen tieferen Einblick in die molekularen Mechanismen zu erhalten und das volle Ausmaß exogener physiologischer Auswirkungen aufzudecken. In diesem Zusammenhang können die umfassenden, quantitativen Lipid-Fingerabdrücke, die durch Shotgun-Lipidomik-Ansätze erzeugt werden, unser Wissen über den zellulären Lipidstoffwechsel effektiv erweitern 8,9,10.
In Bezug auf die CS-Exposition als Risikofaktor für mehrere Krankheiten stützten sich toxikologische Risikobewertungsansätze in der Vergangenheit auf die Verwendung von Tiermodellen wie Nagetieren. Shotgun lipidomics MS bietet ein schnelles, sensitives und quantitatives Analysewerkzeug zur Beurteilung der Lipidomstörung in zahlreichen Probentypen. Das einzigartige Merkmal der Shotgun-Lipidomik ist die automatisierte Direktinjektionsanalyse eines Gesamtlipidextrakts - mit markierten internen Standards versetzt - ohne chromatographische Trennung in ein hochauflösendes MS-Instrument unter Verwendung eines leitfähigen Nanochips, der ein Elektrospray-Ionisations-Nanospray (ESI) erzeugt23.
Die Informationen über das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis, die gleichzeitig im MS1-Modus erfasst werden, liefern den gesamten Lipid-Fußabdruck aller intakten endogenen Lipide. Optional liefert der MS2/MS3-Modus, bei dem die Ausgangslipidmoleküle fragmentiert und analysiert werden, zusätzliche strukturelle Informationen. Die Datenanalyse erfordert spezielle Software und umfasst die Entfaltung von Spektren und Peak-Zuweisungen in gepoolten Spektren, die zur Identifizierung von Lipiden und zur Aufklärung der mutmaßlichen chemischen Struktur führen. Zusätzlich kann eine absolute Quantifizierung durchgeführt werden, indem ein markiertes internes Standardgemisch mit mindestens einem Lipidstandard pro Lipidklasse von Interesse versetzt wird. Insgesamt kann mit der vorliegenden Technik die MS-Analyse, die nur wenige Minuten pro Probe dauert, die Identifizierung und Quantifizierung von bis zu 800 Lipiden aus 14 Lipidklassen24 in Nagetiergeweben abdecken.
Protocol
Alle Verfahren mit Tieren wurden in einer Einrichtung durchgeführt, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International akkreditiert und von der Agri-Food & Veterinary Authority of Singapore lizenziert wurde, mit Genehmigung eines institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung und in Übereinstimmung mit dem National Advisory Committee for Laboratory Animal Research Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (NACLAR, 2004).
1. Probenentnahme
- Führen Sie Maus-Lungendissektionen nach 3 Monaten und 6 Monaten Exposition von ApoE-/− -Mäusen durch. Sammeln Sie die Gewebe 16-24 Stunden nach der Exposition, frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei -80 °C, bevor Sie mit dem Lipidomik-Workflow beginnen. Stellen Sie sicher, dass insgesamt neun Proben aus jeder "Omics"-Dissektionsgruppe entnommen werden.
2. Gewebe - Pulverisierung der Proben
- Bereiten Sie den Magnethammer und die Verbrauchsmaterialien für das Schleifen von Gewebe vor. Vorkühlgewebebeutel, Pinzetten, verschlossene Gewebetransferröhrchen mit Kappen, ein "V"-Kunststoffspatel und 2-ml-Kunststoffsammelröhrchen auf Trockeneis. Montieren Sie den entsprechenden Röhrenhalter an einem magnetischen Hammerinstrument. Schalten Sie den Magnethammer ein und stellen Sie die Schlagkraft auf Hoch.
- Laden Sie die Probe in einen Taschentuchbeutel; Führen Sie die Probe bei Bedarf mit einer vorgekühlten Pinzette durch die obere Öffnung des Gewebebeutels ein. Legen Sie die Probe in die Mitte des flexiblen Beutels, weg von den Rändern.
- Verschließen Sie den Taschentuchbeutel, indem Sie ein vorgekühltes Sammelröhrchen auf die Oberseite des Taschentuchbeutels schrauben.
- Schockfrieren Sie die Probe ein, indem Sie den flexiblen Beutel 10 s lang in flüssigen Stickstoff tauchen.
- Entlüften Sie das Auffangrohr; Lösen Sie den Schlauch für eine 1/4-Umdrehung zum Entlüften, um ein Platzen des Beutels beim Aufprall des Magnethammers zu vermeiden.
- Laden Sie den gefrorenen Taschentuchbeutel auf den Magnethammer.
- Wenden Sie den Magnethammer an, indem Sie die Aktivierungstaste drücken, um die Probe zu pulverisieren. Wenn nicht pulverisierte Gewebestücke im Beutel verbleiben, frieren Sie die Probe erneut in flüssigem Stickstoff ein und wiederholen Sie den Vorgang für einen zweiten Aufprall.
- Entfernen Sie den Taschentuchbeutel vom Magnethammer und halten Sie die pulverisierte Probe am Boden. Um ein Schmelzen der Probe zu verhindern, frieren Sie sie sofort wieder ein.
- Übertragen Sie die Probe in ein Sammelröhrchen. Drehen Sie den Schlauch schnell um, so dass sich der Taschentuchbeutel oben befindet, und klopfen Sie auf den Beutel, um die Gewebepartikel in den Boden des Sammelröhrchens zu übertragen.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte schnell durchgeführt werden, um das Schmelzen des Gewebes zu vermeiden. - Übertragen Sie ein 10-mg-Gewebealiquot zur weiteren lipidomischen Analyse in ein 2-ml-Röhrchen und lagern Sie die Probe bei -80 °C, bis weitere Schritte durchgeführt werden.
3. Homogenisierung des Gewebes
- Schalten Sie das Gewebelysegerät ein und stellen Sie die Schüttelfrequenz auf 30 Hz und die Schütteldauer auf 2 min ein. Bereiten Sie die Pufferlösung für die Gewebehomogenisierung vor: 150 mM Ammoniumbicarbonat in Wasser mit einem pH-Wert von ~8,2.
- Nehmen Sie die Proben aus dem Gefrierschrank, legen Sie sie auf Eis und geben Sie vier Edelstahlkügelchen in die Röhrchen, die das Gewebepulver enthalten. Jeder Probe werden 0,5 ml 150 mM Ammoniumbicarbonatpuffer zugesetzt.
- Setzen Sie die Probenröhrchen in die Gewebelyserhalter ein. Gleichen Sie beide Halter mit der gleichen Anzahl von Rohren aus. Befestigen Sie die Halterungen im Haltearm des Gewebelysers. Stören Sie das Gewebe.
- Legen Sie die Röhrchen auf Eis und überprüfen Sie visuell, ob keine übrig gebliebenen Gewebeaggregate im Röhrchen vorhanden sind. Wenn die Gewebezerstörung unvollständig ist (Aggregate sind zu sehen), wiederholen Sie den Störungsprozess, indem Sie einen weiteren Behandlungszyklus durchführen. Legen Sie die Proben auf Eis.
- Erstellen Sie ein aliquotes 1 von 100 μl der Probe in einem 1,5-ml-Röhrchen, das für die Proteinbestimmung vorgesehen ist. Zentrifugieren Sie es bei 18.200 × g für 5 min bei 10 °C.
