Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

कृंतक ऊतकों के शॉटगन लिपिडोमिक्स

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/63726
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1PMI R&D, Philip Morris Products SA

Summary

शॉटगन मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित लिपिडोमिक्स विभिन्न कृंतक ऊतकों से एक ही माप में एक साथ लिपिड वर्गों के व्यापक स्पेक्ट्रम का एक संवेदनशील मात्रात्मक स्नैपशॉट प्रदान करता है।

Abstract

लिपिड सभी प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक कोशिकाओं के आवश्यक घटकों के रूप में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री में निरंतर तकनीकी सुधार ने लिपिडोमिक्स को होमियोस्टैटिक के साथ-साथ रोग राज्यों में ऊतक लिपिडोम रचनाओं की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण बना दिया है। यह पेपर शॉटगन लिपिड विश्लेषण विधि के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो उच्च थ्रूपुट पर विभिन्न ऊतक और बायोफ्लुइड नमूनों में कुछ सौ आणविक लिपिड प्रजातियों का एक साथ पता लगाने और परिमाणीकरण का समर्थन करता है। यह विधि उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण में क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण के बिना लेबल किए गए आंतरिक मानकों के साथ स्पाइक किए गए कुल लिपिड अर्क के स्वचालित नैनो-प्रवाह प्रत्यक्ष इंजेक्शन का लाभ उठाती है। कृंतक ऊतक की उप-माइक्रोग्राम मात्रा से शुरू होकर, एमएस विश्लेषण प्रति नमूना 10 मिनट लेता है और माउस फेफड़ों के ऊतकों में 14 लिपिड वर्गों से 400 लिपिड तक कवर करता है। यहां प्रस्तुत विधि रोग तंत्र का अध्ययन करने और बायोमार्कर की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है जो कृंतक ऊतकों के भीतर प्रारंभिक विषाक्तता या लाभकारी प्रभावों का संकेत देते हैं।

Introduction

सिगरेट के धुएं (सीएस) को फेफड़ों के पुरानी सूजन संबंधी बीमारियों के विकास से जुड़े एक मुख्य जोखिम कारक के रूप में मान्यता प्राप्त है, जिसमें फुफ्फुसीय कार्सिनोमा, ब्रोंकाइटिस और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) 1 शामिल हैं। फेफड़ों के प्रभाव से परे, सीएस एक्सपोजर एथेरोस्क्लेरोटिक कोरोनरी धमनी रोग और परिधीय संवहनी रोग जैसे अन्य रोगों के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाताहै। सीओपीडी के साथ कार्डियोवैस्कुलर बीमारी, क्रमशः दुनिया भर में मौत का पहला और तीसरा प्रमुख कारण है। विष विज्ञान जोखिम मूल्यांकन दृष्टिकोण ऐतिहासिक रूप से कृन्तकों जैसे पशु मॉडल के उपयोग पर निर्भर रहे हैं। विवो नाक-केवल या पूर्ण शरीर वाले चूहे और माउस मॉडल में आमतौर पर सीएस के संपर्क के दीर्घकालिक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है।

उदाहरण के लिए, आम तौर पर, 6 महीने के धुएं के संपर्क में आने से मुराइन फेफड़ों में हिस्टोलॉजिकल और कार्यात्मक असामान्यताएं उत्पन्न होती हैं जो मानव रोग की नकल करती हैं, जिसमें वातस्फीति, वायुमार्ग रीमॉडेलिंग और फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप शामिल हैं, हालांकि परिवर्तन दीर्घकालिकमानव धूम्रपान करने वालों की तुलना में अपेक्षाकृत हल्के हैं। पशु और मानव दोनों ऊतकों में, अध्ययनों ने सीएस एक्सपोजर के जवाब में आणविक परिवर्तनों की एक विस्तृत श्रृंखला देखी है, जिसमें ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रियाएं, सूजन और संरचनात्मक ऊतक परिवर्तन शामिल हैं। आश्चर्य की बात नहीं है, सीएस एक्सपोजर को फेफड़ों के लिपिडोम पर दूरगामी प्रभाव डालने की भी सूचना मिली है, जिसमें सर्फेक्टेंट लिपिड, लिपिड सिग्नलिंग मध्यस्थों और संरचनात्मक लिपिड 4,5,6 पर प्रभाव शामिल हैं।

माउस फेफड़ों के दीर्घकालिक सीएस एक्सपोजर से प्रेरित थोक लिपिड परिवर्तनों को चिह्नित करने के लिए, हमने एक तेज और मात्रात्मक शॉटगन डायरेक्ट इन्फ्यूजन मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण किया। 2005 7 में शॉटगन लिपिडोमिक्स विधि की शुरूआत के बाद, इस विधि का उपयोग प्रभावीरूप से लिपिड सेलुलर चयापचय 8,9,10 पर हमारे ज्ञान को मॉडल सिस्टम जैसे खमीर 11, केनोरहाब्डिस एलिगेंस12, और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर13 में विस्तारित करने के लिए किया गया है, साथ ही स्तनधारी नमूना प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में जैसे सेल लाइन 14, 15,16 विभिन्न मानव17,18 और कृंतक ऊतक19,20 और शरीर के तरल पदार्थ21,22।

पिछले दशकों में, अध्ययनों ने पर्यावरणीय परिवर्तनों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जटिलता का खुलासा किया है, जिसमें हजारों परस्पर जुड़े प्रोटीन, लिपिड और मेटाबोलाइट्स शामिल हैं। इससे यह स्पष्ट हो गया है कि आणविक मशीनरी के गहन दृष्टिकोण को प्राप्त करने और बहिर्जात शारीरिक प्रभावों के पूर्ण परिमाण को उजागर करने के लिए अत्याधुनिक विश्लेषणात्मक तकनीकों का उपयोग करना आवश्यक है। इस संदर्भ में, शॉटगन लिपिडोमिक्स दृष्टिकोण द्वारा उत्पादित व्यापक, मात्रात्मक लिपिड फिंगरप्रिंट लिपिड सेलुलर चयापचय 8,9,10 पर हमारे ज्ञान को प्रभावी ढंग से जोड़ सकते हैं।

कई बीमारियों के लिए जोखिम कारक के रूप में सीएस जोखिम के बारे में, विष विज्ञान जोखिम मूल्यांकन दृष्टिकोण ऐतिहासिक रूप से कृन्तकों जैसे पशु मॉडल के उपयोग पर निर्भर हैं। शॉटगन लिपिडोमिक्स एमएस कई नमूना प्रकारों में लिपिडोम गड़बड़ी का आकलन करने के लिए एक तेज, संवेदनशील और मात्रात्मक विश्लेषणात्मक उपकरण प्रदान करता है। शॉटगन लिपिडोमिक्स की अनूठी विशेषता इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) नैनोस्प्रे23 उत्पन्न करने वाले प्रवाहकीय नैनोचिप का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमएस उपकरण में क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण के बिना लेबल आंतरिक मानकों के साथ कुल लिपिड अर्क-स्पाइक्ड का स्वचालित प्रत्यक्ष-इंजेक्शन विश्लेषण है।

मास-टू-चार्ज अनुपात जानकारी जो एक साथ एमएस 1 मोड में प्राप्त की जाती है, सभी बरकरार अंतर्जात लिपिड के कुल लिपिड पदचिह्न प्रदान करती है। वैकल्पिक रूप से, एमएस 2 / एमएस 3 मोड, जिसमें मूल लिपिड अणु खंडित और विश्लेषण किए जाते हैं, अतिरिक्त संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है। डेटा विश्लेषण के लिए विशेष सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है और इसमें पूल किए गए स्पेक्ट्रा में स्पेक्ट्रा और पीक असाइनमेंट का डीकन्वोल्यूशन शामिल होता है जो लिपिड पहचान और कथित रासायनिक संरचना स्पष्टीकरण की ओर ले जाता है। इसके अतिरिक्त, पूर्ण परिमाणीकरण एक लेबल आंतरिक मानक मिश्रण को जोड़कर किया जा सकता है जिसमें ब्याज के लिपिड वर्ग में कम से कम एक लिपिड मानक होता है। कुल मिलाकर, वर्तमान तकनीक के साथ, एमएस विश्लेषण प्रति नमूना कुछ मिनट लेता है जो कृंतक ऊतकों में 14 लिपिड वर्गों24 से 800 लिपिड की पहचान और परिमाणीकरण को कवर कर सकता है।

Protocol

जानवरों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को एसोसिएशन फॉर असेसमेंट एंड एक्रेडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर इंटरनेशनल द्वारा मान्यता प्राप्त और सिंगापुर के कृषि-खाद्य और पशु चिकित्सा प्राधिकरण द्वारा लाइसेंस प्राप्त सुविधा में किया गया था, एक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन के साथ और वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए जानवरों की देखभाल और उपयोग पर प्रयोगशाला पशु अनुसंधान दिशानिर्देशों के लिए राष्ट्रीय सलाहकार समिति (एनएसीएलएआर) के अनुपालन में। 2004).

1. नमूना संग्रह

  1. एपीओई-/- चूहों के संपर्क में आने के 3 महीने और 6 महीने बाद माउस फेफड़ों का विच्छेदन करें। एक्सपोजर के 16-24 घंटे बाद ऊतकों को इकट्ठा करें, उन्हें तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रीज करें, और लिपिडोमिक्स वर्कफ़्लो शुरू करने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रत्येक "ओमिक्स" विच्छेदन समूह से कुल नौ नमूनों का संग्रह सुनिश्चित करें।

2. ऊतक - नमूने का पुल्वराइजेशन

  1. ऊतक पीसने के लिए चुंबकीय हथौड़ा और उपभोग्य सामग्री तैयार करें। प्रीकूल ऊतक पाउच, फोर्सप्स, कैप्स के साथ कैप्ड टिशू ट्रांसफर ट्यूब, एक "वी" प्लास्टिक स्पैटुला, और सूखी बर्फ पर 2 एमएल प्लास्टिक संग्रह ट्यूब। चुंबकीय हथौड़ा उपकरण पर संबंधित ट्यूब धारक स्थापित करें। चुंबकीय हथौड़ा चालू करें और प्रभाव शक्ति को उच्च पर सेट करें।
  2. नमूने को एक ऊतक थैली में लोड करें; यदि आवश्यक हो तो प्रीकूल्ड फोर्सप्स का उपयोग करके ऊतक थैली के शीर्ष उद्घाटन के माध्यम से नमूना डालें। नमूने को किनारों से दूर लचीली थैली के केंद्र में रखें।
  3. ऊतक थैली के शीर्ष पर एक प्रीकूल्ड संग्रह ट्यूब को पेंच करके ऊतक थैली को सील करें।
  4. लचीली थैली को 10 सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन में डुबोकर नमूने को स्नैप-फ्रीज करें।
  5. संग्रह ट्यूब को बाहर निकालें; चुंबकीय हथौड़ा के प्रभाव के समय थैली को तोड़ने से बचने के लिए ट्यूब को 1/4 मोड़ के लिए ढीला करें।
  6. चुंबकीय हथौड़ा पर जमे हुए ऊतक थैली लोड करें।
  7. नमूने को पल्वराइज़ करने के लिए सक्रिय बटन दबाकर चुंबकीय हथौड़ा लागू करें। यदि थैली में गैर-फुफ्फुसीय ऊतक के टुकड़े रहते हैं, तो नमूने को तरल नाइट्रोजन में फिर से फ्रीज करें और दूसरे प्रभाव के लिए दोहराएं।
  8. चुंबकीय हथौड़ा से ऊतक थैली को हटा दें, पुल्वराइज्ड नमूने को नीचे रखें। नमूने को पिघलने से रोकने के लिए, इसे तुरंत फिर से फ्रीज करें।
  9. नमूने को संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें। जल्दी से ट्यूब को उलट दें ताकि ऊतक थैली शीर्ष पर हो, और संग्रह ट्यूब के तल में ऊतक कणों को स्थानांतरित करने के लिए थैली को टैप करें।
    नोट: ऊतक के पिघलने से बचने के लिए इस कदम को जल्दी से किया जाना चाहिए।
  10. आगे लिपिडोमिक विश्लेषण के लिए 2 एमएल ट्यूब में 10 मिलीग्राम ऊतक एलिकोट स्थानांतरित करें और आगे के चरणों तक नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. ऊतक समरूपीकरण

