Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Shotgun lipidomics af gnavervæv

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/63726
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1PMI R&D, Philip Morris Products SA

Summary

Shotgun massespektrometri-baseret lipidomics leverer et følsomt kvantitativt øjebliksbillede af et bredt spektrum af lipidklasser samtidigt i en enkelt måling fra forskellige gnavervæv.

Abstract

Lipider spiller en afgørende rolle som væsentlige komponenter i alle prokaryote og eukaryote celler. Konstante teknologiske forbedringer i massespektrometri har gjort lipidomics til et kraftfuldt analytisk værktøj til overvågning af vævlipidomsammensætninger i homeostatiske såvel som sygdomstilstande. Dette papir præsenterer en trin-for-trin protokol til en haglgeværlipidanalysemetode, der understøtter samtidig påvisning og kvantificering af et par hundrede molekylære lipidarter i forskellige vævs- og biovæskeprøver ved høj gennemstrømning. Denne metode udnytter automatiseret nano-flow direkte injektion af et totalt lipidekstrakt spiked med mærkede interne standarder uden kromatografisk adskillelse i et massespektrometriinstrument med høj opløsning. Fra submikrogram mængder gnavervæv tager MS-analysen 10 minutter pr. prøve og dækker op til 400 lipider fra 14 lipidklasser i muselungevæv. Metoden, der præsenteres her, er velegnet til at studere sygdomsmekanismer og identificere og kvantificere biomarkører, der indikerer tidlig toksicitet eller gavnlige virkninger i gnavervæv.

Introduction

Cigaretrøg (CS) anerkendes som en vigtig risikofaktor forbundet med udviklingen af kroniske inflammatoriske lungesygdomme, herunder lungekarcinom, bronkitis og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL)1. Ud over lungepåvirkningen spiller CS-eksponering en væsentlig rolle i udviklingen af andre sygdomme såsom aterosklerotisk koronararteriesygdom og perifer vaskulær sygdom1. Hjerte-kar-sygdomme er sammen med KOL henholdsvis den første og tredje førende dødsårsag på verdensplan. Toksikologiske risikovurderingsmetoder har historisk været baseret på brugen af dyremodeller såsom gnavere. In vivo næse-only eller full-body rotte- og musemodeller bruges almindeligvis til at studere de langsigtede virkninger af eksponering for CS.

For eksempel inducerer generelt 6 måneders røgeksponering histologiske og funktionelle abnormiteter i murine lunger, der efterligner dem af menneskelig sygdom, herunder emfysem, luftvejsremodellering og pulmonal hypertension, selvom ændringerne er relativt milde sammenlignet med dem, der observeres hos langsigtede menneskelige rygere2. I både animalsk og humant væv har undersøgelser observeret en lang række molekylære ændringer som reaktion på CS-eksponering, herunder oxidative stressresponser, inflammation og strukturelle vævsændringer 3,4. Ikke overraskende er CS-eksponering også blevet rapporteret at have en vidtrækkende indvirkning på lungelipidomet, herunder virkninger på overfladeaktive lipider, lipidsignalmediatorer og strukturelle lipider 4,5,6.

For at karakterisere de vigtigste lipidændringer induceret af langvarig CS-eksponering af muselunger udførte vi en hurtig og kvantitativ haglgevær-massespektrometrianalyse. Efter introduktionen af shotgun lipidomics-metoden i 20057 er denne metode effektivt blevet brugt til at udvide vores viden om lipidcellulær metabolisme 8,9,10 i modelsystemer som gær 11, Caenorhabditis elegans12 og Drosophila melanogaster13 samt i en lang række pattedyrprøvetyper såsom cellelinjer 14, 15,16 Forskellige humane17,18 og gnavervæv19,20 og kropsvæsker21,22.

I løbet af de sidste årtier har undersøgelser afsløret kompleksiteten af cellulære reaktioner på miljøændringer, der involverer tusindvis af sammenkoblede proteiner, lipider og metabolitter. Dette har gjort det klart, at brug af state-of-the-art analytiske teknikker er afgørende for at få et dybtgående overblik over de molekylære maskiner og for at afdække det fulde omfang af eksogene fysiologiske virkninger. I denne sammenhæng kan de omfattende, kvantitative lipidfingeraftryk, der produceres af shotgun lipidomics-tilgange, effektivt føje til vores viden om lipidcellulær metabolisme 8,9,10.

Med hensyn til CS-eksponering som en risikofaktor for flere sygdomme har toksikologiske risikovurderingsmetoder historisk været afhængige af brugen af dyremodeller såsom gnavere. Shotgun lipidomics MS giver et hurtigt, følsomt og kvantitativt analytisk værktøj til vurdering af lipidomforstyrrelse i adskillige prøvetyper. Det unikke ved haglgeværlipidomics er den automatiserede direkte injektionsanalyse af et samlet lipidekstrakt - spiket med mærkede interne standarder - uden kromatografisk adskillelse i et MS-instrument med høj opløsning ved hjælp af en ledende nanochip, der genererer en elektrosprayionisering (ESI) nanospray23.

Oplysningerne om masse-til-ladningsforhold, der samtidig hentes i MS1-tilstand, giver det samlede lipidfodaftryk for alle intakte endogene lipider. MS2/MS3-tilstanden, hvor moderlipidmolekylerne fragmenteres og analyseres, giver eventuelt yderligere strukturelle oplysninger. Dataanalyse kræver specialiseret software og omfatter dekonvolution af spektre og toptildelinger i poolede spektre, der fører til lipididentifikation og formodet kemisk strukturbelysning. Derudover kan absolut kvantificering udføres ved at spike en mærket intern standardblanding, der indeholder mindst en lipidstandard pr. Lipidklasse af interesse. Samlet set kan MS-analyse, der tager et par minutter pr. prøve, med den nuværende teknik dække identifikation og kvantificering af op til 800 lipider fra 14 lipidklasser24 i gnavervæv.

Protocol

Alle forsøg, der involverede dyr, blev udført i et anlæg, der var akkrediteret af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International og licenseret af Agri-Food &; Veterinary Authority of Singapore, med godkendelse fra en institutionel komité for dyrepleje og brug og i overensstemmelse med National Advisory Committee for Laboratory Animal Research Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purpose (NACLAR, 2004).

1. Indsamling af prøver

  1. Udfør muselungedissektioner efter 3 måneder og 6 måneders eksponering af ApoE−/− mus. Opsaml vævene 16-24 timer efter eksponering, snap-frys dem i flydende nitrogen, og opbevar ved -80 °C, før lipidomics-arbejdsgangen påbegyndes. Sørg for indsamling af i alt ni prøver fra hver "omics" dissektionsgruppe.

2. Væv - pulverisering af prøverne

  1. Forbered magnetisk hammer og forbrugsstoffer til vævsslibning. Forkølede vævsposer, pincet, overføringsrør med låg med hætter, en "V" plastspatel og 2 ml plastopsamlingsrør på tøris. Installer den tilsvarende rørholder på et magnetisk hammerinstrument. Tænd for magnethammeren, og indstil slageffekten til Høj.
  2. Læg prøven i en vævspose; Prøven indsættes gennem den øverste åbning af vævsposen ved hjælp af forkølet pincet, hvis det er nødvendigt. Placer prøven midt på den fleksible pose, væk fra kanterne.
  3. Forsegl vævsposen ved at skrue et forkølet opsamlingsrør fast på toppen af vævsposen.
  4. Snapfryse prøven ved at nedsænke den fleksible pose i flydende nitrogen i 10 sekunder.
  5. Udluft opsamlingsrøret; Løsn røret i en 1/4 omgang til udluftning for at undgå at sprænge posen, når magnethammeren rammer.
  6. Læg den frosne vævspose på magnethammeren.
  7. Påfør magnethammeren ved at trykke på aktiveringsknappen for at pulverisere prøven. Hvis der forbliver ikke-pulveriserede vævsstykker i posen, snapfryses prøven i flydende nitrogen igen og gentages for en anden påvirkning.
  8. Fjern vævsposen fra magnethammeren, og hold den pulveriserede prøve i bunden. For at forhindre, at prøven smelter, skal du straks snapfryse den igen.
  9. Prøven overføres til et opsamlingsrør. Vend hurtigt røret på hovedet, så vævsposen er øverst, og bank på posen for at overføre vævspartiklerne til bunden af opsamlingsrøret.
    BEMÆRK: Dette trin skal udføres hurtigt for at undgå smeltning af vævet.
  10. En 10 mg vævsprøve overføres til et 2 ml glas til yderligere lipidomisk analyse, og prøven opbevares ved -80 °C, indtil yderligere trin udføres.

