Summary
We presenteren een protocol om anti-hepatitis B-virus (HBV) verbindingen te screenen gericht op pre- en post-virale entry lifecycle stadia, met behulp van isothermische titratie calorimetrie om bindingsaffiniteit (KD) te meten met gastheer natrium taurocholaat cotransporting polypeptide. Antivirale werkzaamheid werd bepaald door de onderdrukking van virale levenscyclusmarkers (cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage).
Abstract
Hepatitis B-virus (HBV) infectie is beschouwd als een cruciale risicofactor voor hepatocellulair carcinoom. De huidige behandeling kan alleen de virale lading verminderen, maar niet resulteren in volledige remissie. Een efficiënt hepatocytenmodel voor HBV-infectie zou een levensechte virale levenscyclus bieden die cruciaal zou zijn voor de screening van therapeutische middelen. De meeste beschikbare anti-HBV-middelen richten zich op levenscyclusstadia na virale binnenkomst, maar niet vóór virale binnenkomst. Dit protocol beschrijft de generatie van een competent hepatocytenmodel dat in staat is om te screenen op therapeutische middelen gericht op pre-virale entry en post viral entry lifecycle stadia. Dit omvat de targeting van natrium taurocholaat cotransporting polypeptide (NTCP) binding, cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage op basis van imHC of HepaRG als gastheercellen. Hier gebruikte de HBV-entry-inhibitietest curcumine om HBV-bindings- en transportfuncties via NTCP te remmen. De remmers werden geëvalueerd op bindingsaffiniteit (KD) met NTCP met behulp van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) - een universeel hulpmiddel voor HBV-geneesmiddelenscreening op basis van thermodynamische parameters.
Introduction
Hepatitis B-virus (HBV) infectie wordt wereldwijd beschouwd als een levensbedreigende