Summary
La lipidomique basée sur la spectrométrie de masse Shotgun fournit un instantané quantitatif sensible d’un large spectre de classes de lipides simultanément dans une seule mesure à partir de divers tissus de rongeurs.
Abstract
Les lipides jouent un rôle essentiel en tant que composants essentiels de toutes les cellules procaryotes et eucaryotes. Les améliorations technologiques constantes en spectrométrie de masse ont fait de la lipidomique un outil analytique puissant pour surveiller les compositions des lipidomes tissulaires dans les états homéostatiques et pathologiques. Cet article présente un protocole étape par étape pour une méthode d’analyse lipidique au fusil de chasse qui prend en charge la détection et la quantification simultanées de quelques centaines d’espèces lipidiques moléculaires dans différents échantillons de tissus et de biofluides à haut débit. Cette méthode tire parti de l’injection directe automatisée en nanoflux d’un extrait lipidique total enrichi d’étalons internes marqués sans séparation chromatographique dans un instrument de spectrométrie de masse à haute résolution. À partir de quantités inférieures au microgramme de tissu de rongeur, l’analyse de la SEP prend 10 minutes par échantillon et couvre jusqu’à 400 lipides de 14 classes de lipides dans le tissu pulmonaire de souris. La méthode présentée ici est bien adaptée pour étudier les mécanismes de la maladie et identifier et quantifier les biomarqueurs qui indiquent une toxicité précoce ou des effets bénéfiques dans les tissus des rongeurs.
Introduction
La fumée de cigarette (CS) est reconnue comme l’un des principaux facteurs de risque associés au développement de maladies inflammatoires chroniques des poumons, notamment le carcinome pulmonaire, la bronchite et la bronchopneumopathie chronique obstructive (MPOC)1. Au-delà de l’impact pulmonaire, l’exposition au CS joue un rôle important dans le développement d’autres maladies telles que la coronaropathie athéroscléreuse et la maladie vasculaire périphérique1. Les maladies cardiovasculaires, ainsi que la BPCO, sont respectivement la première et la troisième cause de décès dans le monde. Les approches d’évaluation des risques toxicologiques ont toujours reposé sur l’utilisation de modèles animaux tels que les rongeurs. Des modèles in vivo de rats et de souris nez seulement ou du corps entier sont couramment utilisés pour étudier les effets à long terme de l’exposition au CS.
Par exemple, généralement, 6 mois d’exposition à la fumée induisent des anomalies histologiques et fonctionnelles dans les poumons murins qui imitent celles des maladies humaines, y compris l’emphysème, le remodelage des voies respiratoires et l’hypertension pulmonaire, bien que les changements soient relativement légers par rapport à ceux observés chez les fumeurs humains à long terme2. Dans les tissus animaux et humains, des études ont observé un large éventail de changements moléculaires en réponse à l’exposition au CS, y compris les réponses au stress oxydatif, l’inflammation et les changements tissulaires structurels 3,4. Comme on pouvait s’y attendre, l’exposition au CS aurait également un impact considérable sur le lipidome pulmonaire, y compris des effets sur les lipides tensioactifs, les médiateurs de signalisation lipidique et les lipides structurels 4,5,6.
Pour caractériser les changements lipidiques globaux induits par l’exposition à long terme au CS des poumons de souris, nous avons effectué une analyse rapide et quantitative par spectrométrie de masse par perfusion directe. Après l’introduction de la méthode lipidomique au fusil de chasse en 20057, cette méthode a été utilisée efficacement pour étendre nos connaissances sur le métabolisme cellulaire lipidique 8,9,10 dans des systèmes modèles tels que la levure 11, Caenorhabditis elegans12 et Drosophila melanogaster13, ainsi que dans un large éventail de types d’échantillons de mammifères tels que les lignées cellulaires 14, 15,16 divers tissus humains17,18 et rongeurs19,20 et fluides corporels21,22.
Au cours des dernières décennies, des études ont révélé la complexité des réponses cellulaires aux changements environnementaux, impliquant des milliers de protéines, de lipides et de métabolites interconnectés. Cela a clairement montré que l’utilisation de techniques analytiques de pointe est essentielle pour obtenir une vue approfondie des machines moléculaires et pour découvrir toute l’ampleur des impacts physiologiques exogènes. Dans ce contexte, les empreintes lipidiques quantitatives complètes produites par les approches lipidomiques peuvent efficacement ajouter à nos connaissances sur le métabolisme cellulaire lipidique 8,9,10.
En ce qui concerne l’exposition au CS comme facteur de risque pour plusieurs maladies, les approches d’évaluation des risques toxicologiques ont toujours reposé sur l’utilisation de modèles animaux tels que les rongeurs. Shotgun lipidomics MS fournit un outil analytique rapide, sensible et quantitatif pour évaluer la perturbation des lipidomes dans de nombreux types d’échantillons. La caractéristique unique de la lipidomique de fusil de chasse est l’analyse automatisée par injection directe d’un extrait lipidique total - enrichi d’étalons internes marqués - sans séparation chromatographique dans un instrument MS à haute résolution à l’aide d’une nanopuce conductrice générant une nanopulvérisation d’ionisation par électropulvérisation (ESI)23.
L’information sur le rapport masse/charge qui est acquise simultanément dans le mode MS1 fournit l’empreinte lipidique totale de tous les lipides endogènes intacts. En option, le mode MS2/MS3, dans lequel les molécules lipidiques mères sont fragmentées et analysées, fournit des informations structurelles supplémentaires. L’analyse des données nécessite un logiciel spécialisé et comprend la déconvolution des spectres et les assignations de pics dans des spectres regroupés qui conduisent à l’identification des lipides et à l’élucidation putative de la structure chimique. De plus, la quantification absolue peut être effectuée en augmentant un mélange d’étalons internes étiquetés contenant au moins un étalon lipidique par classe de lipides d’intérêt. Dans l’ensemble, avec la technique actuelle, l’analyse de la SEP prenant quelques minutes par échantillon peut couvrir l’identification et la quantification de jusqu’à 800 lipides de 14 classes lipidiques24 dans les tissus de rongeurs.
Protocol
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées dans un établissement accrédité par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International et agréé par l’Agri-Food & Veterinary Authority of Singapore, avec l’approbation d’un comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux et conformément aux lignes directrices du National Advisory Committee for Laboratory Animal Research Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (NACLAR, 2004).
1. Prélèvement d’échantillons
- Effectuer des dissections pulmonaires de souris après 3 mois et 6 mois d’exposition de souris ApoE−/− . Prélever les tissus 16 à 24 heures après l’exposition, les congeler dans de l’azote liquide et les conserver à −80 °C avant de lancer le flux de travail lipidomique. Assurer le prélèvement d’un total de neuf échantillons de chaque groupe de dissection « omiques ».
