Summary
एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईएफएस) बायोफिज़िकल और बायोसेंसिंग क्षेत्रों में बायोमोलेक्यूलर संरचनाओं के एक समूह के यांत्रिक प्रकटीकरण और वास्तविक समय संवेदन के लिए एक मजबूत तकनीक है।
Abstract
प्रतिदीप्ति और मेकेनोकेमिकल सिद्धांतों पर आधारित एकल-अणु तकनीक जैविक संवेदन में बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करती है। हालांकि, उच्च थ्रूपुट क्षमताओं की कमी के कारण, इन तकनीकों का अनुप्रयोग बायोफिज़िक्स में सीमित है। एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईएफएस) ने अलग-अलग अणुओं के मेकेनोकेमिकल अध्ययनों को आणविक पहनावा में परिवर्तित करके आणविक संरचनाओं के एक विशाल सेट की जांच में उच्च थ्रूपुट का प्रदर्शन किया है। इस प्रोटोकॉल में, डीएनए द्वितीयक संरचनाओं (आई-रूपांकनों) को 77796 / सेकंड तक कतरनी दरों पर एक होमोजेनाइज़र टिप के रोटर और स्टेटर के बीच कतरनी प्रवाह में प्रकट किया गया था। आई-मोटिफ द्वारा अनुभव किए गए कतरनी बलों पर प्रवाह दर और आणविक आकार के प्रभाव ों का प्रदर्शन किया गया था। ईएफएस तकनीक ने डीएनए आई-रूपांकनों और लिगेंड के बीच बाध्यकारी संबंध का भी खुलासा किया। इसके अलावा, हमने एक क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया है जिसे कतरनी बल (यानी, मेकानो-क्लिक रसायन विज्ञान) द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। ये परिणाम आणविक संरचनाओं की रचना को नियंत्रित करने के लिए कतरनी बल का उपयोग करने की प्रभावशीलता स्थापित करते हैं।
Introduction
एकल-अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी1 (एसएमएफएस) में, व्यक्तिगत आणविक संरचनाओं के यांत्रिक गुणों का अध्ययन परिष्कृत उपकरणों जैसे परमाणु बल माइक्रोस्कोप, ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और चुंबकीय चिमटी 2,3,4 द्वारा किया गया है। बल पैदा करने/पता लगाने वाले सेटअपों या चुंबकीय चिमटी में छोटे क्षेत्र और लघु सेंट्रीफ्यूज बल माइक्रोस्कोप (एमसीएफ) 5,6,7,8 में अणुओं की समान दिशात्मकता आवश्यकता द्वारा प्रतिबंधित, एसएमएफएस का उपयोग करके एक साथ केवल सीमित संख्या में अणुओं की जांच की जा सकती है। एसएमएफएस का कम थ्रूपुट आणविक मान्यता क्षेत्र में इसके व्यापक अनुप्रयोग को रोकता है, जिसके लिए अणुओं के एक बड़े सेट की भागीदारी की आवश्यकता होती है।
कतरनी प्रवाह अणुओं के एक विशाल सेट पर बलों को लागू करने के लिए एक संभावित समाधान प्रदान करताहै। एक चैनल के अंदर तरल प्रवाह में, चैनल की सतह के जितना करीब होता है, प्रवाह दर10 धीमी होती है। इस तरह के प्रवाह वेग ढाल कतरनी तनाव का कारण बनता है जो सीमा की सतह के समानांतर होता है। जब एक अणु को इस कतरनी प्रवाह में रखा जाता है, तो अणु खुद को फिर से तैयार करता है ताकि इसकी लंबी धुरी प्रवाह दिशा के साथ संरेखित हो, क्योंकि कतरनी बल लंबी धुरी11 पर लागू होता है। इस पुन: अभिविन्यास के परिणामस्वरूप, एक ही प्रकार के सभी अणुओं (हैंडल के आकार और लंबाई) को एक ही कतरनी बल का अनुभव करते समय एक ही दिशा में संरेखित करने की उम्मीद है।
