Summary
Die Ensemblekraftspektroskopie (EFS) ist eine robuste Technik zur mechanischen Entfaltung und Echtzeiterfassung eines Ensemblesatzes biomolekularer Strukturen in biophysikalischen und biosensorischen Bereichen.
Abstract
Einzelmolekültechniken, die auf Fluoreszenz und mechanochemischen Prinzipien basieren, bieten eine überlegene Empfindlichkeit in der biologischen Sensorik. Aufgrund des Mangels an Hochdurchsatzkapazitäten ist die Anwendung dieser Techniken in der Biophysik jedoch begrenzt. Die Ensemble-Kraft-Spektroskopie (EFS) hat einen hohen Durchsatz bei der Untersuchung eines massiven Satzes molekularer Strukturen gezeigt, indem mechanochemische Untersuchungen einzelner Moleküle in solche von molekularen Ensembles umgewandelt wurden. In diesem Protokoll wurden die DNA-Sekundärstrukturen (i-Motive) im Scherstrom zwischen Rotor und Stator einer Homogenisatorspitze mit Scherraten bis zu 77796/s entfaltet. Die Auswirkungen von Durchflussraten und Molekülgrößen auf die Scherkräfte des i-Motivs wurden nachgewiesen. Die EFS-Technik zeigte auch die Bindungsaffinität zwischen DNA-i-Motiven und Liganden. Darüber hinaus haben wir eine Klickchemiereaktion demonstriert, die durch Scherkraft (d.h. Mechano-Klick-Chemie) ausgelöst werden kann. Diese Ergebnisse belegen die Wirksamkeit der Verwendung von Scherkraft zur Kontrolle der Konformation molekularer Strukturen.
Introduction
In der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie1 (SMFS) wurden die mechanischen Eigenschaften einzelner Molekülstrukturen mit hochentwickelten Instrumenten wie dem Rasterkraftmikroskop, einer optischen Pinzette und einer Magnetpinzette 2,3,4 untersucht. Eingeschränkt durch die gleiche Richtungsanforderung der Moleküle in den krafterzeugenden/detektierenden Aufbauten oder das kleine Sichtfeld in Magnetpinzetten und dem Miniatur-Zentrifugenkraftmikroskop (MCF)5,6,7,8, kann nur eine begrenzte Anzahl von Molekülen gleichzeitig mit SMFS untersucht werden. Der geringe Durchsatz von SMFS verhindert seine breite Anwendung im Bereich der molekularen Erkennung, was die Beteiligung einer großen Anzahl von Molekülen erfordert.
Die Scherströmung bietet eine mögliche Lösung, um Kräfte auf eine massive Gruppe von Molekülen auszuüben9. In einer Flüssigkeitsströmung innerhalb eines Kanals gilt: Je näher an der Kanaloberfläche, desto langsamer ist die Durchflussrate10. Ein solcher Strömungsgeschwindigkeitsgradient verursacht eine Schubspannung, die parallel zur Grenzfläche verläuft. Wenn ein Molekül in diese Scherströmung gebracht wird, orientiert sich das Molekül so, dass seine Längsachse mit der Strömungsrichtung übereinstimmt, da die Querkraft auf die lange Achse11 aufgebracht wird. Als Ergebnis dieser Neuorientierung wird erwartet, dass sich alle Moleküle des gleichen Typs (Größe und Länge der Griffe) in die gleiche Richtung ausrichten, während sie die gleiche Scherkraft erfahren.
