Summary
التحليل الطيفي لقوة المجموعة (EFS) هو تقنية قوية للتكشف الميكانيكي والاستشعار في الوقت الفعلي لمجموعة من الهياكل الجزيئية الحيوية في المجالات الفيزيائية الحيوية والاستشعار الحيوي.
Abstract
توفر تقنيات الجزيء الواحد القائمة على مبادئ التألق والميكانوكيميائية حساسية فائقة في الاستشعار البيولوجي. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود قدرات إنتاجية عالية ، فإن تطبيق هذه التقنيات محدود في الفيزياء الحيوية. أظهر التحليل الطيفي لقوة المجموعة (EFS) إنتاجية عالية في التحقيق في مجموعة ضخمة من الهياكل الجزيئية عن طريق تحويل الدراسات الميكانيكية الكيميائية للجزيئات الفردية إلى دراسات المجموعات الجزيئية. في هذا البروتوكول ، تم الكشف عن الهياكل الثانوية للحمض النووي (i-motifs) في تدفق القص بين الدوار والجزء الثابت لطرف مجانس بمعدلات قص تصل إلى 77796 / ثانية. تم توضيح آثار معدلات التدفق والأحجام الجزيئية على قوى القص التي تعاني منها i-motif. كشفت تقنية EFS أيضا عن تقارب الارتباط بين زخارف الحمض النووي i-motifs والأربطة. علاوة على ذلك ، أظهرنا تفاعل كيمياء النقر الذي يمكن تشغيله بواسطة قوة القص (أي كيمياء النقر الميكانيكي). تثبت هذه النتائج فعالية استخدام قوة القص للتحكم في تشكيل الهياكل الجزيئية.
Introduction
في التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد1 (SMFS) ، تمت دراسة الخواص الميكانيكية للهياكل الجزيئية الفردية بواسطة أدوات متطورة مثل مجهر القوة الذرية والملقط البصري والملقط المغناطيسي2،3،4. مقيدة بنفس متطلبات الاتجاه للجزيئات في إعدادات توليد / اكتشاف القوة أو مجال الرؤية الصغير في الملقط المغناطيسي ومجهر قوة الطرد المركزي المصغر (MCF) 5،6،7،8 ، يمكن التحقيق في عدد محدود فقط من الجزيئات في وقت واحد باستخدام SMFS. تمنع الإنتاجية المنخفضة ل SMFS تطبيقه على نطاق واسع في مجال التعرف الجزيئي ، مما يتطلب مشاركة مجموعة كبيرة من الجزيئات.
يوفر تدفق القص حلا محتملا لتطبيق القوى على مجموعة ضخمة من الجزيئات9. في تدفق السائل داخل القناة ، كلما اقتربت من سطح القناة ، كلما كان معدل التدفق أبطأ10. يسبب تدرج سرعة التدفق هذا إجهاد قص مواز لسطح الحدود. عندما يتم وضع جزيء في تدفق القص هذا ، يعيد الجزيء توجيه نفسه بحيث يتوافق محوره الطويل مع اتجاه التدفق ، حيث يتم تطبيق قوة القص على المحور الطويل11. نتيجة لإعادة التوجيه هذه ، من المتوقع أن تتماشى جميع الجزيئات من نفس النوع (حجم وطول المقابض) في نفس الاتجاه بينما تواجه نفس قوة القص.
يصف هذا العمل بروتوكولا لاستخدام تدفق القص هذا لممارسة قوة القص على مجموعة ضخمة من الهياكل الجزيئية ، كما يتضح من الحمض النووي i-motif. في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء تدفق قص بين الدوار والجزء الثابت في طرف مجانس. وجدت هذه الدراسة أن بنية الحمض النووي المطوية i-motif يمكن أن تتكشف من خلال معدلات القص 9724-97245 s−1. إلى جانب ذلك ، تم العثور على ثابت تفكك يبلغ 36 ميكرومتر بين الرباط L2H2-4OTD و i-motif. وتتفق هذه القيمة مع قيمة 31 ميكرومتر المقاسة بمقايسة إزاحة الهلام12. علاوة على ذلك ، يتم استخدام التقنية الحالية لكشف شكل i-motif ، والذي يمكن أن يعرض النحاس المخلبي (I) لتحفيز تفاعل النقر. وبالتالي يسمح هذا البروتوكول للمرء بالكشف عن مجموعة كبيرة من هياكل i-motif مع أدوات منخفضة التكلفة في وقت معقول (أقصر من 30 دقيقة). بالنظر إلى أن تقنية قوة القص تزيد بشكل كبير من إنتاجية التحليل الطيفي للقوة ، فإننا نسمي هذه التقنية التحليل الطيفي لقوة مجموعة (EFS). يهدف هذا البروتوكول إلى توفير مبادئ توجيهية تجريبية لتسهيل تطبيق نظام EFS القائم على قوة القص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم سرد جميع المخازن المؤقتة والكواشف الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول في مواد الجدول.
1. إعداد مجهر قوة القص
ملاحظة: يحتوي مجهر قوة القص على جزأين، وحدة تفاعل (مجانس) ووحدة كشف (مجهر فلوري). تكبير العدسة هو 10x ، وتكبير العدسة الموضوعية (الهواء) هو 4x.
- قم بتجميع المجانس والمجهر على طاولة تركيب. ارتد نظارات واقية وقم بتشغيل المجهر الفلوري ، ثم اضبط المجانس للتأكد من أن شعاع ضوء الإثارة ذي الطول الموجي المناسب (هنا ، تم استخدام 488 نانومتر) يمر عبر مركز طرف التشتت للمجانس.
- قم بإعداد غرفة تفاعل مسطحة القاع يبلغ ارتفاعها 5 سم و 1.5 سم 2 × 1.5 سم2 في المقطع العرضي. لتقليل الخلفية ، تأكد من أن مادة الغرفة المحددة لا تتألق ، مثل النظارات (بعض المواد البلاستيكية لها تألق).
- اختر طرف تشتيت مجانس مناسب يمكنه توفير قوة القص المطلوبة.
ملاحظة: يعتمد معدل القص على المسافة بين الدوار والجزء الثابت بسرعة دوران ثابتة11 وفقا للمعادلة التالية:
حيث μ هي اللزوجة الديناميكية للمياه عند 20 درجة مئوية ؛ D هو القطر الداخلي للجزء الثابت. d هو القطر الخارجي للدوار ، و V هو سرعة القص (دورة في الدقيقة / ثانية). - قم بتثبيت غرفة التفاعل في مرحلة العينة من المجهر الفلوري ، ثم اضبط الغرفة لتثبيت طرف التشتت للمجانس (الشكل 1). تأكد من أن طرف التشتت أعلى قليلا (~ 1 مم) من السطح السفلي لغرفة التفاعل.
- اضبط الوضع الرأسي للمجانس والغرفة معا لضمان تركيز المجهر على سطح طرف التشتت. بعد ذلك، اضبط الموضع الأفقي لطرف التشتت للتأكد من تعيين منطقة الكشف (مجال الرؤية) بين الدوار والجزء الثابت (الشكل 1).
- قم بتشغيل قنوات التألق وفقا لصبغة الفلورسنت المستخدمة في التجربة.
- قبل تجربة القص عالية السرعة، استخدم الماء منزوع الأيونات (DI) لاختبار القص بسرعة قص منخفضة (على سبيل المثال، 2000 دورة في الدقيقة) لضمان عمل طرف التشتت بشكل مناسب دون لمس غرفة التفاعل.
2. تتكشف i-motifs مع وبدون روابط
- قم بإعداد الحمض النووي البشري للتيلوميريك i-motif (جدول المواد) الموسوم بصبغة ومبرد في طرفيه ، على التوالي ، في مياه DI ، كما هو موضح في Hu et al.11.
ملاحظة: I-MOMOTIF يحتوي على تسلسل: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA. - قم بتخفيف الحمض النووي إلى 5 ميكرومتر في المخزن المؤقت MES 30 mM عند درجة الحموضة 5.5 أو الرقم الهيدروجيني 7.4. إلى محلول الحمض النووي ، أضف الليغاند L2H2-4OTD ، الذي تم تصنيعه وفقا ل Abraham Punnoose et al.13 ، في نطاق تركيز يتراوح بين 0-60 ميكرومتر.
- تحقق من شدة التألق الخلفية لغرفة التفاعل المملوءة بماء DI منزوع الأيونات وقلل من شدته باستخدام المجهر الفلورسنت دون قص. طريقة سهلة لتقليل التألق في الخلفية هي غسل غرفة التفاعل بماء DI. يجب طرح قيمة التألق الخلفية في تحليلات البيانات لاحقا.
ملاحظة: يجب تجنب الضوء الضال من هذه الخطوة فصاعدا. - قم بتعيين معلمات كاميرا CCD باستخدام البرنامج. المعلمات الموصى بها هي كما يلي: وقت التعرض = 0.5 ثانية ، حساسية CCD = 1600 ، ووقت التسجيل = 20 دقيقة.
- باستخدام ماصة طويلة ، أضف محلول الحمض النووي إلى غرفة التفاعل الفارغة والنظيفة. قم بتغطية غرفة التفاعل بصندوق أسود. بعد ذلك، ابدأ تشغيل المجانس لإجراء القص بمعدل قص محدد يتراوح من 9,724 s−1 إلى 97,245 s−1 (تم تحديده باستخدام البرنامج المرتبط بالمجانس) لمدة 20 دقيقة مع تشغيل كاميرا CCD لتسجيل البيانات.
- بعد التجربة ، قم بإزالة الغرفة واغسلها بماء DI.
3. تفاعل النقر الذي يتم تشغيله بقوة القص
- تحضير الحمض النووي i-motif في الماء DI. احتضان 10 ميكرومتر من الحمض النووي i-motif في 300 ميكرولتر من 30 mM Tris buffer (الرقم الهيدروجيني 7.4) مع استكمال 150 μM CuCl و 300 μM حمض الأسكوربيك لمدة 10 دقائق لطي هياكل i-motif (جميع التركيزات هي تركيزات نهائية في المحلول).
ملاحظة: CuCl هو محفز تفاعل النقر. حمض الأسكوربيك سيمنع أكسدة النحاس (I). - قم بترشيح المحلول باستخدام جهاز الترشيح الفائق بقوة طرد مركزي تبلغ 14,300 × جم. قم بتجديد المحلول إلى ~ 500 ميكرولتر باستخدام مخزن مؤقت Tris 30 mM (الرقم الهيدروجيني 7.4) مع استكمال حمض الأسكوربيك 300 ميكرومتر بعد كل ترشيح.
- كرر الترشيح 3x.
- جمع الحل المتبقي وجعل حجم نهائي من 300 ميكرولتر عن طريق إضافة 30 mM Tris (الرقم الهيدروجيني 7.4) مع استكمال حمض الأسكوربيك 300 μM جنبا إلى جنب مع 20 μM Calfluor 488 azide ، 20 μM HPG ، و 10 μM TBTA. بمجرد إضافة الكواشف ، انقل المحلول إلى الغرفة المظلمة.
ملاحظة: يجب تجنب الضوء بعد هذه الخطوة. - تحقق من شدة التألق الخلفية لغرفة التفاعل المملوءة بماء DI وقللها إلى الحد الأدنى باستخدام المجهر قبل تجارب القص. طريقة سهلة لتقليل التألق في الخلفية هي غسل غرفة التفاعل بماء DI.
- أضف محلول الحمض النووي إلى غرفة التفاعل الفارغة باستخدام ماصة طويلة، ثم ابدأ قص المجانس بمعدل قص 63,209 s−1 لمدة 20 دقيقة مع تشغيل كاميرا CCD.
- بعد التجربة ، قم بإزالة الغرفة واغسلها بماء DI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 التكشف الميكانيكي والاستشعار في الوقت الفعلي لجزيئات المجموعة في EFS. في الشكل 1B، لوحظ أن شدة التألق للحمض النووي i-motif تزداد مع معدل القص الذي يتراوح من 9,724 s−1 إلى 97,245 s−1 في مخزن مؤقت للأس الهيدروجيني 5.5 MES. كعنصر تحكم ، لم يتم زيادة شدة التألق عندما تم قص نفس الحمض النووي i-motif بمعدل 63,209 s−1 في مخزن مؤقت للأس الهيدروجيني 7.4 MES. وذلك لأن i-motif لا يطوى عند الرقم الهيدروجيني 7.414. في العمل السابق ، وجدنا أنه كلما ارتفع معدل القص ، زاد تكشف i-motif11. استنادا إلى الكشف عن i-motif في الملقط البصري11 ، قمنا بمعايرة قوة القص مقابل معدل القص كما هو موضح في الشكل 1C ، والذي يصور أنه يمكن تطبيق ما يصل إلى 41 pN على زوج FRET المسمى i-motif بمعدل قص 77,796 s−1. في الشكل 2B، تم تقييم ارتباط الليغاند (L2H2-4OTD) بجزيئات الحمض النووي i-motif المعرضة لتدفق القص، مما أظهر أن زيادة شدة التألق أصبحت أقل وضوحا مع زيادة تركيز L2H2-4OTD (0-60 ميكرومتر). من منحنى الربط (أي مخطط للكسور المرتبطة من الليغاند مقابل تركيز الليغاند الحر) في الشكل 2C ، تم تحديد ثابت تفكك (Kd) من 36 μM للتفاعل بين رباط L2H2-4OTD و i-motif11. كتطبيق عملي لقوة القص للتفاعلات الكيميائية، يوضح الشكل 3 تفاعل النقر الميكانيكي الذي يمكن أن يحدثه تدفق القص. في الشكل 3B، تم الكشف عن شكل cu(I) المخلبي بمعدل قص 63,209 s−1، وأثار النحاس المنبعث (I) تفاعل النقر الفلوري المتولد الموضح في الشكل 3A، مما أدى إلى زيادة شدة التألق بمرور الوقت (الشكل 3C).
الشكل 1: الكشف عن بنية الحمض النووي i-motif عن طريق تدفق القص في EFS. (A) مخطط لكشف بنية الحمض النووي i-motif الموسومة بزوج FRET (Cy5 و quencher) بواسطة تدفق القص المتولد في مجانس على الطاولة. الجزء الداخلي الأيسر: يشير اللون البني الفاتح إلى الجزء الثابت ، ويشير اللون البني الداكن إلى الدوار. الجزء الداخلي الأيمن: تشير الدائرة السماوية المنقطة بين الدوار والجزء الثابت إلى تدفق المخزن المؤقت في ظل ظروف القص. يشير السهم الدائري البني الداكن إلى اتجاه الدوار. تشير الأسهم السماوية في طريقة العرض المكبرة للجزء الداخلي الأيمن إلى تدفق المخزن المؤقت تحت القص. يصور طول كل سهم سرعة تيار تدفق معين (تشير الأسهم الأطول إلى سرعات أعلى). (ب) ترجع النسبة المئوية للتغير في شدة التألق في الاستشعار في الوقت الحقيقي إلى تكشف i-motif بمعدلات قص مختلفة من 9,724 s−1 إلى 97,245 s−1. تشير المنحنيات الصلبة إلى التركيب الأسي. يتم تطبيع شدة التألق فيما يتعلق بالقيمة القصوى التي لوحظت في التجربة. (ج) رسم تخطيطي لمعدل القص مقابل قوة القص للشكل i-motif الموضح في (A). يصور الخط الأحمر تركيبا خطيا (R2 = 1.00). وقد عدل هذا الرقم من Hu et al.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تكشف الزخارف i-motifs المرتبطة بالأربطة . (A) مخطط ل i-motif المسمى بزوج FRET (Cy5 و quencher) المرتبط ب L2H2-4OTD ligand13. (ب) انخفاض كثافة التألق في i-motif مع زيادة تركيزات الرباط L2H2-4OTD (الوردي: 0 ميكرومتر ، الأخضر: 6 ميكرومتر ، السماوي: 30 ميكرومتر ، الرمادي: 36 ميكرومتر ، الأسود: 45 ميكرومتر ، والبني الفاتح: 60 ميكرومتر). يتم تطبيع شدة التألق فيما يتعلق بالقيمة القصوى التي لوحظت في التجربة. (ج) منحنى ربط i-motif بتركيزات L2H2-4OTD حرة مختلفة. وقد عدل هذا الرقم من Hu et al.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تفاعلات النقر الميكانيكي . (أ) تفاعل النقر الفلوروجيني بين Calfluor 488 و HPG. المركب الموضح باللون الأخضر هو منتج تفاعل الفلورسنت. (ب) تمت تصفية بنية الحمض النووي i-motif المخلبة بالنحاس (I) عند الرقم الهيدروجيني 7.4 لإزالة النحاس غير المرتبط (I) في المحلول. تم الكشف عن شكل i-motif المخلب النحاسي (I) بواسطة تدفق القص في EFS. حفز النحاس المنبعث (I) تفاعل النقر الفلوروجيني ، والذي ظهر في الأنابيب الشعرية (أسفل اليمين). (ج) النسبة المئوية لزيادة شدة التألق لتفاعل النقر بمعدل قص قدره 63,209 s−1 لمدة 20 دقيقة. يشير المنحنى الداكن إلى ملاءمة شدة التألق من تفاعل نقرة التحكم بدون الحمض النووي. يمثل المنحنى الأخضر التركيب الأسي. يتم تطبيع شدة التألق فيما يتعلق بالقيمة القصوى التي لوحظت في التجربة. وقد عدل هذا الرقم من Hu et al.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة بالتحقيق في الوقت الفعلي في تكشف مجموعة من الهياكل الجزيئية الحيوية بواسطة قوة القص. تؤكد النتائج المعروضة هنا أن هياكل الحمض النووي i-motif يمكن أن تتكشف بواسطة قوة القص. كان الكشف عن i-motif المرتبط بالرباط وتفاعلات النقر التي تحركها قوة القص تطبيقات إثبات المفهوم لطريقة التحليل الطيفي لقوة المجموعة هذه.
يعرض الشكل 1 إعداد الأداة. يجب ألا يتلامس طرف مولد المجانس وغرفة التفاعل مع بعضهما البعض ، وهو أمر بالغ الأهمية للسماح بتدفق قص مستقر بين الدوار والجزء الثابت دون تكوين فقاعة. بالنسبة لطرف المجانس التجاري ، من الأفضل اختيار واحد به ثقب هواء لتقليل تكوين الفقاعة. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي أن يكون حجم غرفة التفاعل كبيرا جدا ، لأن الغرفة الكبيرة تتطلب المزيد من حل العينة. على العكس من ذلك ، هناك حاجة إلى ارتفاع معين من غرفة القص لتغطية الجسم الرئيسي لطرف المجانس. لتقليل الخطأ المنهجي ، يقترح الحفاظ على نفس المحاذاة في الإعداد لتنفيذ جميع التجارب ذات الصلة. من المهم الإشارة إلى أن الحمض النووي يحافظ على النزاهة ، كما يتضح من الرحلان الكهربائي الهلامي بعد قص11.
من الشكل 1B ، زاد التألق المشبع بمعدل قص يتراوح من 9724 s−1 إلى 97245 s−1. بعد رسم شدة تألق الهضبة مقابل معدل القص ، لم تعد شدة التألق تزداد بمعدل القص فوق 97245 s−1 ، مما يشير إلى أن قوة القص المرتبطة التي يوفرها معدل القص (97245 s−1) كانت بالفعل أعلى من القوة المطلوبة لكشف i-motif. لذلك ، تم أخذ شدة تألق الهضبة عند 97245 s−1 كنقطة مرجعية (أي المقابلة ل 100٪ تتكشف) لحساب النسبة المئوية ل i-motif غير المطوية بأي معدل قص11. يوضح الشكل 1C قوة القص المتولدة على الشكل التيلوميري i-motif بمعدل قص معين. لتحديد العلاقة بين قوة القص ومعدل القص ، تم إجراء الكشف الميكانيكي لنفس بنية i-motif التيلوميريك في ملاقط بصرية ، وتم رسم مخطط تراكمي لنسبة الكشف عن i-motif مقابل القوة بناء على الرسم البياني لقوة التكشف ل i-motif في تجارب الملقط البصري11 . بالنسبة لهياكل الحمض النووي المختلفة ، يوصى بمعايرة القوة باستخدام ملاقط بصرية. استنادا إلى افتراض أن النسب المئوية ل i-motif غير المطوية متساوية بين التكشف الميكانيكي القائم على ملاقط الليزر والتكشف القائم على قوة القص عند قوة معينة (أي ، بالنظر إلى أن اتجاه القوة التي يختبرها i-motif متشابه في هاتين الطريقتين ، وهو على طول المحور الممتد لمقبضي الحمض النووي [المتدليات]) ، قمنا بمعايرة قوة القص مقابل معدل القص.
على الرغم من أن أدوات المجانس يمكن الوصول إليها بسهولة في أي مختبر ، إلا أن هناك بعض الخطوات الرئيسية التي يجب تنفيذها بعناية. أولا ، للكشف عن قيم التألق الدقيقة ، يجب ضبط مسار الضوء بين الدوار والجزء الثابت. ثانيا ، عند إجراء تجارب القص وفقا لخطوات هذا البروتوكول ، من المهم التحقق من التألق قبل التجربة. من الضروري تقليل كثافة التألق العالية في الخلفية عن طريق تنظيف الإعداد بأكمله جيدا ، وخاصة طرف المجانس وغرفة التفاعل. يجب إجراء التجربة في غرفة مظلمة لتقليل الضوء الضال بشكل أكبر.
واحدة من أهم فوائد تقنية EFS هي مرونتها وتنوعها للتكشف الميكانيكي لمجموعة من الهياكل الجزيئية الحيوية ، بما في ذلك البروتين والحمض النووي الريبي وهياكل الحمض النووي. تقليديا ، تتطلب تجارب الكشف الميكانيكية الجماعية إعدادات تجريبية معقدة. ميزة EFS هي أنه يقلل من التعقيد في تصميم الأداة ، مع تكلفة أقل بكثير. على الرغم من أن EFS يمكنها إجراء تجارب إنتاجية عالية في وقت أقصر مقارنة بتقنيات الجزيء الواحد ، إلا أن هناك بعض القيود ، والتي تشمل حقيقة أن حجم القوة يتم تحديده حسب حجم البنية الجزيئية. بالإضافة إلى ذلك ، مطلوب وضع العلامات الفلورية للجزيء المكتشف. لتحقيق قوى قص أكبر ، قد يصبح من الضروري ربط مقابض القص بالجزيء محل الاهتمام. بالنسبة للتطبيقات المستقبلية ، يمكن استخدام EFS القائم على قوة القص لدراسة مختلف الظواهر الكيميائية الميكانيكية التي تتأثر فيها التفاعلات الكيميائية ، مثل التعرف على التحليل15 وبلمرة البوليمرات الاصطناعية ، بالقوى الميكانيكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل البحثي من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم [CBET-1904921] والمعاهد الوطنية للصحة [NIH R01CA236350] إلى H. M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V.
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H.