2. Tissu - pulvérisation des échantillons
- Préparez le marteau magnétique et les consommables pour le broyage des tissus. Pochettes de mouchoirs prérefroidissables, pinces, tubes de transfert de tissus coiffés avec bouchons, spatule en plastique en « V » et tubes de collecte en plastique de 2 ml sur glace sèche. Installez le porte-tube correspondant sur un instrument à marteau magnétique. Allumez le marteau magnétique et réglez la puissance d’impact sur High.
- Charger l’échantillon dans une poche de tissu; Insérez l’échantillon par l’ouverture supérieure de la poche de tissu à l’aide d’une pince prérefroidie si nécessaire. Placer l’échantillon au centre de la pochette flexible, loin des bords.
- Scellez la poche en tissu en vissant un tube de collecte prérefroidi sur le dessus de la poche de tissu.
- Congeler l’échantillon en immergeant le sachet souple dans de l’azote liquide pendant 10 s.
- Évacuer le tube de collecte; Desserrez le tube pendant un 1/4 de tour pour la ventilation afin d’éviter de rompre la poche lorsque le marteau magnétique frappe.
- Chargez la poche de tissu congelé sur le marteau magnétique.
- Appliquez le marteau magnétique en appuyant sur le bouton d’activation pour pulvériser l’échantillon. S’il reste des morceaux de tissu non pulvérisés dans la poche, congeler à nouveau l’échantillon dans de l’azote liquide et répéter l’opération pour un deuxième impact.
- Retirez la poche de tissu du marteau magnétique en conservant l’échantillon pulvérisé au fond. Pour éviter que l’échantillon ne fonde, congelez-le à nouveau immédiatement.
- Transférer l’échantillon dans un tube de prélèvement. Inversez rapidement le tube de sorte que la poche de tissu soit en haut et tapotez la poche pour transférer les particules de tissu dans le bas du tube de collecte.
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée rapidement pour éviter la fonte du tissu. - Transférer une partie aliquote tissulaire de 10 mg dans un tube de 2 mL pour une analyse lipidomique plus approfondie et conserver l’échantillon à -80 °C jusqu’à ce que d’autres étapes soient effectuées.
3. Homogénéisation tissulaire
- Allumez l’instrument de lyser tissulaire et réglez la fréquence de secousse à 30 Hz et la durée de secouage à 2 min. Préparer la solution tampon d’homogénéisation tissulaire : 150 mM de bicarbonate d’ammonium dans de l’eau, avec un pH de ~8,2.
- Sortez les échantillons du congélateur de stockage, placez-les sur de la glace et ajoutez quatre perles en acier inoxydable dans les tubes contenant la poudre de tissu. Ajouter 0,5 mL de tampon de bicarbonate d’ammonium de 150 mM à chaque échantillon.
- Placez les tubes d’échantillon dans les porte-lyser tissulaire. Contrebalancez les deux supports avec le même nombre de tubes. Fixez les supports dans le bras de maintien du lyser tissu. Perturber le tissu.
- Placez les tubes sur de la glace et vérifiez visuellement qu’aucun agrégat de tissu restant n’est présent dans le tube. Si la perturbation tissulaire est incomplète (des agrégats sont observés), répétez le processus de perturbation en effectuant un autre cycle de traitement. Placez les échantillons sur de la glace.
- Créer une partie aliquote 1 de 100 μL de l’échantillon dans un tube de 1,5 mL dédié à la détermination des protéines. Centrifuger à 18 200 × g pendant 5 min à 10 °C.
- Déterminer la teneur en protéines de l’aliquote 1 par le test de Bradford (voir rubrique 4). Conservez les échantillons sur de la glace.
- Créer une partie aliquote 2 de 20-100 μL de l’homogénat mère dans un nouveau microtube de 2 mL pour l’extraction des lipides (voir rubrique 5). Si les échantillons ne sont pas analysés immédiatement, gardez-les sur la glace jusqu’à ce que l’extraction soit effectuée.
NOTE: Le volume d’extraction final doit être défini sur la base de la quantité totale de protéines. Elle doit être comprise entre 0,015 et 0,045 mg de protéines par aliquote totale.
4. Dosage de détermination des protéines de Bradford
REMARQUE : Les échantillons de l’étude doivent être randomisés avant le début de l’analyse, et la randomisation est respectée pour toutes les étapes du traitement des échantillons.
- Diluer l’aliquote 1 surnageant 2x avec un tampon de bicarbonate d’ammonium.
NOTE: Le facteur de dilution dépend de la concentration de l’homogénat tissulaire. Pour les solutions plus concentrées, appliquer un facteur plus élevé afin que la concentration déterminée se situe dans la plage dynamique de l’essai. - Préparer une courbe étalon d’albumine sérique bovine (BSA) conformément au tableau 1. Vortex les tubes standard. Centrifuger les tubes à 18 200 × g pendant 15 s à température ambiante.
- À partir des tubes étalons préalablement préparés, transférer 6 μL chacun des ébauches et des étalons sur une plaque à fond plat de 96 puits selon la disposition de la plaque illustrée à la figure 1.
- Transférer les échantillons préalablement préparés dans la plaque à fond plat à 96 puits selon la disposition des plaques décrite à la figure 1.
- Ajouter 250 μL du réactif Bradford à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal et mélanger. Incuber pendant 5 min.
- Mesurez l’absorbance à une longueur d’onde de 595 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.
- Calculer les concentrations de protéines dans les aliquotes en fonction de la courbe standard.
NOTA: Le facteur de dilution utilisé au début de la procédure doit être pris en compte lors du calcul des concentrations en protéines.
5. Extraction BUME
REMARQUE: Évitez l’utilisation de tubes en plastique à faible liaison pour l’extraction lipidomique, car les solvants organiques puissants libèrent des plastifiants et créent un fond fort lors de l’analyse des échantillons.
- Préparer des tubes de 1,5 mL avec 100 μL de solution de bicarbonate d’ammonium dans chaque tube des échantillons blancs totaux (TB), des blancs étalons internes (ISB) et des échantillons de contrôle de la qualité (CQ), en considérant que 1 échantillon de CQ est placé entre chaque ensemble de 10 échantillons. Conservez tous les échantillons sur la glace.
- Ajouter 10 μL de plasma humain mélangé à tous les échantillons de CQ. Augmenter de 10 μL de solution étalon interne dans tous les échantillons ISB, QC et à l’étude (c.-à-d. tous les échantillons sauf TB).
REMARQUE : Pour le matériel de contrôle de la qualité, utiliser tout plasma K2EDTA disponible dans le commerce. Quantifier la concentration de lipides dans le plasma combiné en utilisant le protocole mentionné dès réception et conserver ces plages comme références pour toutes les analyses dans lesquelles le matériau CQ est utilisé. Utilisez le plasma NIST uniquement pour des applications plus ciblées ou pour la vérification de méthodes globales, où la précision du test doit être abordée. - Ajouter 300 μL de mélange butanol/méthanol −20 °C (3/1, v/v) à chaque échantillon. Agiter à 450 × g pendant 10 min à température ambiante sur le thermomélangeur.