- Bestimmen Sie den Proteingehalt von Aliquot 1 mit dem Bradford-Assay (siehe Abschnitt 4). Lagern Sie die Proben auf Eis.
- Es wird ein aliquotes 2 von 20-100 μl des Stammhomogenats in einem neuen 2-ml-Mikroröhrchen für die Lipidextraktion hergestellt (siehe Abschnitt 5). Wenn die Proben nicht sofort analysiert werden, bewahren Sie sie bis zur Extraktion auf Eis auf.
ANMERKUNG: Das endgültige Extraktionsvolumen muss auf der Grundlage der Gesamtproteinmenge definiert werden. Es muss im Bereich von 0,015-0,045 mg Protein pro Gesamtaliquot liegen.
4. Bradford-Proteinbestimmungstest
HINWEIS: Studienproben sollten vor Beginn der Analyse randomisiert werden, und die Randomisierung wird für alle Schritte der Probenverarbeitung berücksichtigt.
- Zentrifugiertes Aliquot 1 Überstand 2x mit Ammoniumhydrogencarbonatpuffer verdünnen.
HINWEIS: Der Verdünnungsfaktor hängt von der Konzentration des Gewebehomogenats ab. Wenden Sie bei konzentrierteren Lösungen einen höheren Faktor an, so dass die ermittelte Konzentration in den dynamischen Bereich des Assays fällt. - Bereiten Sie eine Standardkurve für Rinderserumalbumin (BSA) gemäß Tabelle 1 vor. Wirbeln Sie die Standardrohre. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 18.200 × g für 15 s bei Raumtemperatur.
- Übertragen Sie aus den zuvor vorbereiteten Standardröhrchen jeweils 6 μl des Rohlings und der Standards auf eine 96-Well-Flachbodenplatte gemäß dem in Abbildung 1 gezeigten Plattenlayout.
- Übertragen Sie die zuvor vorbereiteten Proben gemäß dem in Abbildung 1 beschriebenen Plattenlayout auf die 96-Well-Flachbodenplatte.
- Geben Sie 250 μl des Bradford-Reagenzes mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung und mischen Sie. 5 Minuten inkubieren.
- Messen Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 595 nm mit einem Plattenleser.
- Berechnen Sie die Proteinkonzentrationen in den Aliquoten anhand der Standardkurve.
ANMERKUNG: Der zu Beginn des Verfahrens verwendete Verdünnungsfaktor sollte bei der Berechnung der Proteinkonzentrationen berücksichtigt werden.
5. BUME-Extraktion
HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Kunststoffröhrchen mit geringer Bindung für die Lipidomik-Extraktion, da die starken organischen Lösungsmittel Weichmacher freisetzen und bei der Probenanalyse einen starken Hintergrund schaffen.
- Bereiten Sie 1,5-ml-Röhrchen mit 100 μl Ammoniumbicarbonatlösung in jedem Röhrchen der Gesamtleerprobe (TB), der internen Standardleerprobe (ISB) und der Qualitätskontrollproben (QC) vor, wobei zu berücksichtigen ist, dass 1 QC-Probe zwischen jedem Satz von 10 Proben platziert wird. Bewahren Sie alle Proben auf Eis auf.
- Fügen Sie 10 μl gepooltes menschliches Plasma zu allen QC-Proben hinzu. Füllen Sie 10 μl der internen Standardlösung in alle ISB-, QC- und Studienproben (d. h. alle Proben außer TB).
HINWEIS: Verwenden Sie für Qualitätskontrollmaterial ein gepooltes, kommerziell erhältliches K2EDTA-Plasma. Quantifizieren Sie die Lipidkonzentration im gepoolten Plasma unter Verwendung des genannten Protokolls nach Erhalt und bewahren Sie diese Bereiche als Referenz für alle Analysen auf, in denen das QC-Material verwendet wird. Verwenden Sie NIST-Plasma nur für gezieltere Anwendungen oder für die globale Methodenverifizierung, bei denen die Genauigkeit des Assays berücksichtigt werden muss. - Jeder Probe werden 300 μl -20 °C Butanol/Methanol-Gemisch (3/1, v/v) zugesetzt. Bei 450 × g 10 min bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer schütteln.
- 300 μl Heptan/Ethylacetat-Gemisch (3/1, v/v) zugeben. Bei 450 × g 10 min bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer schütteln.
- 300 μl 1%ige Essigsäuremischung zugeben. 5 min bei 450 × g bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer schütteln. Bei 2.800 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Übertragen Sie 360 μl der oberen Phase in ein neues 2-ml-Selbstverriegelungsröhrchen 2.
HINWEIS: Bei der Flüssig-Flüssig-Extraktion kann es zu probenabhängigen Verschiebungen der Positionen der Phasengrenze kommen, was zu einer leichten Volumenabweichung für die obere Phase führen kann. Passen Sie bei Bedarf das Auffangvolumen für die obere Phase an. - 320 μl Heptan/Ethylacetat (3/1, v/v) werden in das Wasserphasenrohr 1 gegeben. Bei 450 × g 5 min bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer schütteln. Zentrifugieren bei 2.800 × g für 5 min bei Raumtemperatur. 320 μl der oberen Phase werden übertragen und mit der Fraktion aus Schritt 5.11 kombiniert.
HINWEIS: Passen Sie bei Bedarf das Auffangvolumen für die obere Phase an. - 250 μl Heptan/Ethylacetat (3/1, v/v) werden in Röhrchen 1 in die Wasserphase gegeben. Bei 450 × g 5 min bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer schütteln. Bei 2.800 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. 200 μl der oberen Phase werden übertragen und mit den Fraktionen aus Schritt 5.11 und Schritt 5.15 in Röhrchen 2 vermischt.
HINWEIS: Passen Sie bei Bedarf das Auffangvolumen für die obere Phase an. - Bei 35 °C in einem Vakuumkonzentrator zur Trockene eindampfen.
HINWEIS: Getrocknete Proben können bei Bedarf bis zur Analyse bei −20 °C gelagert werden. - In 300 μl MS-Mischlösung (7,5 mM Ammoniumacetat in Isopropanol/Methanol/Chloroform, 4:2:1-Lösung) erneut auflösen. Wirbeln Sie jedes Röhrchen 5 s lang, um sicherzustellen, dass alles aufgelöst wird. Zentrifugieren bei 18.200 × g für 5 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie ein Aliquot von 50 μl in die Mikroliterplatte gemäß dem Plattenlayout in Abbildung 2 für die Analyse des positiven Ionisationsmodus (Spalten 1-6) und verdünnen Sie es mit 50 μl MS-Mischlösung.
- Übertragen Sie ein Aliquot von 20 μl in die MTP-Platte gemäß dem Plattenlayout in Abbildung 2 für die Analyse des negativen Ionisationsmodus (Spalten 7-12) und verdünnen Sie es mit 80 μl MS-Mischung. Wickeln Sie die Platte mit Folie ein und halten Sie sie vor der Analyse bei 4 °C.
6. MS-Analyse
- Kalibrieren Sie ein Massenspektrometer (MS) sowohl im positiven als auch im negativen Modus gemäß den Anweisungen des Herstellers 5 Tage oder weniger vor der Analyse.
- Installieren Sie die Direktinfusions-Nanoquelle im Voraus und stellen Sie sicher, dass sie richtig gegen die Transferkapillare des MS ausgerichtet ist. Installieren Sie einen 4,1-μm-Düsenchip in den Chiphalter und konfigurieren Sie ihn in der Software.
