Summary
Shotgun 질량분석법 기반 지질체학은 다양한 설치류 조직에서 한 번의 측정으로 광범위한 지질 등급에 대한 민감한 정량적 스냅샷을 동시에 제공합니다.
Abstract
지질은 모든 원핵 및 진핵 세포의 필수 구성 요소로서 중요한 역할을 합니다. 질량 분석법의 지속적인 기술 향상으로 인해 지질체는 항상성 및 질병 상태에서 조직 지질체 구성을 모니터링하기 위한 강력한 분석 도구가 되었습니다. 이 논문은 높은 처리량으로 다양한 조직 및 생체 유체 샘플에서 수백 개의 분자 지질 종을 동시에 검출하고 정량화할 수 있도록 지원하는 샷건 지질 분석 방법에 대한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 크로마토그래피 분리 없이 표지된 내부 표준물질로 스파이크된 총 지질 추출물을 고분해능 질량 분석 기기에 자동으로 나노 플로우 직접 주입하는 방법을 활용합니다. 마이크로그램 미만의 설치류 조직에서 시작하여 MS 분석은 샘플당 10분이 소요되며 마우스 폐 조직의 14개 지질 클래스에서 최대 400개의 지질을 다룹니다. 여기에 제시된 방법은 질병 메커니즘을 연구하고 설치류 조직 내에서 초기 독성 또는 유익한 효과를 나타내는 바이오마커를 식별 및 정량화하는 데 매우 적합합니다.
Introduction
담배 연기(CS)는 폐암, 기관지염 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)을 포함한 폐의 만성 염증성 질환 발병과 관련된 주요 위험 요소로 인식되고 있습니다1. CS 노출은 폐 충격 외에도 죽상동맥경화성 관상동맥 질환 및 말초혈관 질환과 같은 다른 질병의 발병에 중요한 역할을 한다1. 심혈관 질환은 COPD와 함께 전 세계적으로 각각 첫 번째와 세 번째 주요 사망 원인입니다. 독성 학적 위험 평가 접근법은 역사적으로 설치류와 같은 동물 모델의 사용에 의존 해 왔습니다. 생체 내 코 전용 또는 전신 쥐 및 마우스 모델은 일반적으로 CS 노출의 장기적인 영향을 연구하는 데 사용됩니다.
예를 들어, 일반적으로 6개월 동안 연기에 노출되면 폐기종, 기도 리모델링, 폐고혈압 등 인간 질환과 유사한 조직학적 및 기능적 이상이 쥐 폐에 나타나지만, 그 변화는 장기간 흡연자에게서 관찰되는 것에 비해 상대적으로 경미하다2. 동물 조직과 인간 조직 모두에서 산화 스트레스 반응, 염증 및 구조적 조직 변화를 포함하여 CS 노출에 대한 광범위한 분자 변화가 관찰되었습니다 3,4. 놀랍지 않게도, CS 노출은 계면활성제 지질, 지질 신호 매개체 및 구조적 지질에 대한 효과를 포함하여 폐 지질체에 광범위한 영향을 미치는 것으로 보고되었다 4,5,6.
마우스 폐의 장기간 CS 노출에 의해 유도된 대량 지질 변화를 특성화하기 위해 빠르고 정량적인 산탄총 직접 주입 질량 분석 분석을 수행했습니다. 2005년 산탄총 지질체학(shotgun lipidomics)분석법이 도입된 후 7, 이 방법은 효모 11, 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)12, 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)13와 같은 모델 시스템뿐만 아니라 세포주(14)와 같은 광범위한 포유류 시료 유형에서 지질 세포 대사 8,9,10에 대한 지식을 확장하는 데 효과적으로 사용되었습니다. 15,16 다양한 인간17,18 및 설치류 조직19,20 및 체액21,22.
지난 수십 년 동안 연구에 따르면 수천 개의 상호 연결된 단백질, 지질 및 대사 산물을 포함하는 환경 변화에 대한 세포 반응의 복잡성이 밝혀졌습니다. 이를 통해 최첨단 분석 기술을 사용하는 것이 분자 기계에 대한 심층적인 관점을 얻고 외인성 생리학적 영향의 전체 규모를 밝히는 데 필수적이라는 것이 분명해졌습니다. 이러한 맥락에서, 샷건 지질체학 접근법에 의해 생성된 포괄적이고 정량적인 지질 지문은 지질 세포 대사에 대한 우리의 지식을 효과적으로 추가할 수 있습니다 8,9,10.
CS 노출을 여러 질병의 위험 요소로 간주하여 독성 학적 위험 평가 접근법은 역사적으로 설치류와 같은 동물 모델의 사용에 의존 해 왔습니다. Shotgun 지질체학 MS는 다양한 샘플 유형에서 지질체 섭동을 평가하기 위한 빠르고 민감한 정량적 분석 도구를 제공합니다. 샷건 지질체학의 고유한 특징은 전기분무 이온화(ESI) 나노스프레이(23)를 생성하는 전도성 나노칩을 사용하여 크로마토그래피 분리 없이 표지된 내부 표준물질로 스파이크된 총 지질 추출물을 고분해능 MS 기기로 분리하는 자동 직접 주입 분석입니다.
MS1 모드에서 동시에 획득되는 질량 대 전하 비율 정보는 모든 온전한 내인성 지질의 총 지질 풋프린트를 제공합니다. 선택적으로 모 지질 분자가 단편화되고 분석되는 MS2/MS3 모드는 추가 구조 정보를 제공합니다. 데이터 분석에는 특수 소프트웨어가 필요하며, 지질 식별 및 추정 화학 구조 설명으로 이어지는 풀링된 스펙트럼의 스펙트럼 및 피크 할당의 디콘볼루션이 포함됩니다. 추가로, 절대 정량화는 관심 있는 지질 클래스 당 적어도 하나의 지질 표준물질을 함유하는 표지된 내부 표준물질 혼합물을 스파이크함으로써 수행될 수 있다. 전반적으로, 본 기술로, 샘플당 몇 분이 걸리는 MS 분석은 설치류 조직에서 14개의 지질 부류(24 )로부터 최대 800개의 지질의 식별 및 정량화를 커버할 수 있다.
Protocol
동물과 관련된 모든 절차는 국제 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)의 인증을 받고 싱가포르 농식품 및 수의청(Agri-Food & Veterinary Authority of Singapore)의 허가를 받은 시설에서 수행되었으며, 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인과 과학적 목적을 위한 동물의 관리 및 사용에 관한 실험실 동물 연구 지침에 대한 국가 자문 위원회(National Advisory Committee for Laboratory Animal Research Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purposes, NACLAR, 2004).
1. 시료 채취
- ApoE-/- 마우스에 노출된 지 3개월 및 6개월 후 마우스 폐 절제를 수행합니다. 노출 후 16-24시간 후에 조직을 수집하고, 액체 질소에서 급속 동결하고, 지질체학 워크플로우를 시작하기 전에 -80°C에서 보관합니다. 각 "오믹스" 해부 그룹에서 총 9개의 샘플을 수집해야 합니다.