3. Homogenisering af væv

  1. Tænd for vævslyseinstrumentet, og indstil rystefrekvensen til 30 Hz og rystevarigheden til 2 min. Forbered vævshomogeniseringsbufferopløsningen: 150 mM ammoniumbicarbonat i vand med en pH på ~ 8,2.
  2. Tag prøverne ud af opbevaringsfryseren, læg dem på is, og tilsæt fire perler i rustfrit stål i rørene, der indeholder vævspulveret. Der tilsættes 0,5 ml 150 mM ammoniumbicarbonatbuffer til hver prøve.
  3. Prøveglassene anbringes i vævslyseholderne. Modvægt begge holdere med det samme antal rør. Fastgør holderne i vævslysatorens holdearm. Forstyrre vævet.
  4. Placer rørene på is og kontroller visuelt, at der ikke er rester af vævsaggregater til stede i røret. Hvis vævsforstyrrelsen er ufuldstændig (aggregater ses), gentages afbrydelsesprocessen ved at udføre en anden behandlingscyklus. Anbring prøverne på is.
  5. Der oprettes en prøve på 1 af 100 μL af prøven i et 1,5 ml rør dedikeret til proteinbestemmelse. Der centrifugeres ved 18.200 × g i 5 minutter ved 10 °C.
  6. Proteinindholdet i delprøve 1 bestemmes ved Bradford-analysen (se punkt 4). Opbevar prøverne på is.
  7. Der oprettes en prøve 2 på 20-100 μL stamhomogenat i et nyt 2 ml mikrorør til lipidekstraktion (se afsnit 5). Hvis prøverne ikke straks analyseres, skal de opbevares på is, indtil ekstraktionen er udført.
    BEMÆRK: Det endelige ekstraktionsvolumen skal defineres ud fra den samlede proteinmængde. Det skal ligge i området 0,015-0,045 mg protein pr. Total alikvote.

4. Bradford-proteinbestemmelsesanalyse

BEMÆRK: Undersøgelsesprøver skal randomiseres inden analysens begyndelse, og randomiseringen respekteres for alle trin i prøvebehandlingen.

  1. Fortyndet centrifugeret alikvote 1 supernatant 2x med ammoniumbicarbonatbuffer.
    BEMÆRK: Fortyndingsfaktoren afhænger af koncentrationen af vævshomogenatet. For mere koncentrerede opløsninger anvendes en højere faktor, således at den bestemte koncentration falder inden for assayets dynamiske område.
  2. Der udarbejdes en standardkurve for bovin serumalbumin (BSA) i henhold til tabel 1. Vortex standardrørene. Centrifuger glassene ved 18.200 × g i 15 s ved stuetemperatur.
  3. Fra de tidligere fremstillede standardrør overføres 6 μL hver af emnerne og standarderne til en fladbundet plade med 96 brønde i overensstemmelse med pladelayoutet vist i figur 1.
  4. De tidligere forberedte prøver overføres til fladbundspladen med 96 brønde i overensstemmelse med det pladelayout, der er beskrevet i figur 1.
  5. Der tilsættes 250 μL Bradford-reagenset til hvert hul ved hjælp af en multikanalpipette og blandes. Inkuber i 5 min.
  6. Absorbansen måles ved en bølgelængde på 595 nm ved hjælp af en pladelæser.
  7. Beregn proteinkoncentrationerne i alikvoterne baseret på standardkurven.
    BEMÆRK: Den fortyndingsfaktor, der anvendes i begyndelsen af proceduren, bør tages i betragtning ved beregning af proteinkoncentrationerne.

5. BUME ekstraktion

BEMÆRK: Undgå brug af plastrør med lav binding til lipidomics-ekstraktion, da de stærke organiske opløsningsmidler frigiver blødgørere og skaber en stærk baggrund under prøveanalyse.

  1. Forbered 1,5 ml rør med 100 μL ammoniumbicarbonatopløsning i hvert rør af den samlede blindprøve (TB), intern standardblindprøve (ISB) og kvalitetskontrolprøver (QC), idet der tages hensyn til, at 1 QC-prøve placeres mellem hvert sæt af 10 prøver. Opbevar alle prøver på is.
  2. Der tilsættes 10 μL poolet humant plasma til alle QC-prøver. Spike 10 μL intern standardopløsning i alle ISB-, QC- og undersøgelsesprøver (dvs. alle prøver undtagen TB).
    BEMÆRK: Til kvalitetskontrolmateriale skal du bruge ethvert poolet kommercielt tilgængeligt K2EDTA-plasma. Kvantificer lipidkoncentrationen i poolet plasma ved hjælp af den nævnte protokol ved modtagelse og opbevar disse intervaller som referencer for alle analyser, hvor QC-materialet anvendes. Brug kun NIST-plasma til mere målrettede applikationer eller til global metodeverifikation, hvor nøjagtigheden af analysen skal adresseres.
  3. Der tilsættes 300 μL butanol/methanol-blanding (3/1, v/v) til hver prøve. Ryst ved 450 × g i 10 min ved stuetemperatur på termomixeren.
  4. Der tilsættes 300 μL heptan/ethylacetatblanding (3/1, v/v). Ryst ved 450 × g i 10 min ved stuetemperatur på termomixeren.
  5. Tilsæt 300 μL 1% eddikesyreblanding. Ryst i 5 min ved 450 × g ved stuetemperatur på termomixeren. Der centrifugeres ved 2.800 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Overfør 360 μL af den øverste fase til et nyt 2 ml selvlåsende rør 2.
    BEMÆRK: Væske-væskeekstraktion kan resultere i forskydning af fasegrænsen på en prøveafhængig måde, hvilket kan resultere i en lille volumenafvigelse for den øverste fase. Juster opsamlingsvolumen for den øverste fase, hvis det er nødvendigt.
  6. Der tilsættes 320 μL heptan/ethylacetat (3/1, v/v) til vandfaserøret 1. Ryst ved 450 × g i 5 min ved stuetemperatur på termomixeren. Der centrifugeres ved 2.800 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Der overføres 320 μL af den øvre fase, og brømmen kombineres med fraktionen fra trin 5.11.
    BEMÆRK: Juster opsamlingslydstyrken for den øverste fase, hvis det er nødvendigt.
  7. Der tilsættes 250 μL heptan/ethylacetat (3/1, v/v) til vandfasen i rør 1. Ryst ved 450 × g i 5 min ved stuetemperatur på termomixeren. Der centrifugeres ved 2.800 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Der overføres 200 μL af den øverste fase, og fraktionerne fra trin 5.11 og trin 5.15 kombineres med fraktionerne i rør 2.
    BEMÆRK: Juster opsamlingslydstyrken for den øverste fase, hvis det er nødvendigt.
  8. Der inddampes til tørhed ved 35 °C i en vakuumkoncentrator.
    BEMÆRK: Tørrede prøver kan opbevares ved -20 °C indtil analyse, hvis det er nødvendigt.
  9. Opløs igen i 300 μL MS-blandingsopløsning (7,5 mM ammoniumacetat i isopropanol/methanol/chloroform, 4:2:1-opløsning). Vortex hvert rør i 5 s for at sikre, at alt er opløst. Der centrifugeres ved 18.200 × g i 5 minutter ved 4 °C.
  10. Der overføres en prøve på 50 μL til mikroliterpladen i overensstemmelse med pladelayoutet i figur 2 til analyse af positiv ioniseringsmåde (kolonne 1-6) og fortyndes med 50 μL MS-blandingsopløsning.
  11. Der overføres en prøve på 20 μL til MTP-pladen i overensstemmelse med pladelayoutet i figur 2 til analyse af negativ ioniseringsmåde (kolonne 7-12), og der fortyndes med 80 μL MS-blanding. Pladen pakkes ind med folie og opbevares ved 4 °C inden analysen.

