Summary
A espectroscopia de força de conjunto (EFS) é uma técnica robusta para desdobramento mecânico e detecção em tempo real de um conjunto de estruturas biomoleculares em campos biofísicos e de biossensoriamento.
Abstract
Técnicas de molécula única baseadas em princípios de fluorescência e mecanoquímicos fornecem sensibilidade superior em sensoriamento biológico. No entanto, devido à falta de recursos de alto rendimento, a aplicação dessas técnicas é limitada em biofísica. A espectroscopia de força de conjunto (EFS) demonstrou alto rendimento na investigação de um conjunto maciço de estruturas moleculares, convertendo estudos mecanoquímicos de moléculas individuais em conjuntos moleculares. Neste protocolo, as estruturas secundárias do DNA (i-motivos) foram desdobradas no fluxo de cisalhamento entre o rotor e o estator de uma ponta do homogeneizador a taxas de cisalhamento de até 77796/s. Os efeitos das taxas de fluxo e tamanhos moleculares sobre as forças de cisalhamento experimentadas pelo motivo i foram demonstrados. A técnica EFS também revelou a afinidade de ligação entre i-motivos de DNA e ligantes. Além disso, demonstramos uma reação química de clique que pode ser acionada por força de cisalhamento (ou seja, química de clique mecano). Esses resultados estabelecem a eficácia do uso da força de cisalhamento para controlar a conformação de estruturas moleculares.
Introduction
Na espectroscopia de força de molécula única1 (SMFS), as propriedades mecânicas de estruturas moleculares individuais têm sido estudadas por instrumentos sofisticados como o microscópio de força atômica, pinças ópticas e pinças magnéticas 2,3,4. Restrito pelo mesmo requisito de direcionalidade das moléculas nas configurações de geração/detecção de força ou pelo pequeno campo de visão em pinças magnéticas e no microscópio de força de centrífuga em miniatura (MCF)5,6,7,8, apenas um número limitado de moléculas pode ser investigado simultaneamente usando SMFS. O baixo rendimento do SMFS impede sua ampla aplicação no campo do reconhecimento molecular, o que requer o envolvimento de um grande conjunto de moléculas.
O fluxo de cisalhamento fornece uma solução potencial para aplicar forças a um conjunto maciço de moléculas9. Em um fluxo de líquido dentro de um canal, quanto mais próximo da superfície do canal, mais lenta a taxa de fluxo10. Tal gradiente de velocidade de fluxo causa tensão de cisalhamento paralela à superfície limite. Quando uma molécula é colocada nesse fluxo de cisalhamento, a molécula se reorienta para que seu eixo longo se alinhe com a direção do fluxo, à medida que a força de cisalhamento é aplicada ao eixo longo11. Como resultado dessa reorientação, espera-se que todas as moléculas do mesmo tipo (tamanho e comprimento das alças) se alinhem na mesma direção enquanto experimentam a mesma força de cisalhamento.
Este trabalho descreve um protocolo para usar tal fluxo de cisalhamento para exercer força de cisalhamento em um conjunto maciço de estruturas moleculares, como exemplificado pelo i-motivo do DNA. Neste protocolo, um fluxo de cisalhamento é gerado entre o rotor e o estator em uma ponta do homogeneizador. O presente estudo descobriu que a estrutura dobrada do i-motivo do DNA poderia ser desdobrada por taxas de cisalhamento de 9724-97245 s−1. Além disso, uma constante de dissociação de 36 μM foi encontrada entre o ligante L2H2-4OTD e o motivo i. Este valor é consistente com o de 31 μM medido pelo ensaio de deslocamento de gel12. Além disso, a técnica atual é usada para desdobrar o i-motivo, que pode expor o cobre quelado (I) para catalisar uma reação de clique. Este protocolo permite, assim, desdobrar um grande conjunto de estruturas i-motif com instrumentos de baixo custo em um tempo razoável (menor que 30 min). Dado que a técnica de força de cisalhamento aumenta drasticamente o rendimento da espectroscopia de força, chamamos essa técnica de espectroscopia de força de conjunto (EFS). Este protocolo tem como objetivo fornecer diretrizes experimentais para facilitar a aplicação deste EFS baseado em força de cisalhamento.
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Protocol
NOTA: Todos os tampões e os reagentes químicos utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação do microscópio de força de cisalhamento
NOTA: O microscópio de força de cisalhamento contém duas partes, uma unidade de reação (homogeneizador) e uma unidade de detecção (microscópio de fluorescência). A ampliação da ocular é de 10x, e a ampliação da lente objetiva (ar) é de 4x.
- Monte o homogeneizador e o microscópio em uma mesa de montagem. Use óculos e ligue o microscópio de fluorescência e, em seguida, ajuste o homogeneizador para garantir que o feixe de luz de excitação de um comprimento de onda apropriado (aqui, 488 nm foi usado) passe pelo centro da ponta de dispersão do homogeneizador.
- Prepare uma câmara de reação de fundo plano com 5 cm de altura e 1,5 cm 2 x 1,5 cm2 de seção transversal. Para reduzir o fundo, certifique-se de que o material da câmara selecionado não fluoresce, como vidros (alguns plásticos têm fluorescência).
- Escolha uma ponta de dispersão do homogeneizador apropriada que possa fornecer a força de cisalhamento desejada.
NOTA: A taxa de cisalhamento depende da distância entre o rotor e o estator a uma velocidade de rotação fixa11 de acordo com a seguinte equação:
em que μ é a viscosidade dinâmica da água a 20 °C; D é o diâmetro interno do estator; d é o diâmetro externo do rotor e V é a velocidade de cisalhamento (rpm/s). - Aperte a câmara de reação no estágio de amostra do microscópio de fluorescência e, em seguida, ajuste a câmara para segurar a ponta dispersora do homogeneizador (Figura 1). Certifique-se de que a ponta de dispersão esteja ligeiramente acima (~1 mm) da superfície inferior da câmara de reação.
- Ajuste a posição vertical do homogeneizador e da câmara em conjunto para garantir que o foco do microscópio esteja na superfície da ponta de dispersão. Em seguida, ajuste a posição horizontal da ponta de dispersão para garantir que a área de detecção (campo de visão) esteja ajustada entre o rotor e o estator (Figura 1).
- Ligue os canais de fluorescência de acordo com o corante fluorescente usado no experimento.
- Antes do experimento de cisalhamento de alta velocidade, use água deionizada (DI) para testar o cisalhamento com uma baixa velocidade de cisalhamento (por exemplo, 2.000 rpm) para garantir que a ponta de dispersão possa funcionar adequadamente sem tocar na câmara de reação.
2. Desdobramento de i-motivos com e sem ligantes
- Preparar um DNA telomérico humano i-motif (Table of Materials) marcado com um corante e um quencher em suas duas extremidades, respectivamente, em água DI, conforme descrito em Hu et al.11.
NOTA: i-motivo contendo sequência: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC CCC TAA. - Diluir o ADN a 5 μM no tampão MES de 30 mM a pH 5,5 ou pH 7,4. À solução de DNA, adicionar o ligante L2H2-4OTD, que foi sintetizado de acordo com Abraham Punnoose et al.13, em uma faixa de concentração de 0-60 μM. Misture a solução suavemente por 10 min para dobrar as estruturas do motivo i sem luz.
- Verifique e minimize a intensidade de fluorescência de fundo da câmara de reação que é preenchida com água DI deionizada usando o microscópio fluorescente sem cisalhamento. Uma maneira fácil de minimizar a fluorescência de fundo é lavar a câmara de reação com água DI. O valor de fluorescência de fundo precisa ser subtraído nas análises de dados posteriormente.
NOTA: A luz dispersa deve ser evitada a partir deste passo. - Defina os parâmetros da câmera CCD usando o software. Os parâmetros recomendados são os seguintes: tempo de exposição = 0,5 s, sensibilidade ao CCD = 1600 e tempo de registro = 20 min.
- Usando uma pipeta longa, adicione a solução de DNA na câmara de reação vazia e limpa. Cubra a câmara de reação com uma caixa preta. Em seguida, inicie o homogeneizador para realizar o cisalhamento a uma taxa de cisalhamento selecionada variando de 9.724 s−1 a 97.245 s−1 (selecionada usando o software associado ao homogeneizador) por 20 minutos com a câmera CCD ligada para registrar os dados.
- Após o experimento, remova a câmara e lave-a com água DI.
3. Reação de clique acionada por força de cisalhamento
- Prepare o DNA i-motif em água DI. Incubar 10 μM de ADN i-motif em 300 μL de tampão Tris de 30 mM (pH 7,4) suplementado com 150 μM de CuCl e 300 μM de ácido ascórbico durante 10 minutos para dobrar as estruturas i-motif (todas as concentrações são concentrações finais na solução).
Observação : CuCl é o catalisador da reação de clique. O ácido ascórbico impedirá a oxidação do cobre (I). - Ultrafiltre a solução com um dispositivo de ultrafiltração a uma força centrífuga de 14.300 x g. Repor a solução até ~500 μL com tampão Tris de 30 mM (pH 7,4) suplementado com ácido ascórbico de 300 μM após cada filtração.
- Repita a filtração 3x.
- Recolher a solução residual e fazer um volume final de 300 μL adicionando 30 mM Tris (pH 7,4) suplementado com ácido ascórbico 300 μM juntamente com 20 μM Calfluor 488 azida, 20 μM HPG e 10 μM TBTA. Uma vez que os reagentes são adicionados, mova a solução para a câmara escura.
NOTA: A luz deve ser evitada após esta etapa. - Verifique e minimize a intensidade de fluorescência de fundo da câmara de reação preenchida com água DI usando o microscópio antes dos experimentos de cisalhamento. Uma maneira fácil de minimizar a fluorescência de fundo é lavar a câmara de reação com água DI.
- Adicione a solução de DNA na câmara de reação vazia com um pipeto longo e, em seguida, inicie o cisalhamento do homogeneizador a uma taxa de cisalhamento de 63.209 s−1 por 20 minutos com a câmera CCD ligada.
- Após o experimento, remova a câmara e lave-a com água DI.
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Representative Results
A Figura 1 descreve o desdobramento mecânico e a detecção em tempo real das moléculas do conjunto no EFS. Na Figura 1B, observou-se que a intensidade de fluorescência do DNA i-motif aumentou com a taxa de cisalhamento variando de 9.724 s−1 a 97.245 s−1 em um tampão MES de pH 5,5. Como controle, a intensidade da fluorescência não foi aumentada quando o mesmo DNA i-motif foi cortado a uma taxa de 63.209 s−1 em um tampão MES de pH 7,4. Isso ocorre porque o i-motif não se dobra em pH 7,414. No trabalho anterior, descobrimos que quanto maior a taxa de cisalhamento, maior o desdobramento do i-motivo11. Com base no desdobramento do motivo i na pinça óptica11, calibramos a força de cisalhamento versus a taxa de cisalhamento, conforme mostrado na Figura 1C, que mostrou que até 41 pN poderiam ser aplicados ao par FRET rotulado i-motivo a uma taxa de cisalhamento de 77.796 s−1. Na Figura 2B, avaliou-se a ligação do ligante (L2H2-4OTD) às moléculas de i-motivo de DNA submetidas ao fluxo de cisalhamento, o que mostrou que o incremento da intensidade de fluorescência tornou-se menos óbvio com o aumento da concentração de L2H2-4OTD (0-60 μM). A partir da curva de ligação (ou seja, um gráfico das frações ligadas do ligante versus a concentração do ligante livre) na Figura 2C, uma constante de dissociação (Kd) de 36 μM foi determinada para a interação entre o ligante L2H2-4OTD e o motivo i11. Como uma aplicação prática da força de cisalhamento para reações químicas, a Figura 3 mostra uma reação mecano-clique que pode ser desencadeada pelo fluxo de cisalhamento. Na Figura 3B, o i-motivo quelado(I) foi desdobrado na taxa de cisalhamento de 63.209 s−1, e o cobre liberado (I) desencadeou a reação de clique fluorogênico mostrada na Figura 3A, resultando em aumento da intensidade de fluorescência ao longo do tempo (Figura 3C).
Figura 1: Desdobramento da estrutura do DNA i-motif pelo fluxo de cisalhamento no EFS. (A) Esquema do desdobramento de uma estrutura de DNA i-motif marcada com um par FRET (Cy5 e quencher) pelo fluxo de cisalhamento gerado em um homogeneizador de bancada. Inserção esquerda: o marrom claro indica o estator, e o marrom escuro indica o rotor. Inserção direita: o círculo ciano pontilhado entre o rotor e o estator indica o fluxo tampão em condições de cisalhamento. A seta circular marrom escuro indica a direção do rotor. As setas ciano na visualização ampliada da inserção direita indicam o fluxo de buffer sob cisalhamento. O comprimento de cada seta representa a velocidade de um fluxo particular (setas mais longas indicam velocidades mais altas). (B) A mudança percentual na intensidade de fluorescência na detecção em tempo real é devida ao desdobramento do motivo i em diferentes taxas de cisalhamento de 9.724 s−1 a 97.245 s−1. Curvas sólidas indicam o ajuste exponencial. A intensidade de fluorescência é normalizada em relação ao valor máximo observado no experimento. (C) Diagrama da taxa de cisalhamento versus a força de cisalhamento para o motivo i mostrado em (A). A linha vermelha representa um ajuste linear (R2 = 1,00). Esse número foi modificado a partir de Hu et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Desdobramento dos i-motivos ligados com ligantes . (A) Esquema do i-motivo rotulado com um par FRET (Cy5 e quencher) ligado com o ligante L2H2-4OTD13. (B) A diminuição da intensidade de fluorescência do motivo i com concentrações crescentes do ligante L2H2-4OTD (rosa: 0 μM, verde: 6 μM, ciano: 30 μM, cinza: 36 μM, preto: 45 μM e marrom claro: 60 μM). A intensidade de fluorescência é normalizada em relação ao valor máximo observado no experimento. (C) Curva de ligação do motivo i em diferentes concentrações livres de L2H2-4OTD. Esse número foi modificado a partir de Hu et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Reações de clique mecano . (A) Reação de clique fluorogênico entre Calfluor 488 e HPG. O composto mostrado em verde é o produto de reação fluorescente. (B) A estrutura do DNA do motivo i quelado com cobre (I) em pH 7,4 foi filtrada para remover o cobre não ligado (I) na solução. O motivo i-quelado de cobre (I) foi desdobrado por fluxo de cisalhamento em EFS. O cobre liberado (I) catalisou a reação de clique fluorogênico, que foi mostrada nos tubos capilares (canto inferior direito). (C) Aumento percentual da intensidade de fluorescência da reação de clique a uma taxa de cisalhamento de 63.209 s−1 por 20 min. A curva escura indica o ajuste da intensidade de fluorescência a partir de uma reação de clique de controle sem DNA. A curva verde representa o ajuste exponencial. A intensidade de fluorescência é normalizada em relação ao valor máximo observado no experimento. Esse número foi modificado a partir de Hu et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito neste manuscrito permite a investigação em tempo real do desdobramento de um conjunto de estruturas biomoleculares por força de cisalhamento. Os resultados aqui apresentados ressaltam que as estruturas do i-motivo do DNA podem ser desdobradas pela força de cisalhamento. O desdobramento do i-motivo ligado ao ligante e as reações de clique acionadas por força de cisalhamento foram aplicações de prova de conceito para este método de espectroscopia de força de conjunto.
A Figura 1 apresenta a configuração do instrumento. A ponta do gerador homogeneizador e a câmara de reação não devem entrar em contato entre si, o que é fundamental para permitir um fluxo de cisalhamento estável entre o rotor e o estator sem formação de bolhas. Para a ponta do homogeneizador comercial, é melhor escolher um com um orifício de ar para reduzir a formação de bolhas. Além disso, o tamanho da câmara de reação não deve ser muito grande, uma vez que uma câmara grande requer mais solução de amostra. Pelo contrário, uma certa altura da câmara de cisalhamento é necessária para cobrir o corpo principal da ponta do homogeneizador. Para reduzir o erro sistemático, sugere-se manter o mesmo alinhamento na configuração para realizar todos os experimentos relevantes. É importante ressaltar que o DNA mantém a integridade, como evidenciado pela eletroforese em gel após a cisalhamento11.
A partir da Figura 1B, a fluorescência de saturação aumentou com a taxa de cisalhamento variando de 9724 s−1 a 97245 s−1. Depois de plotar a intensidade de fluorescência do platô versus a taxa de cisalhamento, a intensidade de fluorescência não aumentou mais na taxa de cisalhamento acima de 97245 s−1, sugerindo que a força de cisalhamento associada fornecida pela taxa de cisalhamento (97245 s−1) já era maior do que a força necessária para desdobrar o motivo i. Portanto, a intensidade de fluorescência do platô em 97245 s−1 foi tomada como ponto de referência (ou seja, correspondente a 100% de desdobramento) para calcular a porcentagem de i-motivo desdobrado em qualquer taxa de cisalhamento11. A Figura 1C mostra a força de cisalhamento gerada no i-motivo telomérico a uma determinada taxa de cisalhamento. Para estabelecer a relação entre a força de cisalhamento e a taxa de cisalhamento, o desdobramento mecânico da mesma estrutura telomérica do i-motivo foi realizado em pinças ópticas, e um gráfico cumulativo da porcentagem de desdobramento do i-motivo vs. força foi plotado com base no histograma da força de desdobramento do i-motivo nos experimentos com pinças ópticas11 . Para diferentes estruturas de DNA, recomenda-se a calibração de força usando pinças ópticas. Com base na suposição de que as porcentagens de i-motif desdobrado são equivalentes entre o desdobramento mecânico baseado em pinças a laser e o desdobramento baseado em força de cisalhamento em uma força particular (ou seja, dado que a direção da força experimentada pelo i-motivo é semelhante nesses dois métodos, que é ao longo do eixo esticado das duas alças de DNA [saliências]), calibramos a força de cisalhamento versus a taxa de cisalhamento.
Embora os instrumentos homogeneizadores sejam facilmente acessíveis em qualquer laboratório, existem algumas etapas importantes que devem ser realizadas com cuidado. Em primeiro lugar, para detectar valores precisos de fluorescência, o caminho da luz deve ser definido entre o rotor e o estator. Em segundo lugar, ao realizar os experimentos de cisalhamento de acordo com as etapas deste protocolo, é importante verificar a fluorescência antes do experimento. É necessário reduzir a alta intensidade de fluorescência de fundo, limpando bem toda a configuração, especialmente a ponta do homogeneizador e a câmara de reação. O experimento deve ser realizado em uma sala escura para reduzir ainda mais a luz dispersa.
Um dos benefícios mais significativos da técnica EFS é sua flexibilidade e versatilidade para o desdobramento mecânico de um conjunto de estruturas biomoleculares, incluindo estruturas de proteínas, RNA e DNA. Tradicionalmente, os experimentos de desdobramento mecânico de conjunto exigem configurações experimentais complexas. A vantagem do EFS é que ele reduz a complexidade no projeto do instrumento, com custo muito reduzido. Embora a EFS possa realizar experimentos de alto rendimento em um tempo mais curto em comparação com técnicas de molécula única, existem algumas limitações, que incluem o fato de que a magnitude da força é determinada pelo tamanho da estrutura molecular. Além disso, é necessária a marcação fluorescente da molécula detectada. Para alcançar forças de cisalhamento maiores, a fixação de alças de cisalhamento à molécula de interesse pode se tornar necessária. Para aplicações futuras, o EFS baseado em força de cisalhamento pode ser potencialmente usado para estudar vários fenômenos mecanoquímicos nos quais reações químicas, como reconhecimentos de analitos15 e polimerização de polímeros sintéticos, são influenciadas por forças mecânicas.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho de pesquisa foi apoiado pela National Science Foundation [CBET-1904921] e pelos Institutos Nacionais de Saúde [NIH R01CA236350] para H. M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
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