2. 조직 - 샘플의 분쇄
- 조직 연삭을 위한 마그네틱 해머와 소모품을 준비합니다. 티슈 파우치, 집게, 캡이 있는 캡이 있는 티슈 이송 튜브, "V" 플라스틱 주걱, 드라이아이스 2mL 플라스틱 수집 튜브를 미리 냉각합니다. 마그네틱 해머 기기에 해당 튜브 홀더를 설치합니다. 마그네틱 해머를 켜고 충격력을 높음으로 설정합니다.
- 검체를 티슈 파우치에 넣습니다. 필요한 경우 미리 냉각된 집게를 사용하여 티슈 파우치의 상단 구멍을 통해 샘플을 삽입합니다. 샘플을 가장자리에서 멀리 떨어진 유연한 파우치의 중앙에 놓습니다.
- 티슈 파우치 상단에 미리 냉각된 수집 튜브를 나사로 고정하여 티슈 파우치를 밀봉합니다.
- 유연한 파우치를 액체 질소에 10초 동안 담가 샘플을 급속 동결합니다.
- 수집 튜브를 환기시키십시오. 마그네틱 해머가 충격을 가할 때 파우치가 파열되는 것을 방지하기 위해 통풍을 위해 튜브를 1/4바퀴 풉니다.
- 얼린 티슈 파우치를 마그네틱 해머에 넣습니다.
- 샘플을 분쇄하기 위해 활성화 버튼을 눌러 마그네틱 해머를 적용하십시오. 분쇄되지 않은 조직 조각이 파우치에 남아 있는 경우 샘플을 액체 질소에서 다시 급속 냉동하고 두 번째 충격을 반복합니다.
- 마그네틱 해머에서 티슈 파우치를 제거하고 분쇄된 샘플을 바닥에 유지합니다. 샘플이 녹는 것을 방지하려면 즉시 다시 급속 냉동하십시오.
- 샘플을 수집 튜브로 옮깁니다. 티슈 파우치가 상단에 오도록 튜브를 빠르게 뒤집고 파우치를 두드려 조직 입자를 수집 튜브의 하단으로 옮깁니다.
알림: 이 단계는 조직이 녹는 것을 방지하기 위해 신속하게 수행해야 합니다. - 추가 지질 분석을 위해 10mg 조직 분취액을 2mL 튜브로 옮기고 추가 단계가 수행될 때까지 샘플을 -80°C에서 보관합니다.
3. 조직 균질화
- 티슈 라이저 기기를 켜고 흔들림 주파수 를 30Hz 로, 흔들림 지속 시간을 2분으로 설정합니다. 조직 균질화 완충 용액을 준비합니다: ~8.2의 pH를 갖는 물에 150mM 중탄산암모늄.
- 보관 냉동고에서 샘플을 꺼내 얼음 위에 놓고 티슈 파우더가 들어 있는 튜브에 4개의 스테인리스 스틸 비드를 추가합니다. 각 샘플에 0.5mL의 150mM 중탄산암모늄 완충액을 추가합니다.
- 샘플 튜브를 티슈 라이저 홀더에 넣습니다. 동일한 수의 튜브로 두 홀더를 균형있게 조정합니다. 홀더를 티슈 라이저 고정 암에 고정합니다. 조직을 파괴하십시오.
- 튜브를 얼음 위에 놓고 튜브에 남은 조직 응집체가 없는지 육안으로 확인하십시오. 조직 파괴가 불완전한 경우(응집체가 보임) 다른 치료 주기를 수행하여 파괴 과정을 반복합니다. 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
- 단백질 측정 전용 1.5mL 튜브에 시료 100μL의 분취량 1 을 생성합니다. 18,200 × g 에서 10 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
- Bradford 분석에 의해 분취량 1 의 단백질 함량을 결정합니다(섹션 4 참조). 샘플을 얼음에 보관하십시오.
- 지질 추출을 위해 새로운 2mL 마이크로튜브에 스톡 균질액 20-100μL의 분취량 2 를 생성합니다(섹션 5 참조). 샘플이 즉시 분석되지 않으면 추출이 수행될 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
알림: 최종 추출 부피는 총 단백질 양을 기준으로 정의해야 합니다. 총 분취량 당 단백질 0.015-0.045 mg의 범위 내에 있어야합니다.
4. 브래드포드 단백질 측정 분석
참고: 연구 샘플은 분석 시작 전에 무작위화되어야 하며 샘플 처리의 모든 단계에서 무작위화가 적용됩니다.
- 원심분리된 분취량 1 상등액 2x를 중탄산암모늄 완충액으로 희석한다.
참고: 희석 계수는 조직 균질액의 농도에 따라 다릅니다. 더 농축된 용액의 경우 결정된 농도가 분석의 동적 범위에 속하도록 더 높은 계수를 적용합니다. - 표 1에 따라 소혈청알부민(BSA) 표준곡선을 준비하였다. 표준 튜브를 소용돌이치십시오. 튜브를 실온에서 18,200×g의 속도로 15초 동안 원심분리합니다.
- 이전에 준비된 표준 튜브에서 블랭크 및 표준물질 각각 6μL를 그림 1에 표시된 플레이트 레이아웃에 따라 96웰 플랫 바닥 플레이트로 옮깁니다.
- 이전에 준비한 샘플을 그림 1에 설명된 플레이트 레이아웃에 따라 96웰 평면 바닥 플레이트로 옮깁니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 Bradford 시약 250μL를 각 웰에 추가하고 혼합합니다. 5분 동안 배양합니다.
- 플레이트 리더를 이용하여 595 nm 파장에서 흡광도를 측정한다.
- 표준 곡선을 기반으로 분취량의 단백질 농도를 계산합니다.
참고: 단백질 농도를 계산할 때 절차 시작 시 사용되는 희석 계수를 고려해야 합니다.
5. BUME 추출
참고: 지질체학 추출을 위해 저결합 플라스틱 튜브를 사용하지 마십시오., 강한 유기 용매가 가소제를 방출하고 샘플 분석 중에 강한 배경을 만들기 때문입니다.
- 10개의 QC 샘플이 각 세트 사이에 배치되는 것을 고려하여 전체 블랭크(TB), 내부 표준 블랭크(ISB) 및 품질 관리 샘플(QC)의 각 튜브에 100μL의 중탄산암모늄 용액이 포함된 1.5mL 튜브를 준비합니다. 모든 샘플을 얼음에 보관하십시오.
- 모든 QC 샘플에 10μL의 풀링된 인간 혈장을 추가합니다. 10μL의 내부 표준물질 용액을 모든 ISB, QC 및 연구 샘플(즉, TB를 제외한 모든 샘플)에 스파이크합니다.
알림: 품질 관리 재료의 경우 시중에서 판매되는K2EDTA 플라즈마를 사용하십시오. 수령 시 언급된 프로토콜을 사용하여 풀링된 혈장의 지질 농도를 정량화하고 이 범위를 QC 재료가 사용되는 모든 분석에 대한 참조로 유지합니다. NIST 플라즈마는 보다 표적화된 응용 분야 또는 분석의 정확성을 해결해야 하는 글로벌 분석법 검증에만 사용하십시오. - -20°C 부탄올/메탄올 혼합물(3/1, v/v) 300μL를 각 시료에 추가합니다. 450 × g 에서 10 분 동안 thermomixer에서 실온에서 흔들어줍니다.
