Summary
Shotgun massaspectrometrie-gebaseerde lipidomics levert een gevoelige kwantitatieve momentopname van een breed spectrum van lipidenklassen tegelijkertijd in een enkele meting van verschillende knaagdierweefsels.
Abstract
Lipiden spelen een vitale rol als essentiële componenten van alle prokaryote en eukaryote cellen. Constante technologische verbeteringen in massaspectrometrie hebben lipidomics tot een krachtig analytisch hulpmiddel gemaakt voor het monitoren van weefsellipidoomsamenstellingen in zowel homeostatische als ziektetoestanden. Dit artikel presenteert een stap-voor-stap protocol voor een shotgun lipidenanalysemethode die de gelijktijdige detectie en kwantificering van een paar honderd moleculaire lipidesoorten in verschillende weefsel- en biofluïde monsters bij hoge doorvoer ondersteunt. Deze methode maakt gebruik van geautomatiseerde nano-flow directe injectie van een totaal lipide-extract met gelabelde interne standaarden zonder chromatografische scheiding in een hoge-resolutie massaspectrometrie-instrument. Uitgaande van submicrogramhoeveelheden knaagdierweefsel duurt de MS-analyse 10 minuten per monster en bestrijkt tot 400 lipiden uit 14 lipidenklassen in longweefsel van muizen. De hier gepresenteerde methode is zeer geschikt voor het bestuderen van ziektemechanismen en het identificeren en kwantificeren van biomarkers die wijzen op vroege toxiciteit of gunstige effecten in knaagdierweefsels.
Introduction
Sigarettenrook (CS) wordt erkend als een belangrijke risicofactor geassocieerd met de ontwikkeling van chronische ontstekingsziekten van de longen, waaronder longcarcinoom, bronchitis en chronische obstructieve longziekte (COPD)1. Naast de longimpact speelt CS-blootstelling een belangrijke rol bij de ontwikkeling van andere ziekten zoals atherosclerotische coronaire hartziekte en perifere vaatziekten1. Hart- en vaatziekten zijn, samen met COPD, respectievelijk de eerste en derde belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd. Toxicologische risicobeoordelingsbenaderingen zijn van oudsher gebaseerd op het gebruik van diermodellen zoals knaagdieren. In vivo neus-only of full-body rat- en muismodellen worden vaak gebruikt voor het bestuderen van de langetermijneffecten van blootstelling aan CS.
Over het algemeen induceert 6 maanden blootstelling aan rook bijvoorbeeld histologische en functionele afwijkingen in muizenlongen die lijken op die van menselijke ziekten, waaronder emfyseem, luchtwegremodellering en pulmonale hypertensie, hoewel de veranderingen relatief mild zijn in vergelijking met die waargenomen bij langdurige menselijke rokers2. In zowel dierlijke als menselijke weefsels hebben studies een breed scala aan moleculaire veranderingen waargenomen als reactie op blootstelling aan CS, waaronder oxidatieve stressreacties, ontstekingen en structurele weefselveranderingen 3,4. Het is niet verrassend dat cs-blootstelling ook een verreikende impact heeft op het longlipidoom, inclusief effecten op oppervlakteactieve lipiden, lipidensignaleringsmediatoren en structurele lipiden 4,5,6.
Om de bulk lipideveranderingen geïnduceerd door de langdurige CS-blootstelling van muizenlongen te karakteriseren, voerden we een snelle en kwantitatieve shotgun directe infusie massaspectrometrie-analyse uit. Na de introductie van de shotgun lipidomics-methode in 20057, is deze methode effectief gebruikt om onze kennis over lipide cellulair metabolisme 8,9,10 uit te breiden in modelsystemen zoals gist11, Caenorhabditis elegans12 en Drosophila melanogaster13, evenals in een breed scala van zoogdiermonstertypen zoals cellijnen 14, 15,16 verschillende menselijke17,18 en knaagdierweefsels19,20 en lichaamsvloeistoffen21,22.
In de afgelopen decennia hebben studies de complexiteit van cellulaire reacties op veranderingen in de omgeving onthuld, waarbij duizenden onderling verbonden eiwitten, lipiden en metabolieten betrokken zijn. Dit heeft duidelijk gemaakt dat het gebruik van state-of-the-art analytische technieken essentieel is voor het verkrijgen van een diepgaand beeld van de moleculaire machines en voor het blootleggen van de volledige omvang van exogene fysiologische effecten. In deze context kunnen de uitgebreide, kwantitatieve lipide-vingerafdrukken geproduceerd door shotgun-lipidomics-benaderingen effectief bijdragen aan onze kennis over lipide cellulair metabolisme 8,9,10.
Met betrekking tot blootstelling aan CS als een risicofactor voor verschillende ziekten, zijn toxicologische risicobeoordelingsbenaderingen van oudsher gebaseerd op het gebruik van diermodellen zoals knaagdieren. Shotgun lipidomics MS biedt een snel, gevoelig en kwantitatief analytisch hulpmiddel voor het beoordelen van lipidoomverstoring in tal van monstertypen. Het unieke kenmerk van shotgun lipidomics is de geautomatiseerde directe injectie-analyse van een totaal lipide-extract - spiked met gelabelde interne normen - zonder chromatografische scheiding in een MS-instrument met hoge resolutie door gebruik te maken van een geleidende nanochip die een elektrospray-ionisatie (ESI) nanospray23 genereert.
De massa-tot-ladingsverhoudingsinformatie die tegelijkertijd wordt verkregen in de MS1-modus biedt de totale lipidenvoetafdruk van alle intacte endogene lipiden. Optioneel biedt de MS2/MS3-modus, waarin de bovenliggende lipidemoleculen worden gefragmenteerd en geanalyseerd, aanvullende structurele informatie. Data-analyse vereist gespecialiseerde software en omvat de deconvolutie van spectra en piektoewijzingen in gepoolde spectra die leiden tot lipide-identificatie en vermeende chemische structuuropheldering. Bovendien kan absolute kwantificering worden uitgevoerd door een gelabeld intern standaardmengsel te spiking dat ten minste één lipidenstandaard per lipideklasse van belang bevat. Over het algemeen kan ms-analyse die enkele minuten per monster duurt, met de huidige techniek de identificatie en kwantificering van maximaal 800 lipiden uit 14 lipidenklassen24 in knaagdierweefsels omvatten.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dieren werden uitgevoerd in een faciliteit die is geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International en is gelicentieerd door de Agri-Food & Veterinary Authority of Singapore, met goedkeuring van een institutioneel comité voor dierverzorging en -gebruik en in overeenstemming met de richtlijnen van het National Advisory Committee for Laboratory Animal Research on the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (NACLAR, 2004).
1. Monsterverzameling
- Voer longdissecties bij muizen uit na 3 maanden en 6 maanden blootstelling aan ApoE-/- muizen. Verzamel de weefsels 16-24 uur na blootstelling, vries ze in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij −80 °C voordat u de lipidomics-workflow start. Zorg voor het verzamelen van in totaal negen monsters van elke "omics" dissectiegroep.
2. Weefsel - verpulvering van de monsters
- Bereid de magnetische hamer en verbruiksartikelen voor op het slijpen van weefsel. Voorkoelde weefselzakjes, tangen, afgedekte weefseltransferbuizen met doppen, een "V" plastic spatel en 2 ml plastic opvangbuizen op droogijs. Installeer de bijbehorende buishouder op een magnetisch hamerinstrument. Schakel de magnetische hamer in en stel het slagvermogen in op Hoog.
- Laad het monster in een zakje; Steek het monster indien nodig door de bovenste opening van het zakje met een voorgekoelde tang. Plaats het monster in het midden van het flexibele zakje, uit de buurt van de randen.
- Sluit het tissuezakje af door een voorgekoelde opvangbuis op de bovenkant van het tissuezakje te schroeven.
- Vries het monster vast door het flexibele zakje gedurende 10 s onder te dompelen in vloeibare stikstof.
- Ontlucht de opvangbuis; Maak de buis los voor een 1/4 draai voor het ontluchten om te voorkomen dat het zakje scheurt wanneer de magnetische hamer botst.
- Laad het bevroren zakdoekje op de magnetische hamer.