यह काम आणविक संरचनाओं के एक विशाल सेट पर कतरनी बल लगाने के लिए इस तरह के कतरनी प्रवाह का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जैसा कि डीएनए आई-मोटिफ द्वारा उदाहरण दिया गया है। इस प्रोटोकॉल में, एक होमोजेनाइज़र टिप में रोटर और स्टेटर के बीच एक कतरनी प्रवाह उत्पन्न होता है। वर्तमान अध्ययन में पाया गया कि मुड़े हुए डीएनए आई-मोटिफ संरचना को 9724-97245 एस -1 की कतरनी दरों द्वारा प्रकट किया जा सकता है। इसके अलावा, एल 2 एच 2-4 ओटीडी लिगैंड और आई-मोटिफ के बीच 36 μM का पृथक्करण स्थिरांक पाया गया था। यह मान जेल शिफ्ट परख12 द्वारा मापा गया 31 μM के अनुरूप है। इसके अलावा, वर्तमान तकनीक का उपयोग आई-मोटिफ को प्रकट करने के लिए किया जाता है, जो एक क्लिक प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करने के लिए चेलेटेड कॉपर (आई) को उजागर कर सकता है। इस प्रकार यह प्रोटोकॉल उचित समय (30 मिनट से कम) में कम लागत वाले उपकरणों के साथ आई-मोटिफ संरचनाओं के एक बड़े सेट को प्रकट करने की अनुमति देता है। यह देखते हुए कि कतरनी बल तकनीक बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के थ्रूपुट को काफी बढ़ाती है, हम इस तकनीक को एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईएफएस) कहते हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इस कतरनी बल-आधारित ईएफएस के आवेदन को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रयोगात्मक दिशानिर्देश प्रदान करना है।
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी बफर और रासायनिक अभिकर्मक तालिका सामग्री में सूचीबद्ध हैं।
1. कतरनी बल माइक्रोस्कोप की तैयारी
नोट: कतरनी बल माइक्रोस्कोप में दो भाग होते हैं, एक प्रतिक्रिया इकाई (होमोजेनाइज़र) और एक पहचान इकाई (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप)। आंख के टुकड़े का आवर्धन 10x है, और उद्देश्य लेंस (हवा) का आवर्धन 4x है।
- एक माउंटिंग टेबल पर होमोजेनाइज़र और माइक्रोस्कोप को इकट्ठा करें। चश्मे पहनें और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप चालू करें, और फिर यह सुनिश्चित करने के लिए होमोजेनाइज़र को समायोजित करें कि एक उपयुक्त तरंग दैर्ध्य (यहां, 488 एनएम का उपयोग किया गया था) की उत्तेजना प्रकाश किरण होमोजेनाइज़र के फैलाव सिरे के केंद्र से गुजरती है।
- एक सपाट-तल प्रतिक्रिया कक्ष तैयार करें जो ऊंचाई में 5 सेमी और क्रॉस-सेक्शन में 1.5 सेमी2 x 1.5 सेमी2 है। पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, सुनिश्चित करें कि चयनित कक्ष सामग्री फ्लोरेस नहीं करती है, जैसे कि चश्मा (कुछ प्लास्टिक में प्रतिदीप्ति होती है)।
- एक उपयुक्त होमोजेनाइज़र फैलाने वाली टिप चुनें जो वांछित कतरनी बल प्रदान कर सकती है।
नोट: कतरनी दर निम्नलिखित समीकरण के अनुसार एक निश्चित घूर्णन गति11 पर रोटर और स्टेटर के बीच की दूरी पर निर्भर है:
जहां μ 20 डिग्री सेल्सियस पर पानी की गतिशील चिपचिपाहट है; डी स्टेटर का आंतरिक व्यास है; डी रोटर का बाहरी व्यास है, और वी कतरनी गति (आरपीएम / - प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के नमूना चरण पर प्रतिक्रिया कक्ष को दबाएं, और फिर होमोजेनाइज़र के फैलाव की नोक को पकड़ने के लिए कक्ष को समायोजित करें (चित्रा 1)। सुनिश्चित करें कि फैलाने वाली नोक प्रतिक्रिया कक्ष की निचली सतह से थोड़ा ऊपर (~ 1 मिमी) है।