  1. ऊतक लाइसर उपकरण पर स्विच करें और 30 हर्ट्ज पर हिलाने की आवृत्ति और 2 मिनट पर हिलाने की अवधि सेट करें। ऊतक होमोजेनाइजेशन बफर समाधान तैयार करें: ~ 8.2 के पीएच के साथ पानी में 150 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट।
  2. भंडारण फ्रीजर से नमूने निकालें, बर्फ पर रखें, और ऊतक पाउडर युक्त ट्यूबों में चार स्टेनलेस स्टील मोती जोड़ें। प्रत्येक नमूने में 150 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर का 0.5 एमएल जोड़ें।
  3. नमूना ट्यूबों को ऊतक लाइसर धारकों में रखें। ट्यूबों की समान संख्या के साथ दोनों धारकों को संतुलित करें। धारकों को ऊतक लाइसर होल्डिंग आर्म में ठीक करें। ऊतक को बाधित करें।
  4. ट्यूबों को बर्फ पर रखें और नेत्रहीन जांचें कि ट्यूब में कोई बचा हुआ ऊतक समुच्चय मौजूद नहीं है। यदि ऊतक विघटन अधूरा है (समुच्चय देखे जाते हैं), तो एक और उपचार चक्र करके व्यवधान प्रक्रिया को दोहराएं। नमूने को बर्फ पर रखें।
  5. प्रोटीन निर्धारण के लिए समर्पित 1.5 एमएल ट्यूब में नमूने के 100 μL का एक एलिकोट 1 बनाएं। इसे 10 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 18,200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. ब्रैडफोर्ड परख द्वारा एलिकोट 1 की प्रोटीन सामग्री निर्धारित करें (अनुभाग 4 देखें)। नमूने को बर्फ पर स्टोर करें।
  7. लिपिड निष्कर्षण के लिए एक नए 2 एमएल माइक्रोट्यूब में स्टॉक होमोजेनेट के 20-100 μL का एक एलिकोट 2 बनाएं (अनुभाग 5 देखें)। यदि नमूनों का तुरंत विश्लेषण नहीं किया जाता है, तो निष्कर्षण होने तक उन्हें बर्फ पर रखें।
    नोट: अंतिम निष्कर्षण मात्रा को कुल प्रोटीन राशि के आधार पर परिभाषित किया जाना चाहिए। यह प्रति कुल एलिकोट 0.015-0.045 मिलीग्राम प्रोटीन की सीमा में होना चाहिए।

4. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन निर्धारण परख

नोट: विश्लेषण की शुरुआत से पहले अध्ययन के नमूनों को यादृच्छिक किया जाना चाहिए, और नमूना प्रसंस्करण के सभी चरणों के लिए यादृच्छिककरण का सम्मान किया जाता है।

  1. अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर के साथ पतला सेंट्रीफ्यूज्ड एलिकोट 1 सतह पर तैरने वाला 2 गुना।
    नोट: कमजोर पड़ने वाला कारक ऊतक होमोजेनेट की एकाग्रता पर निर्भर करता है। अधिक केंद्रित समाधानों के लिए, एक उच्च कारक लागू करें ताकि निर्धारित एकाग्रता परख की गतिशील सीमा में गिर जाए।
  2. तालिका 1 के अनुसार एक गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) मानक वक्र तैयार करें। भंवर मानक ट्यूब। कमरे के तापमान पर 15 सेकंड के लिए 18,200 × ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. पहले से तैयार मानक ट्यूबों से, चित्र 1 में दिखाए गए प्लेट लेआउट के अनुसार रिक्त और मानकों में से प्रत्येक को 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट में स्थानांतरित करें।
  4. चित्र 1 में वर्णित प्लेट लेआउट के अनुसार पहले से तैयार नमूनों को 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट में स्थानांतरित करें।
  5. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक का 250 μL जोड़ें और मिलाएं। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. प्लेट रीडर का उपयोग करके 595 एनएम तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापें।
  7. मानक वक्र के आधार पर एलिकोट में प्रोटीन सांद्रता की गणना करें।
    नोट: प्रोटीन सांद्रता की गणना करते समय प्रक्रिया की शुरुआत में उपयोग किए जाने वाले कमजोर पड़ने वाले कारक पर विचार किया जाना चाहिए।

5. बीयूएमई निष्कर्षण

नोट: लिपिडोमिक्स निष्कर्षण के लिए कम-बिंद प्लास्टिक ट्यूबों के उपयोग से बचें, क्योंकि मजबूत कार्बनिक सॉल्वैंट्स प्लास्टिसाइज़र जारी करते हैं और नमूना विश्लेषण के दौरान एक मजबूत पृष्ठभूमि बनाते हैं।

  1. कुल रिक्त (टीबी), आंतरिक मानक रिक्त (आईएसबी), और गुणवत्ता नियंत्रण नमूने (क्यूसी) के प्रत्येक ट्यूब में 100 μL अमोनियम बाइकार्बोनेट समाधान के साथ 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें, 10 नमूनों के प्रत्येक सेट के बीच 1 QC नमूना रखा गया है। सभी नमूने बर्फ पर रखें।
  2. सभी क्यूसी नमूनों में 10 μL पूल किए गए मानव प्लाज्मा जोड़ें। सभी आईएसबी, क्यूसी और अध्ययन नमूनों (यानी, टीबी को छोड़कर सभी नमूने) में आंतरिक मानक समाधान के स्पाइक 10 μL।
    नोट: गुणवत्ता नियंत्रण सामग्री के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किसी भी पूल किए गए के2ईडीटीए प्लाज्मा का उपयोग करें। प्राप्त होने पर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके पूल किए गए प्लाज्मा में लिपिड एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें और इन श्रेणियों को उन सभी विश्लेषणों के संदर्भ के रूप में रखें जिनमें क्यूसी सामग्री का उपयोग किया जाता है। एनआईएसटी प्लाज्मा का उपयोग केवल अधिक लक्षित अनुप्रयोगों के लिए या वैश्विक विधि सत्यापन के लिए करें, जहां परख की सटीकता को संबोधित करने की आवश्यकता है।
  3. प्रत्येक नमूने में -20 डिग्री सेल्सियस ब्यूटेनॉल /मेथनॉल मिश्रण (3/1, वी / वी) का 300 μL जोड़ें। थर्मोमिक्सर पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 450 × ग्राम पर हिलाएं।
  4. एथिल एसीटेट मिश्रण (3/1, वी / वी) का 300 μL जोड़ें। थर्मोमिक्सर पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 450 × ग्राम पर हिलाएं।
  5. 1% एसिटिक एसिड मिश्रण का 300 μL जोड़ें। थर्मोमिक्सर पर कमरे के तापमान पर 450 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए हिलाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2,800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। ऊपरी चरण के 360 μL को एक नए 2 एमएल सेल्फ-लॉक ट्यूब 2 में स्थानांतरित करें।
    नोट: तरल-तरल निष्कर्षण के परिणामस्वरूप नमूना-निर्भर तरीके से चरण सीमा की स्थिति बदल सकती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊपरी चरण के लिए मामूली मात्रा विसंगति हो सकती है। यदि आवश्यक हो तो ऊपरी चरण के लिए संग्रह मात्रा समायोजित करें।
  6. एथिल एसीटेट (3/1, वी /वी) के 320 μL को पानी के चरण ट्यूब 1 में जोड़ें। थर्मोमिक्सर पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 450 × ग्राम पर हिलाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2,800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। ऊपरी चरण के 320 μL को स्थानांतरित करें और चरण 5.11 से अंश के साथ संयोजित करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो ऊपरी चरण के लिए संग्रह मात्रा समायोजित करें।
  7. ट्यूब 1 में पानी के चरण में 250 μL heptane / ethyl एसीटेट (3/1, v / v) जोड़ें। थर्मोमिक्सर पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 450 × ग्राम पर हिलाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2,800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। ऊपरी चरण के 200 μL को स्थानांतरित करें और ट्यूब 2 में चरण 5.11 और चरण 5.15 के अंशों के साथ संयोजित करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो ऊपरी चरण के लिए संग्रह मात्रा समायोजित करें।
  8. वैक्यूम कंसंट्रेटर में 35 डिग्री सेल्सियस पर सूखापन के लिए वाष्पित।
    नोट: सूखे नमूने को विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो।
  9. एमएस मिश्रण समाधान के 300 μL में पुन: हल करें (आइसोप्रोपेनॉल / मेथनॉल / क्लोरोफॉर्म में 7.5 mM अमोनियम एसीटेट, 4: 2: 1 घोल)। भंवर प्रत्येक ट्यूब को 5 सेकंड के लिए सुनिश्चित करने के लिए कि सब कुछ भंग हो गया है। सेंट्रीफ्यूज 18,200 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए।
  10. सकारात्मक आयनीकरण मोड विश्लेषण (कॉलम 1-6) के लिए चित्रा 2 में प्लेट लेआउट के अनुसार माइक्रोलीटर प्लेट में 50 μL का एक एलिकोट स्थानांतरित करें और एमएस मिश्रण समाधान के 50 μL के साथ पतला करें।
  11. नकारात्मक आयनीकरण मोड विश्लेषण (कॉलम 7-12) के लिए चित्रा 2 में प्लेट लेआउट के अनुसार एमटीपी प्लेट में 20 μL का एक एलिकोट स्थानांतरित करें और एमएस मिश्रण के 80 μL के साथ पतला करें। प्लेट को पन्नी के साथ लपेटें और विश्लेषण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