- Breng de magnetische hamer aan door op de activeringsknop te drukken om het monster te verpulveren. Als niet-verpulverde weefselstukken in het zakje achterblijven, vries het monster dan opnieuw in vloeibare stikstof en herhaal het voor een tweede impact.
- Verwijder het tissuezakje uit de magnetische hamer en houd het verpulverde monster aan de onderkant. Om te voorkomen dat het monster smelt, klikt u het onmiddellijk opnieuw in.
- Breng het monster over in een opvangbuis. Keer de buis snel om zodat het weefselzakje zich aan de bovenkant bevindt en tik op het zakje om de weefseldeeltjes naar de bodem van de verzamelbuis over te brengen.
OPMERKING: Deze stap moet snel worden uitgevoerd om het smelten van het weefsel te voorkomen. - Breng een weefselaliquot van 10 mg over in een buis van 2 ml voor verdere lipidomische analyse en bewaar het monster bij −80 °C totdat verdere stappen zijn uitgevoerd.
3. Weefselhomogenisatie
- Schakel het weefsellyserinstrument in en stel de schudfrequentie in op 30 Hz en de schudduur op 2 min. Bereid de weefselhomogenisatiebufferoplossing: 150 mM ammoniumbicarbonaat in water, met een pH van ~8,2.
- Haal de monsters uit de vriezer, leg ze op ijs en voeg vier roestvrijstalen kralen toe aan de buizen met het weefselpoeder. Voeg 0,5 ml 150 mM ammoniumbicarbonaatbuffer toe aan elk monster.
- Plaats de monsterbuizen in de weefsellyserhouders. Compenseer beide houders met hetzelfde aantal buizen. Bevestig de houders in de weefsellyser-houdarm. Verstoor het weefsel.
- Plaats de buisjes op ijs en controleer visueel of er geen overgebleven weefselaggregaten in de buis aanwezig zijn. Als weefselverstoring onvolledig is (aggregaten worden gezien), herhaal dan het verstoringsproces door een andere behandelingscyclus uit te voeren. Leg de monsters op ijs.
- Maak een aliquot 1 van 100 μL van het monster in een buis van 1,5 ml speciaal voor eiwitbepaling. Centrifugeer het bij 18.200 × g gedurende 5 minuten bij 10 °C.
- Bepaal het eiwitgehalte van aliquot 1 door de Bradford-test (zie rubriek 4). Bewaar de monsters op ijs.
- Maak een aliquot 2 van 20-100 μL van het stamhomogenaat in een nieuwe microbuis van 2 ml voor lipide-extractie (zie rubriek 5). Als monsters niet onmiddellijk worden geanalyseerd, bewaar ze dan op ijs totdat de extractie is uitgevoerd.
OPMERKING: Het uiteindelijke extractievolume moet worden gedefinieerd op basis van de totale hoeveelheid eiwit. Het moet in het bereik liggen van 0,015-0,045 mg eiwit per totaal aliquot.
4. Bradford eiwitbepalingstest
OPMERKING: Studiemonsters moeten vóór het begin van de analyse worden gerandomiseerd en de randomisatie wordt gerespecteerd voor alle stappen van de monsterverwerking.
- Verdun gecentrifugeerd aliquot 1 supernatant 2x met ammoniumbicarbonaat buffer.
OPMERKING: De verdunningsfactor is afhankelijk van de concentratie van het weefselhomogenaat. Voor meer geconcentreerde oplossingen past u een hogere factor toe, zodat de bepaalde concentratie binnen het dynamische bereik van de test valt. - Bereid een runderserumalbumine (BSA) standaardcurve volgens tabel 1. Vortex de standaard buizen. Centrifugeer de buizen op 18.200 × g gedurende 15 s bij kamertemperatuur.
- Breng van de eerder voorbereide standaardbuizen 6 μL elk van de blanco en standaarden over naar een 96-well vlakbodemplaat volgens de plaatindeling in figuur 1.
- Breng de eerder bereide monsters over op de 96-puts vlakbodemplaat volgens de in figuur 1 beschreven plaatindeling.
- Voeg 250 μL van het Bradford-reagens toe aan elke put met behulp van een meerkanaalspipet en meng. Incubeer gedurende 5 min.
- Meet de absorptie bij een golflengte van 595 nm met behulp van een plaatlezer.
- Bereken de eiwitconcentraties in de aliquots op basis van de standaardcurve.
OPMERKING: Bij de berekening van de eiwitconcentraties moet rekening worden gehouden met de verdunningsfactor die aan het begin van de procedure wordt gebruikt.
5. BUME extractie
OPMERKING: Vermijd het gebruik van plastic buizen met een lage binding voor lipidomica-extractie, omdat de sterke organische oplosmiddelen weekmakers afgeven en een sterke achtergrond creëren tijdens monsteranalyse.
- Bereid buizen van 1,5 ml met 100 μL ammoniumbicarbonaatoplossing in elke buis van de totale blanco (TB), interne standaard blanco (ISB) en kwaliteitscontrolemonsters (QC), rekening houdend met 1 QC-monster dat tussen elke set van 10 monsters wordt geplaatst. Bewaar alle monsters op ijs.
- Voeg 10 μL gepoold menselijk plasma toe aan alle QC-monsters. Spike 10 μL interne standaardoplossing in alle ISB-, QC- en onderzoeksmonsters (d.w.z. alle monsters behalve TB).
OPMERKING: Gebruik voor kwaliteitscontrolemateriaal elk gepoold commercieel verkrijgbaar K2EDTA-plasma. Kwantificeer de lipidenconcentratie in gepoold plasma met behulp van het genoemde protocol bij ontvangst en bewaar deze bereiken als referenties voor alle analyses waarin het QC-materiaal wordt gebruikt. Gebruik NIST-plasma alleen voor meer gerichte toepassingen of voor wereldwijde methodeverificatie, waarbij de nauwkeurigheid van de test moet worden aangepakt. - Voeg 300 μL van −20 °C butanol/methanolmengsel (3/1, v/v) toe aan elk monster. Schud op 450 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op de thermomixer.
- Voeg 300 μL heptaan/ethylacetaatmengsel (3/1, v/v) toe. Schud op 450 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op de thermomixer.
- Voeg 300 μL 1% azijnzuurmengsel toe. Schud gedurende 5 minuten bij 450 × g bij kamertemperatuur op de thermomixer. Centrifugeer bij 2.800 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng 360 μL van de bovenste fase over naar een nieuwe 2 ml zelfslotbuis 2.
OPMERKING: Vloeistof-vloeistofextractie kan resulteren in het verschuiven van posities van de fasegrens op een monsterafhankelijke manier, wat kan resulteren in een kleine volumeafwijking voor de bovenste fase. Pas indien nodig het opvangvolume voor de bovenste fase aan. - Voeg 320 μL heptaan/ethylacetaat (3/1, v/v) toe aan de waterfasebuis 1. Schud op 450 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op de thermomixer. Centrifugeer bij 2.800 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng 320 μL van de bovenste fase over en combineer met de fractie uit stap 5.11.
OPMERKING: Pas indien nodig het opvangvolume voor de bovenste fase aan. - Voeg 250 μL heptaan/ethylacetaat (3/1, v/v) toe aan de waterfase in buis 1. Schud op 450 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op de thermomixer. Centrifugeer bij 2.800 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng 200 μL van de bovenste fase over en combineer met de fracties uit stap 5.11 en stap 5.15 in buis 2.
OPMERKING: Pas indien nodig het opvangvolume voor de bovenste fase aan. - Verdampen tot droogheid bij 35 °C in een vacuümconcentrator.
OPMERKING: Gedroogde monsters kunnen worden bewaard bij −20 °C tot de analyse, indien nodig. - Los opnieuw op in 300 μL MS-mengoplossing (7,5 mM ammoniumacetaat in isopropanol/methanol/chloroform, 4:2:1-oplossing). Draai elke buis gedurende 5 s om ervoor te zorgen dat alles is opgelost. Centrifugeer bij 18.200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Breng een aliquot van 50 μL over in de microliterplaat volgens de plaatindeling in figuur 2 voor positieve ionisatiemodusanalyse (kolommen 1-6) en verdun met 50 μL MS-mengoplossing.