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, um eine solche Scherströmung zu verwenden, um Scherkraft auf einen massiven Satz molekularer Strukturen auszuüben, wie das DNA-i-Motiv veranschaulicht. Bei diesem Protokoll wird eine Scherströmung zwischen Rotor und Stator in einer Homogenisatorspitze erzeugt. Die vorliegende Studie ergab, dass die gefaltete DNA-i-Motivstruktur durch Scherraten von 9724-97245 s−1 entfaltet werden konnte. Außerdem wurde eine Dissoziationskonstante von 36 μM zwischen dem L2H2-4OTD-Liganden und dem i-Motiv gefunden. Dieser Wert stimmt mit dem Wert von 31 μM überein, gemessen mit dem Gelverschiebungsassay12. Weiterhin wird die aktuelle Technik verwendet, um das i-Motiv zu entfalten, das das chelatierte Kupfer (I) freilegen kann, um eine Klickreaktion zu katalysieren. Dieses Protokoll ermöglicht es somit, einen großen Satz von i-Motiv-Strukturen mit kostengünstigen Instrumenten in angemessener Zeit (kürzer als 30 min) zu entfalten. Da die Querkrafttechnik den Durchsatz der Kraftspektroskopie drastisch erhöht, nennen wir diese Technik Ensemblekraftspektroskopie (EFS). Dieses Protokoll zielt darauf ab, experimentelle Richtlinien bereitzustellen, um die Anwendung dieses auf Scherkraft basierenden EFS zu erleichtern.
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Protocol
HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Puffer und chemischen Reagenzien sind in der Tabelle Materialien aufgeführt.
1. Vorbereitung des Scherkraftmikroskops
HINWEIS: Das Scherkraftmikroskop besteht aus zwei Teilen, einer Reaktionseinheit (Homogenisator) und einer Detektionseinheit (Fluoreszenzmikroskop). Die Vergrößerung des Okulars beträgt 10x und die Vergrößerung der Objektivlinse (Luft) ist 4x.
- Montieren Sie den Homogenisator und das Mikroskop auf einem Montagetisch. Tragen Sie eine Schutzbrille und schalten Sie das Fluoreszenzmikroskop ein und stellen Sie dann den Homogenisator ein, um sicherzustellen, dass der Anregungslichtstrahl einer geeigneten Wellenlänge (hier wurden 488 nm verwendet) durch die Mitte der Dispergierspitze des Homogenisators geht.
- Bereiten Sie eine Reaktionskammer mit flachem Boden vor, die 5 cm hoch und 1,5 cm 2 x 1,5 cm2 im Querschnitt ist. Um den Hintergrund zu reduzieren, stellen Sie sicher, dass das ausgewählte Kammermaterial nicht fluoresziert, wie z. B. Gläser (einige Kunststoffe haben Fluoreszenz).
- Wählen Sie eine geeignete Homogenisator-Dispergierspitze, die die gewünschte Scherkraft bereitstellen kann.
HINWEIS: Die Scherrate ist abhängig vom Abstand zwischen Rotor und Stator bei einer festen Drehzahl11 gemäß der folgenden Gleichung:
wobei μ die dynamische Viskosität von Wasser bei 20 °C ist; D ist der Innendurchmesser des Stators; d ist der Außendurchmesser des Rotors und V die Schergeschwindigkeit (U/min). - Klemmen Sie die Reaktionskammer auf den Probentisch des Fluoreszenzmikroskops, und stellen Sie die Kammer dann so ein, dass sie die Dispergierspitze des Homogenisators hält (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass sich die Dispergierspitze etwas über (~ 1 mm) der unteren Oberfläche der Reaktionskammer befindet.
- Stellen Sie die vertikale Position des Homogenisators und der Kammer zusammen ein, um sicherzustellen, dass der Fokus des Mikroskops auf der Oberfläche der Dispergierspitze liegt. Stellen Sie dann die horizontale Position der Dispergierspitze ein, um sicherzustellen, dass der Erfassungsbereich (Sichtfeld) zwischen Rotor und Stator eingestellt ist (Abbildung 1).
- Schalten Sie die Fluoreszenzkanäle entsprechend dem im Experiment verwendeten Fluoreszenzfarbstoff ein.
- Verwenden Sie vor dem Hochgeschwindigkeitsscherexperiment entionisiertes (DI) Wasser, um die Scherung mit einer niedrigen Schergeschwindigkeit (z. B. 2.000 U/min) zu testen, um sicherzustellen, dass die Dispergierspitze ordnungsgemäß arbeiten kann, ohne die Reaktionskammer zu berühren.