6. एमएस विश्लेषण

  1. विश्लेषण से 5 दिन या उससे कम समय पहले निर्माता के निर्देशों के अनुसार सकारात्मक और नकारात्मक मोड दोनों में एक मास स्पेक्ट्रोमीटर (एमएस) को कैलिब्रेट करें।
  2. प्रत्यक्ष जलसेक नैनो-स्रोत को अग्रिम रूप से स्थापित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह एमएस के ट्रांसफर केशिका के खिलाफ ठीक से संरेखित है। चिप धारक में 4.1 μm नोजल चिप स्थापित करें और इसे सॉफ़्टवेयर में कॉन्फ़िगर करें।
  3. सकारात्मक और नकारात्मक मोड विधि सेटअप के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: 1.25 पीएसआई का गैस दबाव; 1.1 केवी का स्रोत वोल्टेज; नमूना इंजेक्शन की मात्रा का 5 μL; 2.5 सेकंड के लिए आउटपुट संपर्क बंद Rel1; डिलीवरी का समय 5 मिनट; प्लेट 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा।
  4. सकारात्मक मोड में प्रत्यक्ष जलसेक रोबोट के लिए विश्लेषण अनुक्रम कतार सेट करें।
  5. निम्न MS सेटिंग्स का उपयोग कर सकारात्मक मोड के लिए MS विधि सेट करें:
    1. केशिका तापमान को 250 डिग्री सेल्सियस और एस-लेंस आरएफ स्तर को 65.0 पर सेट करें। 1 ×10 6 के स्वचालित लाभ नियंत्रण और 50 एमएस के अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ 140,000 रिज़ॉल्यूशन पर 550-1000 मीटर / जेड रेंज में 0 से 1 मिनट तक पूर्ण स्कैन एमएस अधिग्रहण करें। 680.48022 का लॉक द्रव्यमान लागू करें।
    2. 250 मीटर / जेड के निश्चित पहले द्रव्यमान के साथ 17,500 रिज़ॉल्यूशन पर 1 और 5 मिनट की समय सीमा के बीच डेटा-स्वतंत्र एमएस / एमएस अधिग्रहण विधि सेट करें। 1 × 105 पर एमएस 2 के लिए एक स्वचालित लाभ नियंत्रण और 64 एमएस के अधिकतम इंजेक्शन समय, 20 एनसीई की टकराव ऊर्जा और 1 मीटर / जेड की अलगाव खिड़की का उपयोग करें। 1 डीए के द्रव्यमान चरण के साथ, 550 से 1,000 मीटर / जेड तक समावेश द्रव्यमान सूची का उपयोग करें।
  6. नकारात्मक मोड में अधिग्रहण के लिए, एमएस ट्यून फ़ाइल में केशिका तापमान को 250 डिग्री सेल्सियस और एस-लेंस आरएफ स्तर को 65.0 पर सेट करें।
    1. निम्नलिखित एमएस विधि सेटिंग्स का उपयोग करें: 400-940 मीटर / जेड रेंज को कवर करने वाले 140,000 रिज़ॉल्यूशन पर 0 से 1 मिनट तक पूर्ण-स्कैन अधिग्रहण मोड, 1 × 106 का स्वचालित लाभ नियंत्रण; 50 एमएस का अधिकतम इंजेक्शन समय; 529.46262 के लॉक द्रव्यमान का उपयोग करें।
    2. 150 मीटर / जेड के निश्चित पहले द्रव्यमान के साथ 17,500 के रिज़ॉल्यूशन पर रन के 1 से 5 मिनट के बीच डीआईए मोड में एमएस 2 अधिग्रहण सेट करें; 1 × 105 का स्वचालित लाभ नियंत्रण; अधिकतम इंजेक्शन समय के 64 एमएस; और टकराव ऊर्जा का 35 एनसीई। 1 डीए के द्रव्यमान चरण के साथ 400 से 940 तक समावेशन द्रव्यमान सूची का उपयोग करें।
  7. सकारात्मक मोड में एमएस सॉफ्टवेयर में विश्लेषण अनुक्रम कतार बनाएं। प्रत्येक नमूने के लिए प्रत्यक्ष जलसेक रोबोट से आने वाले संपर्क बंद संकेत द्वारा नमूना अधिग्रहण को ट्रिगर करने की प्रतीक्षा करें।
  8. जब सकारात्मक मोड विश्लेषण पूरा हो जाता है, तो नकारात्मक मोड में प्रत्यक्ष जलसेक रोबोट के लिए अनुक्रम कतार बनाएं।
  9. नकारात्मक मोड में एमएस सॉफ्टवेयर में विश्लेषण अनुक्रम कतार सेट करें।

7. डेटा प्रोसेसिंग

  1. डेटा फ़ाइलों को सकारात्मक और नकारात्मक मोड से .raw स्वरूप से .mzML स्वरूप में कनवर्ट करने के लिए, कनवर्टर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें.
    नोट: सकारात्मक और नकारात्मक मोड से डेटा फ़ाइलों को अलग-अलग परिवर्तित किया जाना चाहिए (उनकी अलग-अलग अधिग्रहण सेटिंग्स और विभिन्न शोर सीमा के कारण)।
    1. फ़ाइल रूपांतरण करने के लिए निम्न सेटिंग्स भरें: शोर सीमा कारक क्रमशः एमएस और एमएस 2 के लिए 3 और 5 है; एमएस और एमएस 2, डेटा संपीड़न, औसत एमएस 2 स्कैन और पीक पिकिंग दोनों के लिए शोर हटाने फ़ंक्शन को सक्रिय करें। सकारात्मक और नकारात्मक मोड (जैसे, 10,000 और 5,000; एक विशिष्ट उपकरण द्वारा उत्पादित विशेष नमूने के शोर स्तर के आधार पर परिभाषित किया जाना) के लिए टीआईसी थ्रेसहोल्ड सेट करें। प्रसंस्करण के अंत में एक्सएलसी और पीडीएफ रिपोर्ट उत्पन्न करें।
  2. लिपिड पहचान करें। निम्नलिखित (उदाहरण) फ़ाइल आयात सेटिंग्स पैरामीटर निर्धारित करें: चयन विंडो ±0.5 डीए (एमएस विधि में चयन विंडो पर निर्भर करता है); समय सीमा 2-300 एस (एमएस विधि में स्कैन समय पर निर्भर करता है); एमएस और एमएस 2 के लिए कोई अंशांकन द्रव्यमान नहीं; पीक सॉफ्टवेयर मेटाडेटा फ़ाइलों (न्यूनतम द्रव्यमान [एमएस]) और (न्यूनतम द्रव्यमान [एमएस 2]) द्वारा पीक से द्रव्यमान सीमा को स्थानांतरित और गोल करना; एमएस और एमएस 2 के लिए क्रमशः 3 पीपीएम और 10 पीपीएम की सहिष्णुता; एमएस और एमएस 2 थ्रेसहोल्ड फ़ील्ड, आवृत्ति फ़िल्टर, एमएस 1 ऑफसेट और पीएमओ खाली रखें; एमएस और एमएस 2 के लिए आइसोटोपिक सुधार का चयन किया गया; कनवर्टर मेटाडेटा फ़ाइल से रिज़ॉल्यूशन ग्रेडिएंट को (रिज़ॉल्यूशन रैखिक फिट [एमएस]) और (रिज़ॉल्यूशन रैखिक फिट [एमएस 2]) के रूप में स्थानांतरित करें।
    नोट: सकारात्मक और नकारात्मक मोड में लिपिड पहचान उनके अलग-अलग अधिग्रहण सेटिंग्स के कारण अलग-अलग की जानी चाहिए।
  3. डेटा आयात किए जाने के बाद, रन मेनू पर जाएं और लिपिड पहचान के लिए एमएफक्यूएल फाइलें अपलोड करें।
    नोट: एमएफक्यूएल की संरचना पर विस्तृत जानकारी के लिए, हर्ज़ोग एट अल.25 द्वारा प्रकाशन देखें। https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library पर MFQL फ़ाइलों के कुछ उदाहरण देखें और चर्चा देखें। डेटा प्रोसेसिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी एमएफक्यूएल पूरक सामग्री में प्रदान किए जाते हैं।
  4. लेबल किए गए आंतरिक मानक की संबंधित तीव्रता से लिपिड विशेषता की अग्रदूत द्रव्यमान तीव्रता को विभाजित करके और फिर लेबल किए गए आंतरिक मानक की एकाग्रता से भागफल को गुणा करके एमएस स्तर पर पहचानकी गई प्रजातियों की मात्रा निर्धारित करें। ब्रैडफोर्ड परख द्वारा मापे गए कुल प्रोटीन की मात्रा के प्रति अंतिम लिपिड एकाग्रता को सामान्य करें।

8. क्यूसी जांच प्रक्रिया

नोट: विधि की तकनीकी प्रजनन क्षमता को सत्यापित करने के लिए एक गुणवत्ता जांच प्रक्रिया एक आवश्यक कदम है। इसके लिए, प्रति बैच 15 समान एलिकोट (कुल पांच बैच) में 5 दिनों में विभिन्न लिपिड के अंतर्जात स्तर को निर्धारित करने के लिए एक वाणिज्यिक पूल प्लाज्मा का विश्लेषण किया जाता है। ध्यान दें कि, इस मामले में, आर सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर वातावरण का उपयोग करके एक शाइनी वेब एप्लिकेशन के रूप में एक डेटा मूल्यांकन पाइपलाइन बनाई गई थी।

  1. संदर्भ स्वीकृति सीमा को सभी पांच बैचों ±3 मानक विचलन के लिए गणना किए गए औसत मूल्य के रूप में परिभाषित करें।
  2. प्रत्येक विश्लेषणात्मक बैच के लिए "पास" स्वीकृति नियम लागू करें: संदर्भ लक्ष्यों का 90% पारित होना चाहिए, यह देखते हुए कि एक संदर्भ यौगिक एक लिपिड वर्ग का प्रतिनिधित्व करता है। उदाहरण के लिए, यदि क्यूसी सत्यापन में 15 संदर्भ लक्ष्य शामिल हैं, तो सुनिश्चित करें कि बैच को स्वीकार करने के लिए 13 लक्ष्य गुजरते हैं।
    नोट: दूसरे शब्दों में, प्रति संदर्भ यौगिक क्यूसी नमूने का 68% इस लिपिड वर्ग को स्वीकार करने के लिए डेटा के लिए पास होना चाहिए।
  3. यदि अध्ययन बैच क्यूसी जांच के लिए स्वीकृति मानदंडों को पूरा नहीं करता है, तो प्रक्रिया को दोहराएं।