- Breng een aliquot van 20 μL over in de MTP-plaat volgens de plaatindeling in figuur 2 voor analyse van de negatieve ionisatiemodus (kolommen 7-12) en verdun met 80 μL MS-mengsel. Wikkel de plaat met folie en houd deze vóór de analyse op 4 °C.
6. LS-analyse
- Kalibreer een massaspectrometer (MS) zowel in positieve als negatieve modus in overeenstemming met de instructies van de fabrikant 5 dagen of minder vóór de analyse.
- Installeer de nanobron voor directe infusie vooraf en zorg ervoor dat deze goed is uitgelijnd tegen het overdrachtscapillair van de MS. Installeer een 4,1 μm nozzle-chip in de chiphouder en configureer deze in de software.
- Gebruik de volgende parameters voor het instellen van de positieve en negatieve modusmethode: gasdruk van 1,25 psi; bronspanning van 1,1 kV; 5 μl injectievolume van het monster; uitgangscontactsluiting Rel1 gedurende 2,5 s; 5 min levertijd; plaatkoeling bij 4 °C.
- Stel de analysevolgordewachtrij voor de directe infuusrobot in positieve modus in.
- Stel de MS-methode in voor de positieve modus met behulp van de volgende MS-instellingen:
- Stel de capillaire temperatuur in op 250 °C en het RF-niveau van de S-lens op 65,0. Voer full-scan MS-acquisitie uit van 0 tot 1 minuut in het bereik van 550-1000 m/z met een resolutie van 140.000 met geautomatiseerde versterkingsregeling van 1 ×106 en een maximale injectietijd van 50 ms. Pas een slotmassa van 680,48022 toe.
- Stel de gegevensonafhankelijke MS/MS-acquisitiemethode in tussen het tijdsbereik van 1 en 5 minuten met een resolutie van 17.500 met een vaste eerste massa van 250 m/z. Gebruik een geautomatiseerde versterkingsregeling voor MS2 bij 1 × 105 en een maximale injectietijd van 64 ms, een botsingsenergie van 20 NCE en een isolatievenster van 1 m/z. Gebruik de inclusiemassalijst van 550 tot 1.000 m/z, met een massastap van 1 Da.
- Voor de acquisitie in negatieve modus stelt u de capillaire temperatuur in op 250 °C en het RF-niveau van de S-lens op 65,0 in het MS-tunebestand.
- Gebruik de volgende MS-methode-instellingen: volledige scanacquisitiemodus van 0 tot 1 min bij een resolutie van 140.000 voor het bereik van 400-940 m/z, geautomatiseerde versterkingsregeling van 1 × 106; maximale injectietijd van 50 ms; Gebruik een slotmassa van 529,46262.
- Stel MS2-acquisitie in DIA-modus in tussen 1 en 5 minuten van de run met een resolutie van 17.500 met een vaste eerste massa van 150 m / z; geautomatiseerde versterkingsregeling van 1 × 105; 64 ms maximale injectietijd; en 35NCE aan botsingsenergie. Gebruik de inclusiemassalijst van 400 tot 940 met een massastap van 1 Da.
- Maak de analysevolgordewachtrij in MS-software in de positieve modus. Wacht tot de monsteracquisitie wordt geactiveerd door een contactsluitingssignaal afkomstig van de directe infuusrobot voor elk monster.
- Wanneer de analyse van de positieve modus is voltooid, maakt u de sequentiewachtrij voor de directe infusierobot in de negatieve modus.
- Stel de analysevolgordewachtrij in MS-software in negatieve modus in.
7. Gegevensverwerking
- Als u de gegevensbestanden van de positieve en negatieve modi van .raw naar .mzML-indeling wilt converteren, gebruikt u de conversiesoftware.
OPMERKING: Gegevensbestanden uit positieve en negatieve modi moeten afzonderlijk worden geconverteerd (vanwege hun verschillende acquisitie-instellingen en verschillende ruisdrempel).- Vul de volgende instellingen in om bestandsconversie uit te voeren: ruisdrempelfactor is 3 en 5 voor respectievelijk MS en MS2; activeer de ruisverwijderingsfunctie voor zowel MS als MS2, gegevenscompressie, gemiddelde MS2-scans en piekselectie. Stel TIC-drempels in voor positieve en negatieve modi (bijv. 10.000 en 5.000; te definiëren op basis van het geluidsniveau van het specifieke monster dat door een specifiek instrument wordt geproduceerd). Genereer XLC- en PDF-rapporten aan het einde van de verwerking.
- Voer de lipidenidentificatie uit. Definieer de volgende (voorbeeld) parameters voor het importeren van bestanden: selectievenster ±0,5 Da (afhankelijk van het selectievenster in de MS-methode); tijdsbereik 2-300 s (afhankelijk van de scantijd in de MS-methode); geen kalibratiemassa's voor MS en MS2; overdracht en afronding van het massabereik van de Peak by Peak-softwaremetagegevensbestanden (min massa [MS]) en (min massa [MS2]); tolerantie van 3 ppm en 10 ppm voor respectievelijk MS en MS2; houd het MS- en MS2-drempelveld, frequentiefilter, MS1-offset en PMO leeg; Isotopische correctie voor MS en MS2 geselecteerd; overdrachtsresolutieverloop van het metagegevensbestand van de converter als (Resolutie lineaire fit [MS]) en as (Resolutie lineaire fit [MS2]).
OPMERKING: Lipide-identificatie in de positieve en negatieve modi moet afzonderlijk worden uitgevoerd vanwege hun verschillende acquisitie-instellingen. - Nadat de gegevens zijn geïmporteerd, gaat u naar het menu Uitvoeren en uploadt u de MFQL-bestanden voor lipidenidentificatie.
OPMERKING: Voor gedetailleerde informatie over de structuur van MFQL's, zie de publicatie van Herzog et al.25. Bekijk enkele voorbeelden van MFQL-bestanden op https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library en zie de discussie. Alle MFQL's die voor de gegevensverwerking worden gebruikt, worden verstrekt in de aanvullende materialen. - Kwantificeer de geïdentificeerde soorten op MS-niveau door de precursormassa-intensiteit van het lipidekenmerk te delen door de respectieve intensiteit van de gelabelde interne standaard en vervolgens het quotiënt te vermenigvuldigen met de concentratie van de gelabelde interne standaard. Normaliseer de uiteindelijke lipideconcentratie per hoeveelheid totaal eiwit gemeten door de Bradford-test.
8. QC-controleprocedure
OPMERKING: Een kwaliteitscontroleprocedure is een essentiële stap om de technische reproduceerbaarheid van de methode te verifiëren. Hiertoe wordt een commercieel gepoold plasma geanalyseerd om de endogene niveaus van verschillende lipiden gedurende 5 dagen te bepalen in 15 identieke aliquots per batch (totaal vijf batches). Merk op dat in dit geval een pijplijn voor gegevensevaluatie is gemaakt als een Shiny-webtoepassing met behulp van de statistische R-softwareomgeving.
- Definieer het referentieacceptatiebereik als de gemiddelde waarde die voor alle vijf de partijen is berekend ±3 standaardafwijkingen.
- Pas de "pass"-acceptatieregels toe voor elke analytische batch: 90% van de referentiedoelen moet slagen, aangezien één referentieverbinding één lipidenklasse vertegenwoordigt. Als er bijvoorbeeld 15 referentiedoelen zijn opgenomen in de QC-verificatie, moet u ervoor zorgen dat 13 doelen doorgaan voor de te accepteren batch.
OPMERKING: Met andere woorden, 68% van de QC-monsters per referentieverbinding moet doorgaan om de gegevens voor deze lipidenklasse te accepteren. - Als de onderzoeksbatch niet voldoet aan de acceptatiecriteria voor de QC-controle, herhaalt u de procedure.
9. Schatting van (relatieve) geconjugeerde vetzuurhoeveelheden
- Schat voor elke lipidenklasse de hoeveelheden geconjugeerde vetzuren op basis van hun MS2-intensiteiten.