- 300 μL의 헵탄/에틸 아세테이트 혼합물(3/1, v/v)을 추가합니다. 450 × g에서 10 분 동안 thermomixer에서 실온에서 흔들어줍니다.
- 300 μL의 1 % 아세트산 혼합물을 첨가한다. 써모믹서에서 실온에서 450× g 에서 5분 동안 흔들어줍니다. 실온에서 5분 동안 2,800× g 의 원심분리기. 상부 상 360μL를 새로운 2mL 자동 잠금 튜브 2로 옮깁니다.
알림: 액체-액체 추출은 s로 상 경계의 위치를 이동할 수 있습니다.ample-의존적인 방식으로 상부상에 약간의 부피 불일치가 발생할 수 있습니다. 필요한 경우 상위 단계의 수집 부피를 조정합니다. - 320 μL의 헵탄/에틸 아세테이트(3/1, v/v)를 수성 튜브 1에 추가합니다. 450 × g 에서 열혼합기에서 실온에서 5분 동안 흔들어줍니다. 실온에서 5분 동안 2,800× g 의 원심분리기. 상부 상 320 μL를 옮기고 단계 5.11의 분획과 합친다.
알림: 필요한 경우 상위 단계의 수집 볼륨을 조정하십시오. - 250μL의 헵탄/에틸 아세테이트(3/1, v/v)를 튜브 1의 수성에 추가합니다. 450 × g 의 온도 조절기에서 실온에서 5 분 동안 흔들어줍니다. 실온에서 5분 동안 2,800× g 의 원심분리기. 상부 상 200μL를 옮기고 튜브 2에서 단계 5.11 및 단계 5.15의 분획과 결합합니다.
알림: 필요한 경우 상위 단계의 수집 볼륨을 조정하십시오. - 진공 농축기에서 35°C에서 증발시켜 건조시킵니다.
참고: 건조된 샘플은 필요한 경우 분석될 때까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다. - 300μL의 MS 혼합 용액(이소프로판올/메탄올/클로로포름 중 7.5mM 아세트산암모늄, 4:2:1 용액)에 재용해합니다. 모든 것이 용해되도록 각 튜브를 5초 동안 소용돌이칩니다. 4°C에서 5분 동안 18,200× g 의 원심분리기.
- 양성 이온화 모드 분석(컬럼 1-6)을 위해 그림 2 의 플레이트 레이아웃에 따라 50μL의 분취액을 마이크로리터 플레이트로 옮기고 50μL의 MS 혼합 용액으로 희석합니다.
- 음이온화 모드 분석(컬럼 2-2)을 위해 그림 12 의 플레이트 레이아웃에 따라 20μL의 분취량을 MTP 플레이트로 옮기고 80μL의 MS 믹스로 희석합니다. 플레이트를 호일로 감싸고 분석 전에 4°C에서 보관하십시오.
6. MS 분석
- 질량 분석기(MS)를 정량 및 음성 모드 모두에서 제조업체의 지침에 따라 분석 5일 이내에 보정합니다.
- 직접 주입 나노 소스를 미리 설치하여 MS의 전달 모세관에 올바르게 정렬되도록 합니다. 4.1μm 노즐 칩을 칩 홀더에 설치하고 소프트웨어에서 구성합니다.
- 포지티브 및 네거티브 모드 방법 설정을 위해 다음 매개 변수를 사용하십시오 : 1.25psi의 가스 압력; 1.1kV의 소스 전압; 5 μL의 시료 주입 부피; 2.5초 동안 출력 접점 폐쇄 Rel1; 배달 시간 5 분; 플레이트를 4°C에서 냉각시킨다.
- 포지티브 모드에서 직접 주입 로봇에 대한 분석 시퀀스 대기열을 설정합니다.
- 다음 MS 설정을 사용하여 포지티브 모드에 대한 MS 메서드를 설정합니다.
- 모세관 온도를 250°C로 설정하고 S-렌즈 RF 레벨을 65.0으로 설정합니다. 140,000 분해능에서 550-1000 m/z 범위에서 1 ×10 6의 자동 게인 제어와 50 ms의 최대 주입 시간으로 0분에서 1분까지 전체 스캔 MS 수집을 수행합니다. 680.48022의 잠금 질량을 적용합니다.
- 250 m/z의 고정된 첫 번째 질량으로 17,500 분해능에서 1분과 5분 사이의 데이터 독립적인 MS/MS 수집 방법을 설정합니다. 1 × 105에서 MS2에 대한 자동 이득 제어와 64ms의 최대 주입 시간, 20NCE의 충돌 에너지 및 1m/z의 절연 윈도우를 사용합니다. 550 - 1,000 m/z의 포함 질량 목록을 1 Da의 질량 단위로 사용합니다.
- 네거티브 모드에서 수집하려면 MS tune 파일에서 모세관 온도를 250°C로 설정하고 S-Lens RF 레벨을 65.0으로 설정합니다.
- 다음 MS 방법 설정 사용: 400-940 m/z 범위를 포괄하는 140,000 해상도에서 0에서 1분까지의 전체 스캔 획득 모드, 1 × 106의 자동 게인 제어; 50ms의 최대 주입 시간; 529.46262의 잠금 질량을 사용합니다.
- 150 m/z의 고정된 첫 번째 질량으로 17,500의 분해능으로 실행 후 1분에서 5분 사이에 DIA 모드에서 MS2 획득을 설정합니다. 1 × 105의 자동 이득 제어; 64ms의 최대 주입 시간; 그리고 충돌 에너지의 35NCE. 400에서 940까지의 포함 질량 목록을 1Da의 질량 단위로 사용합니다.
- MS 소프트웨어에서 포지티브 모드의 분석 시퀀스 대기열을 생성합니다. 각 샘플에 대해 직접 주입 로봇에서 오는 접촉 폐쇄 신호에 의해 샘플 수집이 트리거될 때까지 기다립니다.
- 포지티브 모드 분석이 완료되면 네거티브 모드에서 직접 주입 로봇에 대한 시퀀스 대기열을 생성합니다.
- MS 소프트웨어에서 분석 시퀀스 대기열을 네거티브 모드로 설정합니다.
7. 데이터 처리
- 양수 및 음수 모드의 데이터 파일을 .raw 형식에서 .mzML 형식으로 변환하려면 변환기 소프트웨어를 사용하십시오.
참고: 포지티브 모드와 네거티브 모드의 데이터 파일은 별도로 변환해야 합니다(획득 설정이 다르고 노이즈 임계값이 다르기 때문에).- 파일 변환을 수행하려면 다음 설정을 채우십시오 : 노이즈 임계 계수는 MS 및 MS2에 대해 각각 3 및 5입니다. MS 및 MS2 모두에 대한 노이즈 제거 기능, 데이터 압축, 평균 MS2 스캔 및 피크 피킹을 활성화합니다. 포지티브 및 네거티브 모드에 대한 TIC 임계값을 설정합니다(예: 10,000 및 5,000, 특정 기기의 노이즈 레벨에 따라 정의됨amp특정 기기에서 생성된 파일). 처리가 끝나면 XLC 및 PDF 보고서를 생성합니다.