6. MS-analyse

  1. Der kalibreres et massespektrometer (MS) både i positiv og negativ tilstand i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger 5 dage eller mindre før analysen.
  2. Installer nanokilden til direkte infusion på forhånd, og sørg for, at den er korrekt justeret mod MS's overførselskapillær. Installer en 4,1 μm dysechip i chipholderen, og konfigurer den i softwaren.
  3. Brug følgende parametre til opsætning af metode til positiv og negativ tilstand: gastryk på 1,25 psi; kildespænding på 1,1 kV; 5 μL prøveinjektionsvolumen udgangskontaktlukning Rel1 i 2,5 s; 5 min leveringstid; pladekøling ved 4 °C.
  4. Opsæt analysesekvenskøen for den direkte infusionsrobot i positiv tilstand.
  5. Konfigurer MS-metoden til positiv tilstand ved hjælp af følgende MS-indstillinger:
    1. Indstil kapillærtemperaturen til 250 °C og S-objektivets RF-niveau til 65,0. Udfør MS-anskaffelse med fuld scanning fra 0 til 1 min i området 550-1000 m/z ved en opløsning på 140.000 med automatisk forstærkningskontrol på 1 ×106 og maksimal injektionstid på 50 ms. Anvend låsemasse på 680.48022.
    2. Indstil datauafhængig MS/MS-indsamlingsmetode mellem tidsintervallet 1 og 5 minutter med en opløsning på 17.500 med en fast første masse på 250 m/z. Brug en automatisk forstærkningskontrol til MS2 ved 1 × 105 og maksimal indsprøjtningstid på 64 ms, en kollisionsenergi på 20 NCE og et isolationsvindue på 1 m/z. Brug inklusionsmasselisten fra 550 til 1.000 m/z med et massetrin på 1 Da.
  6. Ved optagelse i negativ tilstand indstilles kapillærtemperaturen til 250 °C og S-objektivets RF-niveau til 65,0 i MS-tunefilen.
    1. Brug følgende MS-metodeindstillinger: fuld scanningsoptagelsestilstand fra 0 til 1 min ved 140.000 opløsning, der dækker området 400-940 m / z, automatiseret forstærkningskontrol på 1 × 106; maksimal injektionstid på 50 ms; Brug en låsemasse på 529,46262.
    2. Indstil MS2-optagelse i DIA-tilstand mellem 1 og 5 minutter af kørslen med en opløsning på 17.500 med en fast første masse på 150 m / z; automatiseret forstærkningskontrol på 1 × 105; 64 ms maksimal injektionstid; og 35NCE kollisionsenergi. Brug medtagelsesmasselisten fra 400 til 940 med et massetrin på 1 Da.
  7. Opret analysesekvenskøen i MS-software i positiv tilstand. Vent på, at prøveudtagningen udløses af et kontaktlukningssignal, der kommer fra den direkte infusionsrobot for hver prøve.
  8. Når analysen af positiv tilstand er fuldført, oprettes sekvenskøen for den direkte infusionsrobot i negativ tilstand.
  9. Opsæt analysesekvenskøen i MS-software i negativ tilstand.

7. Databehandling

  1. For at konvertere datafilerne fra de positive og negative tilstande fra .raw format til .mzML-format skal du bruge konverteringssoftwaren.
    BEMÆRK: Datafiler fra positive og negative tilstande skal konverteres separat (på grund af deres forskellige anskaffelsesindstillinger og forskellige støjtærskel).
    1. Udfyld følgende indstillinger for at udføre filkonvertering: støjtærskelfaktor er 3 og 5 for henholdsvis MS og MS2; aktiver støjfjernelsesfunktionen for både MS og MS2, datakomprimering, gennemsnitlige MS2-scanninger og peak picking. Indstil TIC-tærskler for positive og negative tilstande (f.eks. 10.000 og 5.000; defineres ud fra støjniveauet for den pågældende prøve, der produceres af et specifikt instrument). Generer XLC- og PDF-rapporter i slutningen af behandlingen.
  2. Udfør lipididentifikationen. Definer følgende (eksempel) filimportindstillingsparametre : valgvindue ±0,5 Da (afhænger af valgvinduet i MS-metoden); tidsinterval 2-300 s (afhænger af scanningstid i MS-metoden); ingen kalibreringsmasse for MS og MS2 overføre og afrunde masseområdet fra Peak by Peak-softwaremetadatafilerne (min. masse [MS]) og (min. masse [MS2]); tolerance på 3 ppm og 10 ppm for henholdsvis MS og MS2 holde MS og MS2 tærskelfelt , frekvensfilter, MS1 offset og PMO tomt; Isotopkorrektion for MS og MS2 valgt; Overfør opløsningsgradient fra konverteringsmetadatafilen som (Resolution linear fit [MS]) og as (Resolution linear fit [MS2]).
    BEMÆRK: Lipididentifikation i de positive og negative tilstande skal udføres separat på grund af deres forskellige anskaffelsesindstillinger.
  3. Når dataene er importeret, skal du gå til menuen Kør og uploade MFQL-filerne til lipididentifikation.
    BEMÆRK: For detaljerede oplysninger om strukturen af MFQL'er henvises til publikationen af Herzog et al.25. Se nogle eksempler på MFQL-filer på https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library og se diskussionen. Alle MFQL'er, der anvendes til databehandlingen, findes i de supplerende materialer.
  4. Kvantificer de identificerede arter på MS-niveau ved at dividere lipidfunktionens prækursormasseintensitet med den respektive intensitet af den mærkede interne standard og derefter multiplicere kvotienten med koncentrationen af den mærkede interne standard. Normaliser den endelige lipidkoncentration pr. mængde totalt protein målt ved Bradford-analysen.

8. Procedure for QC-kontrol

BEMÆRK: En kvalitetskontrolprocedure er et vigtigt skridt til at verificere metodens tekniske reproducerbarhed. Til dette formål analyseres et kommercielt poolet plasma for at bestemme de endogene niveauer af forskellige lipider over 5 dage i 15 identiske alikvoter pr. batch (i alt fem batcher). Bemærk, at der i dette tilfælde blev oprettet en dataevalueringspipeline som en skinnende webapplikation ved hjælp af det statistiske softwaremiljø R.

  1. Definer referenceacceptintervallet som gennemsnitsværdien beregnet for alle fem batcher ±3 standardafvigelser.
  2. Anvend acceptreglerne for "bestået" for hver analytisk batch: 90% af referencemålene skal bestå, i betragtning af at en referenceforbindelse repræsenterer en lipidklasse. Hvis der f.eks. er inkluderet 15 referencemål i QC-verifikationen, skal du sikre dig, at 13 mål består, for at batchen kan accepteres.
    BEMÆRK: Med andre ord skal 68% af QC-prøver pr. Referenceforbindelse passere, for at dataene for denne lipidklasse kan accepteres.
  3. Hvis forsøgsbatchen ikke opfylder acceptkriterierne for QC-kontrollen, gentages proceduren.