9. संयुग्मित फैटी एसिड की मात्रा का अनुमान

  1. प्रत्येक लिपिड वर्ग के लिए, उनके एमएस 2 तीव्रता के आधार पर संयुग्मित फैटी एसिड की मात्रा का अनुमान लगाएं।
    नोट: विखंडन और आयनीकरण मतभेदों के कारण, व्युत्पन्न मूल्य केवल नमूना समूहों में सापेक्ष बहुतायत तुलना के लिए थे, उदाहरण के लिए, लिपिड वर्ग के समग्र संयुग्मित फैटी एसिड पूल में एक विशिष्ट फैटी एसिड के सापेक्ष योगदान का अनुमान लगाने के लिए।
  2. फैटी एसिड के टुकड़ों की एमएस 2 तीव्रता को संबंधित आंतरिक मानक के फैटी एसिड टुकड़ों की औसत तीव्रता से सामान्य करें। आंतरिक मानक और मापा ऊतक वजन की एकाग्रता के आधार पर, संयुग्मित फैटी एसिड के लिए "सामान्यीकृत एकाग्रता" प्राप्त करें। प्रति नमूने प्रत्येक संयुग्मित फैटी एसिड की कुल मात्रा का अनुमान लगाने के लिए प्रति लिपिड वर्ग इन मूल्यों को सारांशित करें।

10. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. सांख्यिकीय विश्लेषण करें। प्रत्येक स्थिति और संबंधित नियंत्रण समूह के लिए एक रैखिक मॉडल फिट करें, और लॉग 2-रूपांतरित डेटा के लिए टी-सांख्यिकी से पी मानों की गणना करें। कई परीक्षण प्रभावों को सही करने के लिए बेंजामिनी-होचबर्ग झूठी खोज दर विधि का उपयोग करें।
    नोट: 0.05 < समायोजित पी मान वाले लिपिड को अलग-अलग प्रचुर मात्रा में माना जाता है। यहां, आर सांख्यिकीय वातावरण26 में सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था।

Representative Results

यहां, प्रतिनिधि परिणामों के रूप में, हम डेटा प्रस्तुत करते हैं कि चूहों के फेफड़ों पर सीएस के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए शॉटगन लिपिडोमिक्स का उपयोग कैसे किया जा सकता है। शॉटगन लिपिड विश्लेषण प्रोटोकॉल को नमूनों के दो समूहों के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए विवो अध्ययन में सफलतापूर्वक लागू किया गया था: सीएस (3आर 4 एफ समूह; सकारात्मक नियंत्रण) के संपर्क में आने वाले नौ महिला एपो-/- चूहों से विच्छेदित फेफड़ों के ऊतक और 3 महीने में एकत्र किए गए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ताजा हवा की स्थिति (शाम समूह) के तहत बनाए गए चूहों की एक समान संख्या, 4 महीने, और 6 महीने एक्सपोजर समय बिंदु। जानवरों को 2 डिग्री सेल्सियस तापमान के ± 22 डिग्री सेल्सियस और 15% आर्द्रता ± 55% पर फ़िल्टर और वातानुकूलित ताजी हवा के तहत रखा गया था और गामा-विकिरणित गोली आहार के साथ खिलाया गया था। प्रकाश व्यवस्था प्रति दिन 12 घंटे पर बनाए रखी गई थी। प्रत्येक पिंजरे में आठ चूहों को रखा गया था। एक्सपोजर उपचार के लिए 3R4F संदर्भ सिगरेट केंटकी विश्वविद्यालय से 3R4F CS एरोसोल (कुल कण पदार्थ TPM/L एरोसोल का 600 μg) उत्पन्न करने के लिए खरीदी गई थी, जो 3R4F सिगरेट से 28 μg निकोटीन / L के बराबर लक्ष्य जोखिम एकाग्रता के लिए थी.CS 3R4F सिगरेट से धुआं 30 पोर्ट रोटरी धूम्रपान मशीनों का उपयोग करके उत्पादित किया गया था। . हेल्थ कनाडा इंटेंसिव स्मोकिंग प्रोटोकॉल के आधार पर, पर्याप्त एक्सपोजर प्रदान करने के लिए 3आर 4 एफ सिगरेट पर 55 एमएल पफ वॉल्यूम, प्रति 30 सेकंड में एक पफ और वेंटिलेशन छेद की 100% रुकावट लागू की गई थी। अध्ययन डिजाइन पर सभी अतिरिक्त विवरण पहले27,28 रिपोर्ट किए गए हैं।

कुल मिलाकर, 14 सबसे प्रचुर मात्रा में लिपिड वर्गों से ~ 400 आणविक लिपिड प्रजातियों की पहचान और मात्रा निर्धारित की गई (चित्रा 3)। पीई, पीईओ, पीसी, पीसी, पीआई और पीजी लिपिड वर्गों के लिए प्रति वर्ग कुल सामान्यीकृत लिपिड एकाग्रता थोड़ी बढ़ी थी, और एसएम, एलपीई और पीए लिपिड (चित्रा 3 ए) के लिए कुछ डाउनरेग्यूलेशन देखा गया था, जबकि टीएजी और पीएस के लिए कोई अंतर नहीं देखा जा सकता था। . प्लास्मोलोजेन लिपिड के इंट्रासेल्युलर कार्यों में से एक एंटीऑक्सिडेंट गतिविधि है। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन (आरओएस) और नाइट्रोजन प्रजातियों (आरएनएस) के संपर्क में, डायसिल फॉस्फोलिपिड्स की तुलना में प्लास्मोलोजीन्स के चयनात्मक ऑक्सीकरणकी सूचना दी गई थी। प्लास्मोलोगेंस की रासायनिक संरचना में एनाइल-ईथर बंधन ऑक्सीडेटिव तनाव31 पर कट्टरपंथी हमले के प्रति संवेदनशील है। कट्टरपंथी हमले के प्रमुख उत्पाद हाइड्रॉक्सिलेटेड इकोसेटट्राएनोइक एसिड, 2-मोनोसिलग्लिसरॉल फॉस्फोलिपिड्स, पेंटाडेकैनोल, फॉर्मिक एसिड, विभिन्न श्रृंखला लंबाई के α-हाइड्रॉक्सीअल्डिहाइड, 1-फॉर्माइल-2-अराचिडोनोइल ग्लिसरोफॉस्फोलिपिड और लाइसोफॉस्फोलिपिड्स हैं।

इन परिणामों से पता चलता है कि, कुल आणविक सूत्र के आधार पर आणविक विशेषताओं के बीच, 100-120 यौगिक सीएस एक्सपोजर (चित्रा 3 डी) से काफी प्रभावित हुए थे। एमएस 2 विखंडन जानकारी के विस्तृत डीकन्वोल्यूशन और टुकड़ा संकेत तीव्रता के सामान्यीकरण ने प्रत्येक लिपिड वर्ग (चित्रा 3 ई) में प्रतिनिधित्व किए गए प्रत्येक संयुग्मित फैटी एसिड (एफए) की कुल मात्रा की अनुमानित परिभाषा और उजागर और नियंत्रण समूहों के बीच इन आंकड़ों की तुलना की अनुमति दी। पूरी तरह से संतृप्त एफए और केवल कुछ असंतृप्तता वाले दोनों में एक स्पष्ट कमी देखी गई, ज्यादातर लाइसो-लिपिड के संदर्भ में। इसके विपरीत, पीसी, पीई और पीजी फॉस्फोलिपिड वर्गों की संरचना में पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड (पीयूएफए) को सीएस समूह में सभी समय बिंदुओं के लिए ऊंचा किया गया था। ईकोसापेंटेनोइक (ईपीए) और डोकोसाहेक्साएनोइक एसिड (डीएचए) के साथ संयुग्मित पीसी और पीजी के चरम मामलों को विशेष रूप से 3 आर 4 एफ सीएस एक्सपोजर समूह (चित्रा 3 ई, लाल रंग) में पाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: ब्रैडफोर्ड परख में नमूना वितरण के लिए प्लेट लेआउट। रिक्त और मानक नमूने कॉलम 1-3 में तीन प्रतियों में रखे जाते हैं; अज्ञात नमूने कॉलम 4-11 में डुप्लिकेट में रखे गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: शॉटगन मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट का प्लेट लेआउट। सकारात्मक आयनीकरण मोड में अधिग्रहण के लिए रिक्त, मानक, अज्ञात और क्यूसी नमूनों का वितरण प्लेट के बाईं ओर मैप किया गया है (कॉलम 1-6); नकारात्मक आयनीकरण मोड के लिए सभी नमूने दाईं ओर रखे गए हैं (कॉलम 7-12)। संक्षिप्तरूप: पीओएस = सकारात्मक; क्यूसी = गुणवत्ता नियंत्रण; नकारात्मक = नकारात्मक; टीबी = कुल रिक्त। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सिगरेट के धुएं के संपर्क में आने वाले माउस फेफड़ों का शॉटगन लिपिडोमिक्स विश्लेषण। चूहों को 3R4F संदर्भ सिगरेट या ताजी हवा (शाम) से CS के संपर्क में लाया गया था। (ए) लिपिड वर्ग सांद्रता और प्रति वर्ग लिपिड प्रजातियों की संख्या। प्रत्येक वर्ग के लिए, मात्रात्मक लिपिड प्रजातियों की संख्या कोष्ठक में दी गई है। प्रत्येक लिपिड वर्ग के लिए औसत और 95% आत्मविश्वास अंतराल, प्रत्येक एक्सपोज़र प्रकार के लिए अलग-अलग (तीन समय बिंदुओं में एकत्रित)। (बी) ज्वालामुखी भूखंड तीन समय बिंदुओं पर 3 आर 4 एफ सीएस बनाम शाम तुलना के लिए मात्रात्मक लिपिड प्रजातियों के प्रभाव आकार (लॉग 2 गुना परिवर्तन) और महत्व (-लॉग 10 एफडीआर-समायोजित पी मान) को दर्शाते हैं। काफी ऊंचा लिपिड पीले रंग में चिह्नित किया जाता है; काफी कम लिपिड को सियान (एफडीआर-समायोजित पी मान < 0.05) में चिह्नित किया गया है। (ग) सबसे बड़े निरपेक्ष माध्य गुणा परिवर्तनों के साथ 25 लिपिड प्रजातियों की विभेदक प्रचुरता। 3R4F CS बनाम शाम तुलना के लिए लॉग 2 गुना परिवर्तन रंग-कोडित हैं, और सांख्यिकीय महत्व इंगित किया गया है: *: FDR-समायोजित p मान < 0.01; एक्स: एफडीआर-समायोजित पी मान 0.05 <। (घ) तुलनात्मक भूखंड। फोल्ड-परिवर्तन तुलना के लिए सहसंबंध गुणांक रंग-कोडित होते हैं, और साझा अंतर प्रचुर मात्रा में लिपिड की संख्या इंगित की जाती है (मार्जिन में कुल संख्या)। पाई चार्ट परिवर्तन की समान दिशा (एफसी संकेत) के साथ साझा अंतर प्रचुर मात्रा में लिपिड का प्रतिशत दिखाते हैं। तारांकन अलग-अलग प्रचुर मात्रा में लिपिड के एक महत्वपूर्ण ओवरलैप को इंगित करता है। (ई) प्रति लिपिड वर्ग संयुग्मित एफए की विभेदक प्रचुरता। संयुग्मित फैटी एसिड के लिए पैनल सी में हीटमैप सभी तीन समय बिंदुओं (एफडीआर-समायोजित पी मान < 0.05) में 3 आर 4 एफ और शाम एक्सपोजर के बीच महत्वपूर्ण प्रचुरता अंतर के साथ है। प्रति लिपिड वर्ग प्रत्येक फैटी एसिड की मात्रा का अनुमान फैटी-एसिड टुकड़ों की एमएस 2 तीव्रता के आधार पर लगाया गया था। संक्षेप: सीएस = सिगरेट का धुआं; एफडीआर = झूठी खोज दर; एफसी = गुना परिवर्तन; एफए = फैटी एसिड; पीसी = फॉस्फेटिडिलकोलाइन; पीएस = फॉस्फेटिडिलसेरिन; टीएजी = ट्राईसिलग्लिसरॉल; एसएम = स्फिंगोमाइलिन; पीईओ = प्लास्मोलोजेन फॉस्फेटिडिलेथेनॉलमाइन; पीई = फॉस्फेटिडिलथेनॉलमाइन; पीजी = फॉस्फेटिडिल ग्लिसरॉल; पीआई = फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल; डीएजी = डायसिलेग्लिसरॉल; एसई = स्टेरोल / कोलेस्टेरिल एस्टर; पीसीओ = प्लास्मोलोजेन फॉस्फेटिडिलकोलाइन; एलपीसी = लाइसो फॉस्फेटिडिलकोलाइन; एलपीई = लाइसो फॉस्फेटिडिलेथेनॉलमाइन; पीए = फॉस्फेटिडिक एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बीएसए अंतिम एकाग्रता (मिलीग्राम / एमएल) 2 mg/mL पर BSA समाधान अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर (μL)
1 50 50
0.75 37.5 62.5
0.5 25 75
0.25 12.5 87.5
0.125 12.5 187.5
0.0625 0.125 mg/mL घोल में से 50 50
0 0 100