- 지질 식별을 수행합니다. 다음 (예) 파일 가져 오기 설정 매개 변수를 정의하십시오 : 선택 창 ±0.5 Da (MS 방법의 선택 창에 따라 다름); 시간 범위 2-300초(MS 방법의 스캔 시간에 따라 다름); MS 및 MS2에 대한 보정 질량 없음; Peak by Peak 소프트웨어 메타데이터 파일(최소 질량[MS]) 및 (최소 질량[MS2])에서 질량 범위를 전송하고 반올림합니다. MS 및 MS2에 대해 각각 3ppm 및 10ppm의 허용 오차; MS 및 MS2 임계값 필드, 주파수 필터, MS1 오프셋 및 PMO를 비워 두십시오. MS 및 MS2에 대한 동위원소 보정 선택; 변환기 메타데이터 파일에서 해상도 그라데이션을 (해상도 선형 맞춤[MS]) 및 (해상도 선형 맞춤[MS2])으로 전송합니다.
참고: 양성 및 음성 모드의 지질 식별은 획득 설정이 다르기 때문에 별도로 수행해야 합니다. - 데이터를 가져온 후 실행 메뉴로 이동하여 지질 식별을 위해 MFQL 파일을 업로드합니다.
참고: MFQL의 구조에 대한 자세한 내용은 Herzog et al.25의 간행물을 참조하십시오. https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library 에서 MFQL 파일의 몇 가지 예를 참조하고 토론을 참조하십시오. 데이터 처리에 사용되는 모든 MFQL은 보충 자료에 제공됩니다. - 지질 특징의 전구체 질량 강도를 표지된 내부 표준물질의 각각의 강도로 나눈 다음 몫에 표지된 내부 표준물질의 농도를 곱하여 MS 수준에서 식별된 종을 정량화합니다. Bradford 분석에 의해 측정된 총 단백질의 양당 최종 지질 농도를 표준화합니다.
8. QC 검사 절차
참고: 품질 검사 절차는 방법의 기술적 재현성을 검증하기 위한 필수 단계입니다. 이를 위해, 상업적으로 풀링된 혈장을 분석하여 배치당 15개의 동일한 분취량(총 5개 배치)에서 5일에 걸쳐 상이한 지질의 내인성 수준을 결정한다. 이 경우 데이터 평가 파이프라인은 R 통계 소프트웨어 환경을 사용하여 Shiny 웹 애플리케이션으로 생성되었습니다.
- 기준 합격 범위를 5개 배치 모두에 대해 계산된 평균값±3 표준 편차)으로 정의합니다.
- 각 분석 배치에 대해 "통과" 허용 규칙 적용: 하나의 기준 화합물이 하나의 지질 등급을 나타낸다는 점을 고려할 때 기준 표적의 90%가 통과해야 합니다. 예를 들어, 15개의 참조 목표가 QC 검증에 포함된 경우 배치가 수락되도록 13개의 대상이 통과해야 합니다.
참고: 즉, 기준 화합물당 QC 샘플의 68%가 이 지질 등급에 대한 데이터를 수락하기 위해 통과해야 합니다. - 연구 배치가 QC 검사에 대한 허용 기준을 충족하지 않으면 절차를 반복합니다.
9. (상대적) 공액 지방산 양의 추정
- 각 지질 클래스에 대해 MS2 강도를 기반으로 공액 지방산의 양을 추정합니다.
참고: 단편화 및 이온화 차이로 인해 파생된 값은 예를 들어 지질 클래스의 전체 공액 지방산 풀에 대한 특정 지방산의 상대적 기여도를 추정하기 위한 것이 아니라 샘플 그룹 간의 상대적 존재비 비교를 위한 것입니다. - 지방산 단편의 MS2 강도를 상응하는 내부 표준물질의 지방산 단편의 평균 강도로 정규화한다. 내부 표준물질의 농도 및 측정된 조직 중량에 기초하여, 공액 지방산에 대한 "정규화된 농도"를 도출한다. 지질 등급당 이 값을 합산하여 샘플당 각 공액 지방산의 총량을 추정합니다.
10. 통계 분석
- 통계 분석을 수행합니다. 각 조건과 해당 대조군에 대한 선형 모형을 적합하고 log2로 변환된 데이터에 대한 t-통계량에서 p 값을 계산합니다. Benjamini-Hochberg 거짓 발견 비율 방법을 사용하여 여러 테스트 효과를 수정합니다.
참고: 조정된 p 값이 0.05< 지질은 차등적으로 풍부한 것으로 간주됩니다. 여기서, R 통계 환경(26)에서 통계 분석을 수행하였다.
Representative Results
여기에서는 대표적인 결과로 산탄총 지질체가 생쥐의 폐에 대한 CS의 영향을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여주는 데이터를 제시합니다. 산탄총 지질 분석 프로토콜은 두 그룹의 샘플에 대한 비교 분석을 위한 생체 내 연구에 성공적으로 적용되었습니다: CS에 노출된 9마리의 암컷 Apoe-/- 마우스(3R4F 그룹, 양성 대조군)에서 해부된 폐 조직 및 신선한 공기 조건에서 유지된 동일한 수의 마우스(가짜 그룹) 3개월에 수집된 음성 대조군으로, 4개월 및 6개월 노출 시점. 동물을 22°C ± 2°C 온도 및 55% ± 15% 습도에서 여과하고 컨디셔닝된 신선한 공기 하에 유지하고, 감마선-조사된 펠릿 사료를 먹였다. 조명 체제는 하루 12 시간으로 유지되었습니다. 각 케이지 당 최대 8 마리의 마우스를 수용했습니다. 3R4F 담배의 3R4F 담배에서 3R4F 연기는 28 μg의 니코틴/.CS L에 해당하는 목표 노출 농도에 대해 3R4F CS 에어로졸(총 미립자 물질 TPM/L 에어로졸 600μg)을 생성하기 위해 켄터키 대학교에서 구입되었습니다.27 Phillips et al.27에 따르면 30 포트 회전식 흡연 기계를 사용하여 30 포트 회전식 흡연 기계를 사용하여 연기 . 캐나다 보건부 집중 흡연 프로토콜에 따라 3R4F 담배에 55mL의 퍼프 부피, 30초당 1개의 퍼프, 100% 막힌 통풍구를 적용하여 충분한 노출을 제공했습니다. 연구 설계에 대한 모든 추가 세부 사항은 이전에 보고되었습니다27,28.
전반적으로, 가장 풍부한 14개의 지질 부류에서 ~400개의 분자 지질 종을 식별하고 정량화했습니다(그림 3). 클래스당 총 정규화된 지질 농도는 PE, PEO, PC, PCO, PI 및 PG 지질 클래스에 대해 약간 상승했으며 SM, LPE 및 PA 지질에 대해 일부 하향 조절이 관찰되었지만(그림 3A), TAG 및 PS에 대해서는 차이가 없었습니다. 흥미롭게도 CS 그룹에서 PCO 및 PEO 플라스말로겐 지질 수치가 염증 세포에서 보고되었습니다29 . 플라스말로겐 지질의 세포 내 기능 중 하나는 항산화 활성입니다. 활성 산소(ROS) 및 질소종(RNS)에 노출된 상태에서 디아실 인지질과 비교하여 플라스말로겐의 선택적 산화가 보고되었습니다30. 플라스말로겐의 화학 구조에서 에닐-에테르 결합은 산화 스트레스31에 대한 라디칼 공격에 민감합니다. 라디칼 공격의 주요 생성물은 하이드록실화 에이코사테트라엔산, 2-모노아실글리세롤 인지질, 펜타데칸올, 포름산, 다양한 사슬 길이의 α-하이드록시알데히드, 1-포르밀-2-아라키도노일 글리세로인지질 및 리소인지질입니다.