- Ajouter 300 μL de mélange heptane/acétate d’éthyle (3/1, v/v). Agiter à 450 × g pendant 10 min à température ambiante sur le thermomélangeur.
- Ajouter 300 μL de mélange d’acide acétique à 1%. Agiter pendant 5 min à 450 × g à température ambiante sur le thermomélangeur. Centrifuger à 2 800 × g pendant 5 min à température ambiante. Transférer 360 μL de la phase supérieure dans un nouveau tube autobloquant de 2 mL 2.
REMARQUE : L’extraction liquide-liquide peut entraîner un déplacement des positions de la limite de phase d’une manière dépendante de l’échantillon, ce qui peut entraîner un léger écart de volume pour la phase supérieure. Ajustez le volume de collecte pour la phase supérieure si nécessaire. - Ajouter 320 μL d’heptane/acétate d’éthyle (3/1, v/v) dans le tube en phase aqueuse 1. Agiter à 450 × g pendant 5 min à température ambiante sur le thermomélangeur. Centrifuger à 2 800 × g pendant 5 min à température ambiante. Transférer 320 μL de la phase supérieure et combiner avec la fraction de l’étape 5.11.
REMARQUE: Ajustez le volume de collecte pour la phase supérieure si nécessaire. - Ajouter 250 μL d’heptane/acétate d’éthyle (3/1, v/v) à la phase aqueuse dans le tube 1. Agiter à 450 × g pendant 5 min à température ambiante sur le thermomélangeur. Centrifuger à 2 800 × g pendant 5 min à température ambiante. Transférer 200 μL de la phase supérieure et combiner avec les fractions de l’étape 5.11 et de l’étape 5.15 dans le tube 2.
REMARQUE: Ajustez le volume de collecte pour la phase supérieure si nécessaire. - Évaporer à sec à 35 °C dans un concentrateur sous vide.
REMARQUE : Les échantillons séchés peuvent être conservés à −20 °C jusqu’à l’analyse, si nécessaire. - Dissoudre à nouveau dans 300 μL de solution de mélange MS (acétate d’ammonium 7,5 mM dans de l’isopropanol/méthanol/chloroforme, solution 4:2:1). Vortex chaque tube pendant 5 s pour s’assurer que tout est dissous. Centrifuger à 18 200 × g pendant 5 min à 4 °C.
- Transférer une partie aliquote de 50 μL dans la plaque de microlitre selon la disposition de la plaque de la figure 2 pour l’analyse en mode d’ionisation positive (colonnes 1 à 6) et diluer avec 50 μL de solution de mélange MS.
- Transférer une partie aliquote de 20 μL dans la plaque MTP selon la disposition de la plaque de la figure 2 pour l’analyse du mode d’ionisation négative (colonnes 7-12) et diluer avec 80 μL de mélange MS. Envelopper la plaque de papier d’aluminium et maintenir à 4 °C avant l’analyse.
6. Analyse de la SM
- Étalonner un spectromètre de masse (SM) en mode positif et négatif conformément aux instructions du fabricant 5 jours ou moins avant l’analyse.
- Installez la nanosource de perfusion directe dès le départ, en vous assurant qu’elle est correctement alignée contre le capillaire de transfert de la SM. Installez une puce de buse de 4,1 μm dans le support de puce et configurez-la dans le logiciel.
- Utilisez les paramètres suivants pour la configuration de la méthode en mode positif et négatif : pression de gaz de 1,25 psi ; tension de source de 1,1 kV; 5 μL de volume d’injection de l’échantillon; fermeture par contact de sortie Rel1 pendant 2,5 s; 5 min de délai de livraison; refroidissement des plaques à 4 °C.
- Configurez la file d’attente de séquence d’analyse pour le robot de perfusion directe en mode positif.
- Configurez la méthode MS pour le mode positif à l’aide des paramètres MS suivants :
- Réglez la température capillaire à 250 °C et le niveau RF de la lentille S à 65,0. Effectuez une acquisition MS à balayage complet de 0 à 1 min dans la plage 550-1000 m/z à une résolution de 140 000 avec contrôle de gain automatisé de 1 ×106 et temps d’injection maximal de 50 ms. Appliquer la masse de verrouillage de 680.48022.
- Définissez une méthode d’acquisition MS/MS indépendante des données entre 1 et 5 min à une résolution de 17 500 avec une première masse fixe de 250 m/z. Utilisez un contrôle de gain automatisé pour MS2 à 1 × 105 et un temps d’injection maximal de 64 ms, une énergie de collision de 20 NCE et une fenêtre d’isolement de 1 m/z. Utiliser la liste de masse d’inclusion de 550 à 1 000 m/z, avec un pas de masse de 1 Da.
- Pour l’acquisition en mode négatif, réglez la température capillaire à 250 °C et le niveau RF de l’objectif S à 65,0 dans le fichier de réglage MS.
- Utilisez les paramètres suivants de la méthode MS : mode d’acquisition de balayage complet de 0 à 1 min à une résolution de 140 000 couvrant la plage 400-940 m/z, contrôle de gain automatisé de 1 × 106 ; durée maximale d’injection de 50 ms; Utilisez une masse de serrure de 529.46262.
- Régler l’acquisition MS2 en mode DIA entre 1 et 5 min de course à une résolution de 17 500 avec une première masse fixe de 150 m/z ; contrôle automatisé du gain du 1er × 105; 64 ms de temps d’injection maximal; et 35NCE d’énergie de collision. Utilisez la liste de masse d’inclusion de 400 à 940 avec un pas de masse de 1 Da.
- Créez la file d’attente de séquence d’analyse dans le logiciel MS en mode positif . Attendez que l’acquisition de l’échantillon soit déclenchée par un signal de fermeture de contact provenant du robot de perfusion directe pour chaque échantillon.
- Lorsque l’analyse en mode positif est terminée, créez la file d’attente de séquence pour le robot à perfusion directe en mode négatif .
- Configurez la file d’attente de séquence d’analyse dans le logiciel MS en mode négatif .
7. Traitement des données
- Pour convertir les fichiers de données des modes positif et négatif du format .raw au format .mzML, utilisez le logiciel de conversion.
Remarque : Les fichiers de données des modes positif et négatif doivent être convertis séparément (en raison de leurs différents paramètres d’acquisition et seuil de bruit différent).- Renseignez les paramètres suivants pour effectuer la conversion de fichiers : le seuil de bruit est de 3 et 5 pour MS et MS2, respectivement ; activer la fonction de suppression du bruit pour MS et MS2, la compression de données, les analyses MS2 moyennes et la sélection des pics. Fixer des seuils TIC pour les modes positifs et négatifs (p. ex., 10 000 et 5 000; à définir en fonction du niveau de bruit de l’échantillon particulier produit par un instrument spécifique). Générez des rapports XLC et PDF à la fin du traitement.
