Summary
Ensemble force spectroscopy (EFS) er en robust teknikk for mekanisk utfoldelse og sanntidsregistrering av et ensemblesett av biomolekylære strukturer i biofysiske og biosenserende felt.
Abstract
Enkeltmolekylteknikker basert på fluorescens og mekanokjemiske prinsipper gir overlegen følsomhet i biologisk sensing. På grunn av mangelen på høy gjennomstrømningskapasitet er anvendelsen av disse teknikkene imidlertid begrenset i biofysikk. Ensemblekraftspektroskopi (EFS) har vist høy gjennomstrømning i undersøkelsen av et massivt sett med molekylære strukturer ved å konvertere mekanokjemiske studier av individuelle molekyler til molekylære ensembler. I denne protokollen ble DNA-sekundære strukturer (i-motiver) brettet ut i skjærstrømmen mellom rotoren og statoren til en homogenisatorspiss ved skjærhastigheter opp til 77796/s. Effektene av strømningshastigheter og molekylstørrelser på skjærkreftene som oppleves av i-motivet ble demonstrert. EFS-teknikken avslørte også bindingsaffiniteten mellom DNA i-motiver og ligander. Videre har vi demonstrert en klikkkjemireaksjon som kan aktiveres av skjærkraft (dvs. mekano-klikkkjemi). Disse resultatene fastslår effektiviteten av å bruke skjærkraft for å kontrollere konformasjonen av molekylære strukturer.
Introduction
I enkeltmolekylkraftspektroskopi 1 (SMFS) har de mekaniske egenskapene til individuelle molekylære strukturer blitt studert av sofistikerte instrumenter som atomkraftmikroskopet, optisk pinsett og magnetisk pinsett 2,3,4. Begrenset av det samme direksjonalitetskravet til molekylene i kraftgenererende / detekterende oppsett eller det lille synsfeltet i magnetisk pinsett og miniatyrsentrifugekraftmikroskopet (MCF) 5,6,7,8, kan bare et begrenset antall molekyler undersøkes samtidig ved hjelp av SMFS. Den lave gjennomstrømningen av SMFS forhindrer dens brede anvendelse i molekylær anerkjennelsesfelt, noe som krever involvering av et stort sett med molekyler.
Skjærstrøm gir en potensiell løsning for å påføre krefter på et massivt sett med molekyler9. I en væskestrøm inne i en kanal, jo nærmere kanaloverflaten, jo langsommere strømningshastigheten10. En slik strømningshastighetsgradient forårsaker skjærspenning som er parallell med grenseflaten. Når et molekyl er plassert i denne skjærstrømmen, reorienterer molekylet seg slik at den lange aksen justerer seg med strømningsretningen, ettersom skjærkraften påføres den lange aksen11. Som et resultat av denne nyorienteringen forventes alle molekylene av samme type (størrelse og lengde på håndtakene) å justere seg i samme retning mens de opplever samme skjærkraft.
Dette arbeidet beskriver en protokoll for å bruke en slik skjærstrøm for å utøve skjærkraft på et massivt sett med molekylære strukturer, som eksemplifisert av DNA i-motivet. I denne protokollen genereres en skjærstrøm mellom rotoren og statoren i en homogenisatorspiss. Den foreliggende studien fant at den brettede DNA i-motivstrukturen kunne utfoldes med skjærhastigheter på 9724-97245 s−1. Dessuten ble det funnet en dissosiasjonskonstant på 36 μM mellom L2H2-4OTD-liganden og i-motivet. Denne verdien er i samsvar med verdien på 31 μM målt ved gelskiftanalysen12. Videre brukes den nåværende teknikken til å utfolde i-motivet, som kan eksponere chelatert kobber (I) for å katalysere en klikkreaksjon. Denne protokollen gjør det dermed mulig å utfolde et stort sett med i-motivstrukturer med rimelige instrumenter innen rimelig tid (kortere enn 30 min). Gitt at skjærkraftteknikken drastisk øker gjennomstrømningen av kraftspektroskopien, kaller vi denne teknikken ensemble force spectroscopy (EFS). Denne protokollen tar sikte på å gi eksperimentelle retningslinjer for å lette anvendelsen av denne skjærkraftbaserte EFS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle buffere og kjemiske reagenser som brukes i denne protokollen er oppført i tabellen Materialer.
1. Forberedelse av skjærkraftmikroskopet
MERK: Skjærkraftmikroskopet inneholder to deler, en reaksjonsenhet (homogenisator) og en deteksjonsenhet (fluorescensmikroskop). Forstørrelsen av okularet er 10x, og forstørrelsen av objektivlinsen (luft) er 4x.
- Monter homogenisatoren og mikroskopet på et monteringsbord. Bruk vernebriller og slå på fluorescensmikroskopet, og juster deretter homogenisatoren for å sikre at eksitasjonslysstrålen med passende bølgelengde (her ble 488 nm brukt) passerer gjennom midten av dispergeringsspissen til homogenisatoren.
- Forbered et flatbunnet reaksjonskammer som er 5 cm i høyden og 1,5 cm 2 x 1,5 cm2 i tverrsnitt. For å redusere bakgrunnen, sørg for at det valgte kammermaterialet ikke fluoresceres, for eksempel briller (noen plast har fluorescens).
- Velg en passende homogenisatordispergeringsspiss som kan gi ønsket skjærkraft.
MERK: Skjærhastigheten er avhengig av avstanden mellom rotoren og statoren ved en fast rotasjonshastighet11 i henhold til følgende ligning:
hvor μ er vannets dynamiske viskositet ved 20 °C; D er statorens indre diameter; d er rotorens ytre diameter, og V er skjærhastigheten (rpm/s). - Klem reaksjonskammeret på prøvetrinnet i fluorescensmikroskopet, og juster deretter kammeret for å holde dispergeringsspissen til homogenisatoren (figur 1). Forsikre deg om at dispergeringsspissen er litt over (~1 mm) den nederste overflaten av reaksjonskammeret.
- Juster homogenisatorens vertikale posisjon og kammeret sammen for å sikre at mikroskopets fokus er på overflaten av dispergeringsspissen. Juster deretter den horisontale posisjonen til dispergeringsspissen for å sikre at deteksjonsområdet (synsfeltet) er satt mellom rotoren og statoren (figur 1).
- Slå på fluorescenskanalene i henhold til det fluorescerende fargestoffet som ble brukt i forsøket.
- Før høyhastighetsskjæringseksperimentet, bruk avionisert (DI) vann for å teste skjæringen med lav skjærhastighet (f.eks. 2000 o / min) for å sikre at spredningsspissen kan fungere hensiktsmessig uten å berøre reaksjonskammeret.
2. Utfolde i-motiver med og uten ligander
- Forbered et humant telomert i-motiv DNA (Table of Materials) merket med henholdsvis et fargestoff og en slukker i de to endene i DI-vann, som beskrevet i Hu et al.11.
MERK: i-motiv som inneholder sekvens: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA. - Fortynn DNA til 5 μM i 30 mM MES-bufferen ved pH 5,5 eller pH 7,4. Til DNA-løsningen, tilsett ligand L2H2-4OTD, som ble syntetisert i henhold til Abraham Punnoose et al.13, i et konsentrasjonsområde på 0-60 μM. Bland løsningen forsiktig i 10 minutter for å brette i-motivstrukturene uten lys.
- Kontroller og minimer bakgrunnsfluorescensintensiteten til reaksjonskammeret som er fylt med avionisert DI-vann ved hjelp av fluorescerende mikroskop uten skjæring. En enkel måte å minimere bakgrunnsfluorescensen på er å vaske reaksjonskammeret med DI-vann. Bakgrunnsfluorescensverdien må trekkes fra i dataanalysene senere.
MERK: Løslys bør unngås fra dette trinnet og utover. - Still inn parametrene til CCD-kameraet ved hjelp av programvaren. De anbefalte parametrene er som følger: eksponeringstid = 0,5 s, CCD-følsomhet = 1600 og opptakstid = 20 min.
- Bruk en lang pipet til å tilsette DNA-løsningen i det tomme og rene reaksjonskammeret. Dekk reaksjonskammeret med en svart boks. Start deretter homogenisatoren for å utføre skjæring med en valgt skjærhastighet fra 9,724 s−1 til 97,245 s−1 (valgt ved hjelp av programvaren tilknyttet homogenisatoren) i 20 minutter med CCD-kameraet slått på for å registrere dataene.
- Etter forsøket, fjern kammeret og vask det med DI-vann.
3. Skjærkraftaktivert klikkreaksjon
- Klargjør i-motiv DNA i DI-vann. Inkuber 10 μM i-motiv DNA i 300 μL 30 mM Tris buffer (pH 7,4) supplert med 150 μM CuCl og 300 μM askorbinsyre i 10 minutter for å brette i-motivstrukturene (alle konsentrasjoner er endelige konsentrasjoner i løsningen).
MERK: CuCl er katalysatoren for klikkreaksjonen. Askorbinsyre vil forhindre oksidering av kobber (I). - Ultrafiltrer løsningen med en ultrafiltreringsanordning ved en sentrifugalkraft på 14 300 x g. Fyll oppløsningen til ~500 μL med 30 mM Tris buffer (pH 7,4) supplert med 300 μM askorbinsyre etter hver filtrering.
- Gjenta filtreringen 3x.
- Samle restløsningen og lag et endelig volum på 300 μL ved å tilsette 30 mM Tris (pH 7,4) supplert med 300 μM askorbinsyre sammen med 20 μM Kalfluor 488 azid, 20 μM HPG og 10 μM TBTA. Når reagensene er tilsatt, flytter du løsningen til mørkerommet.
MERK: Lys bør unngås etter dette trinnet. - Kontroller og minimer bakgrunnsfluorescensintensiteten til reaksjonskammeret fylt med DI-vann ved hjelp av mikroskopet før skjæreeksperimentene. En enkel måte å minimere bakgrunnsfluorescensen på er å vaske reaksjonskammeret med DI-vann.
- Tilsett DNA-oppløsningen i det tomme reaksjonskammeret med en lang pipet, og start deretter homogenisatorskjæringen med en skjærhastighet på 63 209 s−1 i 20 minutter med CCD-kameraet slått på.
- Etter forsøket, fjern kammeret og vask det med DI-vann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 skisserer den mekaniske utfoldelsen og sanntidsfølingen av ensemblemolekyler i EFS. I figur 1B ble fluorescensintensiteten til i-motiv-DNA observert å øke med skjærhastigheten fra 9,724 s−1 til 97,245 s−1 i en pH 5,5 MES-buffer. Som en kontroll ble fluorescensintensiteten ikke økt når det samme i-motiv-DNA ble skåret med en hastighet på 63 209 s−1 i en pH 7,4 MES-buffer. Dette skyldes at i-motivet ikke brettes ved pH 7,414. I det forrige arbeidet fant vi at jo høyere skjærhastighet, jo mer utfoldelse av i-motivet11. Basert på utfoldelsen av i-motivet i den optiske pinsetten 11, kalibrerte vi skjærkraft vs. skjærhastighet som vist i figur 1C, som viste at opptil 41 pN kunne påføres FRET-paret merket i-motiv med en skjærhastighet på 77 796 s−1. I figur 2B ble liganden (L2H2-4OTD) som binder seg til DNA i-motivmolekylene utsatt for skjærstrømmen evaluert, noe som viste at økningen av fluorescensintensiteten ble mindre tydelig med økende L2H2-4OTD-konsentrasjon (0-60 μM). Fra bindingskurven (dvs. et plott av de bundne fraksjonene av liganden vs. den frie ligandkonsentrasjonen) i figur 2C, ble det bestemt en dissosiasjonskonstant (Kd) på 36 μM for samspillet mellom L2H2-4OTD-liganden og i-motivet11. Som en praktisk anvendelse av skjærkraft for kjemiske reaksjoner, viser figur 3 en mekano-klikkreaksjon som kan utløses av skjærstrømmen. I figur 3B ble Cu(I)-chelatert i-motiv brettet ut med 63 209 s−1 skjærhastighet, og det frigjorte kobberet (I) utløste den fluorogene klikkreaksjonen vist i figur 3A, noe som resulterte i økt fluorescensintensitet over tid (figur 3C).
Figur 1: Utfoldelse av i-motivets DNA-struktur ved skjærstrøm i EFS. (A) Skjematisk av utfoldelsen av en i-motiv DNA-struktur merket med et FRET-par (Cy5 og slukker) av skjærstrømmen generert i en benchtop homogenisator. Venstre innfelt: den lysebrune indikerer statoren, og den mørkebrune indikerer rotoren. Høyre innfelt: Den stiplede cyansirkelen mellom rotoren og statoren indikerer bufferstrømmen under skjærforhold. Den mørkebrune sirkulære pilen indikerer rotorens retning. Cyanpilene i zoomet visning av høyre innfelt indikerer bufferflyten under skjæring. Lengden på hver pil viser hastigheten til en bestemt strømningsstrøm (lengre piler indikerer høyere hastigheter). (B) Den prosentvise endringen i fluorescensintensiteten i sanntidsmåling skyldes utfoldelsen av i-motivet ved forskjellige skjærhastigheter fra 9,724 s−1 til 97,245 s−1. Heldekkende kurver indikerer eksponentiell tilpasning. Fluorescensintensiteten normaliseres med hensyn til den maksimale verdien observert i forsøket. (C) Diagram over skjærhastigheten vs. skjærkraften for i-motivet vist i (A). Den røde linjen viser en lineær tilpasning (R2 = 1,00). Dette tallet er modifisert fra Hu et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Utfoldelse av i-motiver bundet med ligander . (A) Skjematisk av i-motivet merket med et FRET-par (Cy5 og quencher) bundet med L2H2-4OTD-liganden13. (B) Den reduserte fluorescensintensiteten til i-motivet med økende konsentrasjoner av L2H2-4OTD-liganden (rosa: 0 μM, grønn: 6 μM, cyan: 30 μM, grå: 36 μM, svart: 45 μM og lysebrun: 60 μM). Fluorescensintensiteten normaliseres med hensyn til den maksimale verdien observert i forsøket. (C) Bindingskurve for i-motivet ved forskjellige frie L2H2-4OTD-konsentrasjoner. Dette tallet er modifisert fra Hu et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Mekano-klikk-reaksjoner . (A) Fluorogen klikkreaksjon mellom Calfluor 488 og HPG. Forbindelsen vist i grønt er det fluorescerende reaksjonsproduktet. (B) I-motivet DNA-struktur chelatert med kobber (I) ved pH 7,4 ble filtrert for å fjerne ubundet kobber (I) i løsningen. Det kobber (I) chelaterte i-motivet ble brettet ut av skjærstrøm i EFS. Det frigjorte kobberet (I) katalyserte den fluorogene klikkreaksjonen, som ble vist i kapillærrørene (nederst til høyre). (C) Prosentvis økning av fluorescensintensiteten til klikkreaksjonen med en skjærhastighet på 63 209 s−1 i 20 minutter. Den mørke kurven indikerer tilpasningen av fluorescensintensiteten fra en kontrollklikkreaksjon uten DNA. Den grønne kurven representerer eksponentiell tilpasning. Fluorescensintensiteten normaliseres med hensyn til den maksimale verdien observert i forsøket. Dette tallet er modifisert fra Hu et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet i dette manuskriptet tillater sanntidsundersøkelse av utfoldelsen av et ensemblesett av biomolekylære strukturer med skjærkraft. Resultatene som presenteres her understreker at DNA-i-motivstrukturer kan utfoldes med skjærkraft. Utfoldelsen av det ligandbundne i-motivet og skjærkraftaktiverte klikkreaksjoner var proof-of-concept-applikasjoner for denne ensemblekraftspektroskopimetoden.
Figur 1 viser instrumentoppsettet. Homogenisatorgeneratorspissen og reaksjonskammeret må ikke komme i kontakt med hverandre, noe som er kritisk for å tillate en stabil skjærstrøm mellom rotoren og statoren uten bobledannelse. For den kommersielle homogenisatorspissen er det bedre å velge en med et lufthull for å redusere bobledannelsen. I tillegg bør størrelsen på reaksjonskammeret ikke være for stor, siden et stort kammer krever mer prøveløsning. Tvert imot er det nødvendig med en viss høyde på skjærekammeret for å dekke hoveddelen av homogenisatorspissen. For å redusere systematiske feil foreslås det å opprettholde samme justering i oppsettet for å utføre alle relevante eksperimenter. Det er viktig å påpeke at DNA opprettholder integritet, som det fremgår av gelelektroforese etter skjæring11.
Fra figur 1B økte den mettende fluorescensen med skjærhastigheten fra 9724 s−1 til 97245 s−1. Etter å ha plottet platåfluorescensintensiteten vs. skjærhastigheten, økte ikke fluorescensintensiteten lenger ved skjærhastigheten over 97245 s−1, noe som tyder på at den tilhørende skjærkraften fra skjærhastigheten (97245 s−1) allerede var høyere enn den nødvendige kraften for å utfolde i-motivet. Derfor ble platåfluorescensintensiteten ved 97245 s−1 tatt som referansepunkt (dvs. tilsvarende 100% utfoldelse) for å beregne prosentandelen av utfoldet i-motiv ved enhver skjærhastighet11. Figur 1C viser skjærkraften som genereres på det telomere i-motivet ved en bestemt skjærhastighet. For å fastslå forholdet mellom skjærkraften og skjærhastigheten ble mekanisk utfoldelse av den samme telomere i-motivstrukturen utført i optisk pinsett, og et kumulativt plott av utfoldelsesprosenten av i-motivet vs. kraften ble plottet basert på i-motivets utfoldende krafthistogram av i-motivet i de optiske pinsetteksperimentene11 . For forskjellige DNA-strukturer anbefales kraftkalibrering ved hjelp av optisk pinsett. Basert på antagelsen om at prosentandelen av utfoldet i-motiv er ekvivalente mellom laserpinsettbasert mekanisk utfoldelse og skjærkraftbasert utfoldelse ved en bestemt kraft (dvs. gitt at retningen av kraften som oppleves av i-motivet er lik i disse to metodene, som er langs den strakte aksen til de to DNA-håndtakene [overheng]), kalibrerte vi skjærkraften vs. skjærhastigheten.
Selv om homogenisatorinstrumentene er lett tilgjengelige i ethvert laboratorium, er det noen få viktige trinn som bør utføres med forsiktighet. For det første, for å oppdage nøyaktige fluorescensverdier, bør lysets bane settes mellom rotoren og statoren. For det andre, når du utfører skjæreeksperimentene i henhold til trinnene i denne protokollen, er det viktig å sjekke fluorescensen før forsøket. Det er nødvendig å redusere høy bakgrunnsfluorescensintensitet ved å rengjøre hele oppsettet godt, spesielt homogenisatorspissen og reaksjonskammeret. Eksperimentet skal utføres i et mørkt rom for ytterligere å redusere bortkommen lys.
En av de viktigste fordelene med EFS-teknikken er dens fleksibilitet og allsidighet for mekanisk utfoldelse av et ensemblesett av biomolekylære strukturer, inkludert protein-, RNA- og DNA-strukturer. Tradisjonelt krever ensemblemekaniske utfoldelseseksperimenter komplekse eksperimentelle oppsett. Fordelen med EFS er at det reduserer kompleksiteten i instrumentdesignet, med mye reduserte kostnader. Selv om EFS kan utføre eksperimenter med høy gjennomstrømning på kortere tid sammenlignet med enkeltmolekylteknikker, er det noen begrensninger, som inkluderer det faktum at kraftstørrelsen bestemmes av størrelsen på molekylstrukturen. I tillegg er fluorescerende merking av det oppdagede molekylet nødvendig. For å oppnå større skjærkrefter kan det bli nødvendig å feste skjærehåndtakene til molekylet av interesse. For fremtidige anvendelser kan skjærkraftbaserte EFS potensielt brukes til å studere ulike mekanokjemiske fenomener der kjemiske reaksjoner, som analyttgjenkjenning15 og polymerisering av syntetiske polymerer, påvirkes av mekaniske krefter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette forskningsarbeidet ble støttet av National Science Foundation [CBET-1904921] og National Institutes of Health [NIH R01CA236350] til HM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V.
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H.