이러한 결과는 전체 분자식에 기초한 분자 특징 중 100-120개의 화합물이 CS 노출에 의해 유의한 영향을 받았음을 보여줍니다(그림 3D). MS2 단편화 정보의 상세한 디콘볼루션과 단편 신호 강도의 정규화를 통해 각 지질 등급에 표시되는 각 공액 지방산(FA)의 총량을 대략적으로 정의하고(그림 3E) 노출된 그룹과 대조군 간의 이러한 데이터를 비교할 수 있었습니다. 완전히 포화된 FA와 불포화도가 거의 없는 FA 모두에서 뚜렷한 감소가 관찰되었으며, 대부분 리소-지질의 맥락에서 관찰되었습니다. 대조적으로, PC, PE 및 PG 인지질 부류의 조성 중의 고도불포화 지방산 (PUFA)은 모든 시점에 대해 CS 그룹에서 상승하였다. 에이코사펜타엔산(EPA) 및 도코사헥사엔산(DHA)과 결합된 PC 및 PG의 극단적인 경우는 3R4F CS 노출 그룹에서만 독점적으로 검출되었습니다(그림 3E, 빨간색).
그림 1: Bradford 분석에서 샘플 분포를 위한 플레이트 레이아웃. 블랭크 및 표준 샘플은 컬럼 1-3에 세 번 배치됩니다. 알 수 없는 샘플은 4-11열에 이중으로 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 샷건 질량분석법 분석을 위한 96웰 마이크로타이터 플레이트의 플레이트 레이아웃. 양의 이온화 모드에서 수집을 위한 블랭크, 표준, 미지의 및 QC 샘플의 분포는 플레이트의 왼쪽에 매핑됩니다(컬럼 1-6). 음이온화 모드에 대한 모든 샘플은 오른쪽에 배치됩니다(컬럼 7-12). 약어: pos = positive; QC = 품질 관리; 부정 = 음수; TB = 공백 상태 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 담배 연기에 노출된 쥐 폐의 산탄총 지질학 분석. Apoe-/- 마우스는 3R4F 기준 담배 또는 신선한 공기(가짜)로부터 CS에 노출되었습니다. (A) 지질 등급 농도 및 등급당 지질 종의 수. 각 클래스에 대해 정량화 된 지질 종의 수는 괄호 안에 표시됩니다. 각 지질 등급에 대한 평균 및 95% 신뢰 구간, 각 노출 유형에 대해 별도로(3개의 시점에 걸쳐 집계됨). (B) 세 시점에서 3R4F CS 대 가짜 비교에 대한 정량화된 지질 종의 효과 크기(log2 배수 변화) 및 유의성(-log10 FDR 조정 p 값)을 보여주는 화산 플롯. 현저하게 상승 된 지질은 노란색으로 표시됩니다. 현저히 감소된 지질은 청록색으로 표시된다(FDR-adjusted p value < 0.05). (C) 절대 평균 배수 변화가 가장 큰 25개 지질 종의 차등 풍부도. 3R4F CS 대 가짜 비교를 위한 Log2 배수 변화는 색상으로 구분되며 통계적 유의성이 표시됩니다: *: FDR 조정 p 값 < 0.01; X: FDR-조정된 p 값 < 0.05. (D) 비교 플롯. 폴드-변화 비교를 위한 상관 계수는 색상으로 구분되며, 차등적으로 풍부한 공유 지질의 수가 표시됩니다(여백의 총 수). 파이 차트는 동일한 변화 방향(FC 부호)을 가진 공유된 차등적으로 풍부한 지질의 백분율을 보여줍니다. 별표는 차등적으로 풍부한 지질의 현저한 중첩을 나타낸다. (E) 지질 등급당 복합 FA의 차등 풍부도. 세 시점 모두에서 3R4F와 가짜 노출 사이에 상당한 존재비 차이가 있는 공액 지방산에 대한 패널 C 에서와 같은 히트맵(FDR 조정 p 값 < 0.05). 지질 부류당 각각의 지방산의 양은 지방산 단편의 MS2 강도에 기초하여 추정하였다. 약어: CS = 담배 연기; FDR = 거짓 발견률; FC = 배수 변화; FA = 지방산; PC = 포스파티딜콜린; PS = 포스파티딜세린; TAG = 트리아실글리세롤; SM = 스핑고미엘린; PEO = 플라스말로겐 포스파티딜에탄올아민; PE = 포스파티딜에탄올아민; PG = 포스파티딜글리세롤; PI = 포스파티딜이노시톨; DAG = 디아실글리세롤; SE = 스테롤/콜레스테릴 에스테르; PCO = 플라스말로겐 포스파티딜콜린; LPC = 리소포스파티딜콜린; LPE = 리소포스파티딜에탄올아민; PA = 포스파티드산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| BSA 최종 농도(mg/mL) | 2mg/mL(μL)의 BSA 용액 | 중탄산암모늄 완충액(μL) |
| 1 | 50 | 50 |
| 0.75 | 37.5 | 62.5 |
| 0.5 | 25 | 75 |
| 0.25 | 12.5 | 87.5 |
| 0.125 | 12.5 | 187.5 |
| 0.0625 | 50 of 0.125 mg/mL 용액 | 50 |
| 0 | 0 | 100 |
표 1: Bradford 분석에 대한 보정 곡선에 대한 BSA 내부 표준물질의 희석 계획. 약어: BSA = 소 혈청 알부민.
보충 정보: LipidXplorer 지질 식별에 사용되는 MFQL 파일. .zip 패키지는 필요한 개별 MFQL 파일로 구성되며, 각 파일의 이름은
Discussion
다발성 경화증의 발전으로 많은 지질 종을 정확하게 모니터링하는 다양한 방법이 나왔지만 다양한 포유류 조직의 이전 지질 프로파일링은 일관된 결과를 나타내지 않았으며 결과적으로 지질의 특정 조직 특이적 기능은 불분명합니다. 특정 화합물의 발현을 녹아웃하기 위한 보다 강력한 접근법을 사용할 수 있는 단백질 기능 분석과 비교할 때, 대부분의 지질은 조직에서 선택적으로 꺼지거나 과발현될 수 없으므로 지질의 기능 평가가 어렵습니다. 조직 지질체 농도의 고급 프로파일링은 순환 지질과 인간 질병 사이의 연관성을 식별하기 위한 대안적 접근법을 제공할 수 있습니다.
모든 마우스 조직의 내인성 지질 프로파일을 정성적 및 정량적으로 커버할 수 있는 포괄적인 지질체학 방법을 평가할 때 우리는 산탄총 지질체학 방법을 선호했습니다. 일반적으로 두 가지 상반된 유형의 시료 분석이 가능합니다: 액체 크로마토그래피(LC) 기반 분리를 사용한 지질의 완전 비표적 스크리닝과 시료의 전체 지질 복잡성을 밝히기 위한 추가 질량 분석 검출 또는 관심 있는 특정 지질의 매우 정밀한 정량화를 가능하게 하는 표적 접근법. 대조적으로, 제시된 샷건 지질체학 워크플로우의 강력한 특징은 사전 정의된 지질 클래스의 수백 가지 내인성 지질에 대한 신속하고 포괄적인 커버리지이며, 이는 여전히 강력한 반정량적 방식으로 수행될 수 있습니다.