तालिका 1: ब्रैडफोर्ड परख के लिए अंशांकन वक्र के लिए बीएसए आंतरिक मानक की कमजोर पड़ने की योजना। संक्षिप्त नाम: बीएसए = गोजातीय सीरम एल्बुमिन।

पूरक जानकारी: लिपिडएक्सप्लोरर लिपिड पहचान के लिए उपयोग की जाने वाली एमएफक्यूएल फाइलें। .zip पैकेज में व्यक्तिगत आवश्यक एमएफक्यूएल फाइलें होती हैं, जिनमें से प्रत्येक को इस पैटर्न के बाद नामित किया जाता है: <लिपिड वर्ग संक्षिप्त नाम>_<आयनीकरण मोड>_MS2.mfql (उदाहरण के लिए, PE_neg_MS2.mfql)। लेबल किए गए आंतरिक मानक पहचान के लिए फ़ाइल नामों में <लिपिड संक्षिप्त नाम> (जैसे, PED7_neg_MS2.mfql) में D7 (D9) टैग शामिल है। इन MFQL फ़ाइलों का उपयोग आंतरिक मानक में ड्यूटेरियम की मात्रा को सत्यापित करने के लिए किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यद्यपि एमएस में प्रगति ने कई लिपिड प्रजातियों की सटीक निगरानी के लिए कई तरीके दिए हैं, विभिन्न स्तनधारी ऊतकों की पिछली लिपिड प्रोफाइलिंग ने लगातार परिणाम नहीं दिखाए और परिणामस्वरूप, लिपिड के विशेष ऊतक-विशिष्ट कार्य स्पष्ट नहीं हैं। प्रोटीन कार्यात्मक विश्लेषण की तुलना में, जिसके लिए विशेष यौगिकों की अभिव्यक्ति को बाहर निकालने के लिए अधिक मजबूत दृष्टिकोण उपलब्ध हैं, अधिकांश लिपिड को चुनिंदा रूप से बंद नहीं किया जा सकता है या ऊतकों में अतिरंजित नहीं किया जा सकता है, जिससे लिपिड का कार्यात्मक मूल्यांकन मुश्किल हो जाता है। ऊतक लिपिडोम सांद्रता की उन्नत प्रोफाइलिंग परिसंचारी लिपिड और मानव रोगों के बीच संबंधों की पहचान करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान कर सकती है।

किसी भी माउस ऊतक के अंतर्जात लिपिड प्रोफाइल को गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से कवर करने में सक्षम व्यापक लिपिडोमिक्स विधियों का मूल्यांकन करने में, हमने शॉटगन लिपिडोमिक्स विधि को प्राथमिकता दी। सामान्य तौर पर, दो विपरीत प्रकार के नमूना विश्लेषण संभव हैं: या तो नमूने की कुल लिपिड जटिलता को प्रकट करने के लिए आगे मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) आधारित पृथक्करण का उपयोग करके लिपिड की पूरी तरह से अलक्षित स्क्रीनिंग, या लक्षित दृष्टिकोण, जो ज्यादातर रुचि के विशिष्ट लिपिड की बहुत सटीक मात्रा की अनुमति देते हैं। इसके विपरीत, प्रस्तुत शॉटगन लिपिडोमिक्स वर्कफ़्लो की मजबूत विशेषता पूर्वनिर्धारित लिपिड वर्गों से सैकड़ों अंतर्जात लिपिड का तेजी से व्यापक कवरेज है, जिसे अभी भी एक मजबूत अर्ध-मात्रात्मक तरीके से किया जा सकता है।

विभिन्न लिपिड वर्गों की आयनीकरण क्षमता संरचना-निर्भर है और विभिन्न प्रयोगात्मक आयनीकरण स्थितियों के आधार पर काफी भिन्न हो सकती है। एलसी-आधारित पृथक्करण विधियों के विपरीत, शॉटगन विश्लेषण एमएस उपकरण में एक ही आयनीकरण स्थितियों के तहत पूरे लिपिड अर्क के प्रत्यक्ष एक साथ जलसेक के कारण इन अंतरों को कम करता है। आइसोटोपिक रूप से लेबल किए गए लिपिड एनालॉग या संरचनात्मक रूप से समान गैर-अंतर्जात मानकों का उपयोग सभी लिपिड वर्गों के अर्ध-परिमाणीकरण की अनुमति देता है। शॉटगन लिपिडोमिक्स एमएस विश्लेषण के दौरान कम अंतर-और इंट्रा-रन परिवर्तनशीलता प्रदान करता है; नतीजतन, यह विधि अलक्षित तरल क्रोमैटोग्राफी-आधारित विधियों की तुलना में भिन्नता21 के कम गुणांक पैदा करती है, जिसके लिए पर्याप्त मात्रा के लिए कई मानकों की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण रूप से, जबकि वर्तमान विधि में कोई बाहरी अंशांकन वक्र का उपयोग नहीं किया जाता है, विधि को अभी भी पूरी तरह से मात्रात्मकमाना जाता है।

लेबल किए गए आंतरिक मानक (या बिना लेबल मानक जो अंतर्जात रूप से व्यक्त नहीं किया जाता है) प्रति लिपिड वर्ग का एक स्तर अधिकांश लिपिड की मात्रा का परिमाणीकरण के लिए पर्याप्त है। केवल कुछ प्रकाशनों ने शॉटगन लिपिडोमिक्स विधि के लिए आंशिक विधि सत्यापन की सूचना दी है। उदाहरण के लिए, ग्रिज़बेक एट अल.17 और सुरमा एट अल.21 में, आंतरिक मानकों और नमूना मैट्रिक्स की एक निश्चित मात्रा का उपयोग करके उलट अंशांकन वक्र तैयार किए गए थे। रैखिकता का मूल्यांकन लॉग-रूपांतरित लिपिड मात्रा और उनकी तीव्रता के रैखिक प्रतिगमन द्वारा किया गया था और क्रमशः आर2 और ढलान के रूप में रिपोर्ट किया गया था। पहचान की सीमा (एलओडी) और मात्रा की सीमा (एलओक्यू) को एलओडी के लिए 3 और एलओक्यू के लिए 10 के सिग्नल-टू-शोर अनुपात के आधार पर भारित रैखिक प्रतिगमन द्वारा निर्धारित किया गया था। अधिकांश लिपिड वर्गों के लिए, एलओक्यू को वसा ऊतक के लिए 2-9.8 pmol और प्लाज्मा में 0.05-5μM के बीच परिभाषित किया गया था। दोनों मामलों में, वर्ग में सभी लिपिड के लिए अनुमान प्राप्त करने के लिए प्रति वर्ग गैर-अंतर्जात एकल आंतरिक मानकों का उपयोग किया गया था। हालांकि, इस काम में, हम कई चिंताओं के कारण एलओडी / एलओक्यू प्रदान नहीं करते हैं: अंतर्जात मैट्रिक्स यौगिक-मुक्त नहीं है, और ऊतकों के लिए सरोगेट मैट्रिक्स अनुपलब्ध है- इसके साथ, मानकों की छोटी ज्ञात मात्रा की स्पाइक संभव नहीं है। हम शुद्ध मानकों के गैर-अस्तित्व और समस्थानिक रूप से लेबल किए गए लिपिड की बहुत सीमित उपलब्धता के कारण अपने समान समस्थानिक रूप से लेबल मानक द्वारा सामान्यीकृत किसी विशेष यौगिक की अंशांकन वक्र श्रृंखला के उपयोग के साथ एक शास्त्रीय लक्षित परिमाणीकरण दृष्टिकोण नहीं करते हैं। ऑर्बिट्रैप डिटेक्टर स्वचालित रूप से फूरियर परिवर्तन लागू करके क्षणिक संकेत का रूपांतरण करते हैं, और कुछ सिग्नल पहले से ही प्रतिस्थापित होते हैं- परिणामस्वरूप, कम एकाग्रता सीमा केवल कुछ न्यूनतम संकेत के लिए रैखिक होगी, जिसके नीचे अणु अब पता लगाने योग्य नहीं होगा। एक्सकैलिबर सॉफ्टवेयर सिग्नल-टू-शोर मान अणु के एम / जेड अनुपात पर निर्भर करते हैं; नतीजतन, प्रत्येक लिपिड वर्ग के यौगिक, जिसमें फैटी एसिड के विभिन्न संयोजन होते हैं, में अलग-अलग शोर मान होंगे। इसके अलावा, एलओक्यू / एलओक्यू मान मैट्रिक्स के प्रकार से सख्ती से जुड़े होते हैं, और जब लिपिडोम का परिमाणीकरण विभिन्न कृंतक ऊतकों में किया जाता है, तो इसे प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए व्यक्तिगत रूप से एलओक्यू के मूल्यांकन से परिलक्षित किया जाना चाहिए।