OPMERKING: Vanwege fragmentatie- en ionisatieverschillen waren de afgeleide waarden alleen bedoeld voor relatieve abundantievergelijkingen tussen monstergroepen in plaats van bijvoorbeeld de relatieve bijdrage van een specifiek vetzuur aan de totale geconjugeerde vetzuurpool van een lipidenklasse te schatten. - Normaliseer de MS2-intensiteiten van de vetzuurfragmenten door de gemiddelde intensiteit van de vetzuurfragmenten van de overeenkomstige interne standaard. Op basis van de concentratie van de interne standaard en het gemeten weefselgewicht wordt een "genormaliseerde concentratie" voor de geconjugeerde vetzuren afgeleid. Som deze waarden per lipidenklasse op om de totale hoeveelheid van elk geconjugeerd vetzuur per monster te schatten.
10. Statistische analyse
- Voer statistische analyses uit. Pas een lineair model aan voor elke voorwaarde en de bijbehorende controlegroep en bereken p-waarden op basis van een t-statistiek voor log2-getransformeerde gegevens. Gebruik de Benjamini-Hochberg false discovery rate-methode om te corrigeren voor meerdere testeffecten.
OPMERKING: Lipiden met aangepaste p-waarden < 0,05 worden als differentieel overvloedig beschouwd. Hier werd statistische analyse uitgevoerd in de R-statistische omgeving26.
Representative Results
Hier, als representatieve resultaten, presenteren we gegevens die illustreren hoe shotgun lipidomics kunnen worden gebruikt om de effecten van CS op de longen van muizen te bestuderen. Het shotgun lipidenanalyseprotocol werd met succes toegepast voor een in vivo studie voor vergelijkende analyse van twee groepen monsters: longweefsels ontleed van negen vrouwelijke Apoe-/− muizen blootgesteld aan CS (3R4F-groep; positieve controle) en een gelijk aantal muizen onder frisse luchtomstandigheden (schijngroep) als negatieve controle verzameld na 3 maanden, 4 maanden en 6 maanden blootstellingstijdpunten. De dieren werden onder gefilterde en geconditioneerde verse lucht gehouden bij 22 °C ± 2 °C temperatuur en 55% ± 15% luchtvochtigheid en gevoed met een gamma-bestraald pelletdieet. Het lichtregime werd gehandhaafd op 12 uur per dag. Per kooi werden maximaal acht muizen gehuisvest. 3R4F-referentiesigaretten voor de blootstellingsbehandeling werden gekocht van de Universiteit van Kentucky om de 3R4F CS-aerosol (600 μg totale deeltjes TPM / L-aerosol) te genereren voor een doelblootstellingsconcentratie gelijk aan 28 μg nicotine / L.CS rook van 3R4F-sigaretten werd geproduceerd met behulp van 30-poorts roterende rookmachines volgens Phillips et al.27 . Op basis van het Health Canada Intensive Smoking Protocol werden 55 ml pufvolume, één trekje per 30 s en 100% blokkering van ventilatiegaten toegepast op 3R4F-sigaretten om voldoende blootstelling te bieden. Alle aanvullende details over de onderzoeksopzet zijn eerder gemeld27,28.
In totaal werden ~400 moleculaire lipidesoorten uit de 14 meest voorkomende lipidenklassen geïdentificeerd en gekwantificeerd (figuur 3). De totale genormaliseerde lipidenconcentratie per klasse was licht verhoogd voor de PE-, PEO-, PC-, PCO-, PI- en PG-lipidenklassen en er werd enige downregulatie waargenomen voor SM-, LPE- en PA-lipiden (figuur 3A), terwijl er geen verschil te zien was voor TAGs en PS. Interessant is dat verhoogde niveaus van PCO- en PEO-plasmalogenlipiden in de CS-groep zijn gemeld in ontstekingscellen29 . Een van de intracellulaire functies van plasmalogen lipiden is antioxiderende activiteit. Onder blootstelling aan reactieve zuurstof (ROS) en stikstofsoorten (RNS) werd selectieve oxidatie van plasmalogenen in vergelijking met diacylfosfolipiden gemeld30. De enyl-etherbinding in de chemische structuur van plasmalogenen is gevoelig voor radicale aanvallen op oxidatieve stress31. De belangrijkste producten van radicale aanval zijn gehydroxyleerde eicosatetetraeenzuren, 2-monoacylglycerolfosfolipiden, pentadecanol, mierenzuren, α-hydroxyaldehyden van verschillende ketenlengtes, 1-formyl-2-arachidonoylglycerofosfolipide en lysofosfolipiden.
Deze resultaten tonen aan dat, onder de moleculaire kenmerken op basis van de totale molecuulformule, 100-120 verbindingen significant werden beïnvloed door CS-blootstelling (figuur 3D). De gedetailleerde deconvolutie van de MS2-fragmentatie-informatie en de normalisatie van de fragmentsignaalintensiteiten maakten het mogelijk om de totale hoeveelheid van elk geconjugeerd vetzuur (FA) in elke lipidenklasse (figuur 3E) te benaderen en deze gegevens te vergelijken tussen blootgestelde en controlegroepen. Een duidelijke afname van zowel volledig verzadigde VA's als die met slechts enkele onverzadigingen, meestal in de context van lyso-lipiden, werd waargenomen. Daarentegen waren meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA) in de samenstelling van PC-, PE- en PG-fosfolipidenklassen verhoogd in de CS-groep voor alle tijdspunten. De extreme gevallen van PC en PG geconjugeerd met eicosapentaanzuur (EPA) en docosahexaeenzuur (DHA) werden uitsluitend gedetecteerd in de 3R4F CS-blootstellingsgroep (figuur 3E, rode kleur).
Figuur 1: Plaatindeling voor monsterverdeling in de Bradford-test. Blanco- en standaardmonsters worden in drievoud geplaatst in kolommen 1-3; Onbekende monsters worden in tweevoud geplaatst in kolommen 4-11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Plaatindeling van de 96-well microtiterplaat voor shotgun massaspectrometrie analyse. De verdeling van blanco, standaard, onbekende en QC-monsters voor acquisitie in de positieve ionisatiemodus wordt aan de linkerkant van de plaat in kaart gebracht (kolommen 1-6); Alle monsters voor de negatieve ionisatiemodus worden rechts geplaatst (kolommen 7-12). Afkortingen: pos = positief; QC = kwaliteitscontrole; neg = negatief; TB = totaal blanco. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Shotgun lipidomics analyse van muizenlongen blootgesteld aan sigarettenrook. Apoe-/− -muizen werden blootgesteld aan CS van de 3R4F-referentiesigaret of frisse lucht (schijn). (A) Concentraties van de lipidenklasse en het aantal lipidensoorten per klasse. Voor elke klasse staat het aantal gekwantificeerde lipidensoorten tussen haakjes. Gemiddelde en 95% betrouwbaarheidsintervallen voor elke lipidenklasse, afzonderlijk voor elk blootstellingstype (geaggregeerd over drie tijdspunten). (B) Vulkaanplots met de effectgrootte (log2-voudige verandering) en significantie (-log10 FDR-gecorrigeerde p-waarde) van de gekwantificeerde lipidesoorten voor de 3R4F CS versus schijnvergelijking op de drie tijdstippen. Significant verhoogde lipiden zijn geel gemarkeerd; significant verlaagde lipiden zijn gemarkeerd in cyaan (FDR-gecorrigeerde p-waarde < 0,05). (C) Differentiële abundantie van de 25 lipidesoorten met de grootste absolute gemiddelde vouwveranderingen. Log2-vouwveranderingen voor de 3R4F CS versus schijnvergelijking zijn kleurgecodeerd en statistische significantie wordt aangegeven: *: FDR-gecorrigeerde p-waarde < 0,01; X: Voor FDR gecorrigeerde p-waarde < 0,05. (D) Vergelijkingspunten. Correlatiecoëfficiënten voor de vouwveranderingsvergelijkingen zijn kleurgecodeerd en het aantal gedeelde differentieel overvloedige lipiden wordt aangegeven (totale aantallen in de marges). Cirkeldiagrammen tonen het percentage gedeelde differentieel overvloedige lipiden met dezelfde richting van verandering (FC-teken). Asterisk duidt op een significante overlapping van de differentieel overvloedige lipiden. (E) Differentiële abundantie van geconjugeerde VA's per lipidenklasse. Heatmap zoals in paneel C voor geconjugeerde vetzuren met significante abundantieverschillen tussen 3R4F en schijnblootstelling in alle drie de tijdspunten (FDR-gecorrigeerde p-waarde < 0,05). De hoeveelheid van elk vetzuur per lipidenklasse werd geschat op basis van de MS2-intensiteiten van de vetzuurfragmenten. Afkortingen: CS = sigarettenrook; FDR = false discovery rate; FC = vouwwissel; FA = vetzuren; PC = fosfatidylcholine; PS = fosfatidylserine; TAG = triacylglycerol; SM = sfingomyeline; PEO = plasmalogen fosfatidylethanolamine; PE = fosfatidylethanolamine; PG = fosfatidylglycerol; PI = fosfatidylinositol; DAG = diacylglycerol; SE = sterol/cholesterylesters; PCO = plasmalogenfosfatidylcholine; LPC = lysofosfatidylcholine; LPE = lysofosfatidylethanolamine; PA = fosfatidisch zuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| BSA-eindconcentratie (mg/ml) | BSA-oplossing bij 2 mg/ml (μL) | Ammoniumbicarbonaatbuffer (μL) |
| 1 | 50 | 50 |
| 0.75 | 37.5 | 62.5 |
| 0.5 | 25 | 75 |
| 0.25 | 12.5 | 87.5 |
| 0.125 | 12.5 | 187.5 |
| 0.0625 | 50 van 0,125 mg/ml oplossing | 50 |
| 0 | 0 | 100 |
Tabel 1: Verdunningsschema van de interne BSA-standaard voor de kalibratiecurve voor de Bradford-test. Afkorting: BSA = runderserumalbumine.