상이한 지질 부류의 이온화 효율은 구조에 따라 다르며 상이한 실험 이온화 조건에 따라 크게 달라질 수 있다. LC 기반 분리 분석법과 달리, 샷건 분석은 동일한 이온화 조건에서 전체 지질 추출물을 MS 기기에 직접 동시에 주입하기 때문에 이러한 차이를 최소화합니다. 동위원소로 표지된 지질 유사체 또는 구조적으로 유사한 비내인성 표준물질의 사용은 모든 지질 부류의 반정량화를 가능하게 한다. Shotgun 지질체학은 MS 분석 중에 낮은 실행 간 및 실행 중 변동성을 제공합니다. 결과적으로, 이 분석법은 적절한 정량화를 위해 여러 표준물질이 필요한 비표적 액체 크로마토그래피 기반 분석법보다 낮은 변동 계수21 을 생성합니다. 중요하게도, 현재의 방법에서는 외부 검량선이 사용되지 않지만, 이 방법은 여전히 완전한 정량적32로 간주된다.
지질 부류당 표지된 내부 표준물질(또는 내인성적으로 발현되지 않는 표지되지 않은 표준물질)의 한 수준은 대부분의 지질의 정량화에 충분하다. 소수의 출판물만이 산탄총 지질체학 분석법에 대한 부분 분석법 검증을 보고했습니다. 예를 들어, Gryzbek et al.17 및 Surma et al.21에서 내부 표준물질과 고정된 양의 샘플 매트릭스를 사용하여 역보정 곡선을 준비했습니다. 선형성은 로그-변환된 지질의 양과 그 강도의 선형 회귀에 의해 평가되었고, 각각 R2 및 기울기로 보고되었다. 검출 한계(LOD) 및 정량 한계(LOQ)는 LOD의 경우 신호 대 잡음비 3, LOQ의 경우 10을 기반으로 한 가중 선형 회귀에 의해 결정되었습니다. 대부분의 지질 부류의 경우, LOQ는 지방 조직의 경우 2-9.8 pmol, 혈장의 경우 0.05-5μM 사이에서 정의되었습니다. 두 경우 모두, 클래스 당 비내인성 단일 내부 표준물질을 사용하여 클래스 내의 모든 지질에 대한 추정치를 도출했습니다. 그러나, 이 연구에서, 우리는 몇 가지 우려 때문에 LOD/LOQ를 제공하지 않습니다: 내인성 매트릭스는 화합물이 없고, 조직에 대한 대리 매트릭스는 사용할 수 없습니다 - 이로 인해, 알려진 소량의 표준물질의 스파이크가 불가능합니다. 우리는 순수 표준물질의 존재가 없고 동위원소 표지된 지질의 가용성이 매우 제한되어 있기 때문에 동일한 동위원소 표지 표준물질로 정규화된 특정 화합물의 검량선 시리즈를 사용하여 고전적인 표적 정량화 접근법을 수행하지 않습니다. Orbitrap 검출기는 푸리에 변환을 적용하여 과도 신호의 변환을 자동으로 수행하며, 일부 신호는 이미 대체되어 있으며, 그 결과 낮은 농도 범위는 최소 신호까지만 선형이 되어 그 이하에서는 분자를 더 이상 검출할 수 없습니다. Xcalibur 소프트웨어 신호 대 잡음 값은 분자의 m/z 비율에 따라 달라집니다. 결과적으로, 지방산의 상이한 조합을 함유하는 각 지질 부류의 화합물은 상이한 잡음 값을 가질 것이다. 또한, LOQ/LOQ 값은 매트릭스 유형과 엄격하게 연관되어 있으며, 다른 설치류 조직에서 지질체의 정량화를 수행할 때 각 조직 유형에 대한 LOQ를 개별적으로 평가하여 반영해야 합니다.
실제로, 이 방법은 최대 4자릿수(33)의 높은 선형 동적 정량화 범위와 가장 중요한 내인성 구조적 지질을 커버하는 매우 우수한 감도를 제공하며, 이는 MS 획득(32)의 기술적 개선에 의해 추가로 증가될 수 있다. 평균 지질 농도의 변동 계수는 대부분 15% 미만이었는데, 이는 산탄총 지질체학이 GLP(Good Laboratory Practice) 및 GCLP(Good Clinical Practice) 연구에서 고려해야 할 방법으로 FDA(Food and Drug Administration) 요구 사항을 준수함을 의미합니다34.
그러나 극성이 다르기 때문에 일부 지질 클래스는 특정 공액 FA의 기여에 의해 훨씬 더 많은 영향을 받는다는 점에 유의해야 합니다. 이로 인해 광범위한 공액 FA를 포함하는 등몰 혼합물에서 강도 반응이 왜곡되어 인지질 부류에 대해 Koivusalo et al.35 에서 강조한 바와 같이 정량화 편향이 발생합니다. 참고로, 이 저자들은 24-48 사슬 길이의 광범위한 FA에 대한 데이터를 제시했는데, 이는 실제 생물학적 샘플의 상황을 반영하지 않을 가능성이 높습니다. 고도불포화 종에 대한 반응은 완전 포화 종보다 40% 더 높았지만, 이 효과는 더 높은 농도에서만 관찰되었습니다. 혼합물이 점진적으로 희석되었을 때, 불포화의 효과는 점차 감소하고 종당 0.1 pmol/μL에서 사실상 사라졌습니다. 또한 모든 측정은 Q-Exactive 장비가 아닌 이온 트랩 및 삼중 사중극자 장비에서 수행되었습니다.
제시된 워크플로의 또 다른 장점은 특정 프로젝트 요구 사항에 적응할 수 있는 기술적 유연성입니다. 예를 들어, 임의의 지질 추출 프로토콜 - 예컨대 변형된 Bligh and Dyer36, 메틸 tert-부틸 에테르 37, 또는 부탄올-메탄올38 - MS 분석 전에 총 지질 추출물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 클로로포름-메탄올 추출의 주요 한계는 하부 상에 지질 분획이 포함되어 있어 일상적인 작업, 특히 자동화를 복잡하게 만든다는 것입니다. 또한 클로로포름의 독성을 고려해야합니다. tert-부틸 에테르 추출은 혈장 샘플의 지질 분석에 널리 사용된다(37), 자동화된 버전이 제안되었다(21). 이 경우, 우리는 스파이크된 PG, PI, PA 및 PS 지질 클래스38에 대해 훨씬 더 나은 회수율, 더 낮은 용매 소비 및 자동화가능성(39)을 제공하는 반면, 세 가지 방법 모두에 의해 추출된 조직 샘플에 대해 정량화된 전체 농도가 비슷하기 때문에 BUME 방법을 선택했습니다. 또한 현재 작업에서는 샘플 추출을 수동으로 수행했지만 96웰 형식40,41에서 자동화된 샘플 준비 및 지질 추출을 통해 대규모 샘플 세트에서 재현 가능하고 정확한 결과를 얻을 수도 있습니다. 이를 통해 대규모 임상 및 독성학 연구에서 지질학 분석을 구현할 수 있습니다.