- Verwenden Sie die folgenden Parameter für die Einrichtung der Positiv- und Negativmodusmethode: Gasdruck von 1,25 psi; Quellenspannung von 1,1 kV; 5 μl Probeninjektionsvolumen; Ausgangskontaktverschluss Rel1 für 2,5 s; 5 Minuten Lieferzeit; Plattenkühlung bei 4 °C.
- Richten Sie die Analysesequenzwarteschlange für den Direktinfusionsroboter im positiven Modus ein.
- Richten Sie die MS-Methode für den positiven Modus mit den folgenden MS-Einstellungen ein:
- Stellen Sie die Kapillartemperatur auf 250 °C und den HF-Wert der S-Linse auf 65,0 ein. Führen Sie eine vollständige MS-Erfassung von 0 bis 1 Minute im Bereich von 550-1000 m/z bei einer Auflösung von 140.000 mit automatischer Verstärkungsregelung von 1 ×106 und einer maximalen Injektionszeit von 50 ms durch. Wenden Sie eine Sperrmasse von 680,48022 an.
- Stellen Sie die datenunabhängige MS/MS-Erfassungsmethode zwischen dem 1- und 5-Minuten-Zeitbereich mit einer Auflösung von 17.500 und einer festen Anfangsmasse von 250 m/z ein. Verwenden Sie eine automatische Verstärkungsregelung für MS2 bei 1 × 105 und einer maximalen Einspritzzeit von 64 ms, einer Kollisionsenergie von 20 NCE und einem Isolationsfenster von 1 m/z. Verwenden Sie die Einschlussmassenliste von 550 bis 1.000 m/z mit einem Massenschritt von 1 Da.
- Stellen Sie für die Erfassung im negativen Modus die Kapillartemperatur auf 250 °C und den HF-Pegel des S-Objektivs in der MS-Tune-Datei auf 65,0 ein.
- Verwenden Sie die folgenden MS-Methodeneinstellungen: Full-Scan-Erfassungsmodus von 0 bis 1 Minute bei einer Auflösung von 140.000 m/z, die den Bereich von 400 bis 940 m/z abdeckt, automatische Verstärkungsregelung von 1 × 106; maximale Injektionszeit von 50 ms; Verwenden Sie eine Sperrmasse von 529,46262.
- Stellen Sie die MS2-Erfassung im DIA-Modus zwischen 1 und 5 min des Laufs mit einer Auflösung von 17.500 und einer festen Anfangsmasse von 150 m/z ein. automatisierte Verstärkungsregelung von 1 × 105; 64 ms maximale Injektionszeit; und 35NCE der Kollisionsenergie. Verwenden Sie die Einschlussmassenliste von 400 bis 940 mit einem Massenschritt von 1 Da.
- Erstellen Sie die Analysesequenzwarteschlange in der MS-Software im positiven Modus. Warten Sie, bis die Probenaufnahme durch ein Kontaktschließsignal ausgelöst wird, das vom Direktinfusionsroboter für jede Probe kommt.
- Wenn die Analyse im positiven Modus abgeschlossen ist, erstellen Sie die Sequenzwarteschlange für den Direktinfusionsroboter im negativen Modus.
- Richten Sie die Analysesequenzwarteschlange in der MS-Software im negativen Modus ein.
7. Datenverarbeitung
- Verwenden Sie die Konvertersoftware, um die Datendateien aus dem positiven und negativen Modus vom .raw Format in das .mzML-Format zu konvertieren.
HINWEIS: Datendateien aus dem positiven und negativen Modus müssen separat konvertiert werden (aufgrund der unterschiedlichen Erfassungseinstellungen und der unterschiedlichen Rauschschwellen).- Füllen Sie die folgenden Einstellungen aus, um die Dateikonvertierung durchzuführen: Der Rauschschwellenfaktor beträgt 3 bzw. 5 für MS bzw. MS2. Aktivieren Sie die Rauschunterdrückungsfunktion für MS und MS2, Datenkomprimierung, durchschnittliche MS2-Scans und Peak-Picking. Legen Sie TIC-Schwellenwerte für positive und negative Moden fest (z. B. 10.000 und 5.000; basierend auf dem Rauschpegel der jeweiligen Probe, die von einem bestimmten Gerät erzeugt wird). Generieren Sie XLC- und PDF-Berichte am Ende der Verarbeitung.
- Führen Sie die Lipididentifikation durch. Definieren Sie die folgenden (Beispiel-) Parameter für den Dateiimport: Auswahlfenster ±0,5 Da (abhängig vom Auswahlfenster in der MS-Methode); Zeitbereich 2-300 s (abhängig von der Scanzeit bei der MS-Methode); keine Kalibriermassen für MS und MS2; Übertragung und Aufrundung des Massenbereichs aus den Metadatendateien der Peak-by-Peak-Software (Mindestmasse [MS]) und (Mindestmasse [MS2]); Toleranz von 3 ppm bzw. 10 ppm für MS bzw. MS2; Halten Sie das MS- und MS2-Schwellenwertfeld, den Frequenzfilter, den MS1-Offset und das PMO leer. Isotopenkorrektur für MS und MS2 ausgewählt; Übertragen Sie den Auflösungsgradienten aus der Metadatendatei des Konverters als (Resolution linear fit [MS]) und als (Resolution linear fit [MS2]).
HINWEIS: Die Identifizierung von Lipiden im positiven und negativen Modus muss aufgrund der unterschiedlichen Erfassungseinstellungen separat durchgeführt werden. - Nachdem die Daten importiert wurden, gehen Sie zum Menü Ausführen und laden Sie die MFQL-Dateien zur Lipididentifizierung hoch.
HINWEIS: Detaillierte Informationen zum Aufbau von MFQLs finden Sie in der Publikation von Herzog et al.25. Sehen Sie sich einige Beispiele für MFQL-Dateien auf https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library an und sehen Sie sich die Diskussion an. Alle MFQLs, die für die Datenverarbeitung verwendet werden, sind in den Ergänzenden Materialien enthalten. - Quantifizierung der identifizierten Spezies auf MS-Ebene, indem die Vorläufermassenintensität des Lipidmerkmals durch die jeweilige Intensität des markierten internen Standards dividiert und dann der Quotient mit der Konzentration des markierten internen Standards multipliziert wird. Normalisieren Sie die endgültige Lipidkonzentration pro Menge des Gesamtproteins, die mit dem Bradford-Assay gemessen wird.
8. QC-Prüfverfahren
HINWEIS: Ein Qualitätsprüfungsverfahren ist ein wesentlicher Schritt, um die technische Reproduzierbarkeit der Methode zu überprüfen. Zu diesem Zweck wird ein kommerzielles gepooltes Plasma analysiert, um die endogenen Konzentrationen verschiedener Lipide über 5 Tage in 15 identischen Aliquoten pro Charge (insgesamt fünf Chargen) zu bestimmen. Beachten Sie, dass in diesem Fall eine Datenauswertungspipeline als Shiny-Webanwendung mithilfe der statistischen Softwareumgebung R erstellt wurde.
- Definieren Sie den Referenzakzeptanzbereich als den für alle fünf Chargen berechneten Durchschnittswert ±3 Standardabweichungen.
- Wenden Sie die "Pass"-Akzeptanzregeln für jede analytische Charge an: 90 % der Referenzziele müssen bestanden werden, wenn man bedenkt, dass eine Referenzverbindung eine Lipidklasse repräsentiert. Wenn beispielsweise 15 Referenzziele in die QC-Verifizierung einbezogen werden, stellen Sie sicher, dass 13 Ziele bestehen, damit die Charge akzeptiert wird.