2. Entfaltung von i-Motiven mit und ohne Liganden
- Bereiten Sie eine menschliche Telomer-i-Motiv-DNA (Table of Materials) vor, die an ihren beiden Enden mit einem Farbstoff bzw. einem Quencher markiert ist, in DI-Wasser, wie in Hu et al.11 beschrieben.
HINWEIS: i-Motiv mit Sequenz: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA. - Die DNA wird im 30 mM MES-Puffer bei pH 5,5 oder pH 7,4 auf 5 μM verdünnt. Der DNA-Lösung wird der Ligand L2H2-4OTD, der nach Abraham Punnoose et al.13 synthetisiert wurde, in einem Konzentrationsbereich von 0-60 μM hinzugefügt. Mischen Sie die Lösung vorsichtig für 10 min, um die i-Motivstrukturen ohne Licht zu falten.
- Überprüfen und minimieren Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität der Reaktionskammer, die mit deionisiertem DI-Wasser gefüllt ist, mit dem Fluoreszenzmikroskop ohne Scherung. Eine einfache Möglichkeit, die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren, besteht darin, die Reaktionskammer mit DI-Wasser zu waschen. Der Hintergrundfluoreszenzwert muss später in den Datenanalysen subtrahiert werden.
HINWEIS: Streulicht sollte ab diesem Schritt vermieden werden. - Stellen Sie die Parameter der CCD-Kamera über die Software ein. Die empfohlenen Parameter lauten wie folgt: Belichtungszeit = 0,5 s, CCD-Empfindlichkeit = 1600 und Aufnahmezeit = 20 min.
- Geben Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere und saubere Reaktionskammer. Decken Sie die Reaktionskammer mit einer schwarzen Box ab. Starten Sie dann den Homogenisator, um die Scherung mit einer ausgewählten Scherrate von 9.724 s− 1 bis 97.245 s−1 (ausgewählt mit der mit dem Homogenisator verbundenen Software) für 20 Minuten durchzuführen, wobei die CCD-Kamera eingeschaltet ist, um die Daten aufzuzeichnen.
- Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit DI-Wasser.
3. Scherkraftbetätigte Klickreaktion
- Bereiten Sie i-Motiv-DNA in DI-Wasser vor. Inkubation von 10 μM i-Motiv-DNA in 300 μL 30 mM Tris-Puffer (pH 7,4), ergänzt mit 150 μM CuCl und 300 μM Ascorbinsäure für 10 min, um die i-Motivstrukturen zu falten (alle Konzentrationen sind Endkonzentrationen in der Lösung).
HINWEIS: CuCl ist der Katalysator der Klickreaktion. Ascorbinsäure verhindert die Oxidation von Kupfer (I). - Ultrafiltrieren Sie die Lösung mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung bei einer Zentrifugalkraft von 14.300 x g. Die Lösung wird nach jeder Filtration mit 30 mM Tris-Puffer (pH 7,4), ergänzt mit 300 μM Ascorbinsäure, auf ~500 μL aufgefüllt.
- Wiederholen Sie die Filtration 3x.
- Die Restlösung wird gesammelt und ergibt ein Endvolumen von 300 μL durch Zugabe von 30 mM Tris (pH 7,4), ergänzt mit 300 μM Ascorbinsäure, zusammen mit 20 μM Calfluor 488 Azid, 20 μM HPG und 10 μM TBTA. Sobald die Reagenzien hinzugefügt wurden, bringen Sie die Lösung in die Dunkelkammer.
HINWEIS: Licht sollte nach diesem Schritt vermieden werden. - Überprüfen und minimieren Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität der mit DI-Wasser gefüllten Reaktionskammer vor den Scherexperimenten mit dem Mikroskop. Eine einfache Möglichkeit, die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren, besteht darin, die Reaktionskammer mit DI-Wasser zu waschen.
- Geben Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere Reaktionskammer und starten Sie dann die Homogenisatorscherung mit einer Scherrate von 63.209 s−1 für 20 Minuten bei eingeschalteter CCD-Kamera .
- Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit DI-Wasser.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die mechanische Entfaltung und Echtzeiterfassung von Ensemblemolekülen in EFS. In Abbildung 1B wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität der i-Motiv-DNA mit einer Scherrate von 9.724 s−1 bis 97.245 s−1 in einem pH-Puffer von 5,5 MES zunahm. Als Kontrolle wurde die Fluoreszenzintensität nicht erhöht, wenn die gleiche i-Motiv-DNA mit einer Rate von 63.209 s−1 in einem pH-Puffer von 7,4 MES geschert wurde. Dies liegt daran, dass sich das i-Motiv bei pH 7,414 nicht faltet. In der vorherigen Arbeit haben wir festgestellt, dass je höher die Scherrate, desto mehr entfaltet sich das i-Motiv11. Basierend auf der Entfaltung des i-Motivs in der optischen Pinzette 11 kalibrierten wir die Scherkraft gegen die Scherrate, wie in Abbildung 1C gezeigt, die zeigte, dass bis zu 41 pN bei einer Scherrate von 77.796 s−1 auf das FRET-Paar mit der Bezeichnung i-Motiv aufgebracht werden konnten. In Abbildung 2B wurde der Ligand (L2H2-4OTD) bewertet, der an die DNA-i-Motivmoleküle bindet, die dem Scherfluss ausgesetzt sind, was zeigte, dass der Anstieg der Fluoreszenzintensität mit zunehmender L2H2-4OTD-Konzentration (0-60 μM) weniger offensichtlich wurde. Aus der Bindungskurve (d.h. einem Diagramm der gebundenen Anteile des Liganden vs. der freien Ligandenkonzentration) in Abbildung 2C wurde eine Dissoziationskonstante (Kd) von 36 μM für die Wechselwirkung zwischen dem L2H2-4OTD-Liganden und dem i-Motiv11 bestimmt. Als praktische Anwendung der Scherkraft für chemische Reaktionen zeigt Abbildung 3 eine Mechano-Klick-Reaktion, die durch die Scherströmung ausgelöst werden kann. In Abbildung 3B wurde das Cu(I)-chelatierte i-Motiv mit der Scherrate von 63.209 s−1 entfaltet, und das freigesetzte Kupfer (I) löste die in Abbildung 3A gezeigte fluorogene Klickreaktion aus, was im Laufe der Zeit zu einer erhöhten Fluoreszenzintensität führte (Abbildung 3C).
Abbildung 1: Entfaltung der i-Motiv-DNA-Struktur durch Scherfluss im EFS. (A) Schematische Darstellung der Entfaltung einer i-Motiv-DNA-Struktur, die mit einem FRET-Paar (Cy5 und Quencher) markiert ist, durch den in einem Tischhomogenisator erzeugten Scherfluss. Linker Einschub: Das Hellbraun zeigt den Stator an, das Dunkelbraun den Rotor. Rechter Einschub: Der gestrichelte cyanfarbene Kreis zwischen Rotor und Stator zeigt den Pufferstrom unter Scherbedingungen an. Der dunkelbraune Kreispfeil zeigt die Richtung des Rotors an. Die Cyanpfeile in der vergrößerten Ansicht des rechten Einschubs zeigen den Pufferfluss unter Scherung an. Die Länge jedes Pfeils stellt die Geschwindigkeit eines bestimmten Strömungsstroms dar (längere Pfeile zeigen höhere Geschwindigkeiten an). (B) Die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität in der Echtzeitmessung ist auf die Entfaltung des i-Motivs bei unterschiedlichen Scherraten von 9.724 s−1 bis 97.245 s−1 zurückzuführen. Durchgezogene Kurven zeigen die Exponentialanpassung an. Die Fluoreszenzintensität wird in Bezug auf den im Experiment beobachteten Maximalwert normalisiert. (C) Diagramm der Scherrate