- Effectuer l’identification des lipides. Définissez les paramètres d’importation de fichiers suivants (exemple) : fenêtre de sélection ±0,5 Da (dépend de la fenêtre de sélection dans la méthode MS) ; intervalle de temps 2-300 s (dépend du temps de balayage dans la méthode MS); pas de masses d’étalonnage pour MS et MS2; transférer et arrondir la plage de masse à partir des fichiers de métadonnées du logiciel Peak by Peak (masse min [MS]) et ( masse min [MS2]); tolérance de 3 ppm et 10 ppm pour la SEP et la MS2, respectivement; garder vides le champ de seuil MS et MS2 , le filtre de fréquence, le décalage MS1 et le PMO; Correction isotopique pour MS et MS2 sélectionnée; transférer le gradient de résolution du fichier de métadonnées du convertisseur en tant que (ajustement linéaire de résolution [MS]) et en tant que (ajustement linéaire de résolution [MS2]).
REMARQUE: L’identification des lipides dans les modes positif et négatif doit être effectuée séparément en raison de leurs différents paramètres d’acquisition. - Une fois les données importées, allez dans le menu Exécuter et téléchargez les fichiers MFQL pour l’identification des lipides.
NOTE : Pour des renseignements détaillés sur la structure des MFQL, veuillez consulter la publication de Herzog et coll.25. Voir quelques exemples de fichiers MFQL à https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library et voir la discussion. Tous les MFQL utilisés pour le traitement des données sont fournis dans les documents supplémentaires. - Quantifier les espèces identifiées au niveau de la SM en divisant l’intensité massique précurseur de la caractéristique lipidique par l’intensité respective de l’étalon interne marqué, puis en multipliant le quotient par la concentration de l’étalon interne marqué. Normaliser la concentration lipidique finale par quantité de protéines totales mesurée par le test de Bradford.
8. Procédure de vérification du CQ
NOTE: Une procédure de contrôle de la qualité est une étape essentielle pour vérifier la reproductibilité technique de la méthode. À cette fin, un plasma commercial groupé est analysé pour déterminer les niveaux endogènes de différents lipides sur 5 jours dans 15 aliquotes identiques par lot (total de cinq lots). Notez que, dans ce cas, un pipeline d’évaluation des données a été créé en tant qu’application Web Shiny à l’aide de l’environnement logiciel statistique R.
- Définir la plage d’acceptation de référence comme la valeur moyenne calculée pour les cinq lots ±3 écarts-types.
- Appliquer les règles d’acceptation « pass » pour chaque lot analytique : 90% des cibles de référence doivent passer, considérant qu’un composé de référence représente une classe lipidique. Par exemple, si 15 cibles de référence sont incluses dans la vérification du CQ, assurez-vous que 13 cibles réussissent pour que le lot soit accepté.
REMARQUE : En d’autres termes, 68 % des échantillons de CQ par composé de référence doivent réussir pour que les données pour cette classe de lipides soient acceptées. - Si le lot d’étude ne répond pas aux critères d’acceptation pour le contrôle de la qualité, répétez la procédure.
9. Estimation des quantités (relatives) d’acides gras conjugués
- Pour chaque classe de lipides, estimer les quantités d’acides gras conjugués en fonction de leur intensité MS2.
REMARQUE : En raison des différences de fragmentation et d’ionisation, les valeurs dérivées n’étaient destinées qu’aux comparaisons de l’abondance relative entre les groupes d’échantillons plutôt que, par exemple, à l’estimation de la contribution relative d’un acide gras spécifique au pool global d’acides gras conjugués d’une classe de lipides. - Normaliser les intensités MS2 des fragments d’acides gras par l’intensité moyenne des fragments d’acides gras de l’étalon interne correspondant. En fonction de la concentration de l’étalon interne et du poids tissulaire mesuré, calculer une « concentration normalisée » pour les acides gras conjugués. Additionnez ces valeurs par classe de lipides pour estimer la quantité totale de chaque acide gras conjugué par échantillon.
10. Analyse statistique
- Effectuer des analyses statistiques. Ajustez un modèle linéaire pour chaque condition et le groupe de contrôle correspondant, et calculez p valeurs à partir d’une statistique t pour les données transformées en log2. Utilisez la méthode du taux de fausse découverte de Benjamini-Hochberg pour corriger les effets de test multiples.
NOTE: Les lipides avec des valeurs p ajustées < 0,05 sont considérés comme différentiellement abondants. Ici, l’analyse statistique a été effectuée dans l’environnement statistique R26.
Representative Results
Ici, comme résultats représentatifs, nous présentons des données illustrant comment la lipidomique de fusil de chasse peut être utilisée pour étudier les effets du CS sur les poumons de souris. Le protocole d’analyse lipidique du fusil de chasse a été appliqué avec succès pour une étude in vivo pour l’analyse comparative de deux groupes d’échantillons: des tissus pulmonaires disséqués de neuf souris femelles Apoe−/− exposées au CS (groupe 3R4F; témoin positif) et un nombre égal de souris maintenues dans des conditions d’air frais (groupe simulé) en tant que témoin négatif collecté à 3 mois, Points de temps d’exposition de 4 mois et 6 mois. Les animaux ont été maintenus sous air frais filtré et conditionné à une température de 22 °C ± 2 °C et de 55 % ± 15 % d’humidité et nourris avec un régime de granulés irradiés aux rayons gamma. Le régime d’éclairage a été maintenu à 12 heures par jour. Jusqu’à huit souris ont été logées par cage. Les cigarettes de référence 3R4F pour le traitement de l’exposition ont été achetées de l’Université du Kentucky pour produire l’aérosol 3R4F CS (600 μg d’aérosol TPM/L de matières particulaires totales) pour une concentration d’exposition cible équivalente à 28 μg de nicotine/L.CS la fumée des cigarettes 3R4F a été produite à l’aide de machines à fumer rotatives à 30 orifices selon Phillips et coll.27 . Selon le Protocole de fumée intensive de Santé Canada, 55 mL de volume de bouffée, une bouffée par 30 s et un blocage de 100 % des orifices de ventilation ont été appliqués aux cigarettes 3R4F pour assurer une exposition suffisante. Tous les détails supplémentaires sur la conception de l’étude ont été rapportés précédemment27,28.
Dans l’ensemble, ~400 espèces lipidiques moléculaires des 14 classes de lipides les plus abondantes ont été identifiées et quantifiées (Figure 3). La concentration totale normalisée de lipides par classe était légèrement élevée pour les classes de lipides PE, PEO, PC, PCO, PI et PG, et une certaine régulation à la baisse a été observée pour les lipides SM, LPE et PA (figure 3A), alors qu’aucune différence n’a pu être observée pour les TAG et les PS. Fait intéressant, des niveaux élevés de lipides plasmalogènes PCO et PEO dans le groupe CS ont été signalés dans des cellules inflammatoires29 . L’une des fonctions intracellulaires des lipides plasmalogéniques est l’activité antioxydante. Sous exposition à l’oxygène réactif (ROS) et aux espèces azotées (RNS), une oxydation sélective des plasmalogènes par rapport aux phospholipides diacyles a été signalée30. La liaison ényl-éther dans la structure chimique des plasmalogènes est sensible à l’attaque radicale sur le stress oxydatif31. Les principaux produits de l’attaque radicalaire sont les acides eicosatétraénoïques hydroxylés, les phospholipides de 2-monoacylglycérol, le pentadécanol, les acides formiques, les α-hydroxyaldéhydes de différentes longueurs de chaîne, le 1-formyl-2-arachidonoyl glycérophospholipide et les lysophospholipides.