HINWEIS: Mit anderen Worten, 68% der QC-Proben pro Referenzverbindung müssen bestanden werden, damit die Daten für diese Lipidklasse akzeptiert werden. - Wenn die Studiencharge die Akzeptanzkriterien für die QC-Prüfung nicht erfüllt, wiederholen Sie den Vorgang.
9. Abschätzung der (relativen) konjugierten Fettsäuremengen
- Schätzen Sie für jede Lipidklasse die Mengen an konjugierten Fettsäuren basierend auf ihren MS2-Intensitäten.
HINWEIS: Aufgrund von Fragmentierungs- und Ionisationsunterschieden waren die abgeleiteten Werte nur für Vergleiche der relativen Häufigkeit zwischen den Stichprobengruppen gedacht und nicht beispielsweise zur Schätzung des relativen Beitrags einer bestimmten Fettsäure zum gesamten konjugierten Fettsäurepool einer Lipidklasse. - Normalisieren Sie die MS2-Intensitäten der Fettsäurefragmente durch die durchschnittliche Intensität der Fettsäurefragmente des entsprechenden internen Standards. Aus der Konzentration des internen Standards und dem gemessenen Gewebegewicht wird eine "normalisierte Konzentration" für die konjugierten Fettsäuren abgeleitet. Summieren Sie diese Werte pro Lipidklasse, um die Gesamtmenge jeder konjugierten Fettsäure pro Probe zu schätzen.
10. Statistische Auswertung
- Führen Sie statistische Analysen durch. Passen Sie ein lineares Modell für jede Bedingung und die entsprechende Kontrollgruppe an, und berechnen Sie p-Werte aus einer t-Statistik für log2-transformierte Daten. Verwenden Sie die Benjamini-Hochberg-Methode für die Falscherkennungsrate, um mehrere Testeffekte zu korrigieren.
ANMERKUNG: Lipide mit angepassten p-Werten < 0,05 gelten als unterschiedlich häufig. Hier wurde die statistische Analyse im statistischen UmfeldR 26 durchgeführt.
Representative Results
Hier präsentieren wir als repräsentative Ergebnisse Daten, die veranschaulichen, wie die Schrotflinten-Lipidomik verwendet werden kann, um die Auswirkungen von CS auf die Lunge von Mäusen zu untersuchen. Das Shotgun-Lipid-Analyseprotokoll wurde erfolgreich für eine In-vivo-Studie zur vergleichenden Analyse von zwei Probengruppen angewendet: Lungengewebe, das von neun weiblichen Apoe-/−-Mäusen seziert wurde, die CS ausgesetzt waren (3R4F-Gruppe; Positivkontrolle) und eine gleiche Anzahl von Mäusen, die unter Frischluftbedingungen (Scheingruppe) gehalten wurden, als Negativkontrolle, die nach 3 Monaten gesammelt wurde, 4 Monate und 6 Monate Expositionszeitpunkte. Die Tiere wurden unter gefilterter und konditionierter Frischluft bei 22 °C ± 2 °C Temperatur und 55 % ± 15 % Luftfeuchtigkeit gehalten und mit einem gammabestrahlten Pelletfutter gefüttert. Das Lichtregime wurde bei 12 h pro Tag beibehalten. Pro Käfig wurden bis zu acht Mäuse untergebracht. 3R4F-Referenzzigaretten für die Expositionsbehandlung wurden von der University of Kentucky gekauft, um das 3R4F CS-Aerosol (600 μg Gesamtfeinstaub-TPM/L-Aerosol) für eine Zielexpositionskonzentration zu erzeugen, die 28 μg Nikotin/L entspricht.CS Rauch von 3R4F-Zigaretten wurde mit 30 Rotationsrauchmaschinen nach Phillips et al. erzeugt.27 . Basierend auf dem Health Canada Intensive Smoking Protocol wurden 55 ml Zugvolumen, ein Zug pro 30 s und eine 100%ige Verstopfung der Belüftungsöffnungen auf 3R4F-Zigaretten angewendet, um eine ausreichende Exposition zu gewährleisten. Alle zusätzlichen Details zum Studiendesign wurden bereits berichtet27,28.
Insgesamt wurden ~400 molekulare Lipidspezies aus den 14 am häufigsten vorkommenden Lipidklassen identifiziert und quantifiziert (Abbildung 3). Die normalisierte Gesamtlipidkonzentration pro Klasse war für die Lipidklassen PE, PEO, PC, PCO, PI und PG leicht erhöht, und für SM-, LPE- und PA-Lipide wurde eine gewisse Herunterregulierung beobachtet (Abbildung 3A), während für TAGs und PS kein Unterschied festgestellt werden konnte. Interessanterweise wurden erhöhte Konzentrationen von PCO- und PEO-Plasmalogenlipiden in der CS-Gruppe in Entzündungszellen berichtet29 . Eine der intrazellulären Funktionen von Plasmalogenlipiden ist die antioxidative Aktivität. Unter Exposition gegenüber reaktivem Sauerstoff (ROS) und Stickstoffspezies (RNS) wurde über selektive Oxidation von Plasmalogen im Vergleich zu Diacylphospholipiden berichtet30. Die Enyl-Ether-Bindung in der chemischen Struktur von Plasmalogen reagiert empfindlich auf Radikalangriffe auf oxidativen Stress31. Die Hauptprodukte des Radikalangriffs sind hydroxylierte Eicosatetraensäuren, 2-Monoacylglycerinphospholipide, Pentadecanol, Ameisensäuren, α-Hydroxyaldehyde verschiedener Kettenlängen, 1-Formyl-2-arachidonoylglycerophospholipid und Lysophospholipide.
Diese Ergebnisse zeigen, dass unter den molekularen Merkmalen, die auf der Gesamtsummenformel basieren, 100-120 Verbindungen signifikant durch die CS-Exposition beeinflusst wurden (Abbildung 3D). Die detaillierte Entfaltung der MS2-Fragmentierungsinformationen und die Normalisierung der Fragmentsignalintensitäten ermöglichten die ungefähre Definition der Gesamtmenge jeder konjugierten Fettsäure (FA), die in jeder Lipidklasse vertreten ist (Abbildung 3E) und den Vergleich dieser Daten zwischen exponierten und Kontrollgruppen. Es wurde eine deutliche Abnahme sowohl der vollständig gesättigten FAs als auch der FAs mit nur wenigen Ungesättigten, hauptsächlich im Zusammenhang mit Lysolipiden, beobachtet. Im Gegensatz dazu waren mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) in der Zusammensetzung der PC-, PE- und PG-Phospholipidklassen in der CS-Gruppe zu allen Zeitpunkten erhöht. Die extremen Fälle von PC und PG, die mit Eicosapentansäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) konjugiert waren, wurden ausschließlich in der 3R4F CS-Expositionsgruppe nachgewiesen (Abbildung 3E, rote Farbe).