- होमोजेनाइज़र और कक्ष की ऊर्ध्वाधर स्थिति को एक साथ समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि माइक्रोस्कोप का ध्यान फैलाने वाली नोक की सतह पर है। फिर, यह सुनिश्चित करने के लिए कि रोटर और स्टेटर (चित्रा 1) के बीच पता लगाने वाला क्षेत्र (दृश्य का क्षेत्र) सेट है, फैलाव टिप की क्षैतिज स्थिति को समायोजित करें।
- प्रयोग में उपयोग किए गए फ्लोरोसेंट डाई के अनुसार प्रतिदीप्ति चैनलों पर स्विच करें।
- उच्च गति वाले कतरन प्रयोग से पहले, कम कतरनी गति (जैसे, 2,000 आरपीएम) के साथ कतरन का परीक्षण करने के लिए विआयनीकृत (डीआई) पानी का उपयोग करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि फैलाव टिप प्रतिक्रिया कक्ष को छूने के बिना उचित रूप से काम कर सके।
2. लिगेंड के साथ और बिना आई-रूपांकनों को उजागर करना
- डीआई पानी में क्रमशः एक डाई और एक बुझाने वाले के साथ लेबल किए गए मानव टेलोमेरिक आई-मोटिफ डीएनए (सामग्री की तालिका) तैयार करें, जैसा कि हू एट अल.11 में वर्णित है।
नोट: आई-मोटिफ युक्त अनुक्रम: 5'-टीएए सीसीसी टीएए सीसीसी टीएए सीसीसी टीएए सीसीसी टीएए। - पीएच 5.5 या पीएच 7.4 पर 30 एमएम एमईएस बफर में डीएनए को 5 μM तक पतला करें। डीएनए समाधान में, लिगैंड L2H2-4OTD जोड़ें, जिसे अब्राहम पुन्नोस एट अल.13 के अनुसार संश्लेषित किया गया था, 0-60 μM की एकाग्रता सीमा में। प्रकाश के बिना i-आकृति संरचनाओं को मोड़ने के लिए 10 मिनट के लिए घोल को धीरे से मिलाएं।
- प्रतिक्रिया कक्ष की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता की जांच करें और कम करें जो कतरनी के बिना फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विआयनीकृत डीआई पानी से भरा होता है। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने का एक आसान तरीका डीआई पानी के साथ प्रतिक्रिया कक्ष को धोना है। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मान को बाद में डेटा विश्लेषण में घटाया जाना चाहिए।
नोट: इस कदम से आवारा प्रकाश से बचा जाना चाहिए। - सॉफ़्टवेयर का उपयोग करसीसीडी कैमरे के पैरामीटर सेट करें। अनुशंसित पैरामीटर निम्नानुसार हैं: एक्सपोज़र समय = 0.5 एस, सीसीडी संवेदनशीलता = 1600, और रिकॉर्डिंग समय = 20 मिनट।
- एक लंबे पिपेट का उपयोग करके, डीएनए समाधान को खाली और साफ प्रतिक्रिया कक्ष में जोड़ें। प्रतिक्रिया कक्ष को एक ब्लैक बॉक्स के साथ कवर करें। फिर, डेटा रिकॉर्ड करने के लिए चालू सीसीडी कैमरा चालू करने के साथ 20 मिनट के लिए 9,724 एस-1 से 97,245 एस -1 (होमोजेनाइज़र से जुड़े सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके चयनित) तक चयनित कतरनी दर पर कतरनी करने के लिए होमोजेनाइज़र शुरू करें।
- प्रयोग के बाद, कक्ष को हटा दें और इसे डीआई पानी से धो लें।
3. कतरनी बल-सक्रिय क्लिक प्रतिक्रिया