Aanvullende informatie: MFQL-bestanden die worden gebruikt voor lipidXplorer-lipidenidentificatie. Het .zip pakket bestaat uit de afzonderlijke vereiste MFQL-bestanden, elk met de naam volgens dit patroon:
Discussion
Hoewel de vooruitgang in MS een verscheidenheid aan methoden heeft opgeleverd om veel lipidesoorten nauwkeurig te volgen, vertoonde de eerdere lipidenprofilering van verschillende zoogdierweefsels geen consistente resultaten en bijgevolg blijven de specifieke weefselspecifieke functies van lipiden onduidelijk. In vergelijking met eiwitfunctionele analyse, waarvoor robuustere benaderingen beschikbaar zijn om de expressie van bepaalde verbindingen uit te schakelen, kan de meerderheid van de lipiden niet selectief worden uitgeschakeld of overexpressie in weefsels, waardoor de functionele evaluatie van lipiden moeilijk wordt. Geavanceerde profilering van weefsellipidoomconcentraties kan een alternatieve benadering bieden om associaties tussen circulerende lipiden en menselijke ziekten te identificeren.
Bij het evalueren van uitgebreide lipidomics-methoden die in staat zijn om kwalitatief en kwantitatief het endogene lipidenprofiel van elk muisweefsel te dekken, gaven we de voorkeur aan de shotgun lipidomics-methode. Over het algemeen zijn twee tegenovergestelde soorten monsteranalyse mogelijk: ofwel een volledig ongerichte screening van lipiden met behulp van vloeistofchromatografie (LC) -gebaseerde scheiding met verdere massaspectrometrische detectie om de totale lipidecomplexiteit van het monster te onthullen, of gerichte benaderingen, die meestal een zeer nauwkeurige kwantificering van specifieke lipiden van belang mogelijk maken. Het sterke kenmerk van de gepresenteerde shotgun lipidomics-workflow is daarentegen de snelle uitgebreide dekking van honderden endogene lipiden uit vooraf gedefinieerde lipidenklassen, die nog steeds op een robuuste semi-kwantitatieve manier kunnen worden uitgevoerd.
De ionisatie-efficiëntie van verschillende lipideklassen is structuurafhankelijk en kan drastisch variëren, afhankelijk van de verschillende experimentele ionisatieomstandigheden. In tegenstelling tot op LC gebaseerde scheidingsmethoden, minimaliseert shotgun-analyse deze verschillen als gevolg van de directe gelijktijdige infusie van het hele lipide-extract onder dezelfde ionisatieomstandigheden in het MS-instrument. Het gebruik van isotopisch gelabelde lipide-analogen of structureel vergelijkbare niet-endogene standaarden maakt semi-kwantificering van alle lipideklassen mogelijk. Shotgun lipidomics biedt lage inter- en intra-run variabiliteit tijdens MS-analyse; Als gevolg hiervan produceert deze methode lagere variatiecoëfficiënten21 dan op ongerichte vloeistofchromatografie gebaseerde methoden, die meerdere normen vereisen voor adequate kwantificering. Belangrijk is dat, hoewel er geen externe kalibratiecurve wordt gebruikt in de huidige methode, de methode nog steeds als volledig kwantitatiefwordt beschouwd 32.
Eén niveau van gelabelde interne standaard (of niet-gelabelde standaard die niet endogeen tot expressie wordt gebracht) per lipidenklasse is voldoende voor de kwantificering van de meeste lipiden. Slechts enkele publicaties hebben melding gemaakt van een gedeeltelijke methodevalidatie voor een shotgun lipidomics-methode. In Gryzbek et al.17 en Surma et al.21 werden bijvoorbeeld omgekeerde kalibratiecurven opgesteld met behulp van interne standaarden en een vaste hoeveelheid monstermatrix. Lineariteit werd beoordeeld door de lineaire regressie van log-getransformeerde lipidehoeveelheden en hun intensiteiten en gerapporteerd als respectievelijk R2 en helling. De detectiegrens (LOD) en kwantificeringsgrens (LOQ) werden bepaald door gewogen lineaire regressie op basis van een signaal-ruisverhouding van 3 voor LOD en 10 voor LOQ. Voor de meeste lipidenklassen werd LOQ gedefinieerd tussen 2-9,8 pmol voor vetweefsel en 0,05-5μM in plasma. In beide gevallen werden niet-endogene enkelvoudige interne standaarden per klasse gebruikt om schattingen af te leiden voor alle lipiden in de klasse. In dit werk bieden we echter geen LD / LOQ vanwege verschillende zorgen: de endogene matrix is niet vrij van verbindingen en de surrogaatmatrix voor weefsels is niet beschikbaar - hiermee is de piek van kleine bekende hoeveelheden normen niet mogelijk. We voeren geen klassieke gerichte kwantificeringsbenadering uit met behulp van een kalibratiecurvereeks van een bepaalde verbinding genormaliseerd door zijn identieke isotopisch gelabelde standaard vanwege het ontbreken van zuivere normen en de zeer beperkte beschikbaarheid van isotopisch gelabelde lipiden. Orbitrap-detectoren voeren automatisch de conversie van het transiënte signaal uit door een Fouriertransformatie toe te passen, en een deel van het signaal is al vervangen - als gevolg hiervan zal het lagere concentratiebereik alleen lineair zijn tot een minimaal signaal, waaronder het molecuul niet meer detecteerbaar zal zijn. De signaal-ruiswaarden van Xcalibur-software zijn afhankelijk van de m/z-verhouding van het molecuul; Als gevolg hiervan zullen de verbindingen van elke lipidenklasse, die verschillende combinaties van vetzuren bevatten, verschillende ruiswaarden hebben. Bovendien zijn de LOQ/LOQ-waarden strikt gekoppeld aan het type matrix, en wanneer de kwantificering van het lipidoom in verschillende knaagdierweefsels wordt uitgevoerd, moet dit worden weerspiegeld in de beoordeling van LOQ's voor elk weefseltype afzonderlijk.
In feite biedt de methode een hoog lineair dynamisch kwantificeringsbereik van maximaal vier ordes van grootte33 en een zeer goede gevoeligheid om de belangrijkste endogene structurele lipiden te dekken, die verder kunnen worden verhoogd door technische verbeteringen in MS-acquisitie32. De variatiecoëfficiënten van de gemiddelde lipideconcentraties waren meestal lager dan 15%, wat betekent dat lipidomics van shotguns voldoen aan de vereisten van de Food and Drug Administration (FDA) als een methode die in aanmerking moet komen voor goede laboratoriumpraktijken (GLP) en goede klinische praktijken (GCLP)34.