Ces résultats montrent que, parmi les caractéristiques moléculaires basées sur la formule moléculaire totale, 100 à 120 composés ont été significativement affectés par l’exposition au CS (Figure 3D). La déconvolution détaillée de l’information de fragmentation MS2 et la normalisation des intensités du signal fragmenté ont permis de définir approximativement la quantité totale de chaque acide gras conjugué (AF) représenté dans chaque classe de lipides (Figure 3E) et de comparer ces données entre les groupes exposés et témoins. Une nette diminution des FA complètement saturés et de ceux avec seulement quelques insaturations, principalement dans le contexte des lyso-lipides, a été observée. En revanche, les acides gras polyinsaturés (AGPI) dans la composition des classes de phospholipides PC, PE et PG étaient élevés dans le groupe CS pour tous les points temporels. Les cas extrêmes de PC et de PG conjugués avec de l’eicosapentanoïque (EPA) et de l’acide docosahexaénoïque (DHA) ont été détectés exclusivement dans le groupe exposé au 3R4F CS (Figure 3E, couleur rouge).
Figure 1 : Disposition des plaques pour la distribution de l’échantillon dans le test de Bradford. Les échantillons blancs et les échantillons étalons sont placés en trois exemplaires dans les colonnes 1 à 3; Les échantillons inconnus sont placés en double dans les colonnes 4 à 11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Disposition de la plaque de microtitrage à 96 puits pour l’analyse par spectrométrie de masse au fusil de chasse. La distribution des échantillons blancs, standard, inconnus et CQ pour l’acquisition en mode d’ionisation positive est cartographiée sur le côté gauche de la plaque (colonnes 1 à 6); Tous les échantillons pour le mode d’ionisation négative sont placés à droite (colonnes 7 à 12). Abréviations : pos = positif; CQ = contrôle de la qualité; neg = négatif; To = total des blancs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse lipidomique au fusil de chasse de poumons de souris exposés à la fumée de cigarette. Les souris Apoe−/− ont été exposées au CS de la cigarette de référence 3R4F ou à l’air frais (simulacre). (A) Concentrations dans la classe lipidique et nombre d’espèces lipidiques par classe. Pour chaque classe, le nombre d’espèces lipidiques quantifiées est indiqué entre parenthèses. Intervalles de confiance moyens et à 95 % pour chaque classe de lipides, séparément pour chaque type d’exposition (agrégés sur trois points temporels). (B) Graphiques de volcans montrant l’ampleur de l’effet (changement de quintage log2) et la signification (valeur p ajustée en fonction du FDR log10) des espèces lipidiques quantifiées pour la comparaison 3R4F CS versus simulée aux trois points temporels. Les lipides significativement élevés sont marqués en jaune; Les lipides significativement diminués sont marqués dans le cyan (valeur p ajustée par FDR < 0,05). (C) Abondance différentielle des 25 espèces lipidiques présentant les plus grands changements moyens absolus de plis. Les changements de pli log2 pour la comparaison 3R4F CS versus simulacre sont codés par couleur, et la signification statistique est indiquée : *: valeur p ajustée par FDR < 0,01; X : valeur p ajustée en fonction du FDR < 0,05. D) Graphiques comparatifs. Les coefficients de corrélation pour les comparaisons de changement de pli sont codés par couleur, et le nombre de lipides différentiellement abondants partagés est indiqué (nombres totaux dans les marges). Les diagrammes circulaires montrent le pourcentage de lipides communs différentiellement abondants avec la même direction de changement (signe FC). L’astérisque indique un chevauchement significatif des lipides différentiellement abondants. (E) Abondance différentielle des FA conjugués par classe lipidique. Carte thermique comme dans le panneau C pour les acides gras conjugués avec des différences d’abondance significatives entre 3R4F et l’exposition fictive dans les trois points temporels (valeur p ajustée en FDR < 0,05). La quantité de chaque acide gras par classe de lipides a été estimée en fonction des intensités MS2 des fragments d’acides gras. Abréviations : CS = fumée de cigarette; FDR = taux de fausses découvertes; FC = changement de pli; FA = acides gras; PC = phosphatidylcholine; PS = phosphatidylsérine; TAG = triacylglycérol; SM = sphingomyéline; PEO = phosphatidyléthanolamine plasmalogène; PE = phosphatidyléthanolamine; PG = phosphatidylglycérol; PI = phosphatidylinositol; DAG = diacylglycérol; SE = esters de stérols/cholestéryle; PCO = phosphatidylcholine plasmalogène; LPC = lyso phosphatidylcholine; LPE = lyso phosphatidyléthanolamine; PA = acide phosphatidique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Concentration finale de BSA (mg/mL) | Solution de BSA à 2 mg/mL (μL) | Tampon de bicarbonate d’ammonium (μL) |
| 1 | 50 | 50 |
| 0.75 | 37.5 | 62.5 |
| 0.5 | 25 | 75 |
| 0.25 | 12.5 | 87.5 |
| 0.125 | 12.5 | 187.5 |
| 0.0625 | 50 de solution à 0,125 mg/mL | 50 |
| 0 | 0 | 100 |
Tableau 1 : Schéma de dilution de l’étalon interne BSA pour la courbe d’étalonnage pour l’essai de Bradford. Abréviation : BSA = albumine sérique bovine.
Renseignements supplémentaires : fichiers MFQL utilisés pour l’identification des lipides LipidXplorer. Le paquet .zip se compose des fichiers MFQL individuels requis, chacun nommé selon ce modèle :
Discussion
Bien que les progrès de la SP aient donné lieu à diverses méthodes pour surveiller avec précision de nombreuses espèces lipidiques, le profilage lipidique antérieur de divers tissus de mammifères n’a pas donné de résultats cohérents et, par conséquent, les fonctions tissulaires particulières des lipides restent incertaines. En comparaison avec l’analyse fonctionnelle des protéines, pour laquelle des approches plus robustes pour éliminer l’expression de composés particuliers sont disponibles, la majorité des lipides ne peuvent pas être sélectivement désactivés ou surexprimés dans les tissus, ce qui rend l’évaluation fonctionnelle des lipides difficile. Le profilage avancé des concentrations de lipidomes tissulaires peut fournir une approche alternative pour identifier les associations entre les lipides circulants et les maladies humaines.