9. Estimering af (relative) konjugerede fedtsyremængder

  1. For hver lipidklasse estimeres mængderne af konjugerede fedtsyrer baseret på deres MS2-intensiteter.
    BEMÆRK: På grund af fragmenterings- og ioniseringsforskelle var de afledte værdier kun beregnet til sammenligninger af relativ overflod på tværs af prøvegrupper snarere end for eksempel at estimere det relative bidrag fra en specifik fedtsyre til den samlede konjugerede fedtsyrepulje i en lipidklasse.
  2. Normaliser MS2-intensiteterne af fedtsyrefragmenterne med den gennemsnitlige intensitet af fedtsyrefragmenterne i den tilsvarende interne standard. Baseret på koncentrationen af den interne standard og den målte vævsvægt udledes en "normaliseret koncentration" for de konjugerede fedtsyrer. Opsummer disse værdier pr. lipidklasse for at estimere den samlede mængde af hver konjugeret fedtsyre pr. Prøve.

10. Statistisk analyse

  1. Udfør statistisk analyse. Tilpas en lineær model for hver betingelse og den tilsvarende kontrolgruppe, og beregn p-værdier ud fra en t-statistik for log2-transformerede data. Brug Benjamini-Hochbergs metode til falsk opdagelseshastighed til at korrigere for flere testeffekter.
    BEMÆRK: Lipider med justerede p-værdier < 0,05 betragtes som forskelligt rigelige. Her blev statistisk analyse udført i det statistiske R-miljø26.

Representative Results

Her præsenterer vi som repræsentative resultater data, der illustrerer, hvordan haglgeværlipidomics kan bruges til at studere virkningerne af CS på lungerne hos mus. Shotgun-lipidanalyseprotokollen blev med succes anvendt til en in vivo-undersøgelse til sammenlignende analyse af to grupper af prøver: lungevæv dissekeret fra ni kvindelige Apoe-/-mus udsat for CS (3R4F-gruppe; positiv kontrol) og et tilsvarende antal mus opretholdt under friske luftforhold (skingruppe) som negativ kontrol indsamlet efter 3 måneder, 4 måneder og 6 måneders eksponeringstider. Dyrene blev holdt under filtreret og konditioneret frisk luft ved 22 °C ± 2 °C temperatur og 55% ± 15% fugtighed og fodret med en gammabestrålet pelletfoder. Lysregimet blev opretholdt ved 12 timer om dagen. Op til otte mus blev anbragt pr. bur. 3R4F-referencecigaretter til eksponeringsbehandling blev købt fra University of Kentucky for at generere 3R4F CS-aerosolen (600 μg total partikelformet TPM/L-aerosol) til en måleksponeringskoncentration svarende til 28 μg nikotin/L.CS røg fra 3R4F-cigaretter blev fremstillet ved hjælp af 30 roterende rygemaskiner ifølge Phillips et al.27 . Baseret på Health Canada Intensive Smoking Protocol blev 55 ml puffvolumen, et pust pr. 30 s og 100% blokering af ventilationshuller påført 3R4F-cigaretter for at give tilstrækkelig eksponering. Alle yderligere detaljer om undersøgelsens design er tidligere rapporteret27,28.

Samlet set blev ~ 400 molekylære lipidarter fra de 14 mest rigelige lipidklasser identificeret og kvantificeret (figur 3). Den totale normaliserede lipidkoncentration pr. klasse var let forhøjet for PE-, PEO-, PC-, PCO-, PI- og PG-lipidklasserne, og der blev observeret en vis nedregulering for SM-, LPE- og PA-lipider (figur 3A), mens der ikke kunne ses nogen forskel for TAG'er og PS. Interessant nok er forhøjede niveauer af PCO- og PEO-plasmalogenlipider i CS-gruppen blevet rapporteret i inflammatoriske celler29 . En af de intracellulære funktioner af plasmalogen lipider er antioxidantaktivitet. Under eksponering for reaktivt ilt (ROS) og nitrogenarter (RNS) blev selektiv oxidation af plasmalogener sammenlignet med diacylfosfolipider rapporteret30. Enyletherbindingen i plasmalogens kemiske struktur er følsom over for radikale angreb på oxidativt stress31. De vigtigste produkter af radikale angreb er hydroxylerede eicosatetraensyrer, 2-monoacylglycerolphospholipider, pentadecanol, myresyrer, α-hydroxyaldehyder af forskellig kædelængde, 1-formyl-2-arachidonoyl glycerophospholipid og lysophospholipider.

Disse resultater viser, at blandt de molekylære egenskaber baseret på den samlede molekylformel blev 100-120 forbindelser signifikant påvirket af CS-eksponering (figur 3D). Den detaljerede dekonvolution af MS2-fragmenteringsoplysningerne og normaliseringen af fragmentsignalintensiteterne tillod den omtrentlige definition af den samlede mængde af hver konjugeret fedtsyre (FA) repræsenteret i hver lipidklasse (figur 3E) og sammenligning af disse data mellem eksponerede og kontrolgrupper. Et klart fald i både fuldt mættede FA'er og dem med kun få umættede mætninger, hovedsagelig i forbindelse med lyso-lipider, blev observeret. I modsætning hertil blev flerumættede fedtsyrer (PUFA) i sammensætningen af PC-, PE- og PG-phospholipidklasser forhøjet i CS-gruppen for alle tidspunkter. De ekstreme tilfælde af PC og PG konjugeret med eicosapentanoic (EPA) og docosahexaensyre (DHA) blev udelukkende påvist i 3R4F CS-eksponeringsgruppen (figur 3E, rød farve).

Figure 1
Figur 1: Pladelayout til prøvefordeling i Bradford-assayet. Blindprøver og standardprøver anbringes i tre eksemplarer i kolonne 1-3; Ukendte prøver placeres i to eksemplarer i kolonne 4-11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Pladelayout af 96-brønds mikrotiterpladen til analyse af haglgeværmassespektrometri. Fordelingen af blanke, standard-, ukendte og QC-prøver til erhvervelse i positiv ioniseringstilstand er kortlagt på venstre side af pladen (kolonne 1-6); Alle prøver til den negative ioniseringstilstand er placeret til højre (kolonne 7-12). Forkortelser: pos = positiv; QC = kvalitetskontrol; neg = negativ; TB = total blank. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Shotgun lipidomics analyse af muselunger udsat for cigaretrøg. Apoe-/-mus blev udsat for CS fra 3R4F-referencecigaretten eller frisk luft (humbug). (A) Lipidklassekoncentrationer og antallet af lipidarter pr. klasse. For hver klasse er antallet af kvantificerede lipidarter angivet i parentes. Gennemsnitlige og 95% konfidensintervaller for hver lipidklasse, separat for hver eksponeringstype (aggregeret over tre tidspunkter). (B) Vulkandiagrammer, der viser effektstørrelsen (log2 fold ændring) og signifikans (-log10 FDR-justeret p-værdi) af de kvantificerede lipidarter for 3R4F CS versus sham sammenligning på de tre tidspunkter. Signifikant forhøjede lipider er markeret med gult; signifikant nedsatte lipider er markeret i cyan (FDR-justeret p-værdi < 0,05). (C) Differentiel tæthed af de 25 lipidarter med de største absolutte gennemsnitlige foldændringer. Log2-foldændringer for 3R4F CS versus skin-sammenligningen er farvekodede, og statistisk signifikans er angivet: *: FDR-justeret p-værdi < 0,01; X: FDR-justeret p-værdi < 0,05. (D) Sammenligningsområder. Korrelationskoefficienter for foldændringssammenligningerne er farvekodede, og antallet af delte differentielt rigelige lipider er angivet (samlede tal i margenerne). Cirkeldiagrammer viser procentdelen af delte differentielt rigelige lipider med samme ændringsretning (FC-tegn). Stjerne angiver en signifikant overlapning af de differentielt rigelige lipider. (E) Differentiel forekomst af konjugerede FA'er pr. lipidklasse. Heatmap som i panel C for konjugerede fedtsyrer med signifikante tæthedsforskelle mellem 3R4F og skineksponering i alle tre tidspunkter (FDR-justeret p-værdi < 0,05). Mængden af hver fedtsyre pr. lipidklasse blev estimeret ud fra MS2-intensiteterne af fedtsyrefragmenterne. Forkortelser: CS = cigaretrøg; FDR = falsk opdagelsesrate; FC = fold ændring; FA = fedtsyrer; PC = phosphatidylcholin; PS = phosphatidylserin; TAG = triacylglycerol; SM = sphingomyelin; PEO = plasmalogenphosphatidylethanolamin; PE = phosphatidylethanolamin; PG = phosphatidylglycerol; PI = phosphatidylinositol; DAG = diacylglycerol; SE = sterol/cholesterylestere PCO = plasmalogenphosphatidylcholin; LPC = lysophosphatidylcholin; LPE = lysophosphatidylethanolamin; PA = phosphatidsyre. Klik her for at se en større version af denne figur.