Abbildung 1: Plattenlayout für die Probenverteilung im Bradford-Assay. Blind- und Standardproben werden in dreifacher Ausfertigung in den Spalten 1-3 platziert; Unbekannte Proben werden in doppelter Ausfertigung in die Spalten 4-11 eingefügt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Plattenlayout der 96-Well-Mikrotiterplatte für die Schrotflinten-Massenspektrometrie-Analyse. Die Verteilung der Blind-, Standard-, Unbekannt- und QC-Proben für die Erfassung im positiven Ionisationsmodus ist auf der linken Seite der Platte abgebildet (Spalten 1-6); Alle Proben für den negativen Ionisationsmodus befinden sich auf der rechten Seite (Spalten 7-12). Abkürzungen: pos = positiv; QC = Qualitätskontrolle; neg = negativ; TB = Gesamtleerzeichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Schrotflinten-Lipidomics-Analyse von Mauslungen, die Zigarettenrauch ausgesetzt waren. Apoe−/− -Mäuse wurden CS aus der 3R4F-Referenzzigarette oder an der frischen Luft (Schein) ausgesetzt. (A) Lipidklassenkonzentrationen und Anzahl der Lipidspezies pro Klasse. Für jede Klasse ist die Anzahl der quantifizierten Lipidspezies in Klammern angegeben. Mittelwert- und 95%-Konfidenzintervalle für jede Lipidklasse, separat für jeden Expositionstyp (aggregiert über drei Zeitpunkte). (B) Vulkandiagramme, die die Effektgröße (log2-fache Änderung) und Signifikanz (-log10 FDR-adjustierter p-Wert) der quantifizierten Lipidspezies für den 3R4F CS versus Scheinvergleich zu den drei Zeitpunkten zeigen. Signifikant erhöhte Lipide sind gelb markiert; signifikant verminderte Lipide sind in Cyan markiert (FDR-adjustierter p-Wert < 0,05). (C) Differentielle Häufigkeit der 25 Lipidspezies mit den größten absoluten mittleren Faltungsänderungen. Log2-Faltungsänderungen für den 3R4F CS versus Scheinvergleich sind farbkodiert, und die statistische Signifikanz ist angegeben: *: FDR-adjustierter p-Wert < 0,01; X: FDR-adjustierter p-Wert < 0,05. (D) Vergleichsdiagramme. Die Korrelationskoeffizienten für die Faltenänderungsvergleiche sind farbkodiert, und die Anzahl der gemeinsam genutzten differentiell häufigen Lipide wird angegeben (Gesamtzahl an den Rändern). Kreisdiagramme zeigen den Prozentsatz der gemeinsam genutzten unterschiedlich häufig vorkommenden Lipide mit der gleichen Änderungsrichtung (FC-Vorzeichen). Sternchen weisen auf eine signifikante Überlappung der unterschiedlich häufig vorkommenden Lipide hin. (E) Unterschiedliche Häufigkeit konjugierter FAs pro Lipidklasse. Heatmap wie in Panel C für konjugierte Fettsäuren mit signifikanten Abundanzunterschieden zwischen 3R4F und Schein-Exposition in allen drei Zeitpunkten (FDR-adjustierter p-Wert < 0,05). Die Menge jeder Fettsäure pro Lipidklasse wurde basierend auf den MS2-Intensitäten der Fettsäurefragmente geschätzt. Abkürzungen: CS = Zigarettenrauch; FDR = Falscherkennungsrate; FC = Faltänderung; FA = Fettsäuren; PC = Phosphatidylcholin; PS = Phosphatidylserin; TAG = Triacylglycerin; SM = Sphingomyelin; PEO = Plasmalogenphosphatidylethanolamin; PE = Phosphatidylethanolamin; PG = Phosphatidylglycerin; PI = Phosphatidylinositol; DAG = Diacylglycerin; SE = Sterol/Cholesterylester; PCO = Plasmalogenphosphatidylcholin; LPC = Lysophosphatidylcholin; LPE = Lysophosphatidylethanolamin; PA = Phosphatidsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| BSA-Endkonzentration (mg/ml) | BSA-Lösung bei 2 mg/ml (μl) | Ammoniumbicarbonat-Puffer (μl) |
| 1 | 50 | 50 |
| 0.75 | 37.5 | 62.5 |
| 0.5 | 25 | 75 |
| 0.25 | 12.5 | 87.5 |
| 0.125 | 12.5 | 187.5 |
| 0.0625 | 50 von 0,125 mg/ml Lösung | 50 |
| 0 | 0 | 100 |
Tabelle 1: Verdünnungsschema des BSA-internen Standards für die Kalibrierkurve für den Bradford-Assay. Abkürzung: BSA = Rinderserumalbumin.
Ergänzende Informationen: MFQL-Dateien, die für die Identifizierung von LipidXplorer-Lipiden verwendet werden. Das .zip Paket besteht aus den einzelnen benötigten MFQL-Dateien, die jeweils nach folgendem Muster benannt sind:
Discussion
Obwohl Fortschritte bei MS eine Vielzahl von Methoden zur genauen Überwachung vieler Lipidspezies hervorgebracht haben, zeigte das bisherige Lipidprofiling verschiedener Säugetiergewebe keine konsistenten Ergebnisse, so dass die besonderen gewebespezifischen Funktionen von Lipiden unklar bleiben. Im Vergleich zur Proteinfunktionsanalyse, für die robustere Ansätze zur Verfügung stehen, um die Expression bestimmter Verbindungen auszuschalten, kann die Mehrheit der Lipide nicht selektiv ausgeschaltet oder im Gewebe überexprimiert werden, was die funktionelle Bewertung von Lipiden erschwert. Die fortgeschrittene Profilierung von Gewebelipidomkonzentrationen kann einen alternativen Ansatz bieten, um Zusammenhänge zwischen zirkulierenden Lipiden und menschlichen Krankheiten zu identifizieren.
Bei der Evaluierung umfassender Lipidomik-Methoden, die in der Lage sind, das endogene Lipidprofil jedes Mausgewebes qualitativ und quantitativ abzudecken, haben wir der Shotgun-Lipidomics-Methode den Vorzug gegeben. Im Allgemeinen sind zwei gegensätzliche Arten der Probenanalyse möglich: entweder ein völlig ungezieltes Screening von Lipiden mittels flüssigchromatographischer (LC)-basierter Trennung mit weiterer massenspektrometrischer Detektion, um die Gesamtlipidkomplexität der Probe aufzudecken, oder gezielte Ansätze, die meist eine sehr genaue Quantifizierung spezifischer Lipide von Interesse ermöglichen. Im Gegensatz dazu ist das starke Merkmal des vorgestellten Shotgun-Lipidomics-Workflows die schnelle und umfassende Abdeckung von Hunderten von endogenen Lipiden aus vordefinierten Lipidklassen, die immer noch in einer robusten semi-quantitativen Weise durchgeführt werden können.
Die Ionisationseffizienzen verschiedener Lipidklassen sind strukturabhängig und können in Abhängigkeit von den verschiedenen experimentellen Ionisationsbedingungen drastisch variieren. Im Gegensatz zu LC-basierten Trennverfahren minimiert die Schrotflintenanalyse diese Unterschiede durch die direkte gleichzeitige Infusion des gesamten Lipidextrakts unter den gleichen Ionisationsbedingungen in das MS-Gerät. Die Verwendung von isotopenmarkierten Lipidanaloga oder strukturell ähnlichen nicht-endogenen Standards ermöglicht die semi-Quantifizierung aller Lipidklassen. Die Shotgun-Lipidomik bietet eine geringe Variabilität zwischen und innerhalb des Laufs während der MS-Analyse. Infolgedessen erzeugt diese Methode niedrigere Variationskoeffizienten21 als ungezielte Flüssigchromatographie-basierte Methoden, die mehrere Standards für eine angemessene Quantifizierung erfordern. Wichtig ist, dass, obwohl in der aktuellen Methode keine externe Kalibrierkurve verwendet wird, die Methode immer noch als vollständig quantitativangesehen wird 32.