현재 작업에서 우리는 Schuhmann et al.42에 의해 설명된 바와 같이 극성 전환 없이 별도로 양극 및 음극 모드의 MS 획득을 수행했습니다. 나노메이트 신호의 안정성은 포지티브 모드에서보다 약간 덜 농축된 용액에 대해 네거티브 모드에서 더 좋습니다. 또한 .raw 파일에서 mzML로 변환하는 컨버터 소프트웨어를 사용하여 LipidXplorer 소프트웨어에서 지정할 값을 제공하는 완전히 추적 가능한 절차를 개발했으며, 이를 통해 수동 분해능 기울기 계산이 필요하지 않습니다. 우리는 또한 다른 노이즈 설정 대체를 적용했는데, 이는 포지티브 모드에서, 스펙트럼의 노이즈 레벨이 네거티브 모드에서보다 높기 때문이다. 모든 단계는 추적 가능하고 처리량이 많은 일상적인 분석에 최적화되었습니다.
식별을 위해 산탄총 지질체학 분석은 서로 다른 극성 모드에서 고유한 부가물을 형성하는 서로 다른 지질 클래스의 고유한 거동을 활용할 수 있습니다. 이 방법에서, 양의 이온화 모드에서 겹치는 동일한 분자량을 갖는 PC 및 PE 종은 PC가 아세테이트 또는 포름산염 부가물을 형성하고 PE가 탈양성자화된 형태로 이온화됨에 따라 음의 이온화 모드에서 완전히 분리될 수 있습니다. 또한, (부분적) 구조적 디콘볼루션(deconvolution)은 분자식뿐만 아니라 벌크 지방산 구조를 활용하는 방법에 대해서도 가능하다. 예를 들어, 총 탄소 및 총 불포화 계수 수준에 대한 FA 식별은 모든 인지질, DAG, TAG 및 리소-인지질에 대해 작동합니다. 각각의 이성질체 형태의 상향식 정량화는 인지질 부류(43 )의 일부에 대해 부분적으로 수행될 수 있지만, MS2 스펙트럼에서 상이한 FA의 불균등한 신호 응답으로 인해 DAG 및 TAG에 대해 훨씬 더 복잡하다.
또한 이 분야의 최근 이니셔티브와 완전히 일치하는 적절한 품질 관리 절차를 구현할 필요성을 강조하는 것도 중요합니다44. 실험실 간 및 실험실 내에서 적절한 데이터 추적성 및 재현성을 보장하기 위해 분석의 모든 단계에 대한 샘플의 적절한 무작위화, 공급업체 인증 표준 혼합물 사용, 품질 관리 샘플 포함, 배치 승인 또는 거부 확인 절차, 장기적으로 QC 성능을 추적하기 위한 내부 데이터베이스 생성과 같은 여러 단계가 수행되었습니다. 또한 이러한 이니셔티브와 일관되게 시료 안정성을 해결하기 위한 표준화된 분석법이 필요합니다. 일반적으로 대부분의 구조적 지질은 지질 산화의 영향을 받지 않으며, 이는 산화리핀, 산화된 지질 및 고도불포화 지방산과 더 관련이 있으므로 보관 및 취급 조건에 훨씬 더 민감합니다. 그러나 시료 안정성에 대한 정확한 평가는 여전히 기술적으로 어려운 작업입니다.
그러나 이 프로토콜은 화합물의 아분자 수준을 결정할 때 한계가 있습니다. 전체 추출물의 분리가 없다는 것을 고려하여, 동일한 분자량을 갖지만 상이한 지방산 조성을 갖는 지질의 모든 이소형이 MS 분석에서 병합된다. 대부분의 클래스의 경우 MS2에서 잔류 지방산 단편의 단편화 비율을 사용하여 구조의 부분 디콘볼루션을 달성할 수 있습니다. 그러나 각 동형체의 독립적인 정량화는 서로 다른 동형체의 단편화 거동의 큰 차이와 순수한 화학 표준물이 보상 값을 정의할 만큼 충분히 다양하지 않다는 사실 때문에 특히 어려운 작업으로 남아 있습니다. 또 다른 한계는 ESI 공정이 필연적으로 아티팩트를 생성하여 DAG, Pas 및 FA와 같은 일부 지질에 대한 피크를 인위적으로 생성하여 잘못된 정량화로 이어질 수 있다는 것입니다.
다음으로, 우리는 우리의 경험을 바탕으로 프로토콜의 가장 중요한 부분을 요약합니다. 첫 번째는 각 마우스 조직 유형이 지질량과 클래스 비율 측면에서 고유한 지질 프로필을 갖는다는 사실과 관련이 있습니다. 이를 통해, 추출 전의 총 단백질 함량을 기준으로 한 조직의 출발량은 MS 신호를 포화시키지 않고 고농도33 에서 지질 응집으로 인한 동적 정량 범위를 벗어나지 않도록 주의 깊게 결정되어야 하며, 또는 반대 극단에서 각 지질 부류에 대한 주요 지질 화합물을 커버하기에 충분한 MS 신호를 제공해야 합니다.
두 번째 중요한 측면은 직접 주입 나노소스 칩 출구의 위치와 질량 분석기의 전달 모세관의 적절한 정렬을 보장하는 것입니다. 두 모드에서 질량 분석기의 전체 보정이 매주 수행된다는 점을 고려할 때, 보정 소스와 나노 소스 칩 설정 간의 교체는 설치 중 정렬 불량으로 인한 신호 강도의 급격한 변동의 원인이 될 수 있습니다.
프로토콜의 또 다른 중요한 부분은 내부 표준 믹스를 신중하게 처리하는 것입니다. 이 혼합물에는 상당한 양의 디클로로메탄이 포함되어 있으므로 일단 개봉하면 증발 및 인공 농도 변화로 이어지는 장기 보관 및 다중 사용을 피하기 위해 신속하게 섭취해야 합니다. 또한, -20°C 보관에서 제거한 후 표준 혼합물을 일관되게 취급하는 것이 중요한데, 이는 온도 차이로 인해 에어쿠션 피펫으로 피펫팅하는 동안 부피 불일치가 발생할 수 있기 때문입니다. 옵션은 표준 재현탁 완충액의 디클로로메탄을 순수한 메탄올로 대체하는 것인데, 이는 취급 편의성을 향상시킬 수 있지만 일부 지질 클래스의 용해도에 부정적인 영향을 미쳐 이러한 지질 클래스의 정량 정확도를 감소시킬 수 있습니다.