BSA-slutkoncentration (mg/ml) BSA-opløsning ved 2 mg/ml (μL) Ammoniumbicarbonatbuffer (μL)
1 50 50
0.75 37.5 62.5
0.5 25 75
0.25 12.5 87.5
0.125 12.5 187.5
0.0625 50 af 0,125 mg/ml opløsning 50
0 0 100

Tabel 1: Fortyndingsskema for BSA's interne standard for kalibreringskurven for Bradford-assayet. Forkortelse: BSA = bovin serumalbumin.

Supplerende oplysninger: MFQL-filer, der bruges til LipidXplorer lipididentifikation. Den .zip pakke består af de individuelle krævede MFQL-filer, der hver især er navngivet efter dette mønster: __MS2.mfql (f.eks. PE_neg_MS2.mfql). Filnavnene til mærket intern standardidentifikation inkluderer D7 (D9) -mærket i (f.eks. PED7_neg_MS2.mfql). Disse MFQL filer bruges til at verificere mængden af deuterium i den interne standard. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Selv om fremskridt inden for MS har givet en række forskellige metoder til nøjagtig overvågning af mange lipidarter, viste den tidligere lipidprofilering af forskellige pattedyrvæv ikke konsistente resultater, og derfor er lipidernes særlige vævsspecifikke funktioner fortsat uklare. I sammenligning med proteinfunktionel analyse, for hvilken der findes mere robuste tilgange til at slå ekspressionen af bestemte forbindelser ud, kan størstedelen af lipider ikke selektivt slukkes eller overudtrykkes i væv, hvilket gør den funktionelle evaluering af lipider vanskelig. Avanceret profilering af vævslipidomkoncentrationer kan give en alternativ tilgang til at identificere sammenhænge mellem cirkulerende lipider og humane sygdomme.

Ved evaluering af omfattende lipidomics-metoder, der kvalitativt og kvantitativt kan dække den endogene lipidprofil af ethvert musevæv, foretrak vi shotgun lipidomics-metoden. Generelt er to modsatte typer prøveanalyse mulige: enten en fuldstændig ikke-målrettet screening af lipider ved hjælp af væskekromatografi (LC) -baseret adskillelse med yderligere massespektrometrisk detektion for at afsløre prøvens samlede lipidkompleksitet eller målrettede tilgange, som for det meste muliggør meget præcis kvantificering af specifikke lipider af interesse. I modsætning hertil er det stærke træk ved den præsenterede shotgun lipidomics workflow den hurtige omfattende dækning af hundredvis af endogene lipider fra foruddefinerede lipidklasser, som stadig kan udføres på en robust semikvantitativ måde.

Ioniseringseffektiviteten af forskellige lipidklasser er strukturafhængige og kan variere drastisk afhængigt af de forskellige eksperimentelle ioniseringsbetingelser. I modsætning til LC-baserede separationsmetoder minimerer haglgeværanalyse disse forskelle på grund af den direkte samtidige infusion af hele lipidekstraktet under de samme ioniseringsbetingelser i MS-instrumentet. Anvendelsen af isotopisk mærkede lipidanaloger eller strukturelt lignende ikke-endogene standarder tillader semi-kvantificering af alle lipidklasser. Shotgun lipidomics giver lav inter- og intra-run variabilitet under MS-analyse; Som følge heraf producerer denne metode lavere variationskoefficienter21 end ikke-målrettede væskekromatografibaserede metoder, som kræver flere standarder for tilstrækkelig kvantificering. Det er vigtigt, at selv om der ikke anvendes nogen ekstern kalibreringskurve i den nuværende metode, betragtes metoden stadig som fuldt kvantitativ32.

Et niveau af mærket intern standard (eller umærket standard, der ikke udtrykkes endogent) pr. lipidklasse er tilstrækkelig til kvantificering af de fleste lipider. Kun få publikationer har rapporteret en delvis metodevalidering for en shotgun lipidomics-metode. For eksempel blev der i Gryzbek et al.17 og Surma et al.21 fremstillet omvendte kalibreringskurver ved hjælp af interne standarder og en fast mængde prøvematrix. Linearitet blev vurderet ved lineær regression af log-transformerede lipidmængder og deres intensiteter og rapporteret som henholdsvis R2 og hældning. Detektionsgrænsen (LOD) og kvantificeringsgrænsen (LOQ) blev bestemt ved vægtet lineær regression baseret på et signal-støj-forhold på 3 for LOD og 10 for LOQ. For de fleste lipidklasser blev LOQ defineret mellem 2-9,8 pmol for fedtvæv og 0,05-5μM i plasma. I begge tilfælde blev ikke-endogene interne enkeltstandarder pr. klasse anvendt til at udlede estimater for alle lipider i klassen. I dette arbejde leverer vi imidlertid ikke LOD / LOQ på grund af flere bekymringer: den endogene matrix er ikke stoffri, og surrogatmatrixen for væv er ikke tilgængelig - med dette er spidsen af små kendte mængder standarder ikke mulig. Vi udfører ikke en klassisk målrettet kvantificeringsmetode ved brug af en kalibreringskurveserie af en bestemt forbindelse normaliseret af dens identiske isotopmærkede standard på grund af ikke-eksistensen af rene standarder og den meget begrænsede tilgængelighed af isotopisk mærkede lipider. Orbitrap-detektorer udfører automatisk konverteringen af det forbigående signal ved at anvende en Fourier-transformation, og noget signal er allerede erstattet - som følge heraf vil det lavere koncentrationsområde kun være lineært ned til et minimumssignal, under hvilket molekylet ikke længere kan detekteres. Xcalibur-softwarens signal-støj-værdier afhænger af molekylets m/z-forhold; Som følge heraf vil forbindelserne i hver lipidklasse, der indeholder forskellige kombinationer af fedtsyrer, have forskellige støjværdier. Desuden er LOQ/LOQ-værdier strengt knyttet til matrixtypen, og når kvantificering af lipidomet udføres i forskellige gnavervæv, bør det afspejles ved vurderingen af LOQ'er for hver vævstype individuelt.

Faktisk tilbyder metoden et højt lineært dynamisk kvantificeringsområde på op til fire størrelsesordener33 og meget god følsomhed til at dække de vigtigste endogene strukturelle lipider, som kan øges yderligere ved tekniske forbedringer i MS-erhvervelse32. Variationskoefficienterne for de gennemsnitlige lipidkoncentrationer var for det meste under 15%, hvilket betyder, at shotgun lipidomics overholder Food and Drug Administration (FDA) krav som en metode, der skal overvejes til god laboratoriepraksis (GLP) og god klinisk praksis (GCLP) undersøgelser34.

Det skal dog bemærkes, at nogle lipidklasser på grund af deres forskellige polaritet bliver meget mere påvirket af bidraget fra specifikke konjugerede FA'er. Dette fører til forvrængning i intensitetsresponsen i ækvimolære blandinger, der indeholder en bred vifte af konjugerede FA'er, hvilket resulterer i kvantificeringsbias, som fremhævet af Koivusalo et al.35 for phospholipidklasser. Det skal bemærkes, at disse forfattere præsenterede data for en bred vifte af FA'er fra 24-48 kædelængde, hvilket sandsynligvis ikke afspejler situationen i en reel biologisk prøve. Responset for flerumættede arter var 40% højere end for fuldt mættede arter, men denne effekt blev kun observeret for højere koncentrationer. Når blandingen gradvist blev fortyndet, faldt effekten af umættethed gradvist og forsvandt praktisk talt ved 0,1 pmol/μL pr. art. Derudover blev alle målinger udført på ionfælde og tredobbelte quadrupoles instrumenter og ikke på Q-Exactive udstyr.