Für die Quantifizierung der meisten Lipide ist ein markierter interner Standard (oder ein nicht markierter Standard, der nicht endogen exprimiert wird) pro Lipidklasse ausreichend. Nur wenige Publikationen berichten über eine partielle Methodenvalidierung für eine Shotgun-Lipidomics-Methode. Zum Beispiel wurden in Gryzbek et al.17 und Surma et al.21 umgekehrte Kalibrierkurven unter Verwendung interner Standards und einer festen Menge an Probenmatrix erstellt. Die Linearität wurde durch die lineare Regression der logarithmisch transformierten Lipidmengen und ihrer Intensitäten bewertet und als R2 bzw. Steigung angegeben. Die Nachweisgrenze (LOD) und die Bestimmungsgrenze (LOQ) wurden durch gewichtete lineare Regression auf der Grundlage eines Signal-Rausch-Verhältnisses von 3 für LOD und 10 für LOQ bestimmt. Für die meisten Lipidklassen wurde die LOQ zwischen 2-9,8 pmol für Fettgewebe und 0,05-5 μM im Plasma definiert. In beiden Fällen wurden nicht-endogene interne Einzelstandards pro Klasse verwendet, um Schätzungen für alle Lipide in der Klasse abzuleiten. In dieser Arbeit stellen wir jedoch aufgrund mehrerer Bedenken keine LOD/LOQ zur Verfügung: Die endogene Matrix ist nicht verbindungsfrei und die Surrogatmatrix für Gewebe ist nicht verfügbar - damit ist die Spitze kleiner bekannter Mengen von Standards nicht möglich. Wir führen keinen klassischen gezielten Quantifizierungsansatz mit der Verwendung einer Kalibrierkurvenreihe einer bestimmten Verbindung durch, die durch ihren identischen isotopenmarkierten Standard normiert wird, da es keine reinen Standards gibt und die Verfügbarkeit isotopenmarkierter Lipide sehr begrenzt ist. Orbitrap-Detektoren führen automatisch die Umwandlung des transienten Signals durch, indem sie eine Fourier-Transformation anwenden, und ein Teil des Signals ist bereits substituiert - infolgedessen ist der untere Konzentrationsbereich nur linear bis zu einem minimalen Signal, unterhalb dessen das Molekül nicht mehr nachweisbar ist. Die Signal-Rausch-Werte der Xcalibur-Software hängen vom m/z-Verhältnis des Moleküls ab. Infolgedessen haben die Verbindungen jeder Lipidklasse, die unterschiedliche Kombinationen von Fettsäuren enthalten, unterschiedliche Rauschwerte. Darüber hinaus sind die LOQ/LOQ-Werte eng mit der Art der Matrix verbunden, und wenn die Quantifizierung des Lipidoms in verschiedenen Nagetiergeweben durchgeführt wird, sollte dies durch die Bewertung der LOQs für jeden Gewebetyp einzeln widergespiegelt werden.
Tatsächlich bietet die Methode einen hohen linearen dynamischen Quantifizierungsbereich von bis zu vier Größenordnungen33 und eine sehr gute Sensitivität, um die wichtigsten endogenen Strukturlipide abzudecken, was durch technische Verbesserungen bei der MS-Erfassung32 weiter erhöht werden kann. Die Variationskoeffizienten der mittleren Lipidkonzentrationen lagen meist unter 15 %, was bedeutet, dass die Shotgun-Lipidomik den Anforderungen der Food and Drug Administration (FDA) als Methode entspricht, die für Studien zur Guten Laborpraxis (GLP) und zur Guten Klinischen Praxis (GCLP) in Betracht gezogen werdenmuss 34.
Es muss jedoch beachtet werden, dass einige Lipidklassen aufgrund ihrer unterschiedlichen Polarität viel stärker durch den Beitrag spezifischer konjugierter FAs beeinflusst werden. Dies führt zu einer Verzerrung der Intensitätsantwort in äquimolaren Gemischen, die ein breites Spektrum konjugierter FAs enthalten, was zu einer Quantifizierungsverzerrung führt, wie von Koivusalo et al.35 für Phospholipidklassen hervorgehoben. Bemerkenswert ist, dass diese Autoren Daten für eine breite Palette von FAs von 24 bis 48 Kettenlängen präsentierten, die wahrscheinlich nicht die Situation in einer echten biologischen Probe widerspiegeln. Die Reaktion für mehrfach ungesättigte Spezies war 40% höher als für vollständig gesättigte Spezies, aber dieser Effekt wurde nur für höhere Konzentrationen beobachtet. Wenn das Gemisch progressiv verdünnt wurde, nahm der Effekt der Ungesättigtheit allmählich ab und verschwand praktisch bei 0,1 pmol/μl pro Spezies. Darüber hinaus wurden alle Messungen an Ionenfallen- und Dreifach-Quadrupol-Instrumenten und nicht an Q-Exactive-Geräten durchgeführt.
Ein weiterer Vorteil des vorgestellten Workflows ist seine technische Flexibilität, die eine Anpassung an spezifische Projektanforderungen ermöglicht. Zum Beispiel kann jedes Lipidextraktionsprotokoll - wie die modifizierten Bligh- und Dyer-36-, Methyl-tert-butylether-37- oder Butanol-Methanol-38-Methoden - zur Herstellung eines Gesamtlipidextrakts vor der MS-Analyse verwendet werden. Die Haupteinschränkung der Chloroform-Methanol-Extraktion besteht darin, dass die untere Phase die Lipidfraktion enthält, was die Routinearbeit und insbesondere die Automatisierung erschwert. Darüber hinaus muss die Toxizität von Chloroform berücksichtigt werden. Die Tert-Butylether-Extraktion wird häufig für die Lipidanalyse von Plasmaproben37 verwendet, und eine automatisierte Version wurde vorgeschlagen21. In diesem Fall haben wir uns für die BUME-Methode entschieden, da sie eine noch bessere Wiederfindung für die mit Spikes dotierten PG-, PI-, PA- und PS-Lipidklassen38, einen geringeren Lösungsmittelverbrauch und die Möglichkeit der Automatisierung39 bietet, während die Gesamtkonzentrationen, die für die mit allen drei Methoden extrahierten Gewebeproben quantifiziert wurden, vergleichbar waren. Während die Probenextraktion in der aktuellen Arbeit manuell durchgeführt wurde, ist es auch möglich, reproduzierbare und präzise Ergebnisse aus großen Probensätzen durch automatisierte Probenvorbereitung und Lipidextraktion in einem 96-Well-Format40,41 zu erhalten. Dies ermöglicht die Implementierung von Lipidomik-Analysen in groß angelegten klinischen und toxikologischen Studien.
In der aktuellen Arbeit haben wir die MS-Erfassung von positiven und negativen Moden getrennt ohne Polaritätswechsel durchgeführt, wie von Schuhmann et al.42 beschrieben. Die Stabilität des Nanomate-Signals ist im negativen Modus für eine etwas weniger konzentrierte Lösung besser als im positiven Modus. Zusätzlich haben wir ein vollständig rückverfolgbares Verfahren mit einer Konverter-Software von .raw Dateien zu mzML entwickelt, das die in der LipidXplorer-Software anzugebenden Werte bereitstellt - damit sind keine manuellen Auflösungssteilheitsberechnungen erforderlich. Wir haben auch verschiedene Substitutionen für die Rauscheinstellung vorgenommen, da im positiven Modus der Rauschpegel der Spektren höher ist als im negativen Modus. Alle Schritte wurden für rückführbare Hochdurchsatz-Routineanalysen optimiert.