im Vergleich zur Querkraft für das in (A) dargestellte i-Motiv. Die rote Linie zeigt eine lineare Anpassung (R2 = 1,00). Diese Abbildung wurde von Hu et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Entfaltung von i-Motiven, die mit Liganden gebunden sind. (A) Schematische Darstellung des i-Motivs mit einem FRET-Paar (Cy5 und Quencher), gebunden mit dem L2H2-4OTD-Liganden13. (B) Die verminderte Fluoreszenzintensität des i-Motivs mit steigenden Konzentrationen des L2H2-4OTD-Liganden (rosa: 0 μM, grün: 6 μM, Cyan: 30 μM, grau: 36 μM, schwarz: 45 μM und hellbraun: 60 μM). Die Fluoreszenzintensität wird in Bezug auf den im Experiment beobachteten Maximalwert normalisiert. (C) Bindungskurve des i-Motivs bei verschiedenen freien L2H2-4OTD-Konzentrationen. Diese Abbildung wurde von Hu et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Mechano-Klick-Reaktionen . (A) Fluorogene Klickreaktion zwischen Calfluor 488 und HPG. Die grün dargestellte Verbindung ist das fluoreszierende Reaktionsprodukt. (B) Die mit Kupfer (I) bei pH 7,4 chelatierte i-Motiv-DNA-Struktur wurde filtriert, um ungebundenes Kupfer (I) in der Lösung zu entfernen. Das Kupfer (I) chelatierte i-Motiv wurde durch Scherströmung in EFS entfaltet. Das freigesetzte Kupfer (I) katalysierte die fluorogene Klickreaktion, die in den Kapillarröhrchen (unten rechts) gezeigt wurde. (C) Prozentuale Erhöhung der Fluoreszenzintensität der Klickreaktion bei einer Scherrate von 63.209 s−1 für 20 min. Die dunkle Kurve zeigt die Anpassung der Fluoreszenzintensität aus einer Kontrollklickreaktion ohne DNA. Die grüne Kurve stellt die exponentielle Anpassung dar. Die Fluoreszenzintensität wird in Bezug auf den im Experiment beobachteten Maximalwert normalisiert. Diese Abbildung wurde von Hu et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll ermöglicht die Echtzeituntersuchung der Entfaltung eines Ensemblesatzes biomolekularer Strukturen durch Scherkraft. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen, dass DNA-i-Motivstrukturen durch Scherkraft entfaltet werden können. Die Entfaltung des ligandengebundenen i-Motivs und die Scherkraft-betätigten Klickreaktionen waren Proof-of-Concept-Anwendungen für diese Ensemble-Kraftspektroskopie-Methode.
Abbildung 1 zeigt den Geräteaufbau. Die Spitze des Homogenisatorgenerators und die Reaktionskammer dürfen nicht miteinander in Kontakt kommen, was entscheidend ist, um einen stabilen Scherfluss zwischen Rotor und Stator ohne Blasenbildung zu ermöglichen. Für die kommerzielle Homogenisatorspitze ist es besser, einen mit einem Luftloch zu wählen, um die Blasenbildung zu reduzieren. Außerdem sollte die Größe der Reaktionskammer nicht zu groß sein, da eine große Kammer mehr Probenlösung benötigt. Im Gegenteil, eine bestimmte Höhe der Scherkammer ist erforderlich, um den Hauptkörper der Homogenisatorspitze abzudecken. Um systematische Fehler zu reduzieren, wird empfohlen, die gleiche Ausrichtung im Aufbau beizubehalten, um alle relevanten Experimente durchzuführen. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass die DNA ihre Integrität beibehält, wie die Gelelektrophorese nach dem Scheren11 beweist.
