Summary
Hagelgevärsmasspektrometribaserad lipidomik ger en känslig kvantitativ ögonblicksbild av ett brett spektrum av lipidklasser samtidigt i en enda mätning från olika gnagarvävnader.
Abstract
Lipider spelar en viktig roll som väsentliga komponenter i alla prokaryota och eukaryota celler. Ständiga tekniska förbättringar inom masspektrometri har gjort lipidomik till ett kraftfullt analysverktyg för övervakning av vävnadslipidomkompositioner i såväl homeostatiska som sjukdomstillstånd. Denna artikel presenterar ett steg-för-steg-protokoll för en lipidanalysmetod med hagelgevär som stöder samtidig detektion och kvantifiering av några hundra molekylära lipidarter i olika vävnads- och biofluidprover vid hög genomströmning. Denna metod utnyttjar automatiserad nanoflödes direktinjektion av ett totalt lipidextrakt spetsat med märkta interna standarder utan kromatografisk separation i ett högupplöst masspektrometriinstrument. Med utgångspunkt från submikrogram mängder gnagarvävnad tar MS-analysen 10 minuter per prov och täcker upp till 400 lipider från 14 lipidklasser i lungvävnad från mus. Metoden som presenteras här är väl lämpad för att studera sjukdomsmekanismer och identifiera och kvantifiera biomarkörer som indikerar tidig toxicitet eller gynnsamma effekter i gnagarvävnader.
Introduction
Cigarettrök (CS) erkänns som en viktig riskfaktor i samband med utvecklingen av kroniska inflammatoriska sjukdomar i lungan, inklusive lungcancer, bronkit och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL)1. Utöver lungpåverkan spelar CS-exponering en viktig roll i utvecklingen av andra sjukdomar som aterosklerotisk kranskärlssjukdom och perifer kärlsjukdom1. Hjärt-kärlsjukdom, tillsammans med KOL, är den första respektive tredje vanligaste dödsorsaken i världen. Toxikologiska riskbedömningsmetoder har historiskt sett förlitat sig på användningen av djurmodeller som gnagare. In vivo nos- eller helkroppsmodeller för råttor och möss används ofta för att studera de långsiktiga effekterna av exponering för CS.
Till exempel inducerar i allmänhet 6 månaders rökexponering histologiska och funktionella abnormiteter i murina lungor som efterliknar de av mänsklig sjukdom, inklusive emfysem, luftvägsremodellering och pulmonell hypertension, även om förändringarna är relativt milda jämfört med de som observerats hos långvariga mänskliga rökare2. I både djur- och humanvävnader har studier observerat ett brett spektrum av molekylära förändringar som svar på CS-exponering, inklusive oxidativa stressreaktioner, inflammation och strukturella vävnadsförändringar 3,4. Inte överraskande har CS-exponering också rapporterats ha en långtgående inverkan på lunglipidomet, inklusive effekter på ytaktiva lipider, lipidsignalmediatorer och strukturella lipider 4,5,6.
För att karakterisera de bulklipidförändringar som induceras av den långsiktiga CS-exponeringen av muslungor utförde vi en snabb och kvantitativ masspektrometrianalys med hagelgevärsdirektinfusion. Efter introduktionen av hagelgevärets lipidomikmetod 20057 har denna metod effektivt använts för att utöka vår kunskap om lipidcellulär metabolism 8,9,10 i modellsystem som jäst 11, Caenorhabditis elegans12 och Drosophila melanogaster13, liksom i ett brett spektrum av däggdjursprovtyper såsom cellinjer 14, 15,16 olika mänskliga17,18 och gnagarvävnader19,20 och kroppsvätskor21,22.
Under de senaste decennierna har studier avslöjat komplexiteten hos cellulära svar på miljöförändringar, som involverar tusentals sammankopplade proteiner, lipider och metaboliter. Detta har gjort det klart att användning av toppmoderna analytiska tekniker är avgörande för att få en djupgående bild av de molekylära maskinerna och för att avslöja den fulla omfattningen av exogena fysiologiska effekter. I detta sammanhang kan de omfattande, kvantitativa lipidfingeravtryck som produceras av hagelgevärslipidomikmetoder effektivt öka vår kunskap om lipidcellulär metabolism 8,9,10.
När det gäller CS-exponering som en riskfaktor för flera sjukdomar har toxikologiska riskbedömningsmetoder historiskt sett förlitat sig på användningen av djurmodeller som gnagare. Hagelgevär lipidomik MS tillhandahåller ett snabbt, känsligt och kvantitativt analytiskt verktyg för att bedöma lipidomstörning i många provtyper. Den unika egenskapen hos hagelgevärslipidomik är den automatiserade direktinsprutningsanalysen av ett totalt lipidextrakt spetsat med märkta interna standarder - utan kromatografisk separation i ett högupplöst MS-instrument med hjälp av ett ledande nanochip som genererar en elektrosprayjonisering (ESI) nanospray23.
Mass-till-laddningsförhållandeinformationen som samtidigt förvärvas i MS1-läget ger det totala lipidavtrycket för alla intakta endogena lipider. Eventuellt ger MS2 / MS3-läget, där de ursprungliga lipidmolekylerna fragmenteras och analyseras, ytterligare strukturell information. Dataanalys kräver specialiserad programvara och inkluderar dekonvolution av spektra och topptilldelningar i poolade spektra som leder till lipididentifiering och förmodad kemisk strukturbelysning. Dessutom kan absolut kvantifiering utföras genom spikning av en märkt intern standardblandning som innehåller minst en lipidstandard per lipidklass av intresse. Sammantaget, med den nuvarande tekniken, kan MS-analys som tar några minuter per prov täcka identifiering och kvantifiering av upp till 800 lipider från 14 lipidklasser24 i gnagarvävnader.
Protocol
Alla försök med djur utfördes i en anläggning som är ackrediterad av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International och licensierad av Agri-Food &; Veterinary Authority of Singapore, med godkännande från en institutionell djurvårds- och användningskommitté och i enlighet med National Advisory Committee for Laboratory Animal Research Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (NACLAR, 2004).
1. Insamling av prover
- Utför lungdissektioner hos möss efter 3 månader och 6 månaders exponering av ApoE−/− möss. Samla vävnaderna 16-24 timmar efter exponering, snäppfrys dem i flytande kväve och förvara vid -80 ° C innan du påbörjar lipidomikarbetsflödet. Se till att samla in totalt nio prover från varje "omics" dissektionsgrupp.
2. Vävnad - pulverisering av proverna
- Förbered magnethammaren och förbrukningsmaterialen för vävnadsslipning. Förkylda vävnadspåsar, pincett, täckta vävnadsöverföringsrör med lock, en "V" plastspatel och 2 ml plastuppsamlingsrör på torris. Installera motsvarande rörhållare på ett magnetiskt hammarinstrument. Slå på magnethammaren och ställ in slagkraften på Hög.
- Ladda provet i en vävnadspåse; För in provet genom vävnadspåsens övre öppning med hjälp av förkylda pincett om det behövs. Placera provet i mitten av den flexibla påsen, bort från kanterna.
- Förslut vävnadspåsen genom att skruva fast ett förkylt uppsamlingsrör på ovansidan av vävnadspåsen.
- Snäppfrys provet genom att doppa den flexibla påsen i flytande kväve i 10 sekunder.
- Ventilera uppsamlingsröret; Lossa röret i ett 1/4 varv för avluftning för att undvika att påsen spricker när magnethammaren träffar.
- Ladda den frusna vävnadspåsen på magnethammaren.