Zur Identifizierung kann die Shotgun-Lipidomics-Analyse das einzigartige Verhalten verschiedener Lipidklassen ausnutzen, die einzigartige Addukte in verschiedenen Polaritätsmodi bilden. Bei diesem Verfahren können PC- und PE-Spezies mit der gleichen Molekülmasse, die sich im positiven Ionisationsmodus überlappen, im negativen Ionisationsmodus vollständig getrennt werden, da PC Acetat- oder Formiat-Addukte bildet und PE in einer deprotonierten Form ionisiert wird. Darüber hinaus ist eine (partielle) strukturelle Dekonvolution für das Verfahren möglich, wobei nicht nur die Summenformel, sondern auch die Fettsäurestruktur verwendet wird. Zum Beispiel funktioniert die FA-Identifizierung auf der Ebene des Gesamtkohlenstoffs und der Gesamtungesättigtheitszahl für alle Phospholipide, DAGs, TAGs und Lysophospholipide. Die Bottom-up-Quantifizierung jeder isomeren Form kann teilweise für einige der Phospholipidklassen43 durchgeführt werden, ist jedoch für DAGs und TAGs aufgrund der ungleichen Signalantwort verschiedener FAs in den MS2-Spektren viel komplexer.
Es ist auch wichtig zu betonen, dass geeignete Qualitätskontrollverfahren eingeführt werden müssen, die vollständig auf die jüngsten Initiativen in diesem Bereich abgestimmtsind 44. Um eine ordnungsgemäße Rückverfolgbarkeit und Reproduzierbarkeit der Daten zwischen und innerhalb des Labors zu gewährleisten, wurden eine Reihe von Schritten unternommen, wie z. B. die ordnungsgemäße Randomisierung der Proben für alle Analyseschritte, die Arbeit mit vom Lieferanten zertifizierten Standardmischungen, die Einbeziehung von Qualitätskontrollproben, Verfahren zur Überprüfung der Chargenannahme oder -ablehnung und die Erstellung einer internen Datenbank, um die QC-Leistung langfristig zu verfolgen. Im Einklang mit diesen Initiativen steht auch die Notwendigkeit einer standardisierten Methode zur Verbesserung der Probenstabilität. Im Allgemeinen wird die Mehrheit der Strukturlipide nicht von der Lipidoxidation beeinflusst, was für Oxilipine, oxidierte Lipide und mehrfach ungesättigte Fettsäuren relevanter ist, die daher viel empfindlicher auf Lager- und Handhabungsbedingungen reagieren. Die korrekte Beurteilung der Probenstabilität ist jedoch nach wie vor eine technisch anspruchsvolle Aufgabe.
Dieses Protokoll hat jedoch eine Einschränkung, wenn es darum geht, submolekulare Konzentrationen von Verbindungen zu bestimmen. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass es keine Trennung des Gesamtextrakts gibt, werden alle Isoformen von Lipiden mit der gleichen Molekülmasse, aber unterschiedlichen Fettsäurezusammensetzungen in der MS-Analyse zusammengeführt. Für die meisten Klassen ist es möglich, eine partielle Entfaltung der Struktur zu erreichen, indem die Fragmentierungsverhältnisse der verbleibenden Fettsäurefragmente in MS2 verwendet werden. Die unabhängige Quantifizierung jeder Isoform bleibt jedoch eine besonders herausfordernde Aufgabe, da das Fragmentierungsverhalten verschiedener Isoformen sehr unterschiedlich ist und reine chemische Standards nicht in ausreichender Vielfalt zur Verfügung stehen, um die Kompensationswerte zu definieren. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass der ESI-Prozess unweigerlich Artefakte erzeugt, was zur künstlichen Erzeugung von Peaks für einige Lipide wie DAGs, Pas und FAs führt, was zu einer fehlerhaften Quantifizierung führen kann.
Als nächstes fassen wir die kritischsten Teile des Protokolls basierend auf unseren Erfahrungen zusammen. Der erste hängt mit der Tatsache zusammen, dass jeder Mausgewebetyp ein einzigartiges Lipidprofil hat, sowohl in Bezug auf die Lipidmenge als auch auf die Klassenverhältnisse. Dabei müssen die Ausgangsmengen des Gewebes bezogen auf den Gesamtproteingehalt vor der Extraktion sorgfältig bestimmt werden, um das MS-Signal nicht zu sättigen und den dynamischen Quantifizierungsbereich nicht durch Lipidaggregation bei hohen Konzentrationen33 zu verlassen oder - im entgegengesetzten Extrem - genügend MS-Signal bereitzustellen, um die wichtigsten Lipidverbindungen für jede Lipidklasse abzudecken.
Der zweite kritische Aspekt besteht darin, eine korrekte Ausrichtung der Position des Direktinfusions-Nanoquellen-Chipausgangs mit der Transferkapillare des Massenspektrometers sicherzustellen. In Anbetracht der Tatsache, dass die vollständige Kalibrierung des Massenspektrometers in beiden Modi wöchentlich durchgeführt wird, kann der Wechsel zwischen der Kalibrierungsquelle und dem Nanoquellen-Chip-Setup der Grund für eine dramatische Variabilität der Signalintensität aufgrund einer Fehlausrichtung während der Installation sein.
Ein weiterer kritischer Teil des Protokolls ist der sorgfältige Umgang mit dem internen Standardmix. Da dieses Gemisch eine erhebliche Menge an Dichlormethan enthält, sollte es nach dem Öffnen schnell verbraucht werden, um eine lange Lagerung und mehrfache Verwendung zu vermeiden, die zu Verdunstung und künstlichen Konzentrationsänderungen führen. Darüber hinaus ist eine konsistente Handhabung der Standardmischung nach der Entnahme aus der Lagerung bei −20 °C wichtig, da Temperaturunterschiede beim Pipettieren mit Luftkissenpipetten zu Volumeninkonsistenzen führen können. Eine Option wäre, Dichlormethan im Standard-Resuspensionspuffer durch reines Methanol zu ersetzen, was den Handhabungskomfort verbessern könnte, sich jedoch negativ auf die Löslichkeit einiger Lipidklassen auswirken und somit die Quantifizierungsgenauigkeit für diese Lipidklassen verringern könnte.