Aus Abbildung 1B geht hervor, dass die Sättigungsfluoreszenz mit der Scherrate von 9724 s−1 bis 97245 s−1 zunahm. Nach der Darstellung der Plateau-Fluoreszenzintensität vs. Scherrate stieg die Fluoreszenzintensität bei der Scherrate über 97245 s−1 nicht mehr an, was darauf hindeutet, dass die zugehörige Scherkraft, die durch die Scherrate (97245 s−1) geliefert wird, bereits höher war als die erforderliche Kraft, um das i-Motiv zu entfalten. Daher wurde die Plateaufluoreszenzintensität bei 97245 s−1 als Referenzpunkt genommen (d.h. entsprechend einer Entfaltung von 100%), um den Prozentsatz des entfalteten i-Motivs bei einer beliebigen Scherrate11 zu berechnen. Abbildung 1C zeigt die am Telomer-i-Motiv erzeugte Scherkraft bei einer bestimmten Scherrate. Um die Beziehung zwischen der Scherkraft und der Scherrate zu ermitteln, wurde die mechanische Entfaltung derselben telomeren i-Motivstruktur in einer optischen Pinzette durchgeführt, und ein kumulatives Diagramm des sich entfaltenden Prozentsatzes des i-Motivs vs. Kraft wurde basierend auf dem Entfaltungskrafthistogramm des i-Motivs in den optischen Pinzettenexperimenten aufgetragen11 . Für verschiedene DNA-Strukturen wird eine Kraftkalibrierung mit einer optischen Pinzette empfohlen. Basierend auf der Annahme, dass die Prozentsätze des entfalteten i-Motivs äquivalent zwischen mechanischer Entfaltung auf Laserpinzette und auf Scherkraft basierender Entfaltung bei einer bestimmten Kraft sind (d.h. da die Richtung der Kraft, die das i-Motiv erfährt, bei diesen beiden Methoden ähnlich ist, was entlang der gestreckten Achse der beiden DNA-Griffe [Überhänge] liegt), haben wir die Scherkraft vs. Scherrate kalibriert.
Obwohl die Homogenisatorinstrumente in jedem Labor leicht zugänglich sind, gibt es einige wichtige Schritte, die mit Vorsicht durchgeführt werden sollten. Um genaue Fluoreszenzwerte zu erkennen, sollte zunächst der Weg des Lichts zwischen Rotor und Stator eingestellt werden. Zweitens ist es bei der Durchführung der Scherexperimente gemäß den Schritten dieses Protokolls wichtig, die Fluoreszenz vor dem Experiment zu überprüfen. Es ist notwendig, die hohe Hintergrundfluoreszenzintensität zu reduzieren, indem der gesamte Aufbau gut gereinigt wird, insbesondere die Homogenisatorspitze und die Reaktionskammer. Das Experiment sollte in einem dunklen Raum durchgeführt werden, um Streulicht weiter zu reduzieren.
Einer der wichtigsten Vorteile der EFS-Technik ist ihre Flexibilität und Vielseitigkeit für die mechanische Entfaltung eines Ensemblesatzes biomolekularer Strukturen, einschließlich Protein-, RNA- und DNA-Strukturen. Traditionell erfordern ensemblemechanische Entfaltungsexperimente komplexe Versuchsaufbauten. Der Vorteil von EFS besteht darin, dass es die Komplexität im Gerätedesign reduziert und die Kosten erheblich reduziert. Obwohl EFS im Vergleich zu Einzelmolekültechniken Hochdurchsatzexperimente in kürzerer Zeit durchführen kann, gibt es einige Einschränkungen, darunter die Tatsache, dass die Kraftgröße durch die Größe der Molekülstruktur bestimmt wird. Zusätzlich ist eine fluoreszierende Markierung des detektierten Moleküls erforderlich. Um größere Scherkräfte zu erzielen, kann die Befestigung von Schergriffen an dem interessierenden Molekül notwendig werden. Für zukünftige Anwendungen kann das auf Scherkraft basierende EFS potenziell verwendet werden, um verschiedene mechanochemische Phänomene zu untersuchen, bei denen chemische Reaktionen, wie die Analyterkennung15 und die Polymerisation synthetischer Polymere, durch mechanische Kräfte beeinflusst werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Forschungsarbeiten wurden von der National Science Foundation [CBET-1904921] und den National Institutes of Health [NIH R01CA236350] bis H. M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
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