Er moet echter worden opgemerkt dat, vanwege hun verschillende polariteit, sommige lipideklassen veel meer worden beïnvloed door de bijdrage van specifieke geconjugeerde VA's. Dit leidt tot de vervorming van de intensiteitsrespons in equimolaire mengsels die een breed scala aan geconjugeerde VA's bevatten, wat resulteert in kwantificeringsbias, zoals benadrukt door Koivusalo et al.35 voor fosfolipideklassen. Van belang is dat deze auteurs gegevens presenteerden voor een breed scala aan VA's, van 24-48 ketenlengte, wat waarschijnlijk niet de situatie in een echt biologisch monster weerspiegelt. De respons voor meervoudig onverzadigde soorten was 40% hoger dan voor volledig verzadigde soorten, maar dit effect werd alleen waargenomen voor hogere concentraties. Wanneer het mengsel geleidelijk werd verdund, nam het effect van onverzadiging geleidelijk af en verdween vrijwel bij 0,1 pmol/μl per soort. Bovendien werden alle metingen gedaan aan ionenvanger- en triples quadrupoles-instrumenten en niet aan Q-Exactive-apparatuur.
Een ander voordeel van de gepresenteerde workflow is de technische flexibiliteit, die aanpassing aan specifieke projectvereisten mogelijk maakt. Elk lipide-extractieprotocol - zoals de gemodificeerde Bligh en Dyer 36, methyltert-butylether37 of butanol-methanol38-methoden - kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor het bereiden van een totaal lipide-extract vóór MS-analyse. De belangrijkste beperking van chloroform-methanolextractie is dat de onderste fase de lipidefractie bevat, wat routinewerk en vooral automatisering bemoeilijkt; Bovendien moet rekening worden gehouden met de toxiciteit van chloroform. Tert-butyletherextractie wordt veel gebruikt voor lipidenanalyse van plasmamonsters37 en er is een geautomatiseerde versie voorgesteld21. In dit geval kozen we voor de BUME-methode omdat deze nog betere terugwinningen biedt voor de spiked PG-, PI-, PA- en PS-lipidenklassen38, een lager oplosmiddelverbruik en de mogelijkheid van automatisering39, terwijl de totale concentraties gekwantificeerd voor weefselmonsters geëxtraheerd door alle drie de methoden vergelijkbaar waren. Bovendien, terwijl de monsterextractie handmatig werd uitgevoerd in het huidige werk, is het ook mogelijk om reproduceerbare en nauwkeurige resultaten te verkrijgen uit grote monstersets door geautomatiseerde monstervoorbereiding en lipide-extractie in een 96-well-formaat40,41. Dit maakt het mogelijk om lipidomics-analyse te implementeren in grootschalige klinische en toxicologische studies.
In het huidige werk hebben we de MS-acquisitie van positieve en negatieve modi afzonderlijk uitgevoerd zonder polariteitsschakeling zoals beschreven door Schuhmann et al.42. De stabiliteit van het nanomaatsignaal is beter in negatieve modus voor een iets minder geconcentreerde oplossing dan in positieve modus. Daarnaast hebben we een volledig traceerbare procedure ontwikkeld met convertersoftware van .raw bestanden naar mzML, die de waarden biedt die moeten worden opgegeven in de LipidXplorer-software - hiermee zijn handmatige resolutiehellingsberekeningen niet vereist. We hebben ook verschillende vervangingen voor ruisinstellingen toegepast omdat in de positieve modus de ruisniveaus van de spectra hoger zijn dan in de negatieve modus. Alle stappen zijn geoptimaliseerd voor traceerbare, high-throughput routineanalyses.
Voor identificatie kan shotgun lipidomics-analyse het unieke gedrag van verschillende lipidenklassen benutten, die unieke adducten vormen in verschillende polariteitsmodi. Bij deze methode kunnen PC- en PE-soorten met dezelfde moleculaire massa die elkaar overlappen in de positieve ionisatiemodus volledig worden gescheiden in de negatieve ionisatiemodus, omdat PC acetaat- of formate-adducten vormt en PE wordt geïoniseerd in een gedeprotoneerde vorm. Bovendien is (gedeeltelijke) structurele deconvolutie mogelijk voor de methode waarbij niet alleen de molecuulformule wordt gebruikt, maar ook de bulkvetzuurstructuur. Fa-identificatie op het niveau van totale koolstof en totale onverzadiging werkt bijvoorbeeld voor alle fosfolipiden, DAGs, TAGs en lyso-fosfolipiden. De bottom-up kwantificering van elke isomere vorm kan gedeeltelijk worden uitgevoerd voor sommige van de fosfolipideklassen43 , maar is veel complexer voor DAGs en TAGs vanwege de ongelijke signaalrespons van verschillende VA's in de MS2-spectra.
Het is ook belangrijk om de noodzaak te benadrukken om passende kwaliteitscontroleprocedures in te voeren, volledig afgestemd op recente initiatieven op dit gebied44. Omdat we willen zorgen voor een goede traceerbaarheid en reproduceerbaarheid van gegevens tussen en binnen het laboratorium, zijn een aantal stappen genomen, zoals een goede randomisatie van de monsters voor alle stappen van de analyse, het werken met door de leverancier gecertificeerde standaardmengsels, het opnemen van kwaliteitscontrolemonsters, procedures om batchacceptatie of -afwijzing te verifiëren en het creëren van een interne database om de QC-prestaties op de lange termijn te volgen. Ook consistent met deze initiatieven is de behoefte aan een gestandaardiseerde methode om de stabiliteit van de steekproef aan te pakken. Over het algemeen wordt de meerderheid van de structurele lipiden niet beïnvloed door lipideoxidatie, wat relevanter is voor oxilipines, geoxideerde lipiden en meervoudig onverzadigde vetzuren die daarom veel gevoeliger zijn voor opslag- en behandelingsomstandigheden. De juiste beoordeling van de stabiliteit van de monsters is echter nog steeds een technisch uitdagende taak.
Dit protocol heeft echter een beperking als het gaat om het bepalen van submoleculaire niveaus van verbindingen. Aangezien er geen scheiding is van het totale extract, worden alle isovormen van lipiden met dezelfde molecuulmassa maar verschillende vetzuursamenstellingen samengevoegd in de MS-analyse. Voor de meeste klassen is het mogelijk om gedeeltelijke deconvolutie van de structuur te bereiken door gebruik te maken van de fragmentatieverhoudingen van resterende vetzuurfragmenten in MS2. De onafhankelijke kwantificering van elke isovorm blijft echter een bijzonder uitdagende taak vanwege de grote verschillen in het fragmentatiegedrag van verschillende isovormen en het feit dat zuivere chemische normen niet in voldoende grote verscheidenheid beschikbaar zijn om de compensatiewaarden te definiëren. Een andere beperking is dat het ESI-proces onvermijdelijk artefacten genereert, wat resulteert in de kunstmatige generatie van pieken voor sommige lipiden zoals DAGs, Pas en VAs, wat kan leiden tot onjuiste kwantificering.
Vervolgens vatten we de meest kritieke delen van het protocol samen op basis van onze ervaring. De eerste houdt verband met het feit dat elk type muisweefsel een uniek lipidenprofiel heeft in termen van zowel de lipidehoeveelheid als de klasseverhoudingen. Hiermee moeten de beginhoeveelheden van het weefsel op basis van het totale eiwitgehalte vóór de extractie zorgvuldig worden bepaald om het MS-signaal niet te verzadigen en het dynamische kwantificeringsbereik niet te verlaten als gevolg van lipideaggregatie bij hoge concentraties33 of - aan het andere uiterste - om voldoende MS-signaal te leveren om de belangrijkste lipideverbindingen voor elke lipidenklasse te dekken.
Het tweede kritieke aspect is het zorgen voor een goede afstemming van de positie van de directe infusie nano-bron chipuitlaat met het transfercapillair van de massaspectrometer. Aangezien de volledige kalibratie van de massaspectrometer in beide modi wekelijks wordt uitgevoerd, kan het wisselen tussen de kalibratiebron en de opstelling van de nanobronchip de reden zijn voor dramatische variabiliteit in signaalintensiteit als gevolg van een verkeerde uitlijning tijdens de installatie.