마지막으로 중요한 부분은 데이터 처리입니다. 데이터 처리 워크플로는 .raw에서 .mzML 형식으로의 Peak by Peak 소프트웨어 변환을 결합하여 MS2 스캔 평균화, MS1 및 MS2 노이즈 필터링, 피크 피킹 및 데이터 압축을 적용합니다. 대안으로 Proteowizard 소프트웨어를 데이터 변환에도 사용할 수 있지만 이 경우 LipidXplorer의 여러 설정을 수동으로 정의해야 합니다. 샷건 지질체학의 모든 복잡성은 특히 직접 주입 MS1 및 MS2 스펙트럼의 디콘볼루션 단계에 집중되어 있습니다. 오픈 소스 LipidXplorer 소프트웨어는 질량 정확도, 질량 분해능 및 m/z 증가에 따른 변화 기울기를 기반으로 mzML 파일 형식에서 변환된 스펙트럼을 가져옵니다. 이 소프트웨어는 분석 실행 내에서 획득한 여러 개별 MS 및 MS/MS 스펙트럼을 병합합니다. 그런 다음 서로 다른 샘플 실행 내에서 개별 피크를 정렬하고, 정렬된 피크의 각 클러스터에서 해당 질량을 단일 강도 가중 평균 질량으로 대체하고 각 데이터 파일의 풍부도는 그대로 유지합니다. 정렬된 피크 클러스터의 대표 질량과 개별 피크 강도는 마스터 스캔 데이터베이스에 저장됩니다. 마스터 스캔 데이터베이스에는 배치의 모든 샘플에 대해 생성된 모든 MS1 및 MS2 스펙트럼이 포함되어 있으며 MFQL(Molecular Fragmentation Query Language)로 작성된 쿼리를 통해 지질 식별로 디콘볼루션할 수 있습니다.
전반적으로, 이 방법은 양성 모드를 기반으로 하는 DAG, TAG 및 SE 지질과 음성 모드 획득을 기반으로 하는 PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC 및 LPE 지질의 식별을 다룹니다. 지질 식별 중에 MS1 및 MS2에 대해 동위원소 보정이 수행되고 조정된 강도가 .xlsx 출력 파일에 보고됩니다. 또는 ALEX45 및 LipidHunter46과 같은 여러 다른 소프트웨어를 사용하여 샷건 데이터를 처리할 수 있습니다.
주요 핵세포 및 세포막 구성 요소인 지방산은 생리 활성 분자로의 추가 전환을 위해 인지질 형태로 저장됩니다. 이들은 리소인지질 아실트랜스퍼라제 효소에 의해 Lands 경로47을 통해 리소인지질로 전환될 수 있습니다. 예를 들어, LPCAT3 효소는 AA를 리소포스파티딜콜린 및 리소포스파티딜세린 중간체에 통합하기 위해 높은 특이성을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 효소의 상대적으로 높은 발현은 폐포 대식세포 및 기관지 상피 세포와 같은 염증 세포 내에서 보고되었으며,47, 이는 해당 세포에서 AA 함유 인지질의 상대적 비율이 더 많이 방출되도록 합니다. 그러나, 포스포리파아제 A2에 의해 막 인지질로부터 이들이 유리된 후, PUFA를 다양한 유형의 지질 매개체로 전환시키는 것은 많은 효소에 의해 촉매된다48. 또한, 이들 PUFA는 사이클로옥시게나제(COX)-1 및 COX-2 효소47의 작용을 통해 전염증성 및 항염증성 프로스타글란딘의 생산을 위한 기질이 될 수 있다. 인지질은 생물학적 효과를 입증하기 위해 이러한 매개체가 필요한 특정 위치에서 방출되는 지질 매개체의 공급원 중 하나입니다.
폐는 여러 세포 유형으로 구성된 복잡한 기관으로, 각 세포는 정상적인 폐 발달과 기능을 촉진하는 데 겹치고 틈새 역할을 합니다. 마우스 또는 인간 폐에서 다양한 세포 유형(예: 폐포 유형 2 세포)을 분리하고 프로파일링하기 위한 연구는 소수에 불과합니다.49,50; 다른 주요 폐 세포 유형은 특성화되지 않았습니다. 또 다른 흥미로운 연구51은 마우스 폐에서 내피, 상피, 중간엽 및 혼합 면역 세포의 지질 분석을 분리하고 수행하기 위해 수행되었습니다. PCO 및 PG에 혼입된 PUFAs의 농도가 면역 세포에서 농축되는 것이 관찰되었다. 기관지폐포 세척(BAL)52에 의해 평가된 바와 같이 CS가 폐 내 면역 세포의 증가(4-5배)를 유도한다는 사실을 고려할 때, 이 연구에서 관찰된 총 지질 변화는 마우스 폐에서 면역 세포 모집의 누적 증가로 설명될 수 있습니다.
결론적으로, 인지질에 포함된 단일불포화 지방산 및 PUFA의 관찰된 왜곡은 세포 내 특정 FA의 과잉을 반영하거나 산화 스트레스 및 염증 조건에서 과잉 생산되는 옥시리핀 전구체의 세포 내 자원을 구성할 수 있습니다. 그러나 유리 EPA, DHA 및 기타 옥시리핀에 대한 추가 데이터는 이 점을 명확히 하는 데 필수적이며 현재 방법 적용 범위를 벗어납니다.
Disclosures
모든 저자는 필립 모리스 인터내셔널의 직원입니다. 필립 모리스 인터내셔널(Philip Morris International)은 이 프로젝트의 유일한 자금원이자 후원자입니다.
Acknowledgments
저자는 연구팀에 감사를 표하고 특히 PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., 싱가포르 및 PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Switzerland. 저자는 바이오뱅킹을 관리해 준 Sam Ansari에게 감사를 표하고 원고 초안을 편집한 Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 5, and 2 mL self-lock tubes | Eppendorf | 30120086, 30120094 | |
| 3 mm stainless still beads | Qiagen | 69997 | |
| 4.1 µm nozzle chip | Advion | HD-D-384 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 45754-100ML-F | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 14267-25G | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830-500G | |
| Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | 23209 | |
| Butanol | Honeywell | 33065-2.5L | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650498-1L | |
| Dichloromethane | Honeywell | 34856-1L | |
| Ethyl acetate | Honeywell | 33211 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma | M9686 | |
| Heptane | Sigma Aldrich | 34873-2.5L | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A456 | |
| Mouse pooled plasma | BioIvt | ||
| Mouse SPLASH standard | Avanti Polar Lipids | 330710X | Internal standard |
| Nunc 96-flat bottom well transparent plates | VWR | 62409-068 | |
| Plastic spatula | Sigma | Z560049-300EA | |
| Quick Start Bradford 1x Dye reagent | BioRad | 5000205 | |
| Serum diluent | Sigma Aldrich | D5197 | |
| Equipment/software | |||
| CryoPrep CP02 impactor instrument | Covaris | Magnetic hammer | |
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | . | Centrifuge |
| ChipSoft 8.3 | Advion Biosciences | . | Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot |
| LipidXplorer 1.2.8.1 | N/A | . | Software to identify lipids |
| Peak By Peak | SpectroSwiss | . | Software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| ProteoWizard | ProteoWizard | . | Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| Q-Exactive MS | Thermo Fisher | . | High resolution orbitrap mass spectrometer |
| Qiagen Tissue Lyser II | Qiagen | . | Tissue lyser |
| SpeedVac SPD140DDA | Thermo Fisher | . | Vacuum concentrator |
| Tecan Infinite M nano plus | Tecan | . | Plate reader |
| ThermoMixer C | Eppendorf | . | Thermomixer |
| TriVersa Nanomate | Advion Biosciences | . | Direct infusion nano-source |
| Xcalibur 4.3 | Thermo Scientific | . | Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS |
References
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