En anden fordel ved den præsenterede arbejdsgang er dens tekniske fleksibilitet, som muliggør tilpasning til specifikke projektkrav. For eksempel kan enhver lipidekstraktionsprotokol - såsom de modificerede Bligh og Dyer36, methyltert-butylether 37 eller butanol-methanol38 metoder - anvendes til fremstilling af et totalt lipidekstrakt før MS-analyse. Hovedbegrænsningen ved chloroform-methanolekstraktion er, at den nedre fase indeholder lipidfraktionen, hvilket komplicerer rutinearbejde og især automatisering; Derudover skal chloroforms toksicitet overvejes. Tert-butyletherekstraktion anvendes i vid udstrækning til lipidanalyse af plasmaprøver37, og en automatiseret version er blevet foreslået21. I dette tilfælde valgte vi BUME-metoden, fordi den giver endnu bedre genvinding for de spikede PG-, PI-, PA- og PS-lipidklasser38, lavere opløsningsmiddelforbrug og muligheden for automatisering39, mens de samlede koncentrationer kvantificeret for vævsprøver ekstraheret ved alle tre metoder var sammenlignelige. Derudover, mens prøveekstraktionen blev udført manuelt i det aktuelle arbejde, er det også muligt at opnå reproducerbare og præcise resultater fra store prøvesæt ved automatiseret prøveforberedelse og lipidekstraktion i et 96-brøndformat40,41. Dette gør det muligt at implementere lipidomics-analyse i store kliniske og toksikologiske undersøgelser.

I det aktuelle arbejde udførte vi MS-erhvervelsen af positive og negative tilstande separat uden polaritetsskift som beskrevet af Schuhmann et al.42. Stabiliteten af nanomatsignalet er bedre i negativ tilstand for en lidt mindre koncentreret opløsning end i positiv tilstand. Derudover udviklede vi en fuldt sporbar procedure med konverteringssoftware fra .raw filer til mzML, som giver de værdier, der skal specificeres i LipidXplorer-softwaren - med dette er manuelle opløsningshældningsberegninger ikke påkrævet. Vi anvendte også forskellige støjindstillingssubstitutioner, fordi spektrenes støjniveauer i positiv tilstand er højere end i negativ tilstand. Alle trin blev optimeret til sporbare rutineanalyser med højt gennemløb.

Til identifikation kan shotgun lipidomics analyse udnytte den unikke opførsel af forskellige lipidklasser, som danner unikke addukter i forskellige polaritetstilstande. I denne metode kan PC- og PE-arter med samme molekylmasse, der overlapper hinanden i den positive ioniseringstilstand, adskilles fuldstændigt i den negative ioniseringstilstand, da PC danner acetat- eller formikataddukter, og PE ioniseres i en deprotoneret form. Desuden er (delvis) strukturel dekonvolution mulig for metoden, der ikke kun anvender molekylformlen, men også bulkfedtsyrestrukturen. For eksempel fungerer FA-identifikation på niveauet af totalt kulstof og totalt umætningsantal for alle fosfolipider, DAG'er, TAG'er og lyso-phospholipider. Bottom-up-kvantificeringen af hver isomere form kan delvist udføres for nogle af phospholipidklasserne43 , men er meget mere kompleks for DAG'er og TAG'er på grund af det ulige signalrespons fra forskellige FA'er i MS2-spektrene.

Det er også vigtigt at understrege behovet for at gennemføre passende kvalitetskontrolprocedurer, der er i fuld overensstemmelse med de seneste initiativer på dette område44. Da vi ønsker at sikre korrekt datasporbarhed og reproducerbarhed mellem og inden for laboratoriet, er der taget en række skridt, såsom korrekt randomisering af prøverne til alle trin i analysen, arbejde med leverandørcertificerede standardblandinger, inkludering af kvalitetskontrolprøver, procedurer til verifikation af batchaccept eller afvisning og oprettelse af en intern database til sporing af QC-ydeevne på lang sigt. I overensstemmelse med disse initiativer er behovet for en standardiseret metode til håndtering af prøvestabilitet. Generelt påvirkes størstedelen af strukturelle lipider ikke af lipidoxidation, hvilket er mere relevant for oxilipiner, oxiderede lipider og flerumættede fedtsyrer, der derfor er meget mere følsomme over for opbevarings- og håndteringsbetingelser. Den korrekte vurdering af prøvestabilitet er dog stadig en teknisk udfordrende opgave.

Denne protokol har imidlertid en begrænsning, når det kommer til bestemmelse af submolekylære niveauer af forbindelser. I betragtning af at der ikke er nogen adskillelse af det samlede ekstrakt, fusioneres alle isoformer af lipider med samme molekylmasse, men forskellige fedtsyresammensætninger i MS-analysen. For de fleste klasser er det muligt at opnå delvis dekonvolution af strukturen ved at anvende fragmenteringsforholdene mellem resterende fedtsyrefragmenter i MS2. Den uafhængige kvantificering af hver isoform er imidlertid fortsat en særlig udfordrende opgave på grund af de store forskelle i forskellige isoformers fragmenteringsadfærd og det faktum, at rene kemiske standarder ikke er tilgængelige i stor nok variation til at definere kompensationsværdierne. En anden begrænsning er, at ESI-processen uundgåeligt genererer artefakter, hvilket resulterer i kunstig generering af toppe for nogle lipider såsom DAG'er, PA'er og FA'er, hvilket kan føre til fejlagtig kvantificering.

Dernæst opsummerer vi de mest kritiske dele af protokollen baseret på vores erfaring. Den første er relateret til det faktum, at hver musevævstype har en unik lipidprofil med hensyn til både lipidmængden og klasseforholdene. Med dette skal udgangsmængderne af vævet baseret på det samlede proteinindhold før ekstraktion bestemmes omhyggeligt for ikke at mætte MS-signalet og ikke forlade det dynamiske kvantificeringsområde på grund af lipidaggregering ved høje koncentrationer33 eller - i den modsatte ekstrem - for at give tilstrækkeligt MS-signal til at dække de vigtigste lipidforbindelser for hver lipidklasse.

Det andet kritiske aspekt er at sikre en korrekt justering af placeringen af nanokildechipudløbet med massespektrometerets overførselskapillær. I betragtning af at fuld kalibrering af massespektrometeret i begge tilstande udføres ugentligt, kan skift mellem kalibreringskilden og nanokildechipopsætningen være årsagen til dramatisk variation i signalintensitet på grund af forkert justering under installationen.

En anden kritisk del af protokollen er den omhyggelige håndtering af det interne standardmix. Da denne blanding indeholder en betydelig mængde dichlormethan, bør den, når den er åbnet, indtages hurtigt for at undgå lang opbevaring og flere anvendelser, der fører til fordampning og kunstig koncentrationsændring. Desuden er konsekvent håndtering af standardblandingen efter fjernelse fra -20 °C-lagring vigtig, da temperaturforskelle kan føre til volumenuoverensstemmelser under pipetteringen med luftpudepipetter. En mulighed ville være at erstatte dichlormethan i standardresuspensionsbufferen med ren methanol, hvilket kunne forbedre håndteringskomforten, men kunne have en negativ indvirkning på opløseligheden af nogle lipidklasser og dermed mindske kvantificeringsnøjagtigheden for disse lipidklasser.