Een ander cruciaal onderdeel van het protocol is de zorgvuldige omgang met de interne standaardmix. Omdat dit mengsel een aanzienlijke hoeveelheid dichloormethaan bevat, moet het, eenmaal geopend, snel worden geconsumeerd om lange opslag en meerdere toepassingen te voorkomen die leiden tot verdamping en kunstmatige concentratieverandering. Bovendien is een consistente hantering van het standaardmengsel na verwijdering uit opslag bij −20 °C belangrijk, omdat temperatuurverschillen kunnen leiden tot volume-inconsistenties tijdens het pipetteren met luchtkussenpipetten. Een optie zou zijn om dichloormethaan in de standaard resuspensiebuffer te vervangen door zuivere methanol, wat het hanteringsgemak zou kunnen verbeteren, maar de oplosbaarheid van sommige lipideklassen negatief zou kunnen beïnvloeden en dus de kwantificeringsnauwkeurigheid voor deze lipidenklassen zou kunnen verminderen.
Het laatste kritieke onderdeel is gegevensverwerking. De gegevensverwerkingsworkflow combineert de Peak by Peak-softwareconversie van .raw naar .mzML-indeling, waarbij MS2-scanmiddeling en MS1- en MS2-ruisfiltratie worden toegepast, evenals piekpicking en gegevenscompressie. Als alternatief kan de Proteowizard-software ook worden gebruikt voor gegevensconversie, maar in dit geval moeten verschillende instellingen in LipidXplorer handmatig worden gedefinieerd. Alle complexiteit van shotgun lipidomics is vooral geconcentreerd op de stap van deconvolutie van directe injectie MS1 en MS2 spectra. De open-source LipidXplorer-software importeert de geconverteerde spectra uit het mzML-bestandsformaat op basis van massanauwkeurigheid, massaresolutie en de helling van de verandering met toenemende m / z. De software voegt meerdere individuele MS- en MS / MS-spectra samen die zijn verkregen binnen een analyserun. Daarna worden individuele pieken binnen verschillende steekproefruns uitgelijnd en in elk cluster van uitgelijnde pieken vervangt het hun massa's door hun naar intensiteit gewogen gemiddelde massa, terwijl hun abundanties in elk gegevensbestand onaangeroerd blijven. Representatieve massa's van uitgelijnde piekclusters en individuele piekintensiteiten worden opgeslagen in een masterscandatabase. De masterscandatabase bevat alle MS1- en MS2-spectra die zijn gegenereerd voor alle monsters in de batch en kan worden gedeconvoluteerd tot lipide-identificaties door query's die zijn geschreven in de moleculaire fragmentatiequerytaal (MFQL).
Over het algemeen omvat de methode de identificatie van DAG-, TAG- en SE-lipiden op basis van positieve modus en PC-, PE-, PS-, PI-, PA-, PG-, SM-, LPC- en LPE-lipiden op basis van negatieve modusacquisitie. Tijdens lipidenidentificatie wordt isotopische correctie uitgevoerd voor MS1 en MS2 en worden aangepaste intensiteiten gerapporteerd in het .xlsx uitvoerbestand. Als alternatief zijn er verschillende andere software beschikbaar om shotgun-gegevens te verwerken, zoals ALEX45 en LipidHunter46.
Vetzuren - belangrijke nucleaire en cellulaire membraancomponenten - worden opgeslagen in de vorm van fosfolipiden voor verdere omzetting in bioactieve moleculen. Ze kunnen worden omgezet door lysofosfolipide acyltransferase enzymen in lysofosfolipiden via de Lands pathway47. Van het LPCAT3-enzym is bijvoorbeeld bekend dat het een hoge specificiteit vertoont om AA op te nemen in lysofosfatidylcholine en lysofosfatidylserine-tussenproducten. De relatief hoge expressie van deze enzymen werd gemeld in ontstekingscellen, zoals alveolaire macrofagen en bronchiale epitheelcellen47, wat leidde tot de afgifte van grotere relatieve hoeveelheden AA-bevattende fosfolipiden in die cellen. Na hun bevrijding van membraanfosfolipiden door fosfolipase A2, wordt de omzetting van PUFA's in verschillende soorten lipidemediatoren echter gekatalyseerd door vele enzymen48. Verder kunnen deze PUFA's het substraat worden voor de productie van pro-inflammatoire en ontstekingsremmende prostaglandinen via de werking van cyclooxygenase (COX)-1 en COX-2 enzymen47. Fosfolipiden zijn een van de bronnen van lipidemediatoren die vrijkomen op bepaalde locaties waar deze mediatoren hun biologische effecten moeten aantonen.
De long is een complex orgaan dat bestaat uit meerdere celtypen, die elk overlappende en nicherollen spelen bij het vergemakkelijken van de normale longontwikkeling en -functie. Er zijn slechts enkele studies gedaan om verschillende celtypen in de muis of menselijke long te isoleren en te profileren (bijv. alveolaire type 2-cellen)49,50; Andere belangrijke longceltypen zijn niet gekarakteriseerd. Een andere interessante studie51 werd uitgevoerd om lipideanalyse van endotheel-, epitheel-, mesenchymale en gemengde immuuncellen in de muizenlong te isoleren en uit te voeren. Er werd waargenomen dat de concentratie van PUFA's opgenomen in PCO en PG werd verrijkt in de immuuncellen. Gezien het feit dat CS een toename van immuuncellen in de long induceert (4-5-voudig), zoals beoordeeld door bronchoalveolaire lavage (BAL)52, kunnen de totale lipideveranderingen die in deze studie zijn waargenomen, worden verklaard door een cumulatieve toename van immuuncelrekrutering in de muislong.
Kortom, de waargenomen vervorming van enkelvoudig onverzadigde vetzuren en PUFA's in fosfolipiden kan de overmaat aan bepaalde VA's in de cel weerspiegelen en / of een intracellulaire bron van oxilipineprecursoren vormen die worden overgeproduceerd onder oxidatieve stress en ontstekingsomstandigheden. Aanvullende gegevens over vrije EPA, DHA en andere oxilipinen zijn echter essentieel om dit punt te verduidelijken en vallen buiten het toepassingsgebied van de huidige methodetoepassing.
Disclosures
Alle auteurs zijn medewerkers van Philip Morris International. Philip Morris International is de enige financieringsbron en sponsor van dit project.
Acknowledgments
De auteurs willen het onderzoeksteam bedanken en vooral de technische assistentie en ondersteuning van de bioonderzoeks- en aerosolteams van PMI R &D, Philip Morris International Research Laboratories Pte, erkennen. Ltd., Singapore, en PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Zwitserland. De auteurs bedanken Sam Ansari voor het beheer van de biobanking en erkennen de steun van Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy voor het bewerken van een concept van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 5, and 2 mL self-lock tubes | Eppendorf | 30120086, 30120094 | |
| 3 mm stainless still beads | Qiagen | 69997 | |
| 4.1 µm nozzle chip | Advion | HD-D-384 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 45754-100ML-F | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 14267-25G | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830-500G | |
| Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | 23209 | |
| Butanol | Honeywell | 33065-2.5L | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650498-1L | |
| Dichloromethane | Honeywell | 34856-1L | |
| Ethyl acetate | Honeywell | 33211 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma | M9686 | |
| Heptane | Sigma Aldrich | 34873-2.5L | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A456 | |
| Mouse pooled plasma | BioIvt | ||
| Mouse SPLASH standard | Avanti Polar Lipids | 330710X | Internal standard |
| Nunc 96-flat bottom well transparent plates | VWR | 62409-068 | |
| Plastic spatula | Sigma | Z560049-300EA | |
| Quick Start Bradford 1x Dye reagent | BioRad | 5000205 | |
| Serum diluent | Sigma Aldrich | D5197 | |
| Equipment/software | |||
| CryoPrep CP02 impactor instrument | Covaris | Magnetic hammer | |
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | . | Centrifuge |
| ChipSoft 8.3 | Advion Biosciences | . | Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot |
| LipidXplorer 1.2.8.1 | N/A | . | Software to identify lipids |
| Peak By Peak | SpectroSwiss | . | Software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| ProteoWizard | ProteoWizard | . | Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| Q-Exactive MS | Thermo Fisher | . | High resolution orbitrap mass spectrometer |
| Qiagen Tissue Lyser II | Qiagen | . | Tissue lyser |
| SpeedVac SPD140DDA | Thermo Fisher | . | Vacuum concentrator |
| Tecan Infinite M nano plus | Tecan | . | Plate reader |
| ThermoMixer C | Eppendorf | . | Thermomixer |
| TriVersa Nanomate | Advion Biosciences | . | Direct infusion nano-source |
| Xcalibur 4.3 | Thermo Scientific | . | Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS |
References
- Salehi, N., Janjani, P., Tadbiri, H., Rozbahani, M., Jalilian, M. Effect of cigarette smoking on coronary arteries and pattern and severity of coronary artery disease: A review. Journal of International Medical Research. 49 (12), 3000605211059893 (2021).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: Are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 45 (6), 1111-1115 (2011).
