Summary
La spettroscopia di forza d'insieme (EFS) è una tecnica robusta per lo sviluppo meccanico e il rilevamento in tempo reale di un insieme di strutture biomolecolari in campi biofisici e biosensibili.
Abstract
Le tecniche a singola molecola basate sulla fluorescenza e sui principi meccanochimici forniscono una sensibilità superiore nel rilevamento biologico. Tuttavia, a causa della mancanza di elevate capacità di produttività, l'applicazione di queste tecniche è limitata in biofisica. La spettroscopia di forza d'insieme (EFS) ha dimostrato un elevato rendimento nello studio di un massiccio insieme di strutture molecolari convertendo gli studi meccanochimici delle singole molecole in quelli degli insiemi molecolari. In questo protocollo, le strutture secondarie del DNA (i-motivi) sono state spiegate nel flusso di taglio tra il rotore e lo statore di una punta omogeneizzatore a velocità di taglio fino a 77796/s. Sono stati dimostrati gli effetti delle portate e delle dimensioni molecolari sulle forze di taglio sperimentate dall'i-motif. La tecnica EFS ha anche rivelato l'affinità di legame tra i motivi del DNA e i ligandi. Inoltre, abbiamo dimostrato una reazione chimica del clic che può essere azionata dalla forza di taglio (cioè la chimica meccano-clic). Questi risultati stabiliscono l'efficacia dell'uso della forza di taglio per controllare la conformazione delle strutture molecolari.
Introduction
Nella spettroscopia di forza a singola molecola1 (SMFS), le proprietà meccaniche delle singole strutture molecolari sono state studiate da strumenti sofisticati come il microscopio a forza atomica, le pinzette ottiche e le pinzette magnetiche 2,3,4. Limitato dallo stesso requisito di direzionalità delle molecole nelle configurazioni di generazione/rilevamento della forza o dal piccolo campo visivo nelle pinzette magnetiche e nel microscopio a forza centrifuga miniaturizzato (MCF)5,6,7,8, solo un numero limitato di molecole può essere studiato simultaneamente utilizzando SMFS. Il basso rendimento di SMFS impedisce la sua ampia applicazione nel campo del riconoscimento molecolare, che richiede il coinvolgimento di un ampio insieme di molecole.
Il flusso di taglio fornisce una potenziale soluzione per applicare forze a un massiccio insieme di molecole9. In un flusso di liquido all'interno di un canale, più vicino alla superficie del canale, più lenta è la portata10. Tale gradiente di velocità del flusso causa sollecitazioni di taglio parallele alla superficie limite. Quando una molecola viene posizionata in questo flusso di taglio, la molecola si riorienta in modo che il suo asse lungo si allinei con la direzione del flusso, poiché la forza di taglio viene applicata all'asse lungo11. Come risultato di questo riorientamento, ci si aspetta che tutte le molecole dello stesso tipo (dimensioni e lunghezza delle maniglie) si allineino nella stessa direzione mentre sperimentano la stessa forza di taglio.
Questo lavoro descrive un protocollo per utilizzare un tale flusso di taglio per esercitare una forza di taglio su un massiccio insieme di strutture molecolari, come esemplificato dal motivo del DNA. In questo protocollo, viene generato un flusso di taglio tra il rotore e lo statore in una punta omogeneizzatore. Il presente studio ha scoperto che la struttura ripiegata del DNA i-motif potrebbe essere spiegata da velocità di taglio di 9724-97245 s-1. Inoltre, è stata trovata una costante di dissociazione di 36 μM tra il ligando L2H2-4OTD e il motivo i. Questo valore è coerente con quello di 31 μM misurato dal saggio di spostamento del gel12. Inoltre, la tecnica corrente viene utilizzata per dispiegare il motivo i, che può esporre il rame chelato (I) per catalizzare una reazione di clic. Questo protocollo consente quindi di dispiegare un ampio set di strutture i-motif con strumenti a basso costo in un tempo ragionevole (inferiore a 30 min). Dato che la tecnica della forza di taglio aumenta drasticamente il throughput della spettroscopia di forza, chiamiamo questa tecnica spettroscopia di forza d'insieme (EFS). Questo protocollo mira a fornire linee guida sperimentali per facilitare l'applicazione di questo EFS basato sulla forza di taglio.