Lors de l’évaluation de méthodes lipidomiques complètes capables de couvrir qualitativement et quantitativement le profil lipidique endogène de n’importe quel tissu de souris, nous avons donné la préférence à la méthode lipidomique au fusil de chasse. En général, deux types opposés d’analyse d’échantillons sont possibles : soit un criblage complètement non ciblé des lipides par séparation basée sur la chromatographie liquide (CL) avec une détection par spectrométrie de masse supplémentaire pour révéler la complexité lipidique totale de l’échantillon, soit des approches ciblées, qui permettent principalement une quantification très précise des lipides spécifiques d’intérêt. En revanche, la caractéristique forte du flux de travail lipidomique présenté est la couverture complète rapide de centaines de lipides endogènes à partir de classes de lipides prédéfinies, qui peut encore être réalisée de manière semi-quantitative robuste.
Les efficacités d’ionisation des différentes classes de lipides dépendent de la structure et peuvent varier considérablement en fonction des différentes conditions expérimentales d’ionisation. Contrairement aux méthodes de séparation basées sur la LC, l’analyse au fusil de chasse minimise ces différences en raison de l’infusion simultanée directe de l’extrait lipidique entier dans les mêmes conditions d’ionisation dans l’instrument MS. L’utilisation d’analogues lipidiques marqués isotopiquement ou d’étalons non endogènes structurellement similaires permet une semi-quantification de toutes les classes de lipides. La lipidomique de fusil de chasse offre une faible variabilité inter- et intra-run pendant l’analyse de la SEP; Par conséquent, cette méthode produit des coefficients de variation21 inférieurs à ceux des méthodes non ciblées fondées sur la chromatographie liquide, qui nécessitent plusieurs normes pour une quantification adéquate. Il est important de noter que, bien qu’aucune courbe d’étalonnage externe ne soit utilisée dans la méthode actuelle, la méthode est toujours considérée comme entièrement quantitative32.
Un niveau d’étalon interne marqué (ou d’étalon non étiqueté qui n’est pas exprimé de manière endogène) par classe de lipides est suffisant pour la quantification de la plupart des lipides. Seules quelques publications ont fait état d’une validation partielle d’une méthode lipidomique au fusil de chasse. Par exemple, dans Gryzbek et coll.17 et Surma et coll.21, des courbes d’étalonnage inversées ont été préparées à l’aide d’étalons internes et d’une quantité fixe de matrice d’échantillons. La linéarité a été évaluée par la régression linéaire des quantités de lipides transformées logarithmiques et de leurs intensités et rapportée comme R2 et pente, respectivement. La limite de détection (LD) et la limite de quantification (LOQ) ont été déterminées par régression linéaire pondérée basée sur un rapport signal/bruit de 3 pour LOD et de 10 pour LOQ. Pour la plupart des classes de lipides, la LQ a été définie entre 2 et 9,8 pmol pour le tissu adipeux et entre 0,05 et 5 μM dans le plasma. Dans les deux cas, des étalons internes uniques non endogènes par classe ont été utilisés pour calculer les estimations de tous les lipides de la classe. Cependant, dans ce travail, nous ne fournissons pas de LD / LOQ en raison de plusieurs préoccupations: la matrice endogène n’est pas exempte de composés et la matrice de substitution pour les tissus n’est pas disponible - avec cela, le pic de petites quantités connues d’étalons n’est pas possible. Nous n’effectuons pas une approche classique de quantification ciblée avec l’utilisation d’une série de courbes d’étalonnage d’un composé particulier normalisé par son étalon identique marqué isotopiquement en raison de l’inexistence d’étalons purs et de la disponibilité très limitée de lipides marqués isotopiquement. Les détecteurs Orbitrap effectuent automatiquement la conversion du signal transitoire en appliquant une transformation de Fourier, et un signal est déjà substitué - en conséquence, la plage de concentration inférieure ne sera linéaire que jusqu’à un signal minimum, en dessous duquel la molécule ne sera plus détectable. Les valeurs signal/bruit du logiciel Xcalibur dépendent du rapport m/z de la molécule ; En conséquence, les composés de chaque classe de lipides, contenant différentes combinaisons d’acides gras, auront des valeurs de bruit différentes. De plus, les valeurs de LQ/LOQ sont strictement liées au type de matrice, et lorsque la quantification du lipidome est effectuée dans différents tissus de rongeurs, elle devrait être reflétée par l’évaluation des LQ pour chaque type de tissu individuellement.
En fait, la méthode offre une plage de quantification dynamique linéaire élevée allant jusqu’à quatre ordres de grandeur33 et une très bonne sensibilité pour couvrir les lipides structurels endogènes les plus importants, qui peuvent être encore augmentées par des améliorations techniques dans l’acquisition de MS32. Les coefficients de variation des concentrations moyennes de lipides étaient pour la plupart inférieurs à 15 %, ce qui signifie que la lipidomique de fusil de chasse est conforme aux exigences de la Food and Drug Administration (FDA) en tant que méthode à envisager pour les études de bonnes pratiques de laboratoire (BPL) et de bonnes pratiques cliniques (GCLP)34.
Cependant, il faut noter que, en raison de leur polarité différente, certaines classes de lipides deviennent beaucoup plus impactées par la contribution d’AF conjugués spécifiques. Cela conduit à la distorsion de la réponse d’intensité dans les mélanges équimolaires contenant une large gamme d’acides gras conjugués, ce qui entraîne un biais de quantification, comme l’ont souligné Koivusalo et al.35 pour les classes de phospholipides. Il convient de noter que ces auteurs ont présenté des données pour un large éventail d’AF, allant de 24 à 48 longueurs de chaîne, ce qui ne reflète probablement pas la situation dans un échantillon biologique réel. La réponse pour les espèces polyinsaturées était 40% plus élevée que pour les espèces complètement saturées, mais cet effet n’a été observé que pour des concentrations plus élevées. Lorsque le mélange a été progressivement dilué, l’effet de l’insaturation a progressivement diminué et a pratiquement disparu à 0,1 pmol / μL par espèce. De plus, toutes les mesures ont été effectuées sur des instruments à piège à ions et à quadripôles triples et non sur de l’équipement Q-Exactive.
Un autre avantage du flux de travail présenté est sa flexibilité technique, qui permet une adaptation aux exigences spécifiques du projet. Par exemple, tout protocole d’extraction lipidique - tel que les méthodes modifiées de Bligh et Dyer36, de méthyl tert-butyléther 37 ou de butanol-méthanol38 - peut être utilisé pour préparer un extrait lipidique total avant l’analyse de la SEP. La principale limitation de l’extraction chloroforme-méthanol est que la phase inférieure contient la fraction lipidique, ce qui complique le travail de routine et surtout l’automatisation; De plus, la toxicité du chloroforme doit être prise en compte. L’extraction au tert-butyléther est largement utilisée pour l’analyse lipidique des échantillons de plasma37, et une version automatisée a été proposée21. Dans ce cas, nous avons choisi la méthode BUME parce qu’elle offre des récupérations encore meilleures pour les classes de lipides PG, PI, PA et PS38, une consommation de solvant plus faible et la possibilité d’automatisation39, tandis que les concentrations globales quantifiées pour les échantillons de tissus extraits par les trois méthodes étaient comparables. De plus, bien que l’extraction de l’échantillon ait été effectuée manuellement dans le cadre du présent travail, il est également possible d’obtenir des résultats reproductibles et précis à partir de grands ensembles d’échantillons par préparation automatisée des échantillons et extraction lipidique dans un format de 96 puits40,41. Cela permet de mettre en œuvre l’analyse lipidomique dans des études cliniques et toxicologiques à grande échelle.