Den sidste kritiske del er databehandling. Databehandlingsworkflowet kombinerer Peak by Peak-softwarekonvertering fra .raw til .mzML-format, anvender MS2-scanningsgennemsnit og MS1- og MS2-støjfiltrering samt peak picking og datakomprimering. Som et alternativ kan Proteowizard-softwaren også bruges til datakonvertering, men i dette tilfælde skal flere indstillinger i LipidXplorer defineres manuelt. Al kompleksiteten af haglgeværlipidomics er især koncentreret om trinnet med dekonvolution af direkte injektion MS1 og MS2 spektre. Open source LipidXplorer-softwaren importerer de konverterede spektre fra mzML-filformat baseret på massenøjagtighed, masseopløsning og hældningen af dens ændring med stigende m / z. Softwaren fusionerer flere individuelle MS- og MS / MS-spektre erhvervet inden for en analysekørsel. Derefter justerer den individuelle toppe inden for forskellige prøvekørsler, og i hver klynge af justerede toppe erstatter den deres masser med deres enkeltintensitetsvægtede gennemsnitsmasse, mens deres overflod i hver datafil forbliver uberørt. Repræsentative masser af justerede topklynger og individuelle spidsintensiteter gemmes i en masterscanningsdatabase. Masterscanningsdatabasen indeholder alle MS1- og MS2-spektre, der genereres for alle prøver i batchen, og kan dekonvolueres til lipididentifikationer ved forespørgsler skrevet i forespørgselssproget for molekylær fragmentering (MFQL).

Samlet set dækker metoden identifikation af DAG-, TAG- og SE-lipider baseret på positiv tilstand og PC-, PE-, PS-, PI-, PA-, PG-, SM-, LPC- og LPE-lipider baseret på erhvervelse af negativ tilstand. Under lipididentifikation udføres isotopkorrektion for MS1 og MS2, og justerede intensiteter rapporteres i .xlsx-outputfilen. Alternativt er flere andre software tilgængelige til behandling af haglgeværdata, såsom ALEX45 og LipidHunter46.

Fedtsyrer - vigtige nukleare og cellulære membrankomponenter - opbevares i form af fosfolipider til yderligere omdannelse til bioaktive molekyler. De kan omdannes af lysophospholipidacyltransferaseenzymer til lysophospholipider gennem Lands-stien47. LPCAT3-enzymet er for eksempel kendt for at vise høj specificitet for at inkorporere AA i lysophosphatidylcholin og lysophosphatidylserinmellemprodukter. Den relativt høje ekspression af disse enzymer blev rapporteret inden for inflammatoriske celler, såsom alveolære makrofager og bronchiale epitelceller47, hvilket førte til frigivelse af større relative andele af AA-holdige phospholipider i disse celler. Efter deres frigørelse fra membranfosfolipider ved phospholipase A2 katalyseres omdannelsen af PUFA'er til forskellige typer lipidmediatorer imidlertid af mange enzymer48. Endvidere kan disse PUFA'er blive substratet for produktionen af proinflammatoriske og antiinflammatoriske prostaglandiner via virkningen af cyclooxygenase (COX)-1 og COX-2 enzymer47. Fosfolipider er en af kilderne til lipidmediatorer, der frigives på bestemte steder, hvor disse mediatorer skal demonstrere deres biologiske virkninger.

Lungen er et komplekst organ, der består af flere celletyper, der hver spiller overlappende og nicheroller for at lette normal lungeudvikling og funktion. Der er kun udført få undersøgelser for at isolere og profilere forskellige celletyper i mus eller menneskelig lunge (f.eks. alveolære type 2-celler)49,50; Andre større lungecelletyper er ikke blevet karakteriseret. En anden interessant undersøgelse51 blev udført for at isolere og udføre lipidanalyse af endotel-, epitel-, mesenkymale og blandede immunceller i muselungen. Det blev observeret, at koncentrationen af PUFA'er inkorporeret i PCO og PG blev beriget i immuncellerne. I betragtning af det faktum, at CS inducerer en stigning i immunceller i lungen (4-5 gange), som vurderet ved bronchoalveolær skylning (BAL)52, kunne de samlede lipidændringer, der blev observeret i denne undersøgelse, forklares ved en kumulativ stigning i immuncellerekruttering i muselungen.

Afslutningsvis kan den observerede forvrængning af monoumættede fedtsyrer og PUFA'er inkorporeret i fosfolipider afspejle overskuddet af visse FA'er i cellen og / eller udgøre en intracellulær ressource af oxilipinprækursorer, der overproduceres under oxidativ stress og inflammatoriske tilstande. Imidlertid er yderligere data om fri EPA, DHA og andre oxilipiner afgørende for at afklare dette punkt og ligger uden for anvendelsesområdet for den nuværende metodeapplikation.