वास्तव में, विधि33 परिमाण के चार आदेशों तक की एक उच्च रैखिक गतिशील परिमाणीकरण सीमा प्रदान करती है और सबसे महत्वपूर्ण अंतर्जात संरचनात्मक लिपिड को कवर करने के लिए बहुत अच्छी संवेदनशीलता प्रदान करती है, जिसे एमएस अधिग्रहण32 में तकनीकी सुधार द्वारा और बढ़ाया जा सकता है। औसत लिपिड सांद्रता की भिन्नता के गुणांक ज्यादातर 15% से नीचे थे, जिसका अर्थ है कि शॉटगन लिपिडोमिक्स खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) आवश्यकताओं का अनुपालन करता है, जिसे अच्छे प्रयोगशाला अभ्यास (जीएलपी) और अच्छे नैदानिक अभ्यास (जीसीएलपी)अध्ययनों के लिए माना जाता है।

हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, उनकी अलग-अलग ध्रुवीयता के कारण, कुछ लिपिड वर्ग विशिष्ट संयुग्मित एफए के योगदान से बहुत अधिक प्रभावित हो जाते हैं। इससे संयुग्मित एफए की एक विस्तृत श्रृंखला वाले इक्विमोलर मिश्रण में तीव्रता प्रतिक्रिया में विकृति होती है, जिसके परिणामस्वरूप परिमाणीकरण पूर्वाग्रह होता है, जैसा कि फॉस्फोलिपिड वर्गों के लिए कोइवुसालो एट अल .35 द्वारा उजागर किया गया है। ध्यान दें, इन लेखकों ने 24-48 श्रृंखला लंबाई से एफए की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए डेटा प्रस्तुत किया, जो संभवतः वास्तविक जैविक नमूने में स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं करता है। पॉलीअनसेचुरेटेड प्रजातियों के लिए प्रतिक्रिया पूरी तरह से संतृप्त प्रजातियों की तुलना में 40% अधिक थी, लेकिन यह प्रभाव केवल उच्च सांद्रता के लिए देखा गया था। जब मिश्रण को उत्तरोत्तर पतला किया गया, तो असंतृप्ति का प्रभाव धीरे-धीरे कम हो गया और प्रति प्रजाति 0.1 pmol / μL पर लगभग गायब हो गया। इसके अतिरिक्त, सभी माप आयन ट्रैप और ट्रिपल क्वाड्रोपोल उपकरणों पर किए गए थे, न कि क्यू-सटीक उपकरण पर।

प्रस्तुत वर्कफ़्लो का एक और लाभ इसका तकनीकी लचीलापन है, जो विशिष्ट परियोजना आवश्यकताओं के अनुकूलन की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, किसी भी लिपिड निष्कर्षण प्रोटोकॉल - जैसे कि संशोधित ब्लिघ और डायर36, मिथाइल टर्ट-ब्यूटाइल ईथर37, या बुटानॉल-मेथनॉल38 विधियों - का उपयोग एमएस विश्लेषण से पहले कुल लिपिड अर्क तैयार करने के लिए किया जा सकता है। क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल निष्कर्षण की मुख्य सीमा यह है कि निचले चरण में लिपिड अंश होता है, जो नियमित कार्य और विशेष रूप से स्वचालन को जटिल बनाता है; इसके अलावा, क्लोरोफॉर्म की विषाक्तता पर विचार किया जाना चाहिए। टर्ट-ब्यूटाइल ईथर निष्कर्षण का व्यापक रूप से प्लाज्मा नमूने37 के लिपिड विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, और एक स्वचालित संस्करणप्रस्तावित किया गया है। इस मामले में, हमने बीयूएमई विधि को चुना क्योंकि यह स्पाइक्ड पीजी, पीआई, पीए और पीएस लिपिड वर्ग38, कम विलायक खपत और स्वचालन39 की संभावना के लिए और भी बेहतर वसूली प्रदान करता है, जबकि सभी तीन तरीकों से निकाले गए ऊतक नमूनों के लिए निर्धारित समग्र सांद्रता तुलनीय थी। इसके अतिरिक्त, जबकि नमूना निष्कर्षण वर्तमान काम में मैन्युअल रूप से किया गया था, 96-वेल प्रारूप40,41 में स्वचालित नमूना तैयारी और लिपिड निष्कर्षण द्वारा बड़े नमूना सेट से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सटीक परिणाम प्राप्त करना भी संभव है। यह बड़े पैमाने पर नैदानिक और विष विज्ञान अध्ययनों में लिपिडोमिक्स विश्लेषण को लागू करने की अनुमति देता है।

वर्तमान काम में, हमने ध्रुवता स्विचिंग के बिना सकारात्मक और नकारात्मक मोड के एमएस अधिग्रहण का प्रदर्शन किया, जैसा कि शुहमन एट अल .42 द्वारा वर्णित है। सकारात्मक मोड की तुलना में थोड़ा कम केंद्रित समाधान के लिए नकारात्मक मोड में नैनोमेट सिग्नल की स्थिरता बेहतर है। इसके अतिरिक्त, हमने .raw फ़ाइलों से एमजेडएमएल में कनवर्टर सॉफ्टवेयर के साथ एक पूरी तरह से पता लगाने योग्य प्रक्रिया विकसित की, जो लिपिडएक्सप्लोरर सॉफ्टवेयर में निर्दिष्ट किए जाने वाले मूल्यों को प्रदान करता है - इसके साथ, मैनुअल रिज़ॉल्यूशन ढलान गणना की आवश्यकता नहीं है। हमने विभिन्न शोर सेटिंग प्रतिस्थापन भी लागू किए क्योंकि, सकारात्मक मोड में, स्पेक्ट्रा के शोर का स्तर नकारात्मक मोड की तुलना में अधिक है। सभी चरणों को ट्रेस करने योग्य, उच्च-थ्रूपुट नियमित विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया था।

पहचान के लिए, शॉटगन लिपिडोमिक्स विश्लेषण विभिन्न लिपिड वर्गों के अद्वितीय व्यवहार का फायदा उठा सकता है, जो विभिन्न ध्रुवीयता मोड में अद्वितीय जोड़ बनाते हैं। इस विधि में, सकारात्मक आयनीकरण मोड में ओवरलैप होने वाले समान आणविक द्रव्यमान वाले पीसी और पीई प्रजातियों को नकारात्मक आयनीकरण मोड में पूरी तरह से अलग किया जा सकता है, क्योंकि पीसी एसीटेट या फॉर्मेट जोड़ बनाता है, और पीई को अवक्षेपित रूप में आयनित किया जाता है। इसके अलावा, न केवल आणविक सूत्र बल्कि थोक फैटी एसिड संरचना का उपयोग करने वाली विधि के लिए (आंशिक) संरचनात्मक डीकन्वोल्यूशन संभव है। उदाहरण के लिए, कुल कार्बन और कुल असंतृप्ति गणना के स्तर पर एफए पहचान सभी फॉस्फोलिपिड्स, डीएजी, टीएजी और लाइसो-फॉस्फोलिपिड्स के लिए काम करती है। प्रत्येक आइसोमेरिक फॉर्म का बॉटम-अप परिमाणीकरण आंशिक रूप से फॉस्फोलिपिडवर्गों 43 में से कुछ के लिए किया जा सकता है, लेकिन एमएस 2 स्पेक्ट्रा में विभिन्न एफए की असमान संकेत प्रतिक्रिया के कारण डीएजी और टीएजी के लिए बहुत अधिक जटिल है।

इस क्षेत्र में हाल की पहलों के साथ पूरी तरह से संरेखित, उपयुक्त गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रियाओं को लागू करने की आवश्यकता पर जोर देना भी महत्वपूर्णहै। जैसा कि हम प्रयोगशाला के बीच और भीतर उचित डेटा ट्रेसेबिलिटी और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करना चाहते हैं, कई कदम उठाए गए हैं जैसे विश्लेषण के सभी चरणों के लिए नमूनों का उचित यादृच्छिकरण, आपूर्तिकर्ता-प्रमाणित मानक मिश्रण के साथ काम करना, गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों को शामिल करना, बैच स्वीकृति या अस्वीकृति को सत्यापित करने की प्रक्रियाएं, और लंबी अवधि में क्यूसी प्रदर्शन को ट्रैक करने के लिए एक आंतरिक डेटाबेस का निर्माण। इसके अलावा इन पहलों के अनुरूप नमूना स्थिरता को संबोधित करने के लिए एक मानकीकृत विधि की आवश्यकता है। सामान्य तौर पर, अधिकांश संरचनात्मक लिपिड लिपिड ऑक्सीकरण से प्रभावित नहीं होते हैं, जो ऑक्सीलिपिन, ऑक्सीकृत लिपिड और पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड के लिए अधिक प्रासंगिक है, इसलिए, भंडारण और हैंडलिंग स्थितियों के प्रति बहुत अधिक संवेदनशील हैं। हालांकि, नमूना स्थिरता का सही मूल्यांकन अभी भी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कार्य है।

हालांकि, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है जब यह यौगिकों के उप-आणविक स्तरों को निर्धारित करने की बात आती है। यह देखते हुए कि कुल अर्क का कोई पृथक्करण नहीं है, एक ही आणविक द्रव्यमान वाले लिपिड के सभी आइसोफॉर्म लेकिन विभिन्न फैटी एसिड रचनाओं को एमएस विश्लेषण में विलय कर दिया जाता है। अधिकांश वर्गों के लिए, एमएस 2 में अवशिष्ट फैटी एसिड टुकड़ों के विखंडन अनुपात का उपयोग करके संरचना के आंशिक विघटन को प्राप्त करना संभव है। हालांकि, प्रत्येक आइसोफॉर्म की स्वतंत्र मात्रा का निर्धारण विभिन्न आइसोफॉर्म के विखंडन व्यवहार में बड़े अंतर के कारण एक विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण कार्य बना हुआ है और तथ्य यह है कि शुद्ध रासायनिक मानक मुआवजा मूल्यों को परिभाषित करने के लिए पर्याप्त विविधता में उपलब्ध नहीं हैं। एक और सीमा यह है कि ईएसआई प्रक्रिया अनिवार्य रूप से कलाकृतियों को उत्पन्न करती है, जिसके परिणामस्वरूप डीएजी, पास और एफए जैसे कुछ लिपिड के लिए चोटियों की कृत्रिम पीढ़ी होती है, जिससे गलत परिमाणीकरण हो सकता है।

इसके बाद, हम अपने अनुभव के आधार पर प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण हिस्सों को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं। पहला इस तथ्य से संबंधित है कि प्रत्येक माउस ऊतक प्रकार में लिपिड राशि और वर्ग अनुपात दोनों के संदर्भ में एक अद्वितीय लिपिड प्रोफ़ाइल होती है। इसके साथ, निष्कर्षण से पहले कुल प्रोटीन सामग्री के आधार पर ऊतक की शुरुआती मात्रा को सावधानीपूर्वक निर्धारित किया जाना चाहिए ताकि एमएस सिग्नल को संतृप्त न किया जा सके और उच्च सांद्रता33 पर लिपिड एकत्रीकरण के कारण गतिशील परिमाणीकरण सीमा को न छोड़ा जा सके या - विपरीत चरम पर - प्रत्येक लिपिड वर्ग के लिए प्रमुख लिपिड यौगिकों को कवर करने के लिए पर्याप्त एमएस संकेत प्रदान किया जा सके।