- डीआई पानी में आई-मोटिफ डीएनए तैयार करें। आई-मोटिफ संरचनाओं को मोड़ने के लिए 10 मिनट के लिए 10 मिनट के लिए 10 μM i-motif DNA को 30 mM Tris बफर (pH 7.4) के 300 μL में इनक्यूबेट करें।
नोट: क्यूसीएल क्लिक प्रतिक्रिया का उत्प्रेरक है। एस्कॉर्बिक एसिड तांबा (आई) ऑक्सीकरण को रोक देगा। - 14,300 x g के केन्द्रापसारक बल पर अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस के साथ समाधान को अल्ट्रा-फिल्ट्रेट करें। प्रत्येक निस्पंदन के बाद 300 μM एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक 30 mM Tris बफर (pH 7.4) के साथ ~ 500 μL तक घोल को फिर से भरें।
- निस्पंदन 3x दोहराएँ।
- अवशिष्ट घोल एकत्र करें और 30 mM Tris (pH 7.4) को 300 μM एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक 20 μM Calfluor 488 azide, 20 μM HPG, और 10 μM TBTA के साथ जोड़कर 300 μL की अंतिम मात्रा बनाएं। एक बार अभिकर्मकों को जोड़ने के बाद, समाधान को अंधेरे कमरे में ले जाएं।
नोट: इस चरण के बाद प्रकाश से बचना चाहिए। - कतरन प्रयोगों से पहले माइक्रोस्कोप का उपयोग करके डीआई पानी से भरे प्रतिक्रिया कक्ष की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता की जांच करें और कम करें। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने का एक आसान तरीका डीआई पानी के साथ प्रतिक्रिया कक्ष को धोना है।
- डीएनए समाधान को एक लंबे पिपेट के साथ खाली प्रतिक्रिया कक्ष में जोड़ें, और फिर सीसीडी कैमरा चालू करने के साथ 20 मिनट के लिए 63,209 एस -1 की कतरनी दर पर होमोजेनाइज़र कतरन शुरू करें।
- प्रयोग के बाद, कक्ष को हटा दें और इसे डीआई पानी से धो लें।
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Representative Results
चित्रा 1 ईएफएस में एन्सेंबल अणुओं के यांत्रिक प्रकटीकरण और वास्तविक समय संवेदन को रेखांकित करता है। चित्रा 1 बी में, पीएच 5.5 एमईएस बफर में आई-मोटिफ डीएनए की प्रतिदीप्ति तीव्रता 9,724 एस -1 से 97,245 एस -1 तक कतरनी दर के साथ बढ़ी हुई देखी गई थी। एक नियंत्रण के रूप में, प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि नहीं हुई थी जब एक ही आई-मोटिफ डीएनए को पीएच 7.4 एमईएस बफर में 63,209 एस -1 की दर से काटा गया था। ऐसा इसलिए है क्योंकि आई-मोटिफ पीएच 7.414 पर फोल्ड नहीं होता है। पिछले काम में, हमने पाया कि कतरनी दर जितनी अधिक होगी, आई-मोटिफ11 का खुलासा उतना ही अधिक होगा। ऑप्टिकल ट्वीज़र्स11 में आई-मोटिफ के प्रकटीकरण के आधार पर, हमने चित्रा 1 सी में दिखाए गए अनुसार कतरनी बल बनाम कतरनी दर को कैलिब्रेट किया, जिसमें दर्शाया गया था कि 77,796 एस -1 की कतरनी दर पर आई-मोटिफ लेबल वाले फ्रेट-जोड़ी पर 41 पीएन तक लागू किया जा सकता है। चित्रा 2 बी में, कतरनी प्रवाह के अधीन डीएनए आई-मोटिफ अणुओं के लिए लिगैंड (एल 2 एच 2-4 ओटीडी) बंधन का मूल्यांकन किया गया था, जिससे पता चला कि एल 2 एच 2-4 ओटीडी एकाग्रता (0-60 μM) बढ़ने के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता की वृद्धि कम स्पष्ट हो गई। चित्रा 2 सी में बाध्यकारी वक्र (यानी, लिगैंड बनाम मुक्त लिगैंड एकाग्रता के बाध्य अंशों का एक प्लॉट) से, एल 2 एच 2-4 ओटीडी लिगैंड