Dans le présent travail, nous avons effectué l’acquisition MS des modes positif et négatif séparément sans changement de polarité comme décrit par Schuhmann et al.42. La stabilité du signal nanomate est meilleure en mode négatif pour une solution légèrement moins concentrée qu’en mode positif. De plus, nous avons développé une procédure entièrement traçable avec un logiciel de conversion de fichiers .raw vers mzML, qui fournit les valeurs à spécifier dans le logiciel LipidXplorer - avec cela, les calculs manuels de pente de résolution ne sont pas nécessaires. Nous avons également appliqué différentes substitutions de réglage de bruit car, en mode positif, les niveaux de bruit des spectres sont plus élevés qu’en mode négatif. Toutes les étapes ont été optimisées pour des analyses de routine traçables et à haut débit.
Pour l’identification, l’analyse lipidomique au fusil de chasse peut exploiter le comportement unique de différentes classes de lipides, qui forment des adduits uniques dans différents modes de polarité. Dans cette méthode, les espèces PC et PE ayant la même masse moléculaire qui se chevauchent en mode d’ionisation positive peuvent être complètement séparées en mode d’ionisation négative, car PC forme des adduits à l’acétate ou au formate, et le PE est ionisé sous une forme déprotonée. De plus, une déconvolution structurelle (partielle) est possible pour la méthode utilisant non seulement la formule moléculaire, mais aussi la structure des acides gras en vrac. Par exemple, l’identification de l’AF sur le niveau de carbone total et le nombre total d’insaturations fonctionne pour tous les phospholipides, DAG, TAG et lyso-phospholipides. La quantification ascendante de chaque forme isomérique peut être partiellement réalisée pour certaines des classes de phospholipides43 , mais elle est beaucoup plus complexe pour les DAG et les TAG en raison de la réponse inégale du signal des différents FA dans les spectres MS2.
Il importe également de souligner la nécessité de mettre en œuvre des procédures appropriées de contrôle de la qualité, pleinement alignées sur les initiatives récentes dans ce domaine44. Comme nous souhaitons assurer une traçabilité et une reproductibilité appropriées des données entre et au sein du laboratoire, un certain nombre d’étapes ont été prises, telles que la randomisation appropriée des échantillons pour toutes les étapes de l’analyse, la collaboration avec des mélanges standard certifiés par les fournisseurs, l’inclusion d’échantillons de contrôle de la qualité, les procédures pour vérifier l’acceptation ou le rejet des lots et la création d’une base de données interne pour suivre le rendement du CQ à long terme. Ces initiatives sont également conformes à la nécessité d’une méthode normalisée pour assurer la stabilité de l’échantillon. En général, la majorité des lipides structuraux ne sont pas affectés par l’oxydation des lipides, ce qui est plus pertinent pour les oxilimines, les lipides oxydés et les acides gras polyinsaturés qui sont donc beaucoup plus sensibles aux conditions de stockage et de manipulation. Cependant, l’évaluation correcte de la stabilité de l’échantillon reste une tâche techniquement difficile.
Cependant, ce protocole a une limite lorsqu’il s’agit de déterminer les niveaux submoléculaires de composés. Étant donné qu’il n’y a pas de séparation de l’extrait total, toutes les isoformes de lipides ayant la même masse moléculaire mais des compositions différentes en acides gras sont fusionnées dans l’analyse MS. Pour la plupart des classes, il est possible d’obtenir une déconvolution partielle de la structure en utilisant les rapports de fragmentation des fragments d’acides gras résiduels dans MS2. Cependant, la quantification indépendante de chaque isoforme reste une tâche particulièrement difficile en raison des grandes différences dans les comportements de fragmentation des différentes isoformes et du fait que les étalons chimiques purs ne sont pas disponibles dans une variété suffisamment grande pour définir les valeurs de compensation. Une autre limite est que le processus ESI génère inévitablement des artefacts, ce qui entraîne la génération artificielle de pics pour certains lipides tels que les DAG, les PAS et les FA, ce qui peut conduire à une quantification erronée.
Ensuite, nous résumons les parties les plus critiques du protocole en fonction de notre expérience. Le premier est lié au fait que chaque type de tissu de souris a un profil lipidique unique en termes de quantité de lipides et de rapports de classe. Ainsi, les quantités initiales du tissu basées sur la teneur totale en protéines avant l’extraction doivent être soigneusement déterminées afin de ne pas saturer le signal MS et de ne pas quitter la plage de quantification dynamique due à l’agrégation lipidique à des concentrations élevées33 ou - à l’extrême opposé - de fournir suffisamment de signal MS pour couvrir les principaux composés lipidiques pour chaque classe lipidique.
Le deuxième aspect critique est d’assurer un alignement correct de la position de la sortie de la puce nano-source à perfusion directe avec le capillaire de transfert du spectromètre de masse. Étant donné que l’étalonnage complet du spectromètre de masse dans les deux modes est effectué chaque semaine, le permutation entre la source d’étalonnage et la configuration de la puce nano-source peut être la raison de la variabilité spectaculaire de l’intensité du signal en raison d’un désalignement lors de l’installation.
Une autre partie essentielle du protocole est la manipulation minutieuse du mélange de normes internes. Comme ce mélange contient une quantité importante de dichlorométhane, une fois ouvert, il doit être consommé rapidement pour éviter un stockage prolongé et des utilisations multiples conduisant à l’évaporation et à la modification artificielle de la concentration. En outre, une manipulation cohérente du mélange étalon après le retrait du stockage à −20 °C est importante, car les différences de température peuvent entraîner des incohérences de volume pendant le pipetage avec des pipettes à coussin d’air. Une option consisterait à remplacer le dichlorométhane dans le tampon de remise en suspension standard par du méthanol pur, ce qui pourrait améliorer la commodité de manipulation, mais pourrait avoir une incidence négative sur la solubilité de certaines classes de lipides et, par conséquent, diminuer la précision de la quantification pour ces classes de lipides.
