Summary
Ensemble force spectroscopy (EFS) er en robust teknik til mekanisk udfoldelse og realtidsføling af et ensemblesæt af biomolekylære strukturer i biofysiske og biosensing felter.
Abstract
Enkeltmolekyleteknikker baseret på fluorescens og mekanokemiske principper giver overlegen følsomhed i biologisk sensing. På grund af manglen på høje gennemstrømningskapaciteter er anvendelsen af disse teknikker imidlertid begrænset i biofysik. Ensemble force spektroskopi (EFS) har vist høj gennemstrømning i undersøgelsen af et massivt sæt molekylære strukturer ved at konvertere mekanokemiske undersøgelser af individuelle molekyler til molekylære ensembler. I denne protokol blev DNA's sekundære strukturer (i-motiver) udfoldet i forskydningsstrømmen mellem rotoren og statoren på en homogenisatorspids ved forskydningshastigheder op til 77796/s. Virkningerne af strømningshastigheder og molekylære størrelser på forskydningskræfterne oplevet af i-motivet blev demonstreret. EFS-teknikken afslørede også bindingsaffiniteten mellem DNA i-motiver og ligander. Desuden har vi demonstreret en klikkemireaktion, der kan aktiveres af forskydningskraft (dvs. mekano-klikkemi). Disse resultater fastslår effektiviteten af at anvende forskydningskraft til at kontrollere konformationen af molekylære strukturer.
Introduction
I enkeltmolekylekraftspektroskopi1 (SMFS) er de mekaniske egenskaber af individuelle molekylære strukturer blevet undersøgt af sofistikerede instrumenter såsom atomkraftmikroskopet, optisk pincet og magnetisk pincet 2,3,4. Begrænset af det samme retningskrav til molekylerne i de kraftgenererende/detekterende opsætninger eller det lille synsfelt i magnetiske pincetter og miniaturecentrifugekraftmikroskopet (MCF)5,6,7,8, kan kun et begrænset antal molekyler undersøges samtidigt ved hjælp af SMFS. Den lave gennemstrømning af SMFS forhindrer dens brede anvendelse i molekylærgenkendelsesfeltet, hvilket kræver involvering af et stort sæt molekyler.
Forskydningsstrøm giver en potentiel løsning til at anvende kræfter på et massivt sæt molekyler9. I en væskestrøm inde i en kanal, jo tættere på kanaloverfladen, jo langsommere er strømningshastigheden10. En sådan strømningshastighedsgradient forårsager forskydningsspænding, der er parallel med grænseoverfladen. Når et molekyle placeres i denne forskydningsstrømning, omorienterer molekylet sig selv, så dets lange akse stemmer overens med strømningsretningen, da forskydningskraften påføres den lange akse11. Som et resultat af denne omorientering forventes alle molekyler af samme type (størrelse og længde af håndtag) at justere i samme retning, mens de oplever den samme forskydningskraft.
Dette arbejde beskriver en protokol til at bruge en sådan forskydningsstrøm til at udøve forskydningskraft på et massivt sæt molekylære strukturer, som eksemplificeret ved DNA i-motivet. I denne protokol genereres en forskydningsstrøm mellem rotoren og statoren i en homogenisatorspids. Den nuværende undersøgelse viste, at den foldede DNA i-motivstruktur kunne udfoldes ved forskydningshastigheder på 9724-97245 s−1. Desuden blev der fundet en dissociationskonstant på 36 μM mellem L2H2-4OTD-liganden og i-motivet. Denne værdi er i overensstemmelse med værdien 31 μM målt ved gelforskydningsassay12. Endvidere bruges den nuværende teknik til at udfolde i-motivet, som kan udsætte det chelaterede kobber (I) for at katalysere en klikreaktion. Denne protokol giver således mulighed for at udfolde et stort sæt i-motivstrukturer med billige instrumenter inden for en rimelig tid (kortere end 30 min). I betragtning af at forskydningskraftteknikken drastisk øger gennemstrømningen af kraftspektroskopien, kalder vi denne teknik ensemble force spectroscopy (EFS). Denne protokol har til formål at give eksperimentelle retningslinjer for at lette anvendelsen af denne forskydningskraftbaserede EFS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle buffere og kemiske reagenser, der anvendes i denne protokol, er angivet i tabelmaterialerne.
1. Fremstilling af forskydningskraftmikroskopet
BEMÆRK: Forskydningskraftmikroskopet indeholder to dele, en reaktionsenhed (homogenisator) og en detektionsenhed (fluorescensmikroskop). Forstørrelsen af okularet er 10x, og forstørrelsen af objektivlinsen (luft) er 4x.
- Saml homogenisatoren og mikroskopet på et monteringsbord. Brug beskyttelsesbriller og tænd fluorescensmikroskopet, og juster derefter homogenisatoren for at sikre, at excitationslysstrålen med en passende bølgelængde (her blev der brugt 488 nm) passerer gennem midten af homogenisatorens spredningsspids.
- Forbered et fladbundet reaktionskammer, der er 5 cm i højden og 1,5 cm2 x 1,5 cm2 i tværsnit. For at reducere baggrunden skal du sikre dig, at det valgte kammermateriale ikke fluorescerer, såsom briller (nogle plastmaterialer har fluorescens).
- Vælg en passende homogenisatorspredningsspids, der kan give den ønskede forskydningskraft.
BEMÆRK: Forskydningshastigheden afhænger af afstanden mellem rotoren og statoren ved en fast rotationshastighed11 i henhold til følgende ligning:
hvor μ er vandets dynamiske viskositet ved 20 °C D er statorens indre diameter; d er rotorens ydre diameter, og V er forskydningshastigheden (omdr./min.). - Fastgør reaktionskammeret på fluorescensmikroskopets prøvetrin, og juster derefter kammeret for at holde homogenisatorens dispergeringsspids (figur 1). Sørg for, at spredningsspidsen er lidt over (~ 1 mm) den nederste overflade af reaktionskammeret.
- Juster homogenisatorens og kammerets lodrette position sammen for at sikre, at mikroskopets fokus er på overfladen af dispergeringsspidsen. Juster derefter dispergeringsspidsens vandrette position for at sikre, at detektionsområdet (synsfelt) er indstillet mellem rotoren og statoren (figur 1).
- Tænd fluorescenskanalerne i henhold til det fluorescerende farvestof, der blev brugt i eksperimentet.
- Før højhastighedsforskydningseksperimentet skal du bruge deioniseret (DI) vand til at teste forskydningen med en lav forskydningshastighed (f.eks. 2.000 o / min) for at sikre, at spredningsspidsen kan fungere korrekt uden at røre reaktionskammeret.
2. Udfoldelse af i-motiver med og uden ligander
- Forbered et humant telomerisk i-motiv DNA (Table of Materials) mærket med henholdsvis et farvestof og en quencher i dets to ender i DI-vand, som beskrevet i Hu et al.11.
BEMÆRK: i-motiv indeholdende sekvens: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA. - Dna'et fortyndes til 5 μM i 30 mM MES-bufferen ved pH 5,5 eller pH 7,4. Til DNA-opløsningen tilsættes ligand L2H2-4OTD, som blev syntetiseret ifølge Abraham Punnoose et al.13, i et koncentrationsområde på 0-60 μM. Bland opløsningen forsigtigt i 10 minutter for at folde i-motivstrukturerne uden lys.
- Kontroller og minimer baggrundsfluorescensintensiteten af reaktionskammeret, der er fyldt med deioniseret DI-vand ved hjælp af det fluorescerende mikroskop uden at skære. En nem måde at minimere baggrundsfluorescensen på er at vaske reaktionskammeret med DI-vand. Baggrundsfluorescensværdien skal trækkes fra i dataanalyserne senere.
BEMÆRK: Omstrejfende lys bør undgås fra dette trin og fremefter. - Indstil parametrene for CCD-kameraet ved hjælp af softwaren. De anbefalede parametre er som følger: eksponeringstid = 0,5 s, CCD-følsomhed = 1600 og registreringstid = 20 min.
- Brug en lang pipet til at tilføje DNA-opløsningen i det tomme og rene reaktionskammer. Dæk reaktionskammeret med en sort boks. Start derefter homogenisatoren for at udføre klipning med en valgt forskydningshastighed fra 9,724 s-1 til 97,245 s-1 (valgt ved hjælp af den software, der er forbundet med homogenisatoren) i 20 minutter med CCD-kameraet tændt for at optage dataene.
- Efter eksperimentet skal du fjerne kammeret og vaske det med DI-vand.
3. Forskydningskraftaktiveret klikreaktion
- Forbered i-motiv DNA i DI vand. Inkuber 10 μM i-motiv DNA i 300 μL af 30 mM Tris buffer (pH 7,4) suppleret med 150 μM CuCl og 300 μM ascorbinsyre i 10 minutter for at folde i-motivstrukturerne (alle koncentrationer er endelige koncentrationer i opløsningen).
BEMÆRK: CuCl er katalysatoren for klikreaktionen. Ascorbinsyre forhindrer oxidation af kobber (I). - Opløsningen ultrafiltreres med en ultrafiltreringsanordning ved en centrifugalkraft på 14.300 x g. Opløsningen genopfyldes til ~500 μL med 30 mM Tris-buffer (pH 7,4) suppleret med 300 μM ascorbinsyre efter hver filtrering.
- Gentag filtreringen 3x.
- Residualopløsningen opsamles og der laves et slutvolumen på 300 μL ved at tilsætte 30 mM Tris (pH 7,4) suppleret med 300 μM ascorbinsyre sammen med 20 μM Calfluor 488 azid, 20 μM HPG og 10 μM TBTA. Når reagenserne er tilsat, skal du flytte opløsningen til mørkekammeret.
BEMÆRK: Lys bør undgås efter dette trin. - Kontroller og minimer baggrundsfluorescensintensiteten af reaktionskammeret fyldt med DI-vand ved hjælp af mikroskopet før forskydningsforsøgene. En nem måde at minimere baggrundsfluorescensen på er at vaske reaktionskammeret med DI-vand.
- Tilsæt DNA-opløsningen i det tomme reaktionskammer med en lang pipet, og start derefter homogenisatorforskydningen med en forskydningshastighed på 63.209 s-1 i 20 minutter med CCD-kameraet tændt.
- Efter eksperimentet skal du fjerne kammeret og vaske det med DI-vand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 skitserer den mekaniske udfoldelse og realtidsregistrering af ensemblemolekyler i EFS. I figur 1B blev fluorescensintensiteten af i-motiv-DNA observeret at stige med forskydningshastigheden fra 9.724 s-1 til 97.245 s-1 i en pH 5,5 MES-buffer. Som kontrol blev fluorescensintensiteten ikke øget, når det samme i-motiv-DNA blev skåret med en hastighed på 63.209 s-1 i en pH-buffer på 7,4 MES. Dette skyldes, at i-motivet ikke foldes ved pH 7,414. I det foregående arbejde fandt vi, at jo højere forskydningshastigheden er, desto mere udfoldes i-motivet11. Baseret på udfoldelsen af i-motivet i den optiske pincet 11 kalibrerede vi forskydningskraft vs. forskydningshastighed som vist i figur 1C, som viste, at op til 41 pN kunne påføres FRET-parret mærket i-motiv med en forskydningshastighed på 77.796 s−1. I figur 2B blev liganden (L2H2-4OTD) binding til DNA i-motivmolekylerne udsat for forskydningsstrømmen evalueret, hvilket viste, at stigningen i fluorescensintensiteten blev mindre tydelig med stigende L2H2-4OTD-koncentration (0-60 μM). Fra bindingskurven (dvs. et plot af de bundne fraktioner af liganden vs. den frie ligandkoncentration) i figur 2C blev en dissociationskonstant (Kd) på 36 μM bestemt for interaktionen mellem L2H2-4OTD-liganden og i-motivet11. Som en praktisk anvendelse af forskydningskraft til kemiske reaktioner viser figur 3 en mekano-klikreaktion, der kan udløses af forskydningsstrømmen. I figur 3B blev Cu(I)-chelateret i-motiv udfoldet ved forskydningshastigheden på 63.209 s−1, og det frigivne kobber (I) udløste den fluorogene klikreaktion vist i figur 3A, hvilket resulterede i øget fluorescensintensitet over tid (figur 3C).
Figur 1: Udfoldelse af i-motivets DNA-struktur ved forskydningsstrøm i EFS. (A) Skematisk for udfoldelsen af en i-motiv DNA-struktur mærket med et FRET-par (Cy5 og quencher) ved forskydningsstrømmen genereret i en stationær homogenisator. Venstre indsats: den lysebrune angiver statoren, og den mørkebrune angiver rotoren. Højre indsats: Den stiplede cyancirkel mellem rotoren og statoren angiver bufferstrømmen under forskydningsforhold. Den mørkebrune cirkulære pil angiver rotorens retning. Cyanpilene i den zoomede visning af højre indsats angiver bufferstrømmen under klipning. Længden af hver pil viser hastigheden af en bestemt strømningsstrøm (længere pile angiver højere hastigheder). (B) Den procentvise ændring i fluorescensintensiteten i realtidssensing skyldes udfoldelsen af i-motivet ved forskellige forskydningshastigheder fra 9.724 s−1 til 97.245 s−1. Faste kurver angiver den eksponentielle tilpasning. Fluorescensintensiteten normaliseres med hensyn til den maksimale værdi, der observeres i eksperimentet. (C) Diagram over forskydningshastigheden vs. forskydningskraften for i-motivet vist i (A). Den røde linje viser en lineær tilpasning (R2 = 1,00). Dette tal er ændret fra Hu et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Udfoldelse af i-motiver bundet med ligander. (A) Skematisk af i-motivet mærket med et FRET-par (Cy5 og quencher) bundet med L2H2-4OTD ligand13. (B) Den reducerede fluorescensintensitet af i-motivet med stigende koncentrationer af L2H2-4OTD-liganden (lyserød: 0 μM, grøn: 6 μM, cyan: 30 μM, grå: 36 μM, sort: 45 μM og lysebrun: 60 μM). Fluorescensintensiteten normaliseres med hensyn til den maksimale værdi, der observeres i eksperimentet. (C) Bindingskurve for i-motivet ved forskellige frie L2H2-4OTD-koncentrationer. Dette tal er ændret fra Hu et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mekano-klik reaktioner . (A) Fluorogen klikreaktion mellem Calfluor 488 og HPG. Forbindelsen vist i grønt er det fluorescerende reaktionsprodukt. (B) DNA-strukturen med i-motiv chelateret med kobber (I) ved pH 7,4 blev filtreret for at fjerne ubundet kobber (I) i opløsningen. Det kobber (I) chelaterede i-motiv blev udfoldet af forskydningsstrøm i EFS. Det frigivne kobber (I) katalyserede den fluorogene klikreaktion, som blev vist i kapillarrørene (nederst til højre). (C) Procentvis forøgelse af fluorescensintensiteten af klikreaktionen ved en forskydningshastighed på 63.209 s−1 i 20 min. Den mørke kurve angiver tilpasningen af fluorescensintensiteten fra en kontrolklikreaktion uden DNA. Den grønne kurve repræsenterer den eksponentielle tilpasning. Fluorescensintensiteten normaliseres med hensyn til den maksimale værdi, der observeres i eksperimentet. Dette tal er ændret fra Hu et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet i dette manuskript tillader realtidsundersøgelse af udfoldelsen af et ensemblesæt af biomolekylære strukturer ved forskydningskraft. De resultater, der præsenteres her, understreger, at DNA-i-motivstrukturer kan udfoldes ved forskydningskraft. Udfoldelsen af det ligandbundne i-motiv og de forskydningskraftaktiverede klikreaktioner var proof-of-concept-applikationer til denne ensemblekraftspektroskopimetode.
Figur 1 viser instrumentopsætningen. Homogenisatorgeneratorspidsen og reaktionskammeret må ikke komme i kontakt med hinanden, hvilket er afgørende for at muliggøre en stabil forskydningsstrøm mellem rotoren og statoren uden bobledannelse. For den kommercielle homogenisatorspids er det bedre at vælge en med et lufthul for at reducere bobledannelse. Derudover bør reaktionskammerets størrelse ikke være for stor, da et stort kammer kræver mere prøveopløsning. Tværtimod kræves en vis højde på skærekammeret for at dække hoveddelen af homogenisatorspidsen. For at reducere systematiske fejl foreslås det at opretholde den samme justering i opsætningen for at udføre alle relevante eksperimenter. Det er vigtigt at påpege, at DNA opretholder integritet, som det fremgår af gelelektroforese efter klipning11.
Fra figur 1B steg den mættende fluorescens med forskydningshastigheden fra 9724 s-1 til 97245 s−1. Efter at have plottet plateaufluorescensintensiteten vs. forskydningshastigheden steg fluorescensintensiteten ikke længere ved forskydningshastigheden over 97245 s−1, hvilket tyder på, at den tilknyttede forskydningskraft, der leveres af forskydningshastigheden (97245 s−1), allerede var højere end den krævede kraft til at udfolde i-motivet. Derfor blev plateaufluorescensintensiteten ved 97245 s-1 taget som referencepunkt (dvs. svarende til 100% udfoldelse) for at beregne procentdelen af udfoldet i-motiv ved enhver forskydningshastighed11. Figur 1C viser forskydningskraften genereret på det telomeriske i-motiv ved en bestemt forskydningshastighed. For at fastslå forholdet mellem forskydningskraften og forskydningshastigheden blev mekanisk udfoldelse af den samme telomeriske i-motivstruktur udført i optiske pincetter, og et kumulativt plot af udfoldelsesprocenten af i-motivet vs. kraften blev plottet baseret på i-motivets udfoldelseskrafthistogram i de optiske pinceteksperimenter11 . Til forskellige DNA-strukturer anbefales kraftkalibrering ved hjælp af optisk pincet. Baseret på antagelsen om, at procentdelene af udfoldet i-motiv er ækvivalente mellem laserpincetbaseret mekanisk udfoldelse og forskydningskraftbaseret udfoldelse ved en bestemt kraft (dvs. i betragtning af at retningen af den kraft, der opleves af i-motivet, er ens i disse to metoder, som er langs den strakte akse af de to DNA-håndtag [udhæng]), kalibrerede vi forskydningskraften vs. forskydningshastigheden.
Selvom homogenisatorinstrumenterne er let tilgængelige i ethvert laboratorium, er der et par vigtige trin, der skal udføres med omhu. For det første skal lysets vej indstilles mellem rotoren og statoren for at detektere nøjagtige fluorescensværdier. For det andet er det vigtigt at kontrollere fluorescensen før eksperimentet, når du udfører skæreeksperimenterne i henhold til trinene i denne protokol. Det er nødvendigt at reducere høj baggrundsfluorescensintensitet ved at rengøre hele opsætningen godt, især homogenisatorspidsen og reaktionskammeret. Eksperimentet skal udføres i et mørkt rum for yderligere at reducere omstrejfende lys.
En af de mest betydningsfulde fordele ved EFS-teknikken er dens fleksibilitet og alsidighed til mekanisk udfoldelse af et ensemblesæt af biomolekylære strukturer, herunder protein-, RNA- og DNA-strukturer. Traditionelt kræver ensemblemekaniske udfoldelseseksperimenter komplekse eksperimentelle opsætninger. Fordelen ved EFS er, at det reducerer kompleksiteten i instrumentdesignet med meget reducerede omkostninger. Selvom EFS kan udføre eksperimenter med høj kapacitet på kortere tid sammenlignet med enkeltmolekyleteknikker, er der nogle begrænsninger, som omfatter det faktum, at kraftstørrelsen bestemmes af størrelsen af den molekylære struktur. Derudover kræves fluorescerende mærkning af det detekterede molekyle. For at opnå større forskydningskræfter kan fastgørelsen af skærehåndtag til molekylet af interesse blive nødvendig. Til fremtidige anvendelser kan den forskydningskraftbaserede EFS potentielt bruges til at studere forskellige mekanokemiske fænomener, hvor kemiske reaktioner, såsom analytgenkendelse15 og polymerisering af syntetiske polymerer, påvirkes af mekaniske kræfter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette forskningsarbejde blev støttet af National Science Foundation [CBET-1904921] og National Institutes of Health [NIH R01CA236350] til H. M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V.
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H.
