Summary
앙상블 힘 분광법(EFS)은 생물물리학 및 생물감지 분야에서 생체 분자 구조의 앙상블 세트의 기계적 풀림 및 실시간 감지를 위한 강력한 기술입니다.
Abstract
형광 및 기계화학적 원리에 기반한 단일 분자 기술은 생물학적 감지에서 우수한 감도를 제공합니다. 그러나 높은 처리량 기능이 없기 때문에 이러한 기술의 적용은 생물 물리학에서 제한적입니다. 앙상블 힘 분광법(EFS)은 개별 분자의 기계화학적 연구를 분자 앙상블의 연구로 변환하여 방대한 분자 구조 세트의 조사에서 높은 처리량을 입증했습니다. 이 프로토콜에서 DNA 2차 구조(i-모티프)는 최대 77796/s의 전단 속도로 균질화기 팁의 회전자와 고정자 사이의 전단 흐름에서 펼쳐졌습니다. 유속과 분자 크기가 i-모티프가 경험하는 전단력에 미치는 영향이 입증되었습니다. EFS 기술은 또한 DNA i- 모티프와 리간드 사이의 결합 친화도를 밝혀 냈습니다. 또한, 우리는 전단력(즉, 기계-클릭 화학)에 의해 작동될 수 있는 클릭 화학 반응을 시연했습니다. 이러한 결과는 분자 구조의 형태를 제어하기 위해 전단력을 사용하는 효과를 입증합니다.
Introduction
단일 분자 힘 분광법1(SMFS)에서 개별 분자 구조의 기계적 특성은 원자력 현미경, 광학 핀셋 및 자기 핀셋 2,3,4와 같은 정교한 도구에 의해 연구되었습니다. 힘 생성/검출 설정에서 분자의 동일한 방향성 요구 사항 또는 자기 핀셋 및 소형 원심분리기 힘 현미경(MCF)5,6,7,8의 작은 시야로 인해 제한되므로 SMFS를 사용하여 제한된 수의 분자만 동시에 조사할 수 있습니다. SMFS의 낮은 처리량은 많은 분자 세트의 개입을 필요로하는 분자 인식 분야에서의 광범위한 적용을 방해합니다.
전단 흐름은 거대한 분자 세트에 힘을 가하는 잠재적 솔루션을 제공합니다9. 채널 내부의 액체 흐름에서, 채널 표면에 가까울수록, 유량(10)은 느려진다. 이러한 유속 구배는 경계 표면에 평행한 전단 응력을 유발합니다. 분자가 이 전단 흐름에 배치될 때, 전단력이 장축(11)에 가해짐에 따라, 분자는 그 장축이 유동 방향과 정렬되도록 스스로 방향을 바꾼다. 이러한 방향 변경의 결과로 동일한 유형(핸들의 크기 및 길이)의 모든 분자가 동일한 전단력을 경험하면서 동일한 방향으로 정렬될 것으로 예상됩니다.
이 작업은 DNA i- 모티프에 의해 예시 된 바와 같이 거대한 분자 구조 세트에 전단력을 가하기 위해 이러한 전단 흐름을 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에서는 균질화기 팁에서 회전자와 고정자 사이에 전단 흐름이 생성됩니다. 본 연구는 접힌 DNA i- 모티프 구조가 9724-97245 s-1의 전단 속도에 의해 펼쳐질 수 있음을 발견했다. 게다가, L2H2-4OTD 리간드와 i-모티프 사이에 36μM의 해리 상수가 발견되었다. 이 값은 겔 시프트 분석12에 의해 측정된 31 μM의 값과 일치한다. 또한, 현재 기술은 클릭 반응을 촉매하기 위해 킬레이트화된 구리(I)를 노출시킬 수 있는 i-모티프를 전개하는데 사용된다. 따라서 이 프로토콜을 사용하면 합리적인 시간(30분 미만)에 저비용 악기를 사용하여 대규모 i-motif 구조 세트를 펼칠 수 있습니다. 전단력 기술이 힘 분광법의 처리량을 크게 증가시킨다는 점을 감안할 때 이 기술을 앙상블 힘 분광법(EFS)이라고 합니다. 이 프로토콜은 이 전단력 기반 EFS의 적용을 용이하게 하기 위한 실험 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.