La dernière partie critique est le traitement des données. Le flux de travail de traitement des données combine la conversion logicielle Peak by Peak du format .raw au format .mzML, en appliquant la moyenne de numérisation MS2 et la filtration du bruit MS1 et MS2, ainsi que la sélection des pics et la compression des données. Comme alternative, le logiciel Proteowizard peut également être utilisé pour la conversion de données, mais, dans ce cas, plusieurs paramètres dans LipidXplorer doivent être définis manuellement. Toute la complexité de la lipidomique de fusil de chasse est particulièrement concentrée sur l’étape de déconvolution des spectres MS1 et MS2 par injection directe. Le logiciel open source LipidXplorer importe les spectres convertis à partir du format de fichier mzML en fonction de la précision de la masse, de la résolution de masse et de la pente de son changement avec l’augmentation de m / z. Le logiciel fusionne plusieurs spectres MS et MS/MS individuels acquis au cours d’une série d’analyses. Par la suite, il aligne les pics individuels dans différents échantillonnages et, dans chaque groupe de pics alignés, il remplace leurs masses par leur masse moyenne pondérée en fonction de l’intensité, tandis que leurs abondances dans chaque fichier de données restent inchangées. Les masses représentatives des grappes de pics alignées et des intensités de pics individuelles sont stockées dans une base de données de balayage maître. La base de données de balayage principal contient tous les spectres MS1 et MS2 générés pour tous les échantillons du lot et peut être décomplexée en identifications lipidiques par des requêtes écrites dans le langage de requête de fragmentation moléculaire (MFQL).
Dans l’ensemble, la méthode couvre l’identification des lipides DAG, TAG et SE en fonction du mode positif et des lipides PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC et LPE basés sur l’acquisition en mode négatif. Lors de l’identification des lipides, une correction isotopique est effectuée pour MS1 et MS2, et les intensités ajustées sont indiquées dans le fichier de sortie .xlsx. Alternativement, plusieurs autres logiciels sont disponibles pour traiter les données des fusils de chasse, tels que ALEX45 et LipidHunter46.
Les acides gras - principaux composants de la membrane nucléaire et cellulaire - sont stockés sous forme de phospholipides pour une conversion ultérieure en molécules bioactives. Ils peuvent être convertis par les enzymes lysophospholipides acyltransférase en lysophospholipides par la voie des terres47. L’enzyme LPCAT3, par exemple, est connue pour montrer une spécificité élevée pour incorporer AA dans les intermédiaires de la lysophosphatidylcholine et de la lysophosphatidylsérine. L’expression relativement élevée de ces enzymes a été rapportée dans les cellules inflammatoires, telles que les macrophages alvéolaires et les cellules épithéliales bronchiques47, conduisant à la libération de plus grandes proportions relatives de phospholipides contenant des AA dans ces cellules. Cependant, suite à leur libération des phospholipides membranaires par la phospholipase A2, la conversion des AGPI en divers types de médiateurs lipidiques est catalysée par de nombreuses enzymes48. De plus, ces AGPI peuvent devenir le substrat pour la production de prostaglandines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires via l’action des enzymes cyclooxygénase (COX)-1 et COX-247. Les phospholipides sont l’une des sources de médiateurs lipidiques libérés à des endroits particuliers où ces médiateurs sont nécessaires pour démontrer leurs effets biologiques.
Le poumon est un organe complexe comprenant plusieurs types de cellules, chacune jouant des rôles de chevauchement et de niche dans la facilitation du développement et de la fonction pulmonaires normaux. Seules quelques études ont été réalisées pour isoler et profiler différents types de cellules dans les poumons de souris ou humains (p. ex. cellules alvéolaires de type 2)49,50; D’autres grands types de cellules pulmonaires n’ont pas été caractérisés. Une autre étude intéressante51 a été réalisée pour isoler et effectuer une analyse lipidique des cellules immunitaires endothéliales, épithéliales, mésenchymateuses et mixtes dans le poumon de souris. Il a été observé que la concentration d’AGPI incorporés dans le BCP et le PG était enrichie dans les cellules immunitaires. Compte tenu du fait que le CS induit une augmentation des cellules immunitaires dans les poumons (4-5 fois), tel qu’évalué par lavage broncho-alvéolaire (BAL)52, les changements lipidiques totaux observés dans cette étude pourraient s’expliquer par une augmentation cumulative du recrutement des cellules immunitaires dans le poumon de souris.
En conclusion, la distorsion observée des acides gras monoinsaturés et des AGPI incorporés dans les phospholipides peut refléter l’excès de certains AF dans la cellule et/ou constituer une ressource intracellulaire de précurseurs d’oxilipine qui sont surproduits dans des conditions de stress oxydatif et inflammatoires. Cependant, des données supplémentaires sur l’EPA, le DHA et d’autres oxilipins libres sont essentielles pour clarifier ce point et sortent du cadre de l’application actuelle de la méthode.
Disclosures
Tous les auteurs sont des employés de Philip Morris International. Philip Morris International est la seule source de financement et sponsor de ce projet.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier l’équipe d’étude et à remercier particulièrement l’assistance technique et le soutien des équipes de biorecherche et d’aérosols de PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapour, et PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Suisse. Les auteurs remercient Sam Ansari pour la gestion de la biobanque et reconnaissent le soutien de Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy pour l’édition d’une ébauche du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 5, and 2 mL self-lock tubes | Eppendorf | 30120086, 30120094 | |
| 3 mm stainless still beads | Qiagen | 69997 | |
| 4.1 µm nozzle chip | Advion | HD-D-384 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 45754-100ML-F | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 14267-25G | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830-500G | |
| Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | 23209 | |
| Butanol | Honeywell | 33065-2.5L | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650498-1L | |
| Dichloromethane | Honeywell | 34856-1L | |
| Ethyl acetate | Honeywell | 33211 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma | M9686 | |
| Heptane | Sigma Aldrich | 34873-2.5L | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A456 | |
| Mouse pooled plasma | BioIvt | ||
| Mouse SPLASH standard | Avanti Polar Lipids | 330710X | Internal standard |
| Nunc 96-flat bottom well transparent plates | VWR | 62409-068 | |
| Plastic spatula | Sigma | Z560049-300EA | |
| Quick Start Bradford 1x Dye reagent | BioRad | 5000205 | |
| Serum diluent | Sigma Aldrich | D5197 | |
| Equipment/software | |||
| CryoPrep CP02 impactor instrument | Covaris | Magnetic hammer | |
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | . | Centrifuge |
| ChipSoft 8.3 | Advion Biosciences | . | Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot |
| LipidXplorer 1.2.8.1 | N/A | . | Software to identify lipids |
| Peak By Peak | SpectroSwiss | . | Software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| ProteoWizard | ProteoWizard | . | Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| Q-Exactive MS | Thermo Fisher | . | High resolution orbitrap mass spectrometer |
| Qiagen Tissue Lyser II | Qiagen | . | Tissue lyser |
| SpeedVac SPD140DDA | Thermo Fisher | . | Vacuum concentrator |
| Tecan Infinite M nano plus | Tecan | . | Plate reader |
| ThermoMixer C | Eppendorf | . | Thermomixer |
| TriVersa Nanomate | Advion Biosciences | . | Direct infusion nano-source |
| Xcalibur 4.3 | Thermo Scientific | . | Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS |
References
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