- Lee, G., Walser, T. C., Dubinett, S. M. Chronic inflammation, chronic obstructive pulmonary disease, and lung cancer. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 15 (4), 303-307 (2009).
- Titz, B., et al. Effects of cigarette smoke, cessation, and switching to two heat-not-burn tobacco products on lung lipid metabolism in C57BL/6 and Apoe-/- mice-An integrative systems toxicology analysis. Toxicological Sciences. 149 (2), 441-457 (2016).
- Morissette, M. C., Shen, P., Thayaparan, D., Stampfli, M. R. Disruption of pulmonary lipid homeostasis drives cigarette smoke-induced lung inflammation in mice. European Respiratory Journal. 46 (5), 1451-1460 (2015).
- Jubinville, E., et al. Interplay between cigarette smoking and pulmonary reverse lipid transport. European Respiratory Journal. 50 (3), 1700681 (2017).
- Han, X., Gross, R. W. Shotgun lipidomics: Electrospray ionization mass spectrometric analysis and quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples. Mass Spectrometry Reviews. 24 (3), 367-412 (2005).
- Titz, B., et al. Multi-omics systems toxicology study of mouse lung assessing the effects of aerosols from two heat-not-burn tobacco products and cigarette smoke. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 1056-1073 (2020).
- Hartung, T., et al. Systems toxicology: Real world applications and opportunities. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 870-882 (2017).
- Talikka, M., et al. Systems Toxicology. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. Lyubimov, A., et al. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2016).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Papan, C., et al. Systematic screening for novel lipids by shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 86 (5), 2703-2710 (2014).
- Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600 (2012).
- Strittmatter, N., et al. Shotgun lipidomic profiling of the NCI60 cell line panel using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (15), 7507-7514 (2016).
- Lydic, T. A., et al. Rapid and comprehensive 'shotgun' lipidome profiling of colorectal cancer cell derived exosomes. Methods. 87, 83-95 (2015).
- Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
- Grzybek, M., et al. Comprehensive and quantitative analysis of white and brown adipose tissue by shotgun lipidomics. Molecular Metabolism. 22, 12-20 (2019).
- Stegemann, C., et al. Comparative lipidomics profiling of human atherosclerotic plaques. Circulation: Cardiovascular Genetics. 4 (3), 232-242 (2011).
- Tajima, Y., et al. Lipidomic analysis of brain tissues and plasma in a mouse model expressing mutated human amyloid precursor protein/tau for Alzheimer's disease. Lipids in Health and Disease. 12, 68 (2013).
- Gross, R. W., Han, X. Shotgun lipidomics of neutral lipids as an enabling technology for elucidation of lipid-related diseases. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (2), 297-303 (2009).
- Surma, M. A., et al. An automated shotgun lipidomics platform for high throughput, comprehensive, and quantitative analysis of blood plasma intact lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (10), 1540-1549 (2015).
- Heiskanen, L. A., Suoniemi, M., Ta, H. X., Tarasov, K., Ekroos, K. Long-term performance and stability of molecular shotgun lipidomic analysis of human plasma samples. Analytical Chemistry. 85 (18), 8757-8763 (2013).
- Zhang, S., Van Pelt, C. K. Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry for protein characterization. Expert Review of Proteomics. 1 (4), 449-468 (2004).
- Surma, M. A., et al. Mouse lipidomics reveals inherent flexibility of a mammalian lipidome. Scientific Reports. 11 (1), 19364 (2021).
- Herzog, R., Schwudke, D., Shevchenko, A. LipidXplorer: Software for quantitative shotgun lipidomics compatible with multiple mass spectrometry platforms. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11-30 (2013).
- R: A language and environment for statistical computing. R: Foundation for Statistical Computing. , Available from: https://www.R-project.org/ (2018).
- Phillips, B., et al. A 7-month cigarette smoke inhalation study in C57BL/6 mice demonstrates reduced lung inflammation and emphysema following smoking cessation or aerosol exposure from a prototypic modified risk tobacco product. Food and Chemical Toxicology. 80, 328-345 (2015).
- Phillips, B., et al. A six-month systems toxicology inhalation/cessation study in ApoE(-/-) mice to investigate cardiovascular and respiratory exposure effects of modified risk tobacco products, CHTP 1.2 and THS 2.2, compared with conventional cigarettes. Food and Chemical Toxicology. 126, 113-141 (2019).
- Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C. Electrospray ionization tandem mass spectrometry of glycerophosphoethanolamine plasmalogen phospholipids. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1499-1508 (2004).
- Engelmann, B. Plasmalogens: Targets for oxidants and major lipophilic antioxidants. Biochemical Society Transactions. 32, 147-150 (2004).
- Nagan, N., Zoeller, R. A.
- Southam, A. D., Weber, R. J., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nature Protocols. 12 (2), 310-328 (2016).
- Yang, K., Han, X. Accurate quantification of lipid species by electrospray ionization mass spectrometry - Meet a key challenge in lipidomics. Metabolites. 1 (1), 21-40 (2011).
- Zullig, T., Trotzmuller, M., Kofeler, H. C. Lipidomics from sample preparation to data analysis: a primer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2191-2209 (2020).
- Koivusalo, M., Haimi, P., Heikinheimo, L., Kostiainen, R., Somerharju, P. Quantitative determination of phospholipid compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response. Journal of Lipid Research. 42 (4), 663-672 (2001).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
- Lofgren, L., Forsberg, G. B., Stahlman, M. The BUME method: A new rapid and simple chloroform-free method for total lipid extraction of animal tissue. Scientific Reports. 6, 27688 (2016).
- Lofgren, L., et al. The BUME method: A novel automated chloroform-free 96-well total lipid extraction method for blood plasma. Journal of Lipid Research. 53 (8), 1690-1700 (2012).
- Jung, H. R., et al. High throughput quantitative molecular lipidomics. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 925-934 (2011).
- Lavrynenko, O., et al. Ceramide ratios are affected by cigarette smoke but not heat-not-burn or e-vapor aerosols across four independent mouse studies. Life Sciences. 263, 118753 (2020).
- Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
- Schuhmann, K., et al. Quantitative fragmentation model for bottom-up shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 91 (18), 12085-12093 (2019).
- Lipidomics Standards Initiative Consortium.
- Husen, P., et al. Analysis of lipid experiments (ALEX): A software framework for analysis of high-resolution shotgun lipidomics data. PloS One. 8 (11), 79736 (2013).
- Ni, Z., Angelidou, G., Lange, M., Hoffmann, R., Fedorova, M. LipidHunter identifies phospholipids by high-throughput processing of LC-MS and shotgun lipidomics datasets. Analytical Chemistry. 89 (17), 8800-8807 (2017).
- Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C., Kosmider, B., Mason, R. J. Lipidomic characterization and localization of phospholipids in the human lung. Journal of Lipid Research. 58 (5), 926-933 (2017).
- Ghosh, M., Tucker, D. E., Burchett, S. A., Leslie, C. C. Properties of the Group IV phospholipase A2 family. Progress in Lipid Research. 45 (6), 487-510 (2006).
- Besnard, V., et al. Deletion of Scap in alveolar type II cells influences lung lipid homeostasis and identifies a compensatory role for pulmonary lipofibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 284 (6), 4018-4030 (2009).
- Plantier, L., et al. Activation of sterol-response element-binding proteins (SREBP) in alveolar type II cells enhances lipogenesis causing pulmonary lipotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10099-10114 (2012).
- Kyle, J. E., et al. Cell type-resolved human lung lipidome reveals cellular cooperation in lung function. Scientific Reports. 8 (1), 13455 (2018).
- Lugg, S. T., Scott, A., Parekh, D., Naidu, B., Thickett, D. R. Cigarette smoke exposure and alveolar macrophages: mechanisms for lung disease. Thorax. 77 (1), 94-101 (2022).