और आई-मोटिफ11 के बीच बातचीत के लिए 36 एसएम का पृथक्करण स्थिरांक (केडी) निर्धारित किया गया था। रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए कतरनी बल के व्यावहारिक अनुप्रयोग के रूप में, चित्रा 3 एक मेकेनो-क्लिक प्रतिक्रिया दिखाता है जिसे कतरनी प्रवाह द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है। चित्रा 3 बी में, क्यू (आई) चेलेटेड आई-मोटिफ को 63,209 एस -1 कतरनी दर पर प्रकट किया गया था, और जारी किए गए तांबा (आई) ने चित्रा 3 ए में दिखाए गए फ्लोरोजेनिक क्लिक प्रतिक्रिया को ट्रिगर किया, जिसके परिणामस्वरूप समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि हुई (चित्रा 3 सी)।
चित्र 1: ईएफएस में कतरनी प्रवाह द्वारा आई-मोटिफ डीएनए संरचना का प्रकटन। (ए) बेंचटॉप होमोजेनाइज़र में उत्पन्न कतरनी प्रवाह द्वारा फ्रेट जोड़ी (Cy5 और बुझाने वाले) के साथ लेबल किए गए आई-मोटिफ डीएनए संरचना के प्रकटहोने का योजनाबद्ध। बाएं इनसेट: हल्का भूरा स्टेटर को इंगित करता है, और गहरा भूरा रोटर को इंगित करता है। दाएं इनसेट: रोटर और स्टेटर के बीच बिंदीदार सियान सर्कल कतरनी परिस्थितियों में बफर प्रवाह को इंगित करता है। गहरे भूरे रंग का गोलाकार तीर रोटर की दिशा को इंगित करता है। दाएं इनसेट के ज़ूम किए गए दृश्य में सियान तीर कतरन के तहत बफर प्रवाह का संकेत देते हैं। प्रत्येक तीर की लंबाई एक विशेष प्रवाह धारा के वेग को दर्शाती है (लंबे तीर उच्च वेगों को इंगित करते हैं)। (बी) वास्तविक समय संवेदन में प्रतिदीप्ति तीव्रता में प्रतिशत परिवर्तन 9,724 एस -1 से 97,245 एस -1 तक अलग-अलग कतरनी दरों पर आई-मोटिफ के प्रकट होने के कारण होता है। ठोस वक्र घातीय फिटिंग का संकेत देते हैं। प्रयोग में देखे गए अधिकतम मूल्य के संबंध में प्रतिदीप्ति तीव्रता सामान्यीकृत है। (सी) आई-मोटिफ के लिए कतरनी दर बनाम कतरनी बल का आरेख (ए) में दिखाया गया है। लाल रेखा एक रैखिक फिटिंग (आर2 = 1.00) को दर्शाती है। इस आंकड़े को हू एट अल.11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: लिगेंड से बंधे आई-रूपांकनों का प्रकटन। (ए) एल 2 एच 2-4 ओटीडी लिगैंड13 से बंधे फ्रेट जोड़ी (Cy5 और बुझाने वाले) के साथ लेबल किए गए आई-मोटिफ का योजनाबद्ध। (बी) एल 2 एच 2-4 ओटीडी लिगैंड (गुलाबी: 0 μM, हरा: 6 μM, cyan: 30 μM, ग्रे: 36 μM, काला: 45 μM, और हल्का भूरा: 60 μM) की बढ़ती सांद्रता के साथ आई-मोटिफ की कम प्रतिदीप्ति तीव्रता। प्रयोग में देखे गए अधिकतम मूल्य के संबंध में प्रतिदीप्ति तीव्रता सामान्यीकृत है। (सी) विभिन्न मुक्त एल 2 एच 2-4 ओटीडी सांद्रता पर आई-मोटिफ का बाध्यकारी वक्र। इस आंकड़े को हू एट अल.11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: मेचानो-क्लिक प्रतिक्रियाएं। (A) कैल्फ्लोर 488 और एचपीजी के बीच फ्लोरोजेनिक क्लिक प्रतिक्रिया। हरे रंग में दिखाया गया यौगिक फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया उत्पाद है। (बी) पीएच 7.4 पर कॉपर (आई) के साथ आई-मोटिफ डीएनए संरचना को घोल में अनबाउंड कॉपर (आई) को हटाने के लिए फ़िल्टर किया गया था। कॉपर (आई) चेलेटेड आई-मोटिफ को ईएफएस में कतरनी प्रवाह द्वारा प्रकट किया गया था। जारी तांबा (आई) ने फ्लोरोजेनिक क्लिक प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित किया, जिसे केशिका ट्यूबों (नीचे दाएं) में दिखाया गया था। (सी) 20 मिनट के लिए 63,209 एस -1 की कतरनी दर पर क्लिक प्रतिक्रिया की प्रतिदीप्ति तीव्रता की प्रतिशत वृद्धि। अंधेरा वक्र डीएनए के बिना नियंत्रण क्लिक-प्रतिक्रिया से प्रतिदीप्ति तीव्रता की फिटिंग को इंगित करता है। हरा वक्र घातीय फिटिंग का प्रतिनिधित्व करता है। प्रयोग में देखे गए अधिकतम मूल्य के संबंध में प्रतिदीप्ति तीव्रता सामान्यीकृत है। इस आंकड़े को हू एट अल.11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल कतरनी बल द्वारा बायोमोलेक्यूलर संरचनाओं के एक समूह के प्रकटहोने की वास्तविक समय की जांच की अनुमति देता है। यहां प्रस्तुत परिणाम इस बात को रेखांकित करते हैं कि डीएनए आई-मोटिफ संरचनाओं को कतरनी बल द्वारा प्रकट किया जा सकता है। लिगैंड-बाउंड आई-मोटिफ और कतरनी फोर्स-एक्ट्यूटेड क्लिक प्रतिक्रियाओं का खुलासा इस एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी विधि के लिए अवधारणा के प्रमाण अनुप्रयोग थे।
चित्रा 1 उपकरण सेटअप प्रस्तुत करता है। होमोजेनाइज़र जनरेटर टिप और प्रतिक्रिया कक्ष को एक दूसरे के साथ संपर्क नहीं करना चाहिए, जो बुलबुला गठन के बिना रोटर और स्टेटर के बीच एक स्थिर कतरनी प्रवाह की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है। वाणिज्यिक होमोजेनाइज़र टिप के लिए, बुलबुला गठन को कम करने के लिए एयर होल के साथ एक चुनना बेहतर है। इसके अलावा, प्रतिक्रिया कक्ष का आकार बहुत बड़ा नहीं होना चाहिए, क्योंकि एक बड़े कक्ष को अधिक नमूना समाधान की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, होमोजेनाइज़र टिप के मुख्य शरीर को कवर करने के लिए कतरन कक्ष की एक निश्चित ऊंचाई की आवश्यकता होती है। व्यवस्थित त्रुटि को कम करने के लिए, सभी प्रासंगिक प्रयोगों को पूरा करने के लिए सेटअप में एक ही संरेखण बनाए रखने का सुझाव दिया जाता है। यह इंगित करना महत्वपूर्ण है कि डीएनए अखंडता बनाए रखता है, जैसा कि11 को कतरने के बाद जेल वैद्युतकणसंचलन से स्पष्ट होता है।
चित्रा 1 बी से, संतृप्त प्रतिदीप्ति 9724 एस -1 से 97245 एस -1 तक कतरनी दर के साथ बढ़ी। पठार प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम कतरनी दर को प्लॉट करने के बाद, प्रतिदीप्ति तीव्रता 97245 एस -1 से ऊपर कतरनी दर पर अब और नहीं बढ़ी, यह सुझाव देते हुए कि कतरनी दर (97245 एस -1) द्वारा आपूर्ति की गई संबंधित कतरनी बल पहले से ही आई-मोटिफ को प्रकट करने के लिए आवश्यक बल से अधिक था। इसलिए, 97245 एस -1 पर पठार प्रतिदीप्ति तीव्रता को किसी भी कतरनी दर 11 पर अनफोल्डेड आई-मोटिफ के प्रतिशत की गणना करने के लिए एक संदर्भ बिंदु (यानी,100% प्रकटन के अनुरूप) के रूप में लिया गया था। चित्रा 1 सी एक विशेष कतरनी दर पर टेलोमेरिक आई-मोटिफ पर उत्पन्न कतरनी बल को दर्शाता है। कतरनी बल और कतरनी दर के बीच संबंध स्थापित करने के लिए, ऑप्टिकल ट्वीज़र्स में एक ही टेलोमेरिक आई-मोटिफ संरचना का यांत्रिक प्रकटीकरण किया गया था, और ऑप्टिकल ट्वीज़र्सप्रयोगों 11 में आई-मोटिफ के प्रकट बल हिस्टोग्राम के आधार पर आई-मोटिफ बनाम बल के प्रकटहोने वाले प्रतिशत का एक संचयी प्लॉट प्लॉट किया गया था। . विभिन्न डीएनए संरचनाओं के लिए, ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग करके बल अंशांकन की सिफारिश की जाती है। इस धारणा के आधार पर कि अनफोल्डेड आई-मोटिफ का प्रतिशत लेजर चिमटी-आधारित यांत्रिक प्रकटीकरण और एक विशेष बल पर कतरनी बल-आधारित प्रकटीकरण के बराबर है (यानी, यह देखते हुए कि आई-मोटिफ द्वारा अनुभव किए गए बल की दिशा इन दो विधियों में समान है, जो दो डीएनए हैंडल [ओवरहैंग्स] के विस्तारित अक्ष के साथ है), हमने कतरनी बल बनाम कतरनी दर को कैलिब्रेट किया।
यद्यपि होमोजेनाइज़र उपकरण किसी भी प्रयोगशाला में आसानी से सुलभ हैं, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें देखभाल के साथ किया जाना चाहिए। सबसे पहले, सटीक प्रतिदीप्ति मूल्यों का पता लगाने के लिए, रोटर और स्टेटर के बीच प्रकाश का पथ सेट किया जाना चाहिए। दूसरे, इस प्रोटोकॉल के चरणों के अनुसार कतरन प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय, प्रयोग से पहले प्रतिदीप्ति की जांच करना महत्वपूर्ण है। पूरे सेटअप को अच्छी तरह से साफ करके उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता को कम करना आवश्यक है, विशेष रूप से होमोजेनाइज़र टिप और प्रतिक्रिया कक्ष। आवारा प्रकाश को और कम करने के लिए प्रयोग एक अंधेरे कमरे में किया जाना चाहिए।
ईएफएस तकनीक के सबसे महत्वपूर्ण लाभों में से एक प्रोटीन, आरएनए और डीएनए संरचनाओं सहित बायोमोलेक्यूलर संरचनाओं के एक समूह के यांत्रिक प्रकटीकरण के लिए इसकी लचीलापन और बहुमुखी प्रतिभा है। परंपरागत रूप से, यांत्रिक प्रकटीकरण प्रयोगों के लिए जटिल प्रयोगात्मक सेटअप की आवश्यकता होती है। ईएफएस का लाभ यह है कि यह बहुत कम लागत के साथ उपकरण डिजाइन में जटिलता को कम करता है। यद्यपि ईएफएस एकल-अणु तकनीकों की तुलना में कम समय में उच्च थ्रूपुट प्रयोग कर सकता है, कुछ सीमाएं हैं, जिनमें यह तथ्य शामिल है कि बल परिमाण आणविक संरचना के आकार से निर्धारित होता है। इसके अलावा, पता लगाए गए अणु के फ्लोरोसेंट लेबलिंग की आवश्यकता होती है। बड़े कतरनी बलों को प्राप्त करने के लिए, रुचि के अणु के लिए कतरन हैंडल का लगाव आवश्यक हो सकता है। भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए, कतरनी बल-आधारित ईएफएस का उपयोग संभावित रूप से विभिन्न मेकेनोकेमिकल घटनाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिसमें रासायनिक प्रतिक्रियाएं, जैसे विश्लेषण मान्यता15 और सिंथेटिक पॉलिमर का पोलीमराइजेशन, यांत्रिक बलों से प्रभावित होते हैं।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध कार्य को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन [सीबीईटी-1904921] और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [एनआईएच आर 01 सीए 236350] द्वारा एचएम तक समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
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