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Protocol
참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 완충액과 화학 시약은 표 재료에 나열되어 있습니다.
1. 전단력 현미경의 제조
참고: 전단력 현미경은 반응 장치(균질화기)와 검출 장치(형광 현미경)의 두 부분으로 구성됩니다. 접안 렌즈의 배율은 10 배이고 대물 렌즈 (공기)의 배율은 4 배입니다.
- 균질화기와 현미경을 장착 테이블에 조립합니다. 고글을 착용하고 형광 현미경을 켠 다음 균질화를 조정하여 적절한 파장(여기서는 488nm가 사용됨)의 여기 광선이 균질화기의 분산 팁 중심을 통과하는지 확인합니다.
- 높이가 5cm이고 단면적이 1.5cm2 x 1.5cm2인 평평한 바닥 반응 챔버를 준비합니다. 배경을 줄이려면 선택한 챔버 재료가 유리와 같이 형광을 발하지 않는지 확인하십시오 (일부 플라스틱에는 형광이 있음).
- 원하는 전단력을 제공할 수 있는 적절한 균질화기 분산 팁을 선택하십시오.
참고: 전단 속도는 다음 방정식에 따라 고정 회전 속도11 에서 회전자와 고정자 사이의 거리에 따라 달라집니다.
여기서 μ 는 20 °C에서 물의 동적 점도입니다. D 는 고정자의 내경입니다. d 는 로터의 외경이고 V 는 전단 속도(rpm/s)입니다. - 형광 현미경의 샘플 스테이지에 반응 챔버를 고정한 다음 균질화기의 분산 팁을 고정하도록 챔버를 조정합니다(그림 1). 분산 팁이 반응 챔버의 바닥 표면보다 약간 위(~1mm)에 있는지 확인하십시오.
- 균질화기와 챔버의 수직 위치를 함께 조정하여 현미경의 초점이 분산 팁의 표면에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 분산 팁의 수평 위치를 조정하여 회전자와 고정자 사이에 감지 영역(시야)이 설정되었는지 확인합니다(그림 1).
- 실험에 사용된 형광 염료에 따라 형광 채널을 켭니다.
- 고속 전단 실험 전에 탈이온수(DI)를 사용하여 낮은 전단 속도(예: 2,000rpm)로 전단을 테스트하여 분산 팁이 반응 챔버를 건드리지 않고 적절하게 작동할 수 있는지 확인합니다.
2. 리간드가 있거나 없는 i-모티프 전개
- Hu et al.11에 기재된 바와 같이, DI 물에서 각각 그의 두 말단에 염료 및 소광제로 표지된 인간 텔로미어 i-모티프 DNA(물질 표)를 준비한다.
참고: 서열을 포함하는 i-모티프: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA. - DNA를 pH 5.5 또는 pH 7.4에서 30 mM MES 완충액에서 5 μM으로 희석한다. DNA 용액에, 0-60 μM의 농도 범위에서 Abraham Punnoose et al.13에 따라 합성된 리간드 L2H2-4OTD를 첨가한다. 용액을 10분 동안 부드럽게 혼합하여 빛이 없는 i-motif 구조를 접습니다.
- 탈이온수로 채워진 반응 챔버의 배경 형광 강도를 전단 없이 형광 현미경을 사용하여 확인하고 최소화합니다. 배경 형광을 최소화하는 쉬운 방법은 반응 챔버를 DI 물로 세척하는 것입니다. 배경 형광 값은 나중에 데이터 분석에서 빼야 합니다.
알림: 이 단계부터 미광은 피해야 합니다. - 소프트웨어를 사용하여 CCD 카메라의 매개 변수를 설정합니다. 권장 파라미터는 노출 시간 = 0.5초, CCD 감도 = 1600, 녹화 시간 = 20분입니다.
- 긴 피펫을 사용하여 DNA 용액을 비어 있고 깨끗한 반응 챔버에 추가합니다. 반응 챔버를 블랙 박스로 덮으십시오. 그런 다음 균질기를 시작하여 데이터를 기록하기 위해 CCD 카메라를 켠 상태에서 20분 동안 9,724s-1에서 97,245s-1(균질화기와 관련된 소프트웨어를 사용하여 선택됨) 범위의 선택된 전단 속도로 전단을 수행합니다.
- 실험 후, 챔버를 제거하고 DI 물로 세척한다.
3. 전단력 작동 클릭 반응
- DI 물에서 i-모티프 DNA를 준비합니다. 150μM CuCl 및 300μM 아스코르브산이 보충된 300μL 트리스 완충액(pH 7.4)에 10μM i-모티프 DNA를 10분 동안 배양하여 i-모티프 구조를 접습니다(모든 농도는 용액 중 최종 농도임).
참고: CuCl은 클릭 반응의 촉매입니다. 아스 코르 빈산은 구리 (I) 산화를 방지합니다. - 한외여과 장치로 용액을 14,300 x g의 원심력으로 초여과한다. 각 여과 후 300μM 아스코르브산이 보충된 30mM 트리스 완충액(pH 7.4)으로 용액을 ~500μL까지 보충합니다.
- 여과를 3 회 반복하십시오.
- 잔류 용액을 수집하고 20μM 칼플루오르 488 아지드, 20μM HPG 및 10μM TBTA와 함께 300μM 아스코르브산이 보충된 30mM 트리스(pH 7.4)를 추가하여 300μL의 최종 부피를 만듭니다. 시약이 추가되면 용액을 암실로 옮깁니다.
알림: 이 단계 후에는 표시등을 피해야 합니다. - 전단 실험 전에 현미경을 사용하여 DI 물로 채워진 반응 챔버의 배경 형광 강도를 확인하고 최소화합니다. 배경 형광을 최소화하는 쉬운 방법은 반응 챔버를 DI 물로 세척하는 것입니다.
- DNA 용액을 긴 피펫으로 빈 반응 챔버에 넣은 다음 CCD 카메라를 켠 상태에서 20분 동안 63,209s-1의 전단 속도로 균질화기 전단을 시작합니다.
- 실험 후, 챔버를 제거하고 DI 물로 세척한다.
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Representative Results
그림 1은 EFS에서 앙상블 분자의 기계적 풀림 및 실시간 감지를 간략하게 설명합니다. 도 1B에서, i-모티프 DNA의 형광 강도는 pH 5.5 MES 완충액에서 9,724 s-1 내지 97,245 s-1 범위의 전단 속도에 따라 증가하는 것으로 관찰되었다. 대조군으로서, 동일한 i-모티프 DNA를 pH 7.4 MES 완충액에서 63,209 s-1의 속도로 전단했을 때 형광 강도는 증가하지 않았다. 이는 i-모티프가 pH 7.414에서 접히지 않기 때문이다. 이전 연구에서 우리는 전단 속도가 높을수록 i- 모티프11의 전개가 더 많다는 것을 발견했습니다. 광학 핀셋(11)에서 i-모티프의 전개에 기초하여, 우리는 그림 1C에 도시된 바와 같이 전단력 대 전단 속도를 교정하였는데, 이는 77,796 s-1의 전단 속도에서 i-모티프에 최대41 pN이 적용될 수 있음을 도시하였다. 도 2B에서, 전단 유동을 거친 DNA i-모티프 분자에 결합하는 리간드(L2H2-4OTD)를 평가한 결과, L2H2-4OTD 농도(0-60μM)가 증가함에 따라 형광 강도의 증가가 덜 분명해지는 것으로 나타났다. 도 2C의 결합 곡선 (즉, 리간드의 결합 분획 대 유리 리간드 농도의 플롯)으로부터, L2H2-4OTD 리간드와 i-모티프 사이의 상호작용에 대해 36μM의 해리 상수 (Kd)가 결정되었다11. 화학 반응에 대한 전단력의 실제 적용으로서 그림 3은 전단 흐름에 의해 유발될 수 있는 기계-클릭 반응을 보여줍니다. 그림 3B에서 Cu(I) 킬레이트화된 i-모티프는 63,209s-1 전단 속도로 펼쳐졌고, 방출된 구리(I)는 그림 3A에 표시된 형광 클릭 반응을 촉발하여 시간이 지남에 따라 형광 강도가 증가했습니다(그림 3C).
그림 1: EFS에서 전단 흐름에 의한 i-모티프 DNA 구조의 전개. (A) 벤치탑 균질기에서 생성된 전단 흐름에 의한 FRET 쌍(Cy5 및 소광제)으로 표지된 i-모티프 DNA 구조의 전개 개략도. 왼쪽 삽입 : 밝은 갈색은 고정자를 나타내고 어두운 갈색은 회 전자를 나타냅니다. 오른쪽 삽입: 회전자와 고정자 사이의 점선 청록색 원은 전단 조건에서의 버퍼 흐름을 나타냅니다. 짙은 갈색 원형 화살표는 로터의 방향을 나타냅니다. 오른쪽 삽입물의 확대/축소 보기에 있는 청록색 화살표는 전단 중인 버퍼 흐름을 나타냅니다. 각 화살표의 길이는 특정 흐름 흐름의 속도를 나타냅니다(긴 화살표는 더 높은 속도를 나타냄). (B) 실시간 감지에서 형광 강도의 백분율 변화는 9,724s-1에서 97,245s-1까지의 상이한 전단 속도에서 i-모티프의 전개로 인한 것입니다. 실선 곡선은 지수 피팅을 나타냅니다. 형광 강도는 실험에서 관찰된 최대값에 대하여 정규화된다. (C) (A)에 도시된 i-모티프에 대한 전단율 대 전단력의 다이어그램. 빨간색 선은 선형 피팅(R2 = 1.00)을 나타냅니다. 이 수치는 Hu et al.11에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 리간드로 결합된 i-모티프의 전개. (A) L2H2-4OTD 리간드13과 결합된 FRET 쌍(Cy5 및 소광제)으로 표지된 i-모티프의 개략도. (B) L2H2-4OTD 리간드의 농도 증가에 따른 i-모티프의 형광 강도 감소(분홍색: 0 μM, 녹색: 6 μM, 청록색: 30 μM, 회색: 36 μM, 검은색: 45 μM 및 밝은 갈색: 60 μM). 형광 강도는 실험에서 관찰된 최대값에 대하여 정규화된다. (C) 상이한 자유 L2H2-4OTD 농도에서의 i- 모티프의 결합 곡선. 이 수치는 Hu et al.11에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 기계 클릭 반응. (A) Calfluor 488과 HPG 사이의 형광 발생 클릭 반응. 녹색으로 표시된 화합물은 형광 반응 생성물입니다. (b) pH 7.4에서 구리 (I)로 킬레이트된 i-motif DNA 구조체를 여과하여 용액 중의 결합되지 않은 구리 (I)를 제거하였다. 구리 (I) 킬레이트화된 i-모티프를 EFS 내의 전단 유동에 의해 전개하였다. 방출된 구리 (I)는 플루오로제닉 클릭 반응을 촉매하였고, 이는 모세관(우측 하단)에 나타내었다. (C) 20분 동안 63,209s-1의 전단 속도에서 클릭 반응의 형광 강도의 백분율 증가. 어두운 곡선은 DNA가 없는 대조군 클릭 반응에서 형광 강도의 피팅을 나타냅니다. 녹색 곡선은 지수 피팅을 나타냅니다. 형광 강도는 실험에서 관찰된 최대값에 대하여 정규화된다. 이 수치는 Hu et al.11에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 원고에 설명 된 프로토콜을 사용하면 전단력에 의한 생체 분자 구조의 앙상블 세트의 전개를 실시간으로 조사 할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 DNA i- 모티프 구조가 전단력에 의해 펼쳐질 수 있음을 강조합니다. 리간드 결합 i-모티프의 풀림과 전단력 작동 클릭 반응은 이 앙상블 힘 분광법의 개념 증명 응용 분야였습니다.
그림 1 은 기기 설정을 보여줍니다. 균질화기 발생기 팁과 반응 챔버는 서로 접촉해서는 안 되며, 이는 기포 형성 없이 회전자와 고정자 사이의 안정적인 전단 흐름을 허용하는 데 중요합니다. 상업용 균질화기 팁의 경우 기포 형성을 줄이기 위해 공기 구멍이 있는 팁을 선택하는 것이 좋습니다. 또한, 큰 챔버는 더 많은 샘플 용액을 필요로하기 때문에 반응 챔버의 크기가 너무 커서는 안됩니다. 반대로, 균질화기 팁의 본체를 덮기 위해 전단 챔버의 특정 높이가 필요합니다. 체계적인 오류를 줄이려면 모든 관련 실험을 수행하기 위해 설정에서 동일한 정렬을 유지하는 것이 좋습니다. DNA가 전단 후 겔 전기 영동에 의해 입증 된 것처럼 무결성을 유지한다는 점을 지적하는 것이 중요합니다11.
그림 1B로부터, 포화 형광은 9724 s-1에서 97245 s-1 범위의 전단 속도로 증가하였다. 고원 형광 강도 대 전단 속도를 플로팅한 후, 형광 강도는 97245 s-1 이상의 전단 속도에서 더 이상 증가하지 않았으며, 이는 전단 속도(97245 s-1)에 의해 공급되는 관련 전단력이 이미 i-모티프를 펼치는 데 필요한 힘보다 높다는 것을 시사합니다. 따라서, 97245 s-1에서의 평원 형광 강도를 기준점(즉, 100% 언폴딩에 해당)으로 취하여 임의의 전단 속도(11)에서 펼쳐진 i-모티프의 백분율을 계산하였다. 도 1C는 특정 전단 속도에서 텔로머 i-모티프에 대해 생성된 전단력을 나타낸다. 전단력과 전단 속도 사이의 관계를 확립하기 위해, 동일한 텔로머 i-모티프 구조의 기계적 풀림이 광학 핀셋에서 수행되었고, 광학 핀셋 실험에서 i-모티프의 풀림 힘 히스토그램에 기초하여 i-모티프 대 힘의 풀림 백분율의 누적 플롯이 플롯되었다11 . 다른 DNA 구조의 경우 광학 핀셋을 사용한 힘 보정을 권장합니다. 펼쳐진 i-모티프의 백분율이 레이저 핀셋 기반 기계적 풀림과 특정 힘에서의 전단력 기반 풀림 간에 동일하다는 가정을 기반으로 (즉, i-모티프가 경험하는 힘의 방향이 두 DNA 핸들[오버행]의 늘어난 축을 따라 있는 이 두 가지 방법에서 유사하다는 점을 감안할 때), 우리는 전단력 대 전단율을 보정했습니다.
균질화기 기기는 모든 실험실에서 쉽게 접근할 수 있지만 주의해서 수행해야 하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 정확한 형광 값을 감지하려면 회전자와 고정자 사이에 빛의 경로를 설정해야 합니다. 둘째, 이 프로토콜의 단계에 따라 전단 실험을 수행할 때, 실험 전에 형광을 확인하는 것이 중요하다. 전체 설정, 특히 균질화기 팁과 반응 챔버를 잘 청소하여 높은 배경 형광 강도를 줄이는 것이 필요합니다. 실험은 미광을 더 줄이기 위해 어두운 방에서 수행해야합니다.
EFS 기술의 가장 중요한 이점 중 하나는 단백질, RNA 및 DNA 구조를 포함한 생체 분자 구조의 앙상블 세트를 기계적으로 펼칠 수 있는 유연성과 다양성입니다. 전통적으로 앙상블 기계적 풀림 실험에는 복잡한 실험 설정이 필요합니다. EFS의 장점은 기기 설계의 복잡성을 줄이고 비용을 크게 절감한다는 것입니다. EFS는 단일 분자 기술에 비해 더 짧은 시간에 고처리량 실험을 수행할 수 있지만 힘 크기가 분자 구조의 크기에 의해 결정된다는 사실을 포함하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 또한, 검출된 분자의 형광 표지가 요구된다. 더 큰 전단력을 얻으려면 전단 핸들을 관심 분자에 부착해야 할 수 있습니다. 미래의 응용을 위해, 전단력 기반 EFS는 분석물 인식(15 ) 및 합성 폴리머의 중합과 같은 화학 반응이 기계적 힘에 의해 영향을 받는 다양한 기계화학적 현상을 연구하는 데 잠재적으로 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구 작업은 국립 과학 재단 [CBET-1904921] 및 국립 보건원 [NIH R01CA236350]의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
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