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Protocol
NOTA: Tutti i tamponi e i reagenti chimici utilizzati in questo protocollo sono elencati nella tabella Materiali.
1. Preparazione del microscopio a forza di taglio
NOTA: Il microscopio a forza di taglio contiene due parti, un'unità di reazione (omogeneizzatore) e un'unità di rilevamento (microscopio a fluorescenza). L'ingrandimento dell'oculare è 10x e l'ingrandimento della lente dell'obiettivo (aria) è 4x.
- Assemblare l'omogeneizzatore e il microscopio su un tavolo di montaggio. Indossare occhiali e accendere il microscopio a fluorescenza, quindi regolare l'omogeneizzatore per assicurarsi che il fascio di luce di eccitazione di una lunghezza d'onda appropriata (qui, è stato utilizzato 488 nm) passi attraverso il centro della punta di dispersione dell'omogeneizzatore.
- Preparare una camera di reazione a fondo piatto di 5 cm di altezza e 1,5 cm 2 x 1,5 cm2 di sezione trasversale. Per ridurre lo sfondo, assicurarsi che il materiale della camera selezionato non fluoresce, come gli occhiali (alcune materie plastiche hanno fluorescenza).
- Scegliere una punta di dispersione omogeneizzatore appropriata in grado di fornire la forza di taglio desiderata.
NOTA: la velocità di taglio dipende dalla distanza tra il rotore e lo statore a una velocità di rotazione fissa11 secondo la seguente equazione:
dove μ è la viscosità dinamica dell'acqua a 20 °C; D è il diametro interno dello statore; d è il diametro esterno del rotore e V è la velocità di taglio (rpm/s). - Bloccare la camera di reazione sullo stadio del campione del microscopio a fluorescenza, quindi regolare la camera per contenere la punta disperdente dell'omogeneizzatore (Figura 1). Assicurarsi che la punta di dispersione sia leggermente al di sopra (~1 mm) della superficie inferiore della camera di reazione.
- Regolare la posizione verticale dell'omogeneizzatore e della camera insieme per assicurarsi che la messa a fuoco del microscopio sia sulla superficie della punta disperdente. Quindi, regolare la posizione orizzontale della punta di dispersione per assicurarsi che l'area di rilevamento (campo visivo) sia impostata tra il rotore e lo statore (Figura 1).
- Accendere i canali di fluorescenza in base al colorante fluorescente utilizzato nell'esperimento.
- Prima dell'esperimento di taglio ad alta velocità, utilizzare acqua deionizzata (DI) per testare la cesoiatura con una bassa velocità di taglio (ad esempio, 2.000 giri / min) per garantire che la punta di dispersione possa funzionare in modo appropriato senza toccare la camera di reazione.
2. Spiegamento di i-motivi con e senza ligandi
- Preparare un DNA i-motif telomerico umano (Table of Materials) etichettato con un colorante e un quencher alle sue due estremità, rispettivamente, in acqua DI, come descritto in Hu et al.11.
NOTA: i-motivo contenente sequenza: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA. - Diluire il DNA a 5 μM nel tampone MES da 30 mM a pH 5,5 o pH 7,4. Alla soluzione di DNA, aggiungere il ligando L2H2-4OTD, che è stato sintetizzato secondo Abraham Punnoose et al.13, in un intervallo di concentrazione di 0-60 μM. Mescolare delicatamente la soluzione per 10 minuti per piegare le strutture i-motif senza luce.
- Controllare e ridurre al minimo l'intensità della fluorescenza di fondo della camera di reazione riempita con acqua DI deionizzata utilizzando il microscopio fluorescente senza cesoiatura. Un modo semplice per ridurre al minimo la fluorescenza di fondo è lavare la camera di reazione con acqua DI. Il valore di fluorescenza di fondo deve essere sottratto nelle analisi dei dati in un secondo momento.
NOTA: la luce diffusa dovrebbe essere evitata da questo passaggio in poi. - Impostare i parametri della telecamera CCD utilizzando il software. I parametri consigliati sono i seguenti: tempo di esposizione = 0,5 s, sensibilità CCD = 1600 e tempo di registrazione = 20 min.
- Utilizzando un pipet lungo, aggiungere la soluzione di DNA nella camera di reazione vuota e pulita. Coprire la camera di reazione con una scatola nera. Quindi, avviare l'omogeneizzatore per eseguire la cesoiatura a una velocità di taglio selezionata compresa tra 9.724 s-1 e 97.245 s-1 (selezionata utilizzando il software associato all'omogeneizzatore) per 20 minuti con la telecamera CCD accesa per registrare i dati.
- Dopo l'esperimento, rimuovere la camera e lavarla con acqua DI.
3. Reazione del clic azionata dalla forza di taglio
- Preparare il DNA i-motif in acqua DI. Incubare 10 μM di DNA i-motif in 300 μL di tampone Tris da 30 mM (pH 7,4) integrato con 150 μM di CuCl e 300 μM di acido ascorbico per 10 minuti per piegare le strutture i-motif (tutte le concentrazioni sono concentrazioni finali nella soluzione).
NOTA: CuCl è il catalizzatore della reazione del clic. L'acido ascorbico impedirà l'ossidazione del rame (I). - Ultrafiltrare la soluzione con un dispositivo di ultrafiltrazione con una forza centrifuga di 14.300 x g. Reintegrare la soluzione a ~500 μL con 30 mM di tampone Tris (pH 7,4) integrato con acido ascorbico 300 μM dopo ogni filtrazione.
- Ripetere la filtrazione 3x.
- Raccogliere la soluzione residua e ottenere un volume finale di 300 μL aggiungendo 30 mM Tris (pH 7,4) integrati con 300 μM di acido ascorbico insieme a 20 μM di Calfluor 488 azide, 20 μM HPG e 10 μM TBTA. Una volta aggiunti i reagenti, spostare la soluzione nella camera oscura.
NOTA: la luce deve essere evitata dopo questo passaggio. - Controllare e ridurre al minimo l'intensità della fluorescenza di fondo della camera di reazione riempita con acqua DI usando il microscopio prima degli esperimenti di taglio. Un modo semplice per ridurre al minimo la fluorescenza di fondo è lavare la camera di reazione con acqua DI.
- Aggiungere la soluzione di DNA nella camera di reazione vuota con un pipet lungo, quindi avviare la cesoiatura dell'omogeneizzatore a una velocità di taglio di 63.209 s−1 per 20 minuti con la telecamera CCD accesa.
- Dopo l'esperimento, rimuovere la camera e lavarla con acqua DI.
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Representative Results
La Figura 1 illustra lo sviluppo meccanico e il rilevamento in tempo reale delle molecole dell'insieme in EFS. Nella Figura 1B, è stato osservato che l'intensità di fluorescenza del DNA i-motif aumenta con la velocità di taglio che varia da 9.724 s-1 a 97.245 s-1 in un tampone MES a pH 5,5. Come controllo, l'intensità della fluorescenza non è aumentata quando lo stesso DNA i-motif è stato tagliato ad una velocità di 63.209 s-1 in un tampone MES a pH 7,4. Questo perché l'i-motif non si piega a pH 7,414. Nel lavoro precedente, abbiamo scoperto che maggiore è la velocità di taglio, maggiore è lo sviluppo dell'i-motif11. Sulla base dello spiegamento del motivo i nelle pinzette ottiche 11, abbiamo calibrato la forza di taglio rispetto alla velocità di taglio come mostrato nella Figura 1C, che ha raffigurato che fino a41 pN potevano essere applicati alla coppia di FRET etichettata i-motif a una velocità di taglio di 77.796 s-1. Nella Figura 2B, è stato valutato il ligando (L2H2-4OTD) che si lega alle molecole di DNA i-motif sottoposte al flusso di taglio, che ha mostrato che l'incremento dell'intensità di fluorescenza è diventato meno evidente con l'aumentare della concentrazione di L2H2-4OTD (0-60 μM). Dalla curva di legame (cioè un grafico delle frazioni legate del ligando rispetto alla concentrazione del ligando libero) nella Figura 2C, è stata determinata una costante di dissociazione (Kd) di 36 μM per l'interazione tra il ligando L2H2-4OTD e l'i-motif11. Come applicazione pratica della forza di taglio per le reazioni chimiche, la Figura 3 mostra una reazione meccano-clic che può essere innescata dal flusso di taglio. Nella Figura 3B, il motivo i chelato Cu(I) è stato spiegato alla velocità di taglio di 63.209 s−1 e il rame rilasciato (I) ha innescato la reazione di clic fluorogenica mostrata nella Figura 3A, con conseguente aumento dell'intensità della fluorescenza nel tempo (Figura 3C).
Figura 1: Dispiegamento della struttura del DNA i-motif mediante flusso di taglio nell'EFS. (A) Schema dello sviluppo di una struttura di DNA i-motif marcata con una coppia FRET (Cy5 e quencher) mediante il flusso di taglio generato in un omogeneizzatore da banco. Inserto sinistro: il marrone chiaro indica lo statore e il marrone scuro indica il rotore. Inserto destro: il cerchio ciano tratteggiato tra il rotore e lo statore indica il flusso tampone in condizioni di taglio. La freccia circolare marrone scuro indica la direzione del rotore. Le frecce ciano nella visualizzazione ingrandita dell'inserto destro indicano il flusso del buffer sotto l'inclinazione. La lunghezza di ogni freccia rappresenta la velocità di un particolare flusso di flusso (frecce più lunghe indicano velocità più elevate). (B) La variazione percentuale dell'intensità di fluorescenza nel rilevamento in tempo reale è dovuta allo sviluppo del motivo i a diverse velocità di taglio da 9.724 s−1 a 97.245 s−1. Le curve solide indicano il raccordo esponenziale. L'intensità della fluorescenza è normalizzata rispetto al valore massimo osservato nell'esperimento. (C) Diagramma della velocità di taglio rispetto alla forza di taglio per il motivo i mostrato in (A). La linea rossa raffigura un raccordo lineare (R2 = 1,00). Questa cifra è stata modificata da Hu et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Spiegamento di i-motivi legati con leganti . (A) Schema del motivo i marcato con una coppia FRET (Cy5 e quencher) legata con il ligando L2H2-4OTD13. (B) La diminuzione dell'intensità di fluorescenza del motivo i con concentrazioni crescenti del ligando L2H2-4OTD (rosa: 0 μM, verde: 6 μM, ciano: 30 μM, grigio: 36 μM, nero: 45 μM e marrone chiaro: 60 μM). L'intensità della fluorescenza è normalizzata rispetto al valore massimo osservato nell'esperimento. (C) Curva di legame dell'i-motif a diverse concentrazioni libere di L2H2-4OTD. Questa cifra è stata modificata da Hu et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Reazioni meccano-clic . (A) Reazione a clic fluorogenica tra Calfluor 488 e HPG. Il composto mostrato in verde è il prodotto di reazione fluorescente. (B) La struttura del DNA i-motif chelata con rame (I) a pH 7,4 è stata filtrata per rimuovere il rame (I) non legato nella soluzione. Il motivo i chelato con rame (I) è stato spiegato mediante flusso di taglio in EFS. Il rame rilasciato (I) ha catalizzato la reazione di clic fluorogenica, che è stata mostrata nei tubi capillari (in basso a destra). (C) Aumento percentuale dell'intensità di fluorescenza della reazione di clic ad una velocità di taglio di 63.209 s−1 per 20 minuti. La curva scura indica l'adattamento dell'intensità di fluorescenza da una reazione di controllo senza DNA. La curva verde rappresenta il raccordo esponenziale. L'intensità della fluorescenza è normalizzata rispetto al valore massimo osservato nell'esperimento. Questa cifra è stata modificata da Hu et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il protocollo descritto in questo manoscritto consente di studiare in tempo reale lo sviluppo di un insieme di strutture biomolecolari mediante forza di taglio. I risultati qui presentati sottolineano che le strutture del DNA i-motif possono essere spiegate dalla forza di taglio. Lo sviluppo del motivo i-legato al ligando e le reazioni a scatto azionate dalla forza di taglio sono state applicazioni proof-of-concept per questo metodo di spettroscopia a forza d'insieme.
La Figura 1 presenta la configurazione dello strumento. La punta del generatore omogeneizzatore e la camera di reazione non devono entrare in contatto tra loro, il che è fondamentale per consentire un flusso di taglio stabile tra il rotore e lo statore senza formazione di bolle. Per la punta dell'omogeneizzatore commerciale, è meglio sceglierne uno con un foro d'aria per ridurre la formazione di bolle. Inoltre, la dimensione della camera di reazione non dovrebbe essere troppo grande, poiché una camera grande richiede più soluzione campione. Al contrario, è necessaria una certa altezza della camera di taglio per coprire il corpo principale della punta dell'omogeneizzatore. Per ridurre l'errore sistematico, si suggerisce di mantenere lo stesso allineamento nella configurazione per eseguire tutti gli esperimenti pertinenti. È importante sottolineare che il DNA mantiene l'integrità, come evidenziato dall'elettroforesi su gel dopo la tosatura11.
Dalla Figura 1B, la fluorescenza saturante è aumentata con la velocità di taglio che va da 9724 s−1 a 97245 s−1. Dopo aver tracciato l'intensità di fluorescenza del plateau rispetto alla velocità di taglio, l'intensità di fluorescenza non è più aumentata alla velocità di taglio superiore a 97245 s−1, suggerendo che la forza di taglio associata fornita dalla velocità di taglio (97245 s−1) era già superiore alla forza richiesta per dispiegare l'i-motivo. Pertanto, l'intensità di fluorescenza del plateau a 97245 s−1 è stata presa come punto di riferimento (cioè, corrispondente al 100% di dispiegamento) per calcolare la percentuale di i-motif dispiegato a qualsiasi velocità di taglio11. La figura 1C mostra la forza di taglio generata sul motivo i telomerico ad una particolare velocità di taglio. Per stabilire la relazione tra la forza di taglio e la velocità di taglio, è stato eseguito uno spiegamento meccanico della stessa struttura telomerica del motivo i-motif in pinzette ottiche e un grafico cumulativo della percentuale di dispiegamento del motivo i rispetto alla forza è stato tracciato in base all'istogramma della forza di dispiegamento del motivo i negli esperimenti sulle pinzette ottiche11 . Per diverse strutture del DNA, si raccomanda la calibrazione della forza utilizzando pinzette ottiche. Partendo dal presupposto che le percentuali di i-motif spiegati siano equivalenti tra lo spiegamento meccanico basato su pinzette laser e lo svolgimento basato sulla forza di taglio a una particolare forza (cioè, dato che la direzione della forza sperimentata dal motivo i è simile in questi due metodi, che è lungo l'asse allungato delle due maniglie del DNA [sporgenze]), abbiamo calibrato la forza di taglio rispetto alla velocità di taglio.
Sebbene gli strumenti omogeneizzatori siano facilmente accessibili in qualsiasi laboratorio, ci sono alcuni passaggi chiave che dovrebbero essere eseguiti con cura. In primo luogo, per rilevare valori di fluorescenza accurati, il percorso della luce deve essere impostato tra il rotore e lo statore. In secondo luogo, quando si eseguono gli esperimenti di taglio secondo i passaggi di questo protocollo, è importante controllare la fluorescenza prima dell'esperimento. È necessario ridurre l'elevata intensità della fluorescenza di fondo pulendo bene l'intera configurazione, in particolare la punta dell'omogeneizzatore e la camera di reazione. L'esperimento dovrebbe essere eseguito in una stanza buia per ridurre ulteriormente la luce diffusa.
Uno dei vantaggi più significativi della tecnica EFS è la sua flessibilità e versatilità per lo sviluppo meccanico di un insieme di strutture biomolecolari, tra cui strutture proteiche, RNA e DNA. Tradizionalmente, gli esperimenti di dispiegamento meccanico di ensemble richiedono complesse configurazioni sperimentali. Il vantaggio di EFS è che riduce la complessità nella progettazione dello strumento, con costi molto ridotti. Sebbene EFS possa eseguire esperimenti ad alto rendimento in un tempo più breve rispetto alle tecniche a singola molecola, ci sono alcune limitazioni, che includono il fatto che la grandezza della forza è determinata dalla dimensione della struttura molecolare. Inoltre, è necessaria l'etichettatura fluorescente della molecola rilevata. Per ottenere forze di taglio maggiori, può diventare necessario l'attacco delle maniglie di taglio alla molecola di interesse. Per applicazioni future, l'EFS basato sulla forza di taglio può essere potenzialmente utilizzato per studiare vari fenomeni meccanochimici in cui le reazioni chimiche, come il riconoscimento degli analiti15 e la polimerizzazione di polimeri sintetici, sono influenzate da forze meccaniche.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla National Science Foundation [CBET-1904921] e dal National Institutes of Health [NIH R01CA236350] a H. M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
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