- Applicera magnethammaren genom att trycka på aktiveringsknappen för att pulverisera provet. Om icke-pulveriserade vävnadsbitar finns kvar i påsen, snäppfrys provet i flytande kväve igen och upprepa för en andra stöt.
- Ta bort vävnadspåsen från magnethammaren och håll det pulveriserade provet längst ner. För att förhindra att provet smälter, snäppfrys det omedelbart igen.
- Överför provet till ett uppsamlingsrör. Vänd snabbt upp och ned röret så att vävnadspåsen är högst upp och knacka på påsen för att överföra vävnadspartiklarna till botten av uppsamlingsröret.
OBS: Detta steg bör göras snabbt för att undvika smältning av vävnaden. - Överför en 10 mg vävnadsalikvot till ett 2 ml rör för ytterligare lipidomisk analys och förvara provet vid −80 °C tills ytterligare steg utförs.
3. Homogenisering av vävnader
- Slå på vävnadslysörinstrumentet och ställ in skakfrekvensen på 30 Hz och skakningstiden på 2 min. Förbered vävnadshomogeniseringsbuffertlösningen: 150 mM ammoniumbikarbonat i vatten, med ett pH av ~ 8,2.
- Ta ut proverna från förvaringsfrysen, lägg på is och tillsätt fyra rostfria pärlor i rören som innehåller vävnadspulvret. Tillsätt 0,5 ml 150 mM ammoniumbikarbonatbuffert till varje prov.
- Placera provrören i vävnadslyshållarna. Balansera båda hållarna med samma antal rör. Fäst hållarna i vävnadshållarmen. Stör vävnaden.
- Placera rören på is och kontrollera visuellt att inga kvarvarande vävnadsaggregat finns i röret. Om vävnadsstörningen är ofullständig (aggregat ses), upprepa störningsprocessen genom att utföra en annan behandlingscykel. Lägg proverna på is.
- Skapa en alikvot 1 på 100 μl av provet i ett 1,5 ml rör avsett för proteinbestämning. Centrifugera den vid 18 200 × g i 5 min vid 10 °C.
- Bestäm proteinhalten i alikvot 1 med Bradford-testet (se avsnitt 4). Förvara proverna på is.
- Skapa en alikvot 2 på 20–100 μl av stamhomogenatet i ett nytt 2 ml mikrorör för lipidextraktion (se avsnitt 5). Om proverna inte analyseras omedelbart, håll dem på is tills extraktionen utförs.
OBS: Den slutliga extraktionsvolymen måste definieras på grundval av den totala proteinmängden. Det måste ligga i intervallet 0,015-0,045 mg protein per total alikvot.
4. Bradford proteinbestämningsanalys
OBS: Studieprover bör randomiseras innan analysen påbörjas, och randomiseringen respekteras för alla steg i provbearbetningen.
- Späd centrifugerad alikvot 1 supernatant 2x med ammoniumbikarbonatbuffert.
Anmärkning: Utspädningsfaktorn beror på koncentrationen av vävnadshomogenatet. För mer koncentrerade lösningar, applicera en högre faktor så att den bestämda koncentrationen faller inom analysens dynamiska område. - Bered en standardkurva för bovint serumalbumin (BSA) enligt tabell 1. Vortex standardrören. Centrifugera rören vid 18 200 × g i 15 s vid rumstemperatur.
- Från de standardrör som tidigare förberetts överförs 6 μL vardera av ämnet och standarderna till en platta med 96 brunnar med plan botten enligt plattlayouten som visas i figur 1.
- Överför de tidigare beredda proverna till plattan med 96 brunnar med plan botten enligt den plattlayout som beskrivs i figur 1.
- Tillsätt 250 μl Bradford Reagens till varje brunn genom att använda en flerkanalig pipett och blanda. Inkubera i 5 min.
- Mät absorbansen vid en våglängd på 595 nm med hjälp av en plattläsare.
- Beräkna proteinkoncentrationerna i alikvoterna baserat på standardkurvan.
Anmärkning: Den utspädningsfaktor som används i början av förfarandet bör beaktas vid beräkning av proteinkoncentrationerna.
5. BUME-extraktion
OBS: Undvik användning av lågbindande plaströr för lipidomikextraktion, eftersom de starka organiska lösningsmedlen frigör mjukgörare och skapar en stark bakgrund under provanalysen.
- Förbered 1,5 ml rör med 100 μL ammoniumbikarbonatlösning i varje rör av det totala ämnet (TB), internt standardämne (ISB) och kvalitetskontrollprover (QC), med tanke på att 1 QC-prov placeras mellan varje uppsättning av 10 prover. Förvara alla prover på is.
- Tillsätt 10 μl poolad human plasma till alla QC-prover. Spika 10 μL intern standardlösning i alla ISB-, QC- och studieprover (dvs. alla prover utom TB).
OBS: För kvalitetskontrollmaterial, använd alla poolade kommersiellt tillgängliga K2EDTA-plasma. Kvantifiera lipidkoncentrationen i poolad plasma med hjälp av det nämnda protokollet vid mottagandet och behåll dessa intervall som referenser för alla analyser där QC-materialet används. Använd endast NIST-plasma för mer riktade tillämpningar eller för global metodverifiering, där analysens noggrannhet måste beaktas. - Tillsätt 300 μl −20 °C butanol/metanolblandning (3/1, v/v) till varje prov. Skaka vid 450 × g i 10 min vid rumstemperatur på termomixern.
- Tillsätt 300 μl blandning av heptan/etylacetat (3/1, v/v). Skaka vid 450 × g i 10 min vid rumstemperatur på termomixern.
- Tillsätt 300 μL 1% ättiksyrablandning. Skaka i 5 min vid 450 × g vid rumstemperatur på termomixern. Centrifugera vid 2 800 × g i 5 min vid rumstemperatur. Överför 360 μL av den övre fasen till ett nytt 2 ml självlåsrör 2.
OBS: Vätske-vätskeextraktion kan resultera i skiftande positioner för fasgränsen på ett provberoende sätt, vilket kan resultera i en liten volymavvikelse för den övre fasen. Justera uppsamlingsvolymen för den övre fasen om det behövs. - Tillsätt 320 μL heptan/etylacetat (3/1, v/v) till vattenfasröret 1. Skaka vid 450 × g i 5 min vid rumstemperatur på termomixern. Centrifugera vid 2 800 × g i 5 min vid rumstemperatur. Överför 320 μL av den övre fasen och kombinera med fraktionen från steg 5.11.
OBS: Justera uppsamlingsvolymen för den övre fasen om det behövs. - Tillsätt 250 μL heptan/etylacetat (3/1, v/v) till vattenfasen i rör 1. Skaka vid 450 × g i 5 min vid rumstemperatur på termomixern. Centrifugera vid 2 800 × g i 5 min vid rumstemperatur. Överför 200 μl av den övre fasen och kombinera med fraktionerna från steg 5.11 och steg 5.15 i rör 2.
OBS: Justera uppsamlingsvolymen för den övre fasen om det behövs. - Indunsta till torrhet vid 35 °C i vakuumkoncentrator.
OBS: Torkade prover kan förvaras vid −20 °C fram till analys, om så krävs. - Lös lös i 300 μl MS-blandningslösning (7,5 mM ammoniumacetat i isopropanol/metanol/kloroform, 4:2:1-lösning). Virvla varje rör i 5 s för att säkerställa att allt är upplöst. Centrifugera vid 18 200 × g i 5 min vid 4 °C.
- Överför en alikvot på 50 μl till mikroliterplattan enligt plattlayouten i figur 2 för analys av positivt joniseringsläge (kolumnerna 1–6) och späd med 50 μl MS-blandningslösning.
- Överför en alikvot på 20 μl till MTP-plattan enligt plattlayouten i figur 2 för analys av negativt joniseringsläge (kolumnerna 7–12) och späd med 80 μl MS-blandning. Slå in plattan med folie och förvara den vid 4 °C före analysen.
6. Analys av medlemsstaterna
- Kalibrera en masspektrometer (MS) både i positiva och negativa lägen i enlighet med tillverkarens instruktioner 5 dagar eller mindre före analysen.
- Installera nanokällan för direktinfusion i förväg och se till att den är korrekt inriktad mot MS: s överföringskapillär. Installera ett 4,1 μm munstyckschip i chiphållaren och konfigurera det i programvaran.
- Använd följande parametrar för inställning av metod för positivt och negativt läge: gastryck på 1,25 psi; källspänning på 1,1 kV; 5 μl provinjektionsvolym. utgångskontaktstängning Rel1 för 2,5 s; 5 min leveranstid; plattkylning vid 4 °C.
- Ställ in analyssekvenskön för direktinfusionsroboten i positivt läge.
- Ställ in MS-metoden för positivt läge med följande MS-inställningar:
- Ställ in kapillärtemperaturen på 250 °C och S-objektivets RF-nivå på 65,0. Utför MS-insamling med full skanning från 0 till 1 minut i intervallet 550–1000 m/z med 140 000 pixlars upplösning med automatisk förstärkningskontroll på 1 ×10 6 och maximal injektionstid på 50 ms. Applicera låsmassa på 680.48022.
- Ställ in dataoberoende MS/MS-insamlingsmetod mellan tidsintervallet 1 och 5 minuter med upplösningen 17 500 med en fast första massa på 250 m/z. Använd en automatiserad förstärkningskontroll för MS2 vid 1 × 105 och maximal injektionstid på 64 ms, en kollisionsenergi på 20 NCE och ett isoleringsfönster på 1 m / z. Använd inkluderingsmasslistan från 550 till 1 000 m/z, med ett masssteg på 1 Da.
- För förvärv i negativt läge, ställ in kapillärtemperaturen på 250 ° C och S-linsens RF-nivå på 65,0 i MS-inställningsfilen.
- Använd följande MS-metodinställningar: fullskanningsinsamlingsläge från 0 till 1 min vid 140 000 upplösning som täcker intervallet 400-940 m / z, automatiserad förstärkningskontroll på 1 × 106; maximal injektionstid på 50 ms; Använd en låsmassa på 529.46262.
- Ställ in MS2-förvärv i DIA-läge mellan 1 och 5 minuter av körningen med en upplösning på 17 500 med en fast första massa på 150 m / z; automatiserad förstärkningskontroll av 1 × 105; 64 ms maximal injektionstid; och 35NCE av kollisionsenergi. Använd inkluderingsmasslistan från 400 till 940 med ett masssteg på 1 Da.
- Skapa analyssekvenskön i MS-programvara i positivt läge. Vänta tills provinsamlingen utlöses av en kontaktstängningssignal som kommer från direktinfusionsroboten för varje prov.
- När analysen av positivt läge är klar skapar du sekvenskön för direktinfusionsroboten i negativt läge.
- Ställ in analyssekvenskön i MS-programvara i negativt läge.
7. Behandling av uppgifter
- För att konvertera datafilerna från positiva och negativa lägen från .raw format till .mzML-format, använd konverteringsprogramvaran.
Datafiler från positiva och negativa lägen måste konverteras separat (på grund av deras olika förvärvsinställningar och olika bruströskel).- Fyll i följande inställningar för att utföra filkonvertering: bruströskelfaktorn är 3 och 5 för MS respektive MS2; aktivera brusborttagningsfunktionen för både MS och MS2, datakomprimering, genomsnittliga MS2-skanningar och toppplockning. Ange TIC-tröskelvärden för positiva och negativa lägen (t.ex. 10 000 och 5 000, som ska definieras utifrån ljudnivån för det specifika prov som produceras av ett specifikt instrument). Generera XLC- och PDF-rapporter i slutet av behandlingen.
- Utför lipididentifieringen. Definiera följande (exempel) inställningsparametrar för filimport: urvalsfönster ±0,5 Da (beror på urvalsfönstret i MS-metoden); tidsintervall 2-300 s (beror på skanningstiden i MS-metoden); inga kalibreringsmassor för MS och MS2; överföra och avrunda massintervallet uppåt från metadatafilerna för programvaran Peak by Peak (min massa [MS]) och (min massa [MS2]), tolerans på 3 ppm och 10 ppm för MS respektive MS2; hålla MS- och MS2-tröskelfältet, frekvensfiltret, MS1-förskjutningen och PMO tomma; Isotopkorrigering för MS och MS2 vald; överföra upplösningsgradient från omvandlarmetadatafilen som (Resolution linear fit [MS]) och as (Resolution linear fit [MS2]).
OBS: Lipididentifiering i positiva och negativa lägen måste utföras separat på grund av deras olika förvärvsinställningar. - När data har importerats går du till menyn Kör och laddar upp MFQL-filerna för lipididentifiering.
OBS: För detaljerad information om MFQL:s struktur, se publikationen av Herzog et al.25. Se några exempel på MFQL-filer på https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library och se diskussionen. Alla MFQL som används för databehandlingen tillhandahålls i tilläggsmaterialet. - Kvantifiera de identifierade arterna på MS-nivå genom att dividera prekursormassintensiteten hos lipidfunktionen med respektive intensitet hos den märkta interna standarden och multiplicera sedan kvoten med koncentrationen av den märkta interna standarden. Normalisera den slutliga lipidkoncentrationen per mängd totalt protein mätt med Bradford-analysen.
8. Förfarande för kvalitetskontroll
OBS: Ett kvalitetskontrollförfarande är ett viktigt steg för att verifiera metodens tekniska reproducerbarhet. För detta ändamål analyseras en kommersiell poolad plasma för att bestämma de endogena nivåerna av olika lipider under 5 dagar i 15 identiska alikvoter per sats (totalt fem satser). Observera att i det här fallet skapades en pipeline för datautvärdering som ett Shiny-webbprogram med hjälp av R-statistikprogramvarumiljön.
- Definiera referensacceptansintervallet som medelvärdet beräknat för alla fem satserna ±3 standardavvikelser.
- Tillämpa reglerna för godkännande för varje analyssats: 90 % av referensmålen måste godkännas, med tanke på att en referensförening representerar en lipidklass. Om till exempel 15 referensmål ingår i QC-verifieringen kontrollerar du att 13 mål godkänns för att batchen ska accepteras.
OBS: Med andra ord måste 68% av QC-proverna per referensförening passera för att data för denna lipidklass ska accepteras. - Om studiebatchen inte uppfyller acceptanskriterierna för QC-kontrollen, upprepa proceduren.
9. Uppskattning av (relativa) konjugerade fettsyramängder
- För varje lipidklass, uppskatta mängderna konjugerade fettsyror baserat på deras MS2-intensiteter.
OBS: På grund av fragmenterings- och joniseringsskillnader var de härledda värdena endast avsedda för relativa överflödsjämförelser mellan provgrupper snarare än till exempel för att uppskatta det relativa bidraget från en specifik fettsyra till den totala konjugerade fettsyrapoolen i en lipidklass. - Normalisera MS2-intensiteterna hos fettsyrafragmenten med den genomsnittliga intensiteten hos fettsyrafragmenten i motsvarande interna standard. Baserat på koncentrationen av den interna standarden och den uppmätta vävnadsvikten, härled en "normaliserad koncentration" för de konjugerade fettsyrorna. Summera dessa värden per lipidklass för att uppskatta den totala mängden av varje konjugerad fettsyra per prov.
10. Statistisk analys
- Utför statistisk analys. Anpassa en linjär modell för varje villkor och motsvarande kontrollgrupp, och beräkna p-värden från en t-statistik för log2-transformerade data. Använd Benjamini-Hochbergs metod för falsk upptäcktsfrekvens för att korrigera för flera testeffekter.
OBS: Lipider med justerade p-värden < 0,05 anses vara differentiellt rikliga. Här utfördes statistisk analys i R-statistikmiljön26.
Representative Results
Här presenterar vi som representativa resultat data som illustrerar hur hagelgevärslipidomik kan användas för att studera effekterna av CS på lungorna hos möss. Hagelgevärets lipidanalysprotokoll tillämpades framgångsrikt för en in vivo-studie för jämförande analys av två grupper av prover: lungvävnader dissekerade från nio kvinnliga Apoe−/−-möss exponerade för CS (3R4F-grupp; positiv kontroll) och lika många möss som hölls under friskluftsförhållanden (skengrupp) som negativ kontroll som samlades in vid 3 månader, 4 månader och 6 månaders exponeringstid. Djuren hölls under filtrerad och konditionerad frisk luft vid 22 °C ± 2 °C temperatur och 55 % ± 15 % luftfuktighet och utfodrades med gammabestrålad pelletsdiet. Ljusregimen upprätthölls vid 12 timmar per dag. Upp till åtta möss var inrymda per bur. 3R4F-referenscigaretter för exponeringsbehandlingen köptes från University of Kentucky för att generera 3R4F CS-aerosolen (600 μg TPM/L-aerosol för totala partiklar) för en målexponeringskoncentration motsvarande 28 μg nikotin/L.CS rök från 3R4F-cigaretter producerades med 30-portars roterande rökmaskiner enligt Phillips et al.27 . Baserat på Health Canada Intensive Smoking Protocol applicerades 55 ml puffvolym, en puff per 30 s och 100% blockering av ventilationshål på 3R4F-cigaretter för att ge tillräcklig exponering. Alla ytterligare detaljer om studiedesignen har rapporterats tidigare27,28.
Sammantaget identifierades och kvantifierades ~ 400 molekylära lipidarter från de 14 vanligaste lipidklasserna (figur 3). Den totala normaliserade lipidkoncentrationen per klass var något förhöjd för PE-, PEO-, PC-, PCO-, PI- och PG-lipidklasserna, och viss nedreglering observerades för SM-, LPE- och PA-lipider (figur 3A), medan ingen skillnad kunde ses för TAG och PS. Intressant nog har förhöjda nivåer av PCO- och PEO-plasmalogenlipider i CS-gruppen rapporterats i inflammatoriska celler29 . En av de intracellulära funktionerna hos plasmalogenlipider är antioxidantaktivitet. Vid exponering för reaktivt syre (ROS) och kvävearter (RNS) rapporterades selektiv oxidation av plasmalogen i jämförelse med diacylffolipider30. Enyleterbindningen i plasmalogens kemiska struktur är känslig för radikala angrepp på oxidativ stress31. De viktigaste produkterna av radikal attack är hydroxylerade eikosatetraensyror, 2-monoacylglycerol fosfolipider, pentadekanol, myrsyror, α-hydroxialdehyder med olika kedjelängder, 1-formyl-2-arakidonoylglycerofosfolipid och lysofosfolipider.
Dessa resultat visar att bland de molekylära egenskaperna baserade på den totala molekylformeln påverkades 100-120 föreningar signifikant av CS-exponering (figur 3D). Den detaljerade dekonvolutionen av MS2-fragmenteringsinformationen och normaliseringen av fragmentsignalintensiteterna möjliggjorde en ungefärlig definition av den totala mängden av varje konjugerad fettsyra (FA) representerad i varje lipidklass (figur 3E) och jämförelse av dessa data mellan exponerade och kontrollgrupper. En tydlig minskning av både helt mättade FA och sådana med endast ett fåtal omättnader, främst i samband med lysolipider, observerades. Däremot var fleromättade fettsyror (PUFA) i sammansättningen av PC-, PE- och PG-fosfolipidklasser förhöjda i CS-gruppen för alla tidpunkter. De extrema fallen av PC och PG konjugerade med eikosapentanosyra (EPA) och dokosahexaensyra (DHA) detekterades uteslutande i 3R4F CS-exponeringsgruppen (figur 3E, röd färg).
Figur 1: Plattlayout för provfördelning i Bradford-testet. Blindprov och standardprover placeras i tre exemplar i kolumnerna 1–3. Okända prover placeras i två exemplar i kolumnerna 4-11. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Plattlayout för 96-brunns mikrotiterplatta för analys av hagelgevärets masspektrometri. Fördelningen av blank-, standard-, okänd- och QC-prover för förvärv i positivt joniseringsläge kartläggs på vänster sida av plattan (kolumnerna 1-6); Alla prover för det negativa joniseringsläget placeras till höger (kolumnerna 7-12). Förkortningar: pos = positiv; QC = kvalitetskontroll; neg = negativ; TB = totalt tomt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Hagelgevärslipidomikanalys av muslungor utsatta för cigarettrök. Apoe−/− möss utsattes för CS från 3R4F-referenscigaretten eller frisk luft (sham). a) Koncentrationer av lipidklass och antalet lipidarter per klass. För varje klass anges antalet kvantifierade lipidarter inom parentes. Genomsnittliga och 95 % konfidensintervall för varje lipidklass, separat för varje exponeringstyp (aggregerat över tre tidpunkter). (B) Vulkandiagram som visar effektstorleken (log2-faldig förändring) och signifikans (-log10 FDR-justerat p-värde) för de kvantifierade lipidarterna för jämförelsen av 3R4F CS kontra bluff vid de tre tidpunkterna. Signifikant förhöjda lipider är markerade i gult; signifikant minskade lipider markeras i cyan (FDR-justerat p-värde < 0,05). (C) Differentiell förekomst av de 25 lipidarter som har de största absoluta genomsnittliga veckförändringarna. Log2-vikningsförändringar för 3R4F CS kontra skenjämförelse är färgkodade och statistisk signifikans anges: *: FDR-justerat p-värde < 0,01; X: FDR-justerat p-värde < 0,05. d) Jämförelsediagram. Korrelationskoefficienter för jämförelserna av vikningsförändringar är färgkodade och antalet delade differentiellt rikliga lipider anges (totalt antal i marginalerna). Cirkeldiagram visar procentandelen delade differentiellt rikliga lipider med samma förändringsriktning (FC-tecken). Asterisk indikerar en signifikant överlappning av de differentiellt rikliga lipiderna. (E) Differentiell förekomst av konjugerade FA per lipidklass. Värmekarta som i panel C för konjugerade fettsyror med signifikanta överflödsskillnader mellan 3R4F och skenexponering i alla tre tidpunkterna (FDR-justerat p-värde < 0,05). Mängden av varje fettsyra per lipidklass uppskattades baserat på MS2-intensiteterna hos fettsyrafragmenten. Förkortningar: CS = cigarettrök; FDR = falsk upptäcktsfrekvens; FC = vikförändring; FA = fettsyror; PC = fosfatidylkolin; PS = fosfatidylserin; TAG = triacylglycerol; SM = sfingomyelin; PEO = plasmalogenfosfatidyletanolamin, PE = fosfatidyletanolamin, PG = fosfatidylglycerol; PI = fosfatidylinositol; DAG = diacylglycerol; SE = sterol-/kolesterylestrar, PCO = plasmalogenfosfatidylkolin; LPC = lysofosfatidylkolin; LPE = lysofosfatidyletanolamin, PA = fosfatidinsyra. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| BSA slutlig koncentration (mg/ml) | BSA-lösning vid 2 mg/ml (μl) | Ammoniumbikarbonatbuffert (μL) |
| 1 | 50 | 50 |
| 0.75 | 37.5 | 62.5 |
| 0.5 | 25 | 75 |
| 0.25 | 12.5 | 87.5 |
| 0.125 | 12.5 | 187.5 |
| 0.0625 | 50 av 0,125 mg/ml lösning | 50 |
| 0 | 0 | 100 |
Tabell 1: Utspädningsschema för BSA:s interna standard för kalibreringskurvan för Bradford-testet. Förkortning: BSA = bovint serumalbumin.
Kompletterande information: MFQL-filer som används för LipidXplorer lipididentifiering. Det .zip paketet består av de enskilda MFQL-filer som krävs, var och en namngiven enligt det här mönstret:
Discussion
Även om framsteg inom MS har gett en mängd olika metoder för att noggrant övervaka många lipidarter, visade den tidigare lipidprofileringen av olika däggdjursvävnader inte konsekventa resultat och följaktligen är lipidernas specifika vävnadsspecifika funktioner fortfarande oklara. I jämförelse med proteinfunktionell analys, för vilken mer robusta metoder för att slå ut uttrycket av vissa föreningar finns tillgängliga, kan majoriteten av lipider inte selektivt stängas av eller överuttryckas i vävnader, vilket gör den funktionella utvärderingen av lipider svår. Avancerad profilering av vävnadslipidomkoncentrationer kan ge ett alternativt tillvägagångssätt för att identifiera samband mellan cirkulerande lipider och mänskliga sjukdomar.
Vid utvärdering av omfattande lipidomikmetoder som kvalitativt och kvantitativt kan täcka den endogena lipidprofilen hos vilken musvävnad som helst, föredrog vi hagelgevärets lipidomikmetod. I allmänhet är två motsatta typer av provanalys möjliga: antingen en helt oriktad screening av lipider med vätskekromatografi (LC) -baserad separation med ytterligare masspektrometrisk detektion för att avslöja provets totala lipidkomplexitet, eller riktade tillvägagångssätt, som mestadels möjliggör mycket exakt kvantifiering av specifika lipider av intresse. Däremot är det starka inslaget i det presenterade hagelgevärslipidomikarbetsflödet den snabba omfattande täckningen av hundratals endogena lipider från fördefinierade lipidklasser, som fortfarande kan utföras på ett robust semikvantitativt sätt.
Joniseringseffektiviteten hos olika lipidklasser är strukturberoende och kan variera drastiskt beroende på de olika experimentella joniseringsförhållandena. I motsats till LC-baserade separationsmetoder minimerar hagelgevärsanalys dessa skillnader på grund av direkt samtidig infusion av hela lipidextraktet under samma joniseringsförhållanden i MS-instrumentet. Användningen av isotopiskt märkta lipidanaloger eller strukturellt liknande icke-endogena standarder möjliggör semikvantifiering av alla lipidklasser. Hagelgevärslipidomik ger låg variabilitet mellan och inom loppet under MS-analys; Som ett resultat ger denna metod lägre koefficienter för variation21 än oriktade vätskekromatografibaserade metoder, vilket kräver flera standarder för adekvat kvantifiering. Det är viktigt att notera att även om ingen extern kalibreringskurva används i den nuvarande metoden, anses metoden fortfarande vara helt kvantitativ32.
En nivå av märkt intern standard (eller omärkt standard som inte uttrycks endogent) per lipidklass är tillräcklig för kvantifiering av de flesta lipider. Endast ett fåtal publikationer har rapporterat en partiell metodvalidering för en hagelgevärslipidomikmetod. Till exempel i Gryzbek et al.17 och Surma et al.21 utarbetades omvända kalibreringskurvor med hjälp av interna standarder och en fast mängd provmatris. Linjäriteten bedömdes genom linjär regression av logtransformerade lipidmängder och deras intensiteter och rapporterades som R2 respektive lutning. Detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ) bestämdes genom viktad linjär regression baserat på ett signal-brusförhållande på 3 för LOD och 10 för LOQ. För de flesta lipidklasser definierades LOQ mellan 2-9,8 pmol för fettvävnad och 0,05-5μM i plasma. I båda fallen användes icke-endogena enskilda interna standarder per klass för att härleda uppskattningar för alla lipider i klassen. I detta arbete tillhandahåller vi dock inte LOD/LOQ på grund av flera problem: den endogena matrisen är inte föreningsfri och surrogatmatrisen för vävnader är inte tillgänglig - med detta är spiken av små kända mängder standarder inte möjlig. Vi utför inte en klassisk riktad kvantifieringsmetod med användning av en kalibreringskurvserie av en viss förening normaliserad med sin identiska isotopmärkta standard på grund av att det inte finns rena standarder och den mycket begränsade tillgängligheten av isotopiskt märkta lipider. Orbitrap-detektorer utför automatiskt omvandlingen av den transienta signalen genom att tillämpa en Fourier-transformation, och en viss signal är redan ersatt - som ett resultat kommer det lägre koncentrationsområdet endast att vara linjärt ner till någon minimisignal, under vilken molekylen inte längre kan detekteras. Xcalibur-programvarans signal-till-brus-värden beror på molekylens m / z-förhållande; Som ett resultat kommer föreningarna i varje lipidklass, innehållande olika kombinationer av fettsyror, att ha olika ljudvärden. Dessutom är LOQ/LOQ-värden strikt kopplade till typen av matris, och när kvantifiering av lipidomet görs i olika gnagarvävnader bör det återspeglas i bedömningen av LOQ för varje vävnadstyp individuellt.
Faktum är att metoden erbjuder ett högt linjärt dynamiskt kvantifieringsområde på upp till fyra storleksordningar33 och mycket god känslighet för att täcka de viktigaste endogena strukturella lipiderna, vilket kan ökas ytterligare genom tekniska förbättringar i MS-förvärv32. Variationskoefficienterna för de genomsnittliga lipidkoncentrationerna var mestadels under 15%, vilket innebär att hagelgevärslipidomik uppfyller kraven från Food and Drug Administration (FDA) som en metod som ska beaktas för studier av god laboratoriesed (GLP) och god klinisk sed (GCLP)34.
Det måste dock noteras att på grund av deras olika polaritet påverkas vissa lipidklasser mycket mer av bidraget från specifika konjugerade FA. Detta leder till förvrängning av intensitetsresponsen i ekvimolära blandningar som innehåller ett brett spektrum av konjugerade FAs, vilket resulterar i kvantifieringsbias, vilket framhävs av Koivusalo et al.35 för fosfolipidklasser. Observera att dessa författare presenterade data för ett brett spektrum av FA, från 24-48 kedjelängd, vilket sannolikt inte återspeglar situationen i ett verkligt biologiskt prov. Svaret för fleromättade arter var 40% högre än för helt mättade arter, men denna effekt observerades endast för högre koncentrationer. När blandningen gradvis späddes minskade effekten av omättnad gradvis och försvann praktiskt taget vid 0,1 pmol/μl per art. Dessutom gjordes alla mätningar på jonfälla och tripplar kvadrupolinstrument och inte på Q-Exactive-utrustning.
En annan fördel med det presenterade arbetsflödet är dess tekniska flexibilitet, vilket möjliggör anpassning till specifika projektkrav. Till exempel kan alla lipidextraktionsprotokoll - såsom de modifierade Bligh och Dyer 36, metyl tert-butyleter37 eller butanol-metanol38-metoder - användas för att framställa ett totalt lipidextrakt före MS-analys. Huvudbegränsningen för kloroform-metanolextraktion är att den nedre fasen innehåller lipidfraktionen, vilket komplicerar rutinarbete och särskilt automatisering; Dessutom måste toxiciteten hos kloroform beaktas. Tert-butyleterextraktion används ofta för lipidanalys av plasmaprover37, och en automatiserad version har föreslagits21. I det här fallet valde vi BUME-metoden eftersom den ger ännu bättre återvinning för de spikade PG-, PI-, PA- och PS-lipidklasserna38, lägre lösningsmedelsförbrukning och möjligheten till automatisering39, medan de totala koncentrationerna kvantifierade för vävnadsprover extraherade med alla tre metoderna var jämförbara. Dessutom, medan provextraktionen utfördes manuellt i det aktuella arbetet, är det också möjligt att erhålla reproducerbara och exakta resultat från stora provuppsättningar genom automatiserad provberedning och lipidextraktion i ett 96-brunnsformat40,41. Detta gör att man kan genomföra lipidomikanalys i storskaliga kliniska och toxikologiska studier.
I det aktuella arbetet utförde vi MS-förvärvet av positiva och negativa lägen separat utan polaritetsväxling som beskrivs av Schuhmann et al.42. Nanomatsignalens stabilitet är bättre i negativt läge för en något mindre koncentrerad lösning än i positivt läge. Dessutom utvecklade vi en fullt spårbar procedur med konverteringsprogramvara från .raw filer till mzML, vilket ger de värden som ska anges i LipidXplorer-programvaran - med detta krävs inte manuella upplösningslutningsberäkningar. Vi tillämpade också olika brusinställningssubstitutioner eftersom spektras brusnivåer i positivt läge är högre än i negativt läge. Alla steg optimerades för spårbara rutinanalyser med hög genomströmning.
För identifiering kan hagelgevärslipidomikanalys utnyttja det unika beteendet hos olika lipidklasser, som bildar unika addukter i olika polaritetslägen. I denna metod kan PC- och PE-arter med samma molekylmassa som överlappar varandra i det positiva joniseringsläget separeras fullständigt i det negativa joniseringsläget, eftersom PC bildar acetat- eller formiataddukter och PE joniseras i en deprotonerad form. Dessutom är (partiell) strukturell dekonvolution möjlig för metoden som använder inte bara molekylformeln utan också bulkfettsyrastrukturen. Till exempel fungerar FA-identifiering på nivån av totalt kol och totalt omättnadsantal för alla fosfolipider, DAG, TAG och lysofosfolipider. Bottom-up-kvantifieringen av varje isomera form kan delvis utföras för några av fosfolipidklasserna43 men är mycket mer komplex för DAG och TAG på grund av det ojämna signalsvaret hos olika FA i MS2-spektra.
Det är också viktigt att betona behovet av att genomföra lämpliga förfaranden för kvalitetskontroll, helt i linje med de senaste initiativen på detta område44. Eftersom vi vill säkerställa korrekt dataspårbarhet och reproducerbarhet mellan och inom laboratoriet har ett antal steg tagits, såsom korrekt randomisering av proverna för alla steg i analysen, arbete med leverantörscertifierade standardblandningar, inkludering av kvalitetskontrollprover, procedurer för att verifiera batchgodkännande eller avslag och skapandet av en intern databas för att spåra QC-prestanda på lång sikt. I överensstämmelse med dessa initiativ är också behovet av en standardiserad metod för att hantera provstabilitet. I allmänhet påverkas majoriteten av strukturella lipider inte av lipidoxidation, vilket är mer relevant för oxilipiner, oxiderade lipider och fleromättade fettsyror som därför är mycket känsligare för lagrings- och hanteringsförhållanden. Korrekt bedömning av provstabilitet är dock fortfarande en tekniskt utmanande uppgift.
Emellertid, Detta protokoll har en begränsning när det gäller att bestämma submolekylära nivåer av föreningar. Med tanke på att det totala extraktet inte separeras slås alla isoformer av lipider med samma molekylmassa men olika fettsyrasammansättningar samman i MS-analysen. För de flesta klasser är det möjligt att uppnå partiell dekonvolution av strukturen genom att använda fragmenteringsförhållandena för kvarvarande fettsyrafragment i MS2. Den oberoende kvantifieringen av varje isoform är dock fortfarande en särskilt utmanande uppgift på grund av de stora skillnaderna i fragmenteringsbeteenden hos olika isoformer och det faktum att rena kemiska standarder inte finns tillgängliga i tillräckligt stor variation för att definiera kompensationsvärdena. En annan begränsning är att ESI-processen oundvikligen genererar artefakter, vilket resulterar i artificiell generering av toppar för vissa lipider såsom DAG, Pas och FA, vilket kan leda till felaktig kvantifiering.
Därefter sammanfattar vi de mest kritiska delarna av protokollet baserat på vår erfarenhet. Den första är relaterad till det faktum att varje musvävnadstyp har en unik lipidprofil när det gäller både lipidmängd och klassförhållanden. Med detta måste utgångsmängderna för vävnaden baserat på det totala proteininnehållet före extraktion noggrant bestämmas för att inte mätta MS-signalen och inte lämna det dynamiska kvantifieringsområdet på grund av lipidaggregering vid höga koncentrationer33 eller - vid motsatt ytterlighet - för att ge tillräckligt med MS-signal för att täcka de viktigaste lipidföreningarna för varje lipidklass.
Den andra kritiska aspekten är att säkerställa en korrekt inriktning av positionen för nanokällans chiputlopp med direktinfusionens nanokälla med masspektrometerns överföringskapillär. Med tanke på att fullständig kalibrering av masspektrometern i båda lägena utförs varje vecka, kan byte mellan kalibreringskällan och nanokällans chipinställning vara orsaken till dramatisk variation i signalintensitet på grund av felinriktning under installationen.
En annan kritisk del av protokollet är den noggranna hanteringen av den interna standardmixen. Eftersom denna blandning innehåller en betydande mängd diklormetan, när den har öppnats, bör den konsumeras snabbt för att undvika lång lagring och flera användningsområden som leder till avdunstning och artificiell koncentrationsförändring. Dessutom är det viktigt med konsekvent hantering av standardblandningen efter avlägsnande från −20 °C-lagring, eftersom temperaturskillnader kan leda till volyminkonsekvenser under pipettering med luftkuddepipetter. Ett alternativ skulle vara att ersätta diklormetan i standardresuspensionsbufferten med ren metanol, vilket skulle kunna förbättra hanteringsbekvämligheten men kan påverka lösligheten hos vissa lipidklasser negativt och därmed minska kvantifieringsnoggrannheten för dessa lipidklasser.
Den sista kritiska delen är databehandling. Databehandlingsarbetsflödet kombinerar programvarukonverteringen Peak by Peak från .raw till .mzML-format, med tillämpning av MS2-skanningsmedelvärde och MS1- och MS2-brusfiltrering samt toppplockning och datakomprimering. Som ett alternativ kan Proteowizard-programvaran också användas för datakonvertering, men i detta fall måste flera inställningar i LipidXplorer definieras manuellt. All komplexitet hos hagelgevärslipidomik är särskilt koncentrerad på dekonvolutionssteget av direktinsprutade MS1- och MS2-spektra. LipidXplorer-programvaran med öppen källkod importerar de konverterade spektra från mzML-filformat baserat på massnoggrannhet, massupplösning och lutningen på dess förändring med ökande m / z. Programvaran sammanfogar flera individuella MS- och MS/MS-spektra som förvärvats inom en analyskörning. Därefter justerar den enskilda toppar inom olika provkörningar, och i varje kluster av inriktade toppar ersätter den deras massor med deras enda intensitetsviktade genomsnittliga massa, medan deras överflöd i varje datafil förblir orörd. Representativa massor av inriktade toppkluster och individuella toppintensiteter lagras i en huvudskanningsdatabas. Master scan-databasen innehåller alla MS1- och MS2-spektra som genereras för alla prover i batchen och kan dekonvoluteras till lipididentifieringar genom frågor skrivna i molekylär fragmenteringsfrågespråk (MFQL).
Sammantaget täcker metoden identifiering av DAG-, TAG- och SE-lipider baserat på positivt läge och PC-, PE-, PS-, PI-, PA-, PG-, SM-, LPC- och LPE-lipider baserat på negativt lägesförvärv. Under lipididentifiering utförs isotopkorrigering för MS1 och MS2, och justerade intensiteter rapporteras i .xlsx utdatafilen. Alternativt finns flera andra programvaror tillgängliga för att bearbeta hagelgevärsdata, till exempel ALEX45 och LipidHunter46.
Fettsyror - stora kärn- och cellmembrankomponenter - lagras i form av fosfolipider för vidare omvandling till bioaktiva molekyler. De kan omvandlas av lysofosfolipidacyltransferasenzymer till lysofosfolipider genom Lands väg47. LPCAT3-enzymet är till exempel känt för att visa hög specificitet för att införliva AA i lysofosfatidylkolin och lysofosfatidylserinintermediärer. Det relativt höga uttrycket av dessa enzymer rapporterades inom inflammatoriska celler, såsom alveolära makrofager och bronkialepitelceller47, vilket ledde till frisättning av större relativa proportioner av AA-innehållande fosfolipider i dessa celler. Efter deras frigörelse från membranfosfolipider med fosfolipas A2 katalyseras emellertid omvandlingen av PUFA till olika typer av lipidmediatorer av många enzymer48. Vidare kan dessa PUFA bli substratet för produktion av proinflammatoriska och antiinflammatoriska prostaglandiner via verkan av cyklooxygenas (COX) -1 och COX-2-enzymer47. Fosfolipider är en av källorna till lipidmediatorer som frigörs på särskilda platser där dessa mediatorer krävs för att visa sina biologiska effekter.
Lungan är ett komplext organ som består av flera celltyper, var och en spelar överlappande och nischroller för att underlätta normal lungutveckling och funktion. Endast ett fåtal studier har gjorts för att isolera och profilera olika celltyper i musen eller humana lungan (t.ex. alveolära typ 2-celler)49,50; Andra större lungcellstyper har inte karakteriserats. En annan intressant studie51 genomfördes för att isolera och utföra lipidanalys av endotel-, epitel-, mesenkymala och blandade immunceller i muslungan. Det observerades att koncentrationen av PUFAs införlivade i PCO och PG anrikades i immuncellerna. Med tanke på det faktum att CS inducerar en ökning av immunceller i lungan (4-5 gånger), bedömt av bronkoalveolär sköljning (BAL)52, kan de totala lipidförändringarna som observerats i denna studie förklaras av en kumulativ ökning av immuncellsrekrytering i muslungan.
Sammanfattningsvis kan den observerade snedvridningen av enkelomättade fettsyror och PUFAs införlivade i fosfolipider återspegla överskottet av vissa FA i cellen och / eller utgöra en intracellulär resurs av oxilipinprekursorer som överproduceras under oxidativ stress och inflammatoriska tillstånd. Ytterligare uppgifter om fri EPA, DHA och andra oxilipiner är dock nödvändiga för att klargöra denna punkt och ligger utanför tillämpningsområdet för den nuvarande metoden.
Disclosures
Alla författare är anställda av Philip Morris International. Philip Morris International är den enda finansieringskällan och sponsorn för detta projekt.
Acknowledgments
Författarna vill tacka studiegruppen och särskilt erkänna det tekniska biståndet och stödet från bioforsknings- och aerosolteamen vid PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapore, och PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Schweiz. Författarna tackar Sam Ansari för att ha hanterat biobanken och erkänner stödet från Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy för att redigera ett utkast till manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 5, and 2 mL self-lock tubes | Eppendorf | 30120086, 30120094 | |
| 3 mm stainless still beads | Qiagen | 69997 | |
| 4.1 µm nozzle chip | Advion | HD-D-384 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 45754-100ML-F | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 14267-25G | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830-500G | |
| Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | 23209 | |
| Butanol | Honeywell | 33065-2.5L | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650498-1L | |
| Dichloromethane | Honeywell | 34856-1L | |
| Ethyl acetate | Honeywell | 33211 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma | M9686 | |
| Heptane | Sigma Aldrich | 34873-2.5L | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A456 | |
| Mouse pooled plasma | BioIvt | ||
| Mouse SPLASH standard | Avanti Polar Lipids | 330710X | Internal standard |
| Nunc 96-flat bottom well transparent plates | VWR | 62409-068 | |
| Plastic spatula | Sigma | Z560049-300EA | |
| Quick Start Bradford 1x Dye reagent | BioRad | 5000205 | |
| Serum diluent | Sigma Aldrich | D5197 | |
| Equipment/software | |||
| CryoPrep CP02 impactor instrument | Covaris | Magnetic hammer | |
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | . | Centrifuge |
| ChipSoft 8.3 | Advion Biosciences | . | Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot |
| LipidXplorer 1.2.8.1 | N/A | . | Software to identify lipids |
| Peak By Peak | SpectroSwiss | . | Software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| ProteoWizard | ProteoWizard | . | Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| Q-Exactive MS | Thermo Fisher | . | High resolution orbitrap mass spectrometer |
| Qiagen Tissue Lyser II | Qiagen | . | Tissue lyser |
| SpeedVac SPD140DDA | Thermo Fisher | . | Vacuum concentrator |
| Tecan Infinite M nano plus | Tecan | . | Plate reader |
| ThermoMixer C | Eppendorf | . | Thermomixer |
| TriVersa Nanomate | Advion Biosciences | . | Direct infusion nano-source |
| Xcalibur 4.3 | Thermo Scientific | . | Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS |
References
- Salehi, N., Janjani, P., Tadbiri, H., Rozbahani, M., Jalilian, M. Effect of cigarette smoking on coronary arteries and pattern and severity of coronary artery disease: A review. Journal of International Medical Research. 49 (12), 3000605211059893 (2021).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: Are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 45 (6), 1111-1115 (2011).
- Lee, G., Walser, T. C., Dubinett, S. M. Chronic inflammation, chronic obstructive pulmonary disease, and lung cancer. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 15 (4), 303-307 (2009).
- Titz, B., et al. Effects of cigarette smoke, cessation, and switching to two heat-not-burn tobacco products on lung lipid metabolism in C57BL/6 and Apoe-/- mice-An integrative systems toxicology analysis. Toxicological Sciences. 149 (2), 441-457 (2016).
- Morissette, M. C., Shen, P., Thayaparan, D., Stampfli, M. R. Disruption of pulmonary lipid homeostasis drives cigarette smoke-induced lung inflammation in mice. European Respiratory Journal. 46 (5), 1451-1460 (2015).
- Jubinville, E., et al. Interplay between cigarette smoking and pulmonary reverse lipid transport. European Respiratory Journal. 50 (3), 1700681 (2017).
- Han, X., Gross, R. W. Shotgun lipidomics: Electrospray ionization mass spectrometric analysis and quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples. Mass Spectrometry Reviews. 24 (3), 367-412 (2005).
- Titz, B., et al. Multi-omics systems toxicology study of mouse lung assessing the effects of aerosols from two heat-not-burn tobacco products and cigarette smoke. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 1056-1073 (2020).
- Hartung, T., et al. Systems toxicology: Real world applications and opportunities. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 870-882 (2017).
- Talikka, M., et al. Systems Toxicology. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. Lyubimov, A., et al. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2016).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Papan, C., et al. Systematic screening for novel lipids by shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 86 (5), 2703-2710 (2014).
- Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600 (2012).
- Strittmatter, N., et al. Shotgun lipidomic profiling of the NCI60 cell line panel using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (15), 7507-7514 (2016).
- Lydic, T. A., et al. Rapid and comprehensive 'shotgun' lipidome profiling of colorectal cancer cell derived exosomes. Methods. 87, 83-95 (2015).
- Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
- Grzybek, M., et al. Comprehensive and quantitative analysis of white and brown adipose tissue by shotgun lipidomics. Molecular Metabolism. 22, 12-20 (2019).
- Stegemann, C., et al. Comparative lipidomics profiling of human atherosclerotic plaques. Circulation: Cardiovascular Genetics. 4 (3), 232-242 (2011).
- Tajima, Y., et al. Lipidomic analysis of brain tissues and plasma in a mouse model expressing mutated human amyloid precursor protein/tau for Alzheimer's disease. Lipids in Health and Disease. 12, 68 (2013).
- Gross, R. W., Han, X. Shotgun lipidomics of neutral lipids as an enabling technology for elucidation of lipid-related diseases. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (2), 297-303 (2009).
- Surma, M. A., et al. An automated shotgun lipidomics platform for high throughput, comprehensive, and quantitative analysis of blood plasma intact lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (10), 1540-1549 (2015).
- Heiskanen, L. A., Suoniemi, M., Ta, H. X., Tarasov, K., Ekroos, K. Long-term performance and stability of molecular shotgun lipidomic analysis of human plasma samples. Analytical Chemistry. 85 (18), 8757-8763 (2013).
- Zhang, S., Van Pelt, C. K. Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry for protein characterization. Expert Review of Proteomics. 1 (4), 449-468 (2004).
- Surma, M. A., et al. Mouse lipidomics reveals inherent flexibility of a mammalian lipidome. Scientific Reports. 11 (1), 19364 (2021).
- Herzog, R., Schwudke, D., Shevchenko, A. LipidXplorer: Software for quantitative shotgun lipidomics compatible with multiple mass spectrometry platforms. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11-30 (2013).
- R: A language and environment for statistical computing. R: Foundation for Statistical Computing. , Available from: https://www.R-project.org/ (2018).
- Phillips, B., et al. A 7-month cigarette smoke inhalation study in C57BL/6 mice demonstrates reduced lung inflammation and emphysema following smoking cessation or aerosol exposure from a prototypic modified risk tobacco product. Food and Chemical Toxicology. 80, 328-345 (2015).
- Phillips, B., et al. A six-month systems toxicology inhalation/cessation study in ApoE(-/-) mice to investigate cardiovascular and respiratory exposure effects of modified risk tobacco products, CHTP 1.2 and THS 2.2, compared with conventional cigarettes. Food and Chemical Toxicology. 126, 113-141 (2019).
- Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C. Electrospray ionization tandem mass spectrometry of glycerophosphoethanolamine plasmalogen phospholipids. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1499-1508 (2004).
- Engelmann, B. Plasmalogens: Targets for oxidants and major lipophilic antioxidants. Biochemical Society Transactions. 32, 147-150 (2004).
- Nagan, N., Zoeller, R. A.
- Southam, A. D., Weber, R. J., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nature Protocols. 12 (2), 310-328 (2016).
- Yang, K., Han, X. Accurate quantification of lipid species by electrospray ionization mass spectrometry - Meet a key challenge in lipidomics. Metabolites. 1 (1), 21-40 (2011).
- Zullig, T., Trotzmuller, M., Kofeler, H. C. Lipidomics from sample preparation to data analysis: a primer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2191-2209 (2020).
- Koivusalo, M., Haimi, P., Heikinheimo, L., Kostiainen, R., Somerharju, P. Quantitative determination of phospholipid compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response. Journal of Lipid Research. 42 (4), 663-672 (2001).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
- Lofgren, L., Forsberg, G. B., Stahlman, M. The BUME method: A new rapid and simple chloroform-free method for total lipid extraction of animal tissue. Scientific Reports. 6, 27688 (2016).
- Lofgren, L., et al. The BUME method: A novel automated chloroform-free 96-well total lipid extraction method for blood plasma. Journal of Lipid Research. 53 (8), 1690-1700 (2012).
- Jung, H. R., et al. High throughput quantitative molecular lipidomics. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 925-934 (2011).
- Lavrynenko, O., et al. Ceramide ratios are affected by cigarette smoke but not heat-not-burn or e-vapor aerosols across four independent mouse studies. Life Sciences. 263, 118753 (2020).
- Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
- Schuhmann, K., et al. Quantitative fragmentation model for bottom-up shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 91 (18), 12085-12093 (2019).
- Lipidomics Standards Initiative Consortium.
- Husen, P., et al. Analysis of lipid experiments (ALEX): A software framework for analysis of high-resolution shotgun lipidomics data. PloS One. 8 (11), 79736 (2013).
- Ni, Z., Angelidou, G., Lange, M., Hoffmann, R., Fedorova, M. LipidHunter identifies phospholipids by high-throughput processing of LC-MS and shotgun lipidomics datasets. Analytical Chemistry. 89 (17), 8800-8807 (2017).
- Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C., Kosmider, B., Mason, R. J. Lipidomic characterization and localization of phospholipids in the human lung. Journal of Lipid Research. 58 (5), 926-933 (2017).
- Ghosh, M., Tucker, D. E., Burchett, S. A., Leslie, C. C. Properties of the Group IV phospholipase A2 family. Progress in Lipid Research. 45 (6), 487-510 (2006).
- Besnard, V., et al. Deletion of Scap in alveolar type II cells influences lung lipid homeostasis and identifies a compensatory role for pulmonary lipofibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 284 (6), 4018-4030 (2009).
- Plantier, L., et al. Activation of sterol-response element-binding proteins (SREBP) in alveolar type II cells enhances lipogenesis causing pulmonary lipotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10099-10114 (2012).
- Kyle, J. E., et al. Cell type-resolved human lung lipidome reveals cellular cooperation in lung function. Scientific Reports. 8 (1), 13455 (2018).
- Lugg, S. T., Scott, A., Parekh, D., Naidu, B., Thickett, D. R. Cigarette smoke exposure and alveolar macrophages: mechanisms for lung disease. Thorax. 77 (1), 94-101 (2022).