Disclosures

Alle forfattere er ansatte hos Philip Morris International. Philip Morris International er den eneste kilde til finansiering og sponsor af dette projekt.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke undersøgelsesteamet og især anerkende den tekniske bistand og støtte fra bioforsknings- og aerosolholdene hos PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapore, og PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Schweiz. Forfatterne takker Sam Ansari for at styre biobanken og anerkender støtten fra Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy for at redigere et udkast til manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1, 5, and 2 mL self-lock tubes Eppendorf 30120086, 30120094
3 mm stainless still beads Qiagen 69997
4.1 µm nozzle chip Advion HD-D-384
Acetic acid Sigma Aldrich 45754-100ML-F
Ammonium acetate Honeywell 14267-25G
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 09830-500G
Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL Thermo Scientific  23209
Butanol Honeywell 33065-2.5L
Chloroform Sigma Aldrich 650498-1L
Dichloromethane Honeywell 34856-1L
Ethyl acetate Honeywell 33211
Greiner CELLSTAR 96 well plates Sigma M9686
Heptane Sigma Aldrich 34873-2.5L
Isopropanol Fisher Scientific A461
Methanol Fisher Scientific A456
Mouse pooled plasma BioIvt
Mouse SPLASH standard Avanti Polar Lipids 330710X Internal standard
Nunc 96-flat bottom well transparent plates VWR 62409-068
Plastic spatula Sigma Z560049-300EA
Quick Start Bradford 1x Dye reagent BioRad 5000205
Serum diluent Sigma Aldrich D5197
Equipment/software
CryoPrep CP02 impactor instrument Covaris     Magnetic hammer
Centrifuge 5427R Eppendorf .    Centrifuge
ChipSoft 8.3 Advion Biosciences .    Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot
LipidXplorer 1.2.8.1 N/A .    Software to identify lipids
Peak By Peak SpectroSwiss .    Software to convert .raw data from MS to .mzml format
ProteoWizard ProteoWizard .    Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format
Q-Exactive MS Thermo Fisher .    High resolution orbitrap mass spectrometer
Qiagen Tissue Lyser II Qiagen .    Tissue lyser
SpeedVac SPD140DDA Thermo Fisher .    Vacuum concentrator
Tecan Infinite M nano plus Tecan .    Plate reader
ThermoMixer C Eppendorf .    Thermomixer
TriVersa Nanomate Advion Biosciences .    Direct infusion nano-source
Xcalibur 4.3 Thermo Scientific .    Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salehi, N., Janjani, P., Tadbiri, H., Rozbahani, M., Jalilian, M. Effect of cigarette smoking on coronary arteries and pattern and severity of coronary artery disease: A review. Journal of International Medical Research. 49 (12), 3000605211059893 (2021).
  2. Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: Are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 45 (6), 1111-1115 (2011).
  3. Lee, G., Walser, T. C., Dubinett, S. M. Chronic inflammation, chronic obstructive pulmonary disease, and lung cancer. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 15 (4), 303-307 (2009).
  4. Titz, B., et al. Effects of cigarette smoke, cessation, and switching to two heat-not-burn tobacco products on lung lipid metabolism in C57BL/6 and Apoe-/- mice-An integrative systems toxicology analysis. Toxicological Sciences. 149 (2), 441-457 (2016).
  5. Morissette, M. C., Shen, P., Thayaparan, D., Stampfli, M. R. Disruption of pulmonary lipid homeostasis drives cigarette smoke-induced lung inflammation in mice. European Respiratory Journal. 46 (5), 1451-1460 (2015).
  6. Jubinville, E., et al. Interplay between cigarette smoking and pulmonary reverse lipid transport. European Respiratory Journal. 50 (3), 1700681 (2017).
  7. Han, X., Gross, R. W. Shotgun lipidomics: Electrospray ionization mass spectrometric analysis and quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples. Mass Spectrometry Reviews. 24 (3), 367-412 (2005).
  8. Titz, B., et al. Multi-omics systems toxicology study of mouse lung assessing the effects of aerosols from two heat-not-burn tobacco products and cigarette smoke. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 1056-1073 (2020).
  9. Hartung, T., et al. Systems toxicology: Real world applications and opportunities. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 870-882 (2017).
  10. Talikka, M., et al. Systems Toxicology. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. Lyubimov, A., et al. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2016).
  11. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  12. Papan, C., et al. Systematic screening for novel lipids by shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 86 (5), 2703-2710 (2014).
  13. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600 (2012).
  14. Strittmatter, N., et al. Shotgun lipidomic profiling of the NCI60 cell line panel using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (15), 7507-7514 (2016).
  15. Lydic, T. A., et al. Rapid and comprehensive 'shotgun' lipidome profiling of colorectal cancer cell derived exosomes. Methods. 87, 83-95 (2015).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Grzybek, M., et al. Comprehensive and quantitative analysis of white and brown adipose tissue by shotgun lipidomics. Molecular Metabolism. 22, 12-20 (2019).
  18. Stegemann, C., et al. Comparative lipidomics profiling of human atherosclerotic plaques. Circulation: Cardiovascular Genetics. 4 (3), 232-242 (2011).
  19. Tajima, Y., et al. Lipidomic analysis of brain tissues and plasma in a mouse model expressing mutated human amyloid precursor protein/tau for Alzheimer's disease. Lipids in Health and Disease. 12, 68 (2013).
  20. Gross, R. W., Han, X. Shotgun lipidomics of neutral lipids as an enabling technology for elucidation of lipid-related diseases. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (2), 297-303 (2009).
  21. Surma, M. A., et al. An automated shotgun lipidomics platform for high throughput, comprehensive, and quantitative analysis of blood plasma intact lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (10), 1540-1549 (2015).
  22. Heiskanen, L. A., Suoniemi, M., Ta, H. X., Tarasov, K., Ekroos, K. Long-term performance and stability of molecular shotgun lipidomic analysis of human plasma samples. Analytical Chemistry. 85 (18), 8757-8763 (2013).
  23. Zhang, S., Van Pelt, C. K. Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry for protein characterization. Expert Review of Proteomics. 1 (4), 449-468 (2004).
  24. Surma, M. A., et al. Mouse lipidomics reveals inherent flexibility of a mammalian lipidome. Scientific Reports. 11 (1), 19364 (2021).
  25. Herzog, R., Schwudke, D., Shevchenko, A. LipidXplorer: Software for quantitative shotgun lipidomics compatible with multiple mass spectrometry platforms. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11-30 (2013).
  26. R: A language and environment for statistical computing. R: Foundation for Statistical Computing. , Available from: https://www.R-project.org/ (2018).
  27. Phillips, B., et al. A 7-month cigarette smoke inhalation study in C57BL/6 mice demonstrates reduced lung inflammation and emphysema following smoking cessation or aerosol exposure from a prototypic modified risk tobacco product. Food and Chemical Toxicology. 80, 328-345 (2015).
  28. Phillips, B., et al. A six-month systems toxicology inhalation/cessation study in ApoE(-/-) mice to investigate cardiovascular and respiratory exposure effects of modified risk tobacco products, CHTP 1.2 and THS 2.2, compared with conventional cigarettes. Food and Chemical Toxicology. 126, 113-141 (2019).
  29. Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C. Electrospray ionization tandem mass spectrometry of glycerophosphoethanolamine plasmalogen phospholipids. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1499-1508 (2004).
  30. Engelmann, B. Plasmalogens: Targets for oxidants and major lipophilic antioxidants. Biochemical Society Transactions. 32, 147-150 (2004).
  31. Nagan, N., Zoeller, R. A. Plasmalogens: Biosynthesis and functions. Progress in Lipid Research. 40 (3), 199-229 (2001).
  32. Southam, A. D., Weber, R. J., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nature Protocols. 12 (2), 310-328 (2016).
  33. Yang, K., Han, X. Accurate quantification of lipid species by electrospray ionization mass spectrometry - Meet a key challenge in lipidomics. Metabolites. 1 (1), 21-40 (2011).
  34. Zullig, T., Trotzmuller, M., Kofeler, H. C. Lipidomics from sample preparation to data analysis: a primer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2191-2209 (2020).
  35. Koivusalo, M., Haimi, P., Heikinheimo, L., Kostiainen, R., Somerharju, P. Quantitative determination of phospholipid compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response. Journal of Lipid Research. 42 (4), 663-672 (2001).
  36. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  37. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  38. Lofgren, L., Forsberg, G. B., Stahlman, M. The BUME method: A new rapid and simple chloroform-free method for total lipid extraction of animal tissue. Scientific Reports. 6, 27688 (2016).
  39. Lofgren, L., et al. The BUME method: A novel automated chloroform-free 96-well total lipid extraction method for blood plasma. Journal of Lipid Research. 53 (8), 1690-1700 (2012).
  40. Jung, H. R., et al. High throughput quantitative molecular lipidomics. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 925-934 (2011).
  41. Lavrynenko, O., et al. Ceramide ratios are affected by cigarette smoke but not heat-not-burn or e-vapor aerosols across four independent mouse studies. Life Sciences. 263, 118753 (2020).
  42. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  43. Schuhmann, K., et al. Quantitative fragmentation model for bottom-up shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 91 (18), 12085-12093 (2019).
  44. Lipidomics Standards Initiative Consortium. Lipidomics needs more standardization. Nature Metabolism. 1 (8), 745-747 (2019).
  45. Husen, P., et al. Analysis of lipid experiments (ALEX): A software framework for analysis of high-resolution shotgun lipidomics data. PloS One. 8 (11), 79736 (2013).
  46. Ni, Z., Angelidou, G., Lange, M., Hoffmann, R., Fedorova, M. LipidHunter identifies phospholipids by high-throughput processing of LC-MS and shotgun lipidomics datasets. Analytical Chemistry. 89 (17), 8800-8807 (2017).
  47. Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C., Kosmider, B., Mason, R. J. Lipidomic characterization and localization of phospholipids in the human lung. Journal of Lipid Research. 58 (5), 926-933 (2017).
  48. Ghosh, M., Tucker, D. E., Burchett, S. A., Leslie, C. C. Properties of the Group IV phospholipase A2 family. Progress in Lipid Research. 45 (6), 487-510 (2006).
  49. Besnard, V., et al. Deletion of Scap in alveolar type II cells influences lung lipid homeostasis and identifies a compensatory role for pulmonary lipofibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 284 (6), 4018-4030 (2009).
  50. Plantier, L., et al. Activation of sterol-response element-binding proteins (SREBP) in alveolar type II cells enhances lipogenesis causing pulmonary lipotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10099-10114 (2012).
  51. Kyle, J. E., et al. Cell type-resolved human lung lipidome reveals cellular cooperation in lung function. Scientific Reports. 8 (1), 13455 (2018).
  52. Lugg, S. T., Scott, A., Parekh, D., Naidu, B., Thickett, D. R. Cigarette smoke exposure and alveolar macrophages: mechanisms for lung disease. Thorax. 77 (1), 94-101 (2022).

Tags

Biokemi nr. 189
Shotgun lipidomics af gnavervæv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavrynenko, O., Dijon, S., Titz, B., … More

Lavrynenko, O., Dijon, S., Titz, B., Ivanov, N. V. Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues. J. Vis. Exp. (189), e63726, doi:10.3791/63726 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter