Summary
La spectroscopie de force d’ensemble (EFS) est une technique robuste pour le déploiement mécanique et la détection en temps réel d’un ensemble de structures biomoléculaires dans les domaines biophysiques et biosensoriels.
Abstract
Les techniques monomoléculaires basées sur la fluorescence et les principes mécanochimiques offrent une sensibilité supérieure dans la détection biologique. Cependant, en raison du manque de capacités de haut débit, l’application de ces techniques est limitée en biophysique. La spectroscopie de force d’ensemble (EFS) a démontré un débit élevé dans l’étude d’un ensemble massif de structures moléculaires en convertissant les études mécanochimiques de molécules individuelles en celles d’ensembles moléculaires. Dans ce protocole, les structures secondaires de l’ADN (i-motifs) ont été déployées dans le flux de cisaillement entre le rotor et le stator d’une pointe d’homogénéisateur à des vitesses de cisaillement allant jusqu’à 77796/s. Les effets des débits et des tailles moléculaires sur les forces de cisaillement subies par le motif i ont été démontrés. La technique EFS a également révélé l’affinité de liaison entre les motifs de l’ADN i et les ligands. De plus, nous avons démontré une réaction de chimie de clic qui peut être actionnée par la force de cisaillement (c’est-à-dire la chimie mécano-clic). Ces résultats établissent l’efficacité de l’utilisation de la force de cisaillement pour contrôler la conformation des structures moléculaires.
Introduction
En spectroscopie de forcemonomoléculaire 1 (SMFS), les propriétés mécaniques de structures moléculaires individuelles ont été étudiées par des instruments sophistiqués tels que le microscope à force atomique, les pinces optiques et les pinces magnétiques 2,3,4. Limité par la même exigence de directionnalité des molécules dans les configurations de génération de force / détection ou le petit champ de vision dans les pinces magnétiques et le microscope de force de centrifugeuse miniature (MCF)5,6,7,8, seul un nombre limité de molécules peut être étudié simultanément en utilisant SMFS. Le faible débit de SMFS empêche sa large application dans le domaine de la reconnaissance moléculaire, qui nécessite l’implication d’un grand ensemble de molécules.
L’écoulement de cisaillement fournit une solution potentielle pour appliquer des forces à un ensemble massif de molécules9. Dans un écoulement de liquide à l’intérieur d’un canal, plus le débit est proche de la surface du canal, plus le débit10 est lent. Un tel gradient de vitesse d’écoulement provoque une contrainte de cisaillement parallèle à la surface limite. Lorsqu’une molécule est placée dans cet écoulement de cisaillement, la molécule se réoriente de sorte que son axe long s’aligne avec la direction de l’écoulement, car la force de cisaillement est appliquée à l’axe long11. Du fait de cette réorientation, toutes les molécules du même type (taille et longueur des poignées) devraient s’aligner dans la même direction tout en subissant la même force de cisaillement.
Ce travail décrit un protocole permettant d’utiliser un tel flux de cisaillement pour exercer une force de cisaillement sur un ensemble massif de structures moléculaires, comme en témoigne le motif i de l’ADN. Dans ce protocole, un flux de cisaillement est généré entre le rotor et le stator dans une pointe d’homogénéisateur. La présente étude a révélé que la structure du motif i de l’ADN plié pouvait être dépliée par des taux de cisaillement de 9724-97245 s−1. En outre, une constante de dissociation de 36 μM a été trouvée entre le ligand L2H2-4OTD et le i-motif. Cette valeur est cohérente avec celle de 31 μM mesurée par le test de décalage de gel12. De plus, la technique actuelle est utilisée pour déplier le i-motif, qui peut exposer le cuivre chélaté (I) pour catalyser une réaction de clic. Ce protocole permet ainsi de déplier un grand ensemble de structures i-motif avec des instruments à faible coût dans un temps raisonnable (moins de 30 min). Étant donné que la technique de la force de cisaillement augmente considérablement le débit de la spectroscopie de force, nous appelons cette technique spectroscopie de force d’ensemble (EFS). Ce protocole vise à fournir des lignes directrices expérimentales pour faciliter l’application de cet EFS basé sur la force de cisaillement.
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Protocol
REMARQUE : Tous les tampons et les réactifs chimiques utilisés dans ce protocole sont énumérés dans le tableau des matériaux.
1. Préparation du microscope à force de cisaillement
REMARQUE: Le microscope à force de cisaillement contient deux parties, une unité de réaction (homogénéisateur) et une unité de détection (microscope à fluorescence). Le grossissement de l’oculaire est de 10x et le grossissement de la lentille de l’objectif (air) est de 4x.
- Assemblez l’homogénéisateur et le microscope sur une table de montage. Portez des lunettes et allumez le microscope à fluorescence, puis ajustez l’homogénéisateur pour vous assurer que le faisceau lumineux d’excitation d’une longueur d’onde appropriée (ici, 488 nm a été utilisé) passe par le centre de l’extrémité dispersante de l’homogénéisateur.
- Préparer une chambre de réaction à fond plat de 5 cm de hauteur et de 1,5 cm de section transversale de 1,5 cm2 x 1,5cm2 . Pour réduire le bruit de fond, assurez-vous que le matériau de chambre sélectionné ne devient pas fluorescent, comme les verres (certains plastiques ont une fluorescence).
- Choisissez une pointe de dispersion homogénéiseur appropriée qui peut fournir la force de cisaillement souhaitée.
NOTE: La vitesse de cisaillement dépend de la distance entre le rotor et le stator à une vitesse de rotation fixe11 selon l’équation suivante:
où μ est la viscosité dynamique de l’eau à 20 °C; D est le diamètre intérieur du stator; d est le diamètre extérieur du rotor et V est la vitesse de cisaillement (tr/min/s). - Serrez la chambre de réaction sur l’étage d’échantillonnage du microscope à fluorescence, puis ajustez la chambre pour maintenir l’extrémité dispersante de l’homogénéisateur (Figure 1). Assurez-vous que l’embout de dispersion est légèrement au-dessus (~1 mm) de la surface inférieure de la chambre de réaction.
- Ajustez la position verticale de l’homogénéisateur et de la chambre ensemble pour vous assurer que le microscope est focalisé sur la surface de la pointe de dispersion. Ajustez ensuite la position horizontale de l’embout dispersant pour vous assurer que la zone de détection (champ de vision) est définie entre le rotor et le stator (Figure 1).
- Allumez les canaux de fluorescence en fonction du colorant fluorescent utilisé dans l’expérience.
- Avant l’expérience de cisaillement à grande vitesse, utilisez de l’eau désionisée (DI) pour tester le cisaillement à faible vitesse de cisaillement (p. ex. 2 000 tr/min) afin de vous assurer que l’extrémité de dispersion peut fonctionner correctement sans toucher la chambre de réaction.
2. Déplier des i-motifs avec et sans ligands
- Préparer un ADN télomérique humain i-motif (Table of Materials) marqué avec un colorant et un quencher à ses deux extrémités, respectivement, dans de l’eau DI, comme décrit dans Hu et al.11.
NOTE: i-motif contenant la séquence: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA. - Diluer l’ADN à 5 μM dans le tampon MES de 30 mM à pH 5,5 ou pH 7,4. À la solution d’ADN, ajouter le ligand L2H2-4OTD, qui a été synthétisé selon Abraham Punnoose et al.13, dans une plage de concentration de 0-60 μM. Mélanger doucement la solution pendant 10 min pour plier les structures i-motif sans lumière.
- Vérifiez et minimisez l’intensité de fluorescence de fond de la chambre de réaction remplie d’eau DI désionisée à l’aide du microscope fluorescent sans cisaillement. Un moyen facile de minimiser la fluorescence de fond est de laver la chambre de réaction avec de l’eau DI. La valeur de fluorescence de fond doit être soustraite dans les analyses de données ultérieures.
REMARQUE: La lumière parasite doit être évitée à partir de cette étape. - Réglez les paramètres de la caméra CCD à l’aide du logiciel. Les paramètres recommandés sont les suivants : temps d’exposition = 0,5 s, sensibilité CCD = 1600 et temps d’enregistrement = 20 min.
- À l’aide d’une longue pipette, ajouter la solution d’ADN dans la chambre de réaction vide et propre. Couvrir la chambre de réaction avec une boîte noire. Ensuite, démarrez l’homogénéisateur pour effectuer un cisaillement à une fréquence de cisaillement sélectionnée allant de 9 724 s−1 à 97 245 s−1 (sélectionnée à l’aide du logiciel associé à l’homogénéisateur) pendant 20 minutes avec la caméra CCD allumée pour enregistrer les données.
- Après l’expérience, retirez la chambre et lavez-la avec de l’eau DI.
3. Réaction de clic actionnée par la force de cisaillement
- Préparer l’ADN i-motif dans de l’eau DI. Incuber 10 μM d’ADN i-motif dans 300 μL de tampon Tris 30 mM (pH 7,4) complété par 150 μM CuCl et 300 μM d’acide ascorbique pendant 10 min pour plier les structures i-motif (toutes les concentrations sont des concentrations finales dans la solution).
REMARQUE: CuCl est le catalyseur de la réaction de clic. L’acide ascorbique empêchera l’oxydation du cuivre (I). - Ultrafiltrez la solution avec un dispositif d’ultrafiltration à une force centrifuge de 14 300 x g. Reconstituer la solution à ~500 μL avec un tampon Tris 30 mM (pH 7,4) complété par de l’acide ascorbique 300 μM après chaque filtration.
- Répétez la filtration 3x.
- Recueillir la solution résiduelle et obtenir un volume final de 300 μL en ajoutant 30 mM de Tris (pH 7,4) complété par 300 μM d’acide ascorbique ainsi que 20 μM d’azoture de Calfluor 488, 20 μM de HPG et 10 μM de TBTA. Une fois les réactifs ajoutés, déplacez la solution dans la chambre noire.
REMARQUE: La lumière doit être évitée après cette étape. - Vérifiez et minimisez l’intensité de fluorescence de fond de la chambre de réaction remplie d’eau DI à l’aide du microscope avant les expériences de cisaillement. Un moyen facile de minimiser la fluorescence de fond est de laver la chambre de réaction avec de l’eau DI.
- Ajouter la solution d’ADN dans la chambre de réaction vide avec une longue pipette, puis démarrer le cisaillement de l’homogénéisateur à une vitesse de cisaillement de 63 209 s−1 pendant 20 min avec la caméra CCD allumée.
- Après l’expérience, retirez la chambre et lavez-la avec de l’eau DI.
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Representative Results
La figure 1 décrit le déploiement mécanique et la détection en temps réel des molécules d’ensemble dans EFS. Dans la figure 1B, on a observé que l’intensité de fluorescence de l’ADN i-motif augmentait avec le taux de cisaillement allant de 9 724 s−1 à 97 245 s−1 dans un tampon de pH 5,5 MES. En tant que témoin, l’intensité de fluorescence n’a pas augmenté lorsque le même ADN i-motif a été cisaillé à un taux de 63 209 s-1 dans un tampon de pH 7,4 MES. En effet, le motif i ne se plie pas à pH 7,414. Dans les travaux précédents, nous avons constaté que plus le taux de cisaillement est élevé, plus le i-motif11 se déploie. Sur la base du déploiement du motif i dans les pincettes optiques 11, nous avons calibré la force de cisaillement par rapport au taux de cisaillement, comme le montre la figure 1C, qui montre que jusqu’à 41 pN pourraient être appliqués au motif i étiqueté par paire FRET à un taux de cisaillement de 77 796 s−1. Dans la figure 2B, le ligand (L2H2-4OTD) se liant aux molécules d’ADN i-motif soumises au flux de cisaillement a été évalué, ce qui a montré que l’augmentation de l’intensité de fluorescence devenait moins évidente avec l’augmentation de la concentration de L2H2-4OTD (0-60 μM). À partir de la courbe de liaison (c’est-à-dire un tracé des fractions liées du ligand par rapport à la concentration du ligand libre) de la figure 2C, une constante de dissociation (Kd) de 36 μM a été déterminée pour l’interaction entre le ligand L2H2-4OTD et le motif i11. En tant qu’application pratique de la force de cisaillement pour les réactions chimiques, la figure 3 montre une réaction de mécano-clic qui peut être déclenchée par l’écoulement de cisaillement. Dans la figure 3B, le motif i chélaté au Cu(I) a été déplié à la vitesse de cisaillement de 63 209 s−1, et le cuivre libéré (I) a déclenché la réaction de clic fluorogénique illustrée à la figure 3A, ce qui a entraîné une augmentation de l’intensité de la fluorescence au fil du temps (figure 3C).
Figure 1 : Dépliage de la structure de l’ADN i-motif par écoulement de cisaillement dans l’EFS. (A) Schéma du déploiement d’une structure d’ADN i-motif marquée avec une paire FRET (Cy5 et quencher) par le flux de cisaillement généré dans un homogénéisateur de paillasse. Encart gauche : le brun clair indique le stator, et le brun foncé indique le rotor. Encart droit: le cercle cyan pointillé entre le rotor et le stator indique l’écoulement tampon dans des conditions de cisaillement. La flèche circulaire brun foncé indique la direction du rotor. Les flèches cyan dans la vue agrandie de l’encart de droite indiquent l’écoulement tampon sous cisaillement. La longueur de chaque flèche représente la vitesse d’un flux particulier (les flèches plus longues indiquent des vitesses plus élevées). (B) La variation en pourcentage de l’intensité de fluorescence en détection en temps réel est due au déploiement du motif i à différentes vitesses de cisaillement de 9 724 s−1 à 97 245 s−1. Les courbes pleines indiquent l’ajustement exponentiel. L’intensité de fluorescence est normalisée par rapport à la valeur maximale observée dans l’expérience. (C) Schéma de la vitesse de cisaillement par rapport à la force de cisaillement pour le motif i représenté en (A). La ligne rouge représente un raccord linéaire (R2 = 1,00). Cette figure a été modifiée à partir de Hu et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Dépliage des i-motifs liés avec des ligands. (A) Schéma du i-motif marqué avec une paire FRET (Cy5 et quencher) liée au ligand L2H2-4OTD13. (B) La diminution de l’intensité de fluorescence du motif i avec l’augmentation des concentrations du ligand L2H2-4OTD (rose : 0 μM, vert : 6 μM, cyan : 30 μM, gris : 36 μM, noir : 45 μM, et brun clair : 60 μM). L’intensité de fluorescence est normalisée par rapport à la valeur maximale observée dans l’expérience. (C) Courbe de liaison du motif i à différentes concentrations libres de L2H2-4OTD. Cette figure a été modifiée à partir de Hu et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Réactions de clic mécano. (A) Réaction de clic fluorogénique entre Calfluor 488 et HPG. Le composé représenté en vert est le produit de réaction fluorescent. (B) La structure de l’ADN i-motif chélatée avec du cuivre (I) à pH 7,4 a été filtrée pour éliminer le cuivre (I) non lié dans la solution. Le motif i chélaté en cuivre (I) a été déplié par écoulement de cisaillement dans EFS. Le cuivre (I) libéré a catalysé la réaction de clic fluorogénique, qui a été montrée dans les tubes capillaires (en bas à droite). (C) Pourcentage d’augmentation de l’intensité de fluorescence de la réaction de clic à une vitesse de cisaillement de 63 209 s−1 pendant 20 min. La courbe sombre indique l’ajustement de l’intensité de fluorescence à partir d’une réaction de clic de contrôle sans ADN. La courbe verte représente l’ajustement exponentiel. L’intensité de fluorescence est normalisée par rapport à la valeur maximale observée dans l’expérience. Cette figure a été modifiée à partir de Hu et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit dans ce manuscrit permet d’étudier en temps réel le déroulement d’un ensemble de structures biomoléculaires par force de cisaillement. Les résultats présentés ici soulignent que les structures à motif d’ADN peuvent être dépliées par la force de cisaillement. Le déploiement du motif i lié au ligand et les réactions de clic actionnées par la force de cisaillement étaient des applications de preuve de concept pour cette méthode de spectroscopie de force d’ensemble.
La figure 1 présente la configuration de l’instrument. L’extrémité du générateur d’homogénéisateur et la chambre de réaction ne doivent pas entrer en contact l’une avec l’autre, ce qui est essentiel pour permettre un flux de cisaillement stable entre le rotor et le stator sans formation de bulles. Pour l’embout d’homogénéisateur commercial, il est préférable d’en choisir un avec un trou d’air pour réduire la formation de bulles. En outre, la taille de la chambre de réaction ne doit pas être trop grande, car une grande chambre nécessite plus de solution d’échantillon. Au contraire, une certaine hauteur de la chambre de cisaillement est nécessaire pour couvrir le corps principal de la pointe de l’homogénéisateur. Pour réduire les erreurs systématiques, il est suggéré de maintenir le même alignement dans la configuration pour effectuer toutes les expériences pertinentes. Il est important de souligner que l’ADN maintient son intégrité, comme en témoigne l’électrophorèse sur gel après cisaillement11.
À partir de la figure 1B, la fluorescence saturante a augmenté avec le taux de cisaillement allant de 9724 s−1 à 97245 s−1. Après avoir tracé l’intensité de fluorescence du plateau en fonction du taux de cisaillement, l’intensité de fluorescence n’a plus augmenté au taux de cisaillement supérieur à 97245 s−1, ce qui suggère que la force de cisaillement associée fournie par le taux de cisaillement (97245 s−1) était déjà supérieure à la force requise pour déplier le motif i. Par conséquent, l’intensité de fluorescence du plateau à 97245 s−1 a été prise comme point de référence (c’est-à-dire correspondant à 100% de déploiement) pour calculer le pourcentage de motif i déplié à n’importe quelle vitesse de cisaillement 11. La figure 1C montre la force de cisaillement générée sur le motif télomérique i à une vitesse de cisaillement particulière. Pour établir la relation entre la force de cisaillement et la vitesse de cisaillement, le dépliage mécanique de la même structure télomérique i-motif a été effectué dans des pincettes optiques, et un tracé cumulatif du pourcentage de déploiement du i-motif par rapport à la force a été tracé sur la base de l’histogramme de la force de déploiement du i-motif dans les expériences de pince optique11 . Pour différentes structures d’ADN, l’étalonnage de force à l’aide de pincettes optiques est recommandé. En supposant que les pourcentages de motif i déplié sont équivalents entre le dépliage mécanique basé sur une pince à épiler laser et le dépliage basé sur la force de cisaillement à une force particulière (c’est-à-dire étant donné que la direction de la force subie par le motif i est similaire dans ces deux méthodes, qui est le long de l’axe étiré des deux poignées d’ADN [surplombs]), nous avons calibré la force de cisaillement par rapport au taux de cisaillement.
Bien que les instruments d’homogénéisation soient facilement accessibles dans n’importe quel laboratoire, il y a quelques étapes clés qui doivent être effectuées avec soin. Tout d’abord, pour détecter des valeurs de fluorescence précises, le trajet de la lumière doit être réglé entre le rotor et le stator. Deuxièmement, lors de la réalisation des expériences de cisaillement selon les étapes de ce protocole, il est important de vérifier la fluorescence avant l’expérience. Il est nécessaire de réduire l’intensité élevée de fluorescence de fond en nettoyant bien l’ensemble de l’installation, en particulier l’embout de l’homogénéisateur et la chambre de réaction. L’expérience doit être réalisée dans une pièce sombre pour réduire davantage la lumière parasite.
L’un des avantages les plus importants de la technique EFS est sa flexibilité et sa polyvalence pour le déploiement mécanique d’un ensemble de structures biomoléculaires, y compris les structures de protéines, d’ARN et d’ADN. Traditionnellement, les expériences de déploiement mécanique d’ensemble nécessitent des configurations expérimentales complexes. L’avantage de l’EFS est qu’il réduit la complexité de la conception de l’instrument, avec un coût considérablement réduit. Bien que l’EFS puisse effectuer des expériences à haut débit en moins de temps que les techniques à molécule unique, il existe certaines limites, notamment le fait que l’amplitude de la force est déterminée par la taille de la structure moléculaire. De plus, un marquage fluorescent de la molécule détectée est nécessaire. Pour obtenir des forces de cisaillement plus importantes, la fixation des poignées de cisaillement à la molécule d’intérêt peut devenir nécessaire. Pour des applications futures, l’EFS basé sur la force de cisaillement peut potentiellement être utilisé pour étudier divers phénomènes mécanochimiques dans lesquels les réactions chimiques, telles que la reconnaissance des analytes15 et la polymérisation des polymères synthétiques, sont influencées par les forces mécaniques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail de recherche a été soutenu par la National Science Foundation [CBET-1904921] et les National Institutes of Health [NIH R01CA236350] à H. M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
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