Der letzte kritische Teil ist die Datenverarbeitung. Der Datenverarbeitungs-Workflow kombiniert die Peak-by-Peak-Softwarekonvertierung vom .raw- in das .mzML-Format, die Anwendung von MS2-Scan-Mittelwertbildung und MS1- und MS2-Rauschfilterung sowie Peak-Picking und Datenkomprimierung. Alternativ kann die Software Proteowizard auch für die Datenkonvertierung verwendet werden, in diesem Fall müssen jedoch einige Einstellungen in LipidXplorer manuell vorgenommen werden. Die gesamte Komplexität der Schrotflinten-Lipidomik konzentriert sich insbesondere auf den Schritt der Entfaltung der MS1- und MS2-Spektren der Direkteinspritzung. Die Open-Source-Software LipidXplorer importiert die konvertierten Spektren aus dem mzML-Dateiformat basierend auf Massengenauigkeit, Massenauflösung und der Steigung ihrer Änderung mit zunehmendem m/z. Die Software führt mehrere einzelne MS- und MS/MS-Spektren zusammen, die innerhalb eines Analyselaufs aufgenommen wurden. Anschließend werden einzelne Peaks innerhalb verschiedener Stichprobenläufe ausgerichtet und in jedem Cluster von ausgerichteten Peaks ihre Massen durch ihre einzelne intensitätsgewichtete Durchschnittsmasse ersetzt, während ihre Häufigkeiten in jeder Datendatei unberührt bleiben. Repräsentative Massen von ausgerichteten Peak-Clustern und einzelnen Peak-Intensitäten werden in einer Master-Scan-Datenbank gespeichert. Die Master-Scan-Datenbank enthält alle MS1- und MS2-Spektren, die für alle Proben im Batch generiert wurden, und kann durch Abfragen, die in der MFQL (Molecular Fragmentation Query Language) geschrieben sind, zu Lipididentifikationen entfaltet werden.
Insgesamt umfasst die Methode die Identifizierung von DAG-, TAG- und SE-Lipiden auf der Grundlage des positiven Modus und PC-, PE-, PS-, PI-, PA-, PG-, SM-, LPC- und LPE-Lipiden auf der Grundlage des negativen Mode-Erwerbs. Während der Lipididentifizierung wird eine Isotopenkorrektur für MS1 und MS2 durchgeführt, und die angepassten Intensitäten werden in der .xlsx Ausgabedatei angegeben. Alternativ stehen mehrere andere Software zur Verfügung, um Schrotflintendaten zu verarbeiten, wie z. B. ALEX45 und LipidHunter46.
Fettsäuren - wichtige Bestandteile der Kern- und Zellmembran - werden in Form von Phospholipiden zur weiteren Umwandlung in bioaktive Moleküle gespeichert. Sie können durch Lysophospholipid-Acyltransferase-Enzyme über den Lands-Weg47 in Lysophospholipide umgewandelt werden. Es ist beispielsweise bekannt, dass das LPCAT3-Enzym eine hohe Spezifität aufweist, um AA in Lysophosphatidylcholin und Lysophosphatidylserin-Zwischenprodukte einzubauen. Die relativ hohe Expression dieser Enzyme wurde in Entzündungszellen wie Alveolarmakrophagen und Bronchialepithelzellenberichtet 47, was zur Freisetzung größerer relativer Anteile von AA-haltigen Phospholipiden in diesen Zellen führte. Nach ihrer Freisetzung aus Membranphospholipiden durch Phospholipase A2 wird die Umwandlung von PUFAs in verschiedene Arten von Lipidmediatoren jedoch durch viele Enzyme katalysiert48. Darüber hinaus können diese PUFAs durch die Wirkung der Enzyme Cyclooxygenase (COX)-1 und COX-247 zum Substrat für die Produktion von entzündungsfördernden und entzündungshemmenden Prostaglandinen werden. Phospholipide sind eine der Quellen für Lipidmediatoren, die an bestimmten Stellen freigesetzt werden, an denen diese Mediatoren ihre biologischen Wirkungen nachweisen müssen.
Die Lunge ist ein komplexes Organ, das aus mehreren Zelltypen besteht, von denen jeder überlappende und Nischenrollen bei der Erleichterung einer normalen Lungenentwicklung und -funktion spielt. Es wurden nur wenige Studien durchgeführt, um verschiedene Zelltypen in der Maus oder der menschlichen Lunge (z. B. alveoläre Typ-2-Zellen) zu isolieren und zu profilieren49,50; Andere wichtige Lungenzelltypen wurden nicht charakterisiert. Eine weitere interessante Studie51 wurde durchgeführt, um Endothel-, Epithel-, Mesenchym- und gemischte Immunzellen in der Mauslunge zu isolieren und eine Lipidanalyse durchzuführen. Es wurde beobachtet, dass die Konzentration von PUFAs, die in PCO und PG eingebaut sind, in den Immunzellen angereichert war. In Anbetracht der Tatsache, dass CS eine Zunahme der Immunzellen in der Lunge (4-5-fach) induziert, wie durch bronchoalveoläre Lavage (BAL)52 beurteilt, könnten die in dieser Studie beobachteten Gesamtlipidveränderungen durch einen kumulativen Anstieg der Immunzellrekrutierung in der Mauslunge erklärt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beobachtete Verzerrung von einfach ungesättigten Fettsäuren und PUFAs, die in Phospholipiden eingebaut sind, den Überschuss bestimmter FAs in der Zelle widerspiegeln und/oder eine intrazelluläre Ressource von Oxilipin-Vorläufern darstellen kann, die unter oxidativem Stress und entzündlichen Bedingungen überproduziert werden. Zusätzliche Daten zu freiem EPA, DHA und anderen Oxilipinen sind jedoch unerlässlich, um diesen Punkt zu klären, und liegen außerhalb des Anwendungsbereichs der aktuellen Methode.
Disclosures
Alle Autoren sind Mitarbeiter von Philip Morris International. Philip Morris International ist die einzige Finanzierungsquelle und Sponsor dieses Projekts.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich beim Studienteam und bedanken sich insbesondere für die technische Unterstützung und Unterstützung der Bioforschungs- und Aerosolteams von PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapur, und PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Schweiz. Die Autoren danken Sam Ansari für die Leitung des Biobankings und bedanken sich für die Unterstützung von Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy für die Bearbeitung eines Entwurfs des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 5, and 2 mL self-lock tubes | Eppendorf | 30120086, 30120094 | |
| 3 mm stainless still beads | Qiagen | 69997 | |
| 4.1 µm nozzle chip | Advion | HD-D-384 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 45754-100ML-F | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 14267-25G | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830-500G | |
| Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | 23209 | |
| Butanol | Honeywell | 33065-2.5L | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650498-1L | |
| Dichloromethane | Honeywell | 34856-1L | |
| Ethyl acetate | Honeywell | 33211 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma | M9686 | |
| Heptane | Sigma Aldrich | 34873-2.5L | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A456 | |
| Mouse pooled plasma | BioIvt | ||
| Mouse SPLASH standard | Avanti Polar Lipids | 330710X | Internal standard |
| Nunc 96-flat bottom well transparent plates | VWR | 62409-068 | |
| Plastic spatula | Sigma | Z560049-300EA | |
| Quick Start Bradford 1x Dye reagent | BioRad | 5000205 | |
| Serum diluent | Sigma Aldrich | D5197 | |
| Equipment/software | |||
| CryoPrep CP02 impactor instrument | Covaris | Magnetic hammer | |
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | . | Centrifuge |
| ChipSoft 8.3 | Advion Biosciences | . | Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot |
| LipidXplorer 1.2.8.1 | N/A | . | Software to identify lipids |
| Peak By Peak | SpectroSwiss | . | Software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| ProteoWizard | ProteoWizard | . | Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| Q-Exactive MS | Thermo Fisher | . | High resolution orbitrap mass spectrometer |
| Qiagen Tissue Lyser II | Qiagen | . | Tissue lyser |
| SpeedVac SPD140DDA | Thermo Fisher | . | Vacuum concentrator |
| Tecan Infinite M nano plus | Tecan | . | Plate reader |
| ThermoMixer C | Eppendorf | . | Thermomixer |
| TriVersa Nanomate | Advion Biosciences | . | Direct infusion nano-source |
| Xcalibur 4.3 | Thermo Scientific | . | Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS |
References
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