दूसरा महत्वपूर्ण पहलू मास स्पेक्ट्रोमीटर के ट्रांसफर केशिका के साथ प्रत्यक्ष जलसेक नैनो-स्रोत चिप आउटलेट की स्थिति का उचित संरेखण सुनिश्चित करना है। यह देखते हुए कि दोनों मोड में मास स्पेक्ट्रोमीटर का पूर्ण अंशांकन साप्ताहिक रूप से किया जाता है, अंशांकन स्रोत और नैनो-स्रोत चिप सेटअप के बीच स्वैपिंग स्थापना के दौरान गलत संरेखण के कारण सिग्नल तीव्रता में नाटकीय परिवर्तनशीलता का कारण हो सकता है।

प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण हिस्सा आंतरिक मानक मिश्रण का सावधानीपूर्वक संचालन है। चूंकि इस मिश्रण में डाइक्लोरोमेथेन की एक महत्वपूर्ण मात्रा होती है, एक बार खोलने के बाद, इसे लंबे भंडारण और वाष्पीकरण और कृत्रिम एकाग्रता परिवर्तन के लिए कई उपयोगों से बचने के लिए जल्दी से सेवन किया जाना चाहिए। इसके अलावा, -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से हटाने के बाद मानक मिश्रण की लगातार हैंडलिंग महत्वपूर्ण है, क्योंकि तापमान अंतर से एयर-कुशन पिपेट के साथ पाइपिंग के दौरान मात्रा विसंगतियां हो सकती हैं। एक विकल्प शुद्ध मेथनॉल के साथ मानक पुन: निलंबन बफर में डाइक्लोरोमेथेन को बदलना होगा, जो हैंडलिंग सुविधा में सुधार कर सकता है लेकिन कुछ लिपिड वर्गों की घुलनशीलता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है और इस प्रकार, इन लिपिड वर्गों के लिए परिमाणीकरण सटीकता को कम कर सकता है।

अंतिम महत्वपूर्ण हिस्सा डेटा प्रोसेसिंग है। डेटा प्रोसेसिंग वर्कफ़्लो पीक द्वारा पीक सॉफ्टवेयर रूपांतरण को .raw से .mzML प्रारूप में जोड़ रहा है, MS2 स्कैन औसत और MS1 और MS2 शोर निस्पंदन को लागू कर रहा है, साथ ही पीक पिकिंग और डेटा संपीड़न भी कर रहा है। एक विकल्प के रूप में, प्रोटिओविजार्ड सॉफ्टवेयर का उपयोग डेटा रूपांतरण के लिए भी किया जा सकता है, लेकिन, इस मामले में, लिपिडएक्सप्लोरर में कई सेटिंग्स को मैन्युअल रूप से परिभाषित किया जाना है। शॉटगन लिपिडोमिक्स की सभी जटिलता विशेष रूप से प्रत्यक्ष इंजेक्शन एमएस 1 और एमएस 2 स्पेक्ट्रा के डीकन्वोल्यूशन के चरण पर केंद्रित है। ओपन-सोर्स लिपिडएक्सप्लोरर सॉफ्टवेयर बड़े पैमाने पर सटीकता, द्रव्यमान रिज़ॉल्यूशन और बढ़ते एम / जेड के साथ इसके परिवर्तन की ढलान के आधार पर एमजेडएमएल फ़ाइल प्रारूप से परिवर्तित स्पेक्ट्रा आयात करता है। सॉफ्टवेयर एक विश्लेषण रन के भीतर प्राप्त कई अलग-अलग एमएस और एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा को विलय करता है। बाद में, यह अलग-अलग नमूना रन के भीतर अलग-अलग चोटियों को संरेखित करता है, और, संरेखित चोटियों के प्रत्येक समूह में, यह उनके द्रव्यमान को उनके एकल तीव्रता-भारित औसत द्रव्यमान से बदल देता है, जबकि प्रत्येक डेटा फ़ाइल में उनकी बहुतायत अछूती रहती है। संरेखित शिखर समूहों और व्यक्तिगत शिखर तीव्रता के प्रतिनिधि द्रव्यमान को मास्टर स्कैन डेटाबेस में संग्रहीत किया जाता है। मास्टर स्कैन डेटाबेस में बैच में सभी नमूनों के लिए उत्पन्न सभी एमएस 1 और एमएस 2 स्पेक्ट्रा होते हैं और आणविक विखंडन क्वेरी भाषा (एमएफक्यूएल) में लिखे गए प्रश्नों द्वारा लिपिड पहचान के लिए जटिल हो सकते हैं।

कुल मिलाकर, विधि में सकारात्मक मोड के आधार पर डीएजी, टीएजी और एसई लिपिड और नकारात्मक मोड अधिग्रहण के आधार पर पीसी, पीई, पीएस, पीआई, पीए, पीजी, एसएम, एलपीसी और एलपीई लिपिड की पहचान शामिल है। लिपिड पहचान के दौरान, एमएस 1 और एमएस 2 के लिए आइसोटोपिक सुधार किया जाता है, और .xlsx आउटपुट फ़ाइल में समायोजित तीव्रता की सूचना दी जाती है। वैकल्पिक रूप से, शॉटगन डेटा को संसाधित करने के लिए कई अन्य सॉफ़्टवेयर उपलब्ध हैं, जैसे एलेक्स45 और लिपिडहंटर46।

फैटी एसिड - प्रमुख परमाणु और सेलुलर झिल्ली घटक - बायोएक्टिव अणुओं में आगे रूपांतरण के लिए फॉस्फोलिपिड्स के रूप में संग्रहीत होते हैं। उन्हें लाइसोफॉस्फोलिपिड एसाइलट्रांसफेरेज़ एंजाइमों द्वारा लैंड्स पाथवे47 के माध्यम से लाइसोफॉस्फोलिपिड्स में परिवर्तित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एलपीसीएटी 3 एंजाइम, एए को लाइसोफॉस्फेटिडिलकोलाइन और लाइसोफॉस्फेटिडिलसेरिन इंटरमीडिएट्स में शामिल करने के लिए उच्च विशिष्टता दिखाने के लिए जाना जाता है। इन एंजाइमों की अपेक्षाकृत उच्च अभिव्यक्ति भड़काऊ कोशिकाओं के भीतर रिपोर्ट की गई थी, जैसे कि वायुकोशीय मैक्रोफेज और ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाएं47, जिससे उन कोशिकाओं में एए युक्त फॉस्फोलिपिड्स के बड़े सापेक्ष अनुपात की रिहाई हुई। हालांकि, फॉस्फोलिपेज़ ए 2 द्वारा झिल्ली फॉस्फोलिपिड्स से उनकी मुक्ति के बाद, विभिन्न प्रकार के लिपिड मध्यस्थों में पीयूएफए का रूपांतरण कईएंजाइमों द्वारा उत्प्रेरित होता है। इसके अलावा, ये पीयूएफए साइक्लोऑक्सीजिनेज (सीओएक्स) -1 और सीओएक्स -2 एंजाइम47 की कार्रवाई के माध्यम से प्रो-भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ प्रोस्टाग्लैंडिंस के उत्पादन के लिए सब्सट्रेट बन सकते हैं। फॉस्फोलिपिड्स विशेष स्थानों पर जारी लिपिड मध्यस्थों के स्रोतों में से एक हैं जहां इन मध्यस्थों को उनके जैविक प्रभावों को प्रदर्शित करने की आवश्यकता होती है।

फेफड़े एक जटिल अंग है जिसमें कई सेल प्रकार शामिल हैं, प्रत्येक सामान्य फेफड़ों के विकास और कार्य को सुविधाजनक बनाने में अतिव्यापी और आला भूमिका निभाते हैं। माउस या मानव फेफड़े में विभिन्न सेल प्रकारों को अलग करने और प्रोफाइल करने के लिए केवल कुछ अध्ययन किए गए हैं (उदाहरण के लिए, वायुकोशीय प्रकार 2 कोशिकाएं) 49,50; अन्य प्रमुख फेफड़ों की कोशिका प्रकारों की विशेषता नहीं है। माउस फेफड़ों में एंडोथेलियल, उपकला, मेसेनकाइमल और मिश्रित प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिपिड विश्लेषण को अलग करने और करने के लिए एक और दिलचस्प अध्ययन51 किया गया था। यह देखा गया कि पीसीओ और पीजी में शामिल पीयूएफए की एकाग्रता प्रतिरक्षा कोशिकाओं में समृद्ध थी। इस तथ्य को ध्यान में रखते हुए कि सीएस फेफड़ों के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं (4-5 गुना) में वृद्धि को प्रेरित करता है, जैसा कि ब्रोन्कोएल्वोलर लैवेज (बीएएल) 52 द्वारा मूल्यांकन किया गया है, इस अध्ययन में देखे गए कुल लिपिड परिवर्तनों को माउस फेफड़े में प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती में संचयी वृद्धि से समझाया जा सकता है।

निष्कर्ष में, फॉस्फोलिपिड्स में शामिल मोनोअनसैचुरेटेड फैटी एसिड और पीयूएफए की देखी गई विकृति सेल के भीतर कुछ एफए की अधिकता को प्रतिबिंबित कर सकती है और / या ऑक्सीलिपिन अग्रदूतों के इंट्रासेल्युलर संसाधन का गठन कर सकती है जो ऑक्सीडेटिव तनाव और भड़काऊ स्थितियों के तहत अधिक उत्पादित होते हैं। हालांकि, इस बिंदु को स्पष्ट करने के लिए मुफ्त ईपीए, डीएचए और अन्य ऑक्सीलिपिन पर अतिरिक्त डेटा आवश्यक हैं और वर्तमान विधि अनुप्रयोग के दायरे से बाहर हैं।

Disclosures

सभी लेखक फिलिप मॉरिस इंटरनेशनल के कर्मचारी हैं। फिलिप मॉरिस इंटरनेशनल इस परियोजना के वित्तपोषण और प्रायोजक का एकमात्र स्रोत है।

Acknowledgments

लेखक अध्ययन टीम को धन्यवाद देना चाहते हैं और विशेष रूप से पीएमआई आर एंड डी, फिलिप मॉरिस इंटरनेशनल रिसर्च लेबोरेटरीज पीटीई में बायोरिसर्च और एरोसोल टीमों की तकनीकी सहायता और समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं। लिमिटेड, सिंगापुर, और पीएमआई आर एंड डी, फिलिप मॉरिस प्रोडक्ट्स एसए, न्यूचटेल, स्विट्जरलैंड। लेखकबायोबैंकिंग के प्रबंधन के लिए सैम अंसारी को धन्यवाद देते हैं और पांडुलिपि के मसौदे को संपादित करने के लिए सिंधुरा भार्गवी गोपाल रेड्डी के समर्थन को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1, 5, and 2 mL self-lock tubes Eppendorf 30120086, 30120094
3 mm stainless still beads Qiagen 69997
4.1 µm nozzle chip Advion HD-D-384
Acetic acid Sigma Aldrich 45754-100ML-F
Ammonium acetate Honeywell 14267-25G
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 09830-500G
Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL Thermo Scientific  23209
Butanol Honeywell 33065-2.5L
Chloroform Sigma Aldrich 650498-1L
Dichloromethane Honeywell 34856-1L
Ethyl acetate Honeywell 33211
Greiner CELLSTAR 96 well plates Sigma M9686
Heptane Sigma Aldrich 34873-2.5L
Isopropanol Fisher Scientific A461
Methanol Fisher Scientific A456
Mouse pooled plasma BioIvt
Mouse SPLASH standard Avanti Polar Lipids 330710X Internal standard
Nunc 96-flat bottom well transparent plates VWR 62409-068
Plastic spatula Sigma Z560049-300EA
Quick Start Bradford 1x Dye reagent BioRad 5000205
Serum diluent Sigma Aldrich D5197
Equipment/software
CryoPrep CP02 impactor instrument Covaris     Magnetic hammer
Centrifuge 5427R Eppendorf .    Centrifuge
ChipSoft 8.3 Advion Biosciences .    Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot
LipidXplorer 1.2.8.1 N/A .    Software to identify lipids
Peak By Peak SpectroSwiss .    Software to convert .raw data from MS to .mzml format
ProteoWizard ProteoWizard .    Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format
Q-Exactive MS Thermo Fisher .    High resolution orbitrap mass spectrometer
Qiagen Tissue Lyser II Qiagen .    Tissue lyser
SpeedVac SPD140DDA Thermo Fisher .    Vacuum concentrator
Tecan Infinite M nano plus Tecan .    Plate reader
ThermoMixer C Eppendorf .    Thermomixer
TriVersa Nanomate Advion Biosciences .    Direct infusion nano-source
Xcalibur 4.3 Thermo Scientific .    Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salehi, N., Janjani, P., Tadbiri, H., Rozbahani, M., Jalilian, M. Effect of cigarette smoking on coronary arteries and pattern and severity of coronary artery disease: A review. Journal of International Medical Research. 49 (12), 3000605211059893 (2021).
  2. Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: Are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 45 (6), 1111-1115 (2011).
  3. Lee, G., Walser, T. C., Dubinett, S. M. Chronic inflammation, chronic obstructive pulmonary disease, and lung cancer. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 15 (4), 303-307 (2009).
  4. Titz, B., et al. Effects of cigarette smoke, cessation, and switching to two heat-not-burn tobacco products on lung lipid metabolism in C57BL/6 and Apoe-/- mice-An integrative systems toxicology analysis. Toxicological Sciences. 149 (2), 441-457 (2016).
  5. Morissette, M. C., Shen, P., Thayaparan, D., Stampfli, M. R. Disruption of pulmonary lipid homeostasis drives cigarette smoke-induced lung inflammation in mice. European Respiratory Journal. 46 (5), 1451-1460 (2015).
  6. Jubinville, E., et al. Interplay between cigarette smoking and pulmonary reverse lipid transport. European Respiratory Journal. 50 (3), 1700681 (2017).
  7. Han, X., Gross, R. W. Shotgun lipidomics: Electrospray ionization mass spectrometric analysis and quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples. Mass Spectrometry Reviews. 24 (3), 367-412 (2005).
  8. Titz, B., et al. Multi-omics systems toxicology study of mouse lung assessing the effects of aerosols from two heat-not-burn tobacco products and cigarette smoke. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 1056-1073 (2020).
  9. Hartung, T., et al. Systems toxicology: Real world applications and opportunities. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 870-882 (2017).
  10. Talikka, M., et al. Systems Toxicology. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. Lyubimov, A., et al. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2016).
  11. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  12. Papan, C., et al. Systematic screening for novel lipids by shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 86 (5), 2703-2710 (2014).
  13. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600 (2012).
  14. Strittmatter, N., et al. Shotgun lipidomic profiling of the NCI60 cell line panel using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (15), 7507-7514 (2016).
  15. Lydic, T. A., et al. Rapid and comprehensive 'shotgun' lipidome profiling of colorectal cancer cell derived exosomes. Methods. 87, 83-95 (2015).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Grzybek, M., et al. Comprehensive and quantitative analysis of white and brown adipose tissue by shotgun lipidomics. Molecular Metabolism. 22, 12-20 (2019).
  18. Stegemann, C., et al. Comparative lipidomics profiling of human atherosclerotic plaques. Circulation: Cardiovascular Genetics. 4 (3), 232-242 (2011).
  19. Tajima, Y., et al. Lipidomic analysis of brain tissues and plasma in a mouse model expressing mutated human amyloid precursor protein/tau for Alzheimer's disease. Lipids in Health and Disease. 12, 68 (2013).
  20. Gross, R. W., Han, X. Shotgun lipidomics of neutral lipids as an enabling technology for elucidation of lipid-related diseases. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (2), 297-303 (2009).
  21. Surma, M. A., et al. An automated shotgun lipidomics platform for high throughput, comprehensive, and quantitative analysis of blood plasma intact lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (10), 1540-1549 (2015).
  22. Heiskanen, L. A., Suoniemi, M., Ta, H. X., Tarasov, K., Ekroos, K. Long-term performance and stability of molecular shotgun lipidomic analysis of human plasma samples. Analytical Chemistry. 85 (18), 8757-8763 (2013).
  23. Zhang, S., Van Pelt, C. K. Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry for protein characterization. Expert Review of Proteomics. 1 (4), 449-468 (2004).
  24. Surma, M. A., et al. Mouse lipidomics reveals inherent flexibility of a mammalian lipidome. Scientific Reports. 11 (1), 19364 (2021).
  25. Herzog, R., Schwudke, D., Shevchenko, A. LipidXplorer: Software for quantitative shotgun lipidomics compatible with multiple mass spectrometry platforms. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11-30 (2013).
  26. R: A language and environment for statistical computing. R: Foundation for Statistical Computing. , Available from: https://www.R-project.org/ (2018).
  27. Phillips, B., et al. A 7-month cigarette smoke inhalation study in C57BL/6 mice demonstrates reduced lung inflammation and emphysema following smoking cessation or aerosol exposure from a prototypic modified risk tobacco product. Food and Chemical Toxicology. 80, 328-345 (2015).
  28. Phillips, B., et al. A six-month systems toxicology inhalation/cessation study in ApoE(-/-) mice to investigate cardiovascular and respiratory exposure effects of modified risk tobacco products, CHTP 1.2 and THS 2.2, compared with conventional cigarettes. Food and Chemical Toxicology. 126, 113-141 (2019).
  29. Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C. Electrospray ionization tandem mass spectrometry of glycerophosphoethanolamine plasmalogen phospholipids. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1499-1508 (2004).
  30. Engelmann, B. Plasmalogens: Targets for oxidants and major lipophilic antioxidants. Biochemical Society Transactions. 32, 147-150 (2004).
  31. Nagan, N., Zoeller, R. A. Plasmalogens: Biosynthesis and functions. Progress in Lipid Research. 40 (3), 199-229 (2001).
  32. Southam, A. D., Weber, R. J., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nature Protocols. 12 (2), 310-328 (2016).
  33. Yang, K., Han, X. Accurate quantification of lipid species by electrospray ionization mass spectrometry - Meet a key challenge in lipidomics. Metabolites. 1 (1), 21-40 (2011).
  34. Zullig, T., Trotzmuller, M., Kofeler, H. C. Lipidomics from sample preparation to data analysis: a primer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2191-2209 (2020).
  35. Koivusalo, M., Haimi, P., Heikinheimo, L., Kostiainen, R., Somerharju, P. Quantitative determination of phospholipid compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response. Journal of Lipid Research. 42 (4), 663-672 (2001).
  36. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  37. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  38. Lofgren, L., Forsberg, G. B., Stahlman, M. The BUME method: A new rapid and simple chloroform-free method for total lipid extraction of animal tissue. Scientific Reports. 6, 27688 (2016).
  39. Lofgren, L., et al. The BUME method: A novel automated chloroform-free 96-well total lipid extraction method for blood plasma. Journal of Lipid Research. 53 (8), 1690-1700 (2012).
  40. Jung, H. R., et al. High throughput quantitative molecular lipidomics. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 925-934 (2011).
  41. Lavrynenko, O., et al. Ceramide ratios are affected by cigarette smoke but not heat-not-burn or e-vapor aerosols across four independent mouse studies. Life Sciences. 263, 118753 (2020).
  42. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  43. Schuhmann, K., et al. Quantitative fragmentation model for bottom-up shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 91 (18), 12085-12093 (2019).
  44. Lipidomics Standards Initiative Consortium. Lipidomics needs more standardization. Nature Metabolism. 1 (8), 745-747 (2019).
  45. Husen, P., et al. Analysis of lipid experiments (ALEX): A software framework for analysis of high-resolution shotgun lipidomics data. PloS One. 8 (11), 79736 (2013).
  46. Ni, Z., Angelidou, G., Lange, M., Hoffmann, R., Fedorova, M. LipidHunter identifies phospholipids by high-throughput processing of LC-MS and shotgun lipidomics datasets. Analytical Chemistry. 89 (17), 8800-8807 (2017).
  47. Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C., Kosmider, B., Mason, R. J. Lipidomic characterization and localization of phospholipids in the human lung. Journal of Lipid Research. 58 (5), 926-933 (2017).
  48. Ghosh, M., Tucker, D. E., Burchett, S. A., Leslie, C. C. Properties of the Group IV phospholipase A2 family. Progress in Lipid Research. 45 (6), 487-510 (2006).
  49. Besnard, V., et al. Deletion of Scap in alveolar type II cells influences lung lipid homeostasis and identifies a compensatory role for pulmonary lipofibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 284 (6), 4018-4030 (2009).
  50. Plantier, L., et al. Activation of sterol-response element-binding proteins (SREBP) in alveolar type II cells enhances lipogenesis causing pulmonary lipotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10099-10114 (2012).
  51. Kyle, J. E., et al. Cell type-resolved human lung lipidome reveals cellular cooperation in lung function. Scientific Reports. 8 (1), 13455 (2018).
  52. Lugg, S. T., Scott, A., Parekh, D., Naidu, B., Thickett, D. R. Cigarette smoke exposure and alveolar macrophages: mechanisms for lung disease. Thorax. 77 (1), 94-101 (2022).

Tags

जैव रसायन अंक 189
कृंतक ऊतकों के शॉटगन लिपिडोमिक्स
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavrynenko, O., Dijon, S., Titz, B., … More

Lavrynenko, O., Dijon, S., Titz, B., Ivanov, N. V. Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues. J. Vis. Exp. (189), e63726, doi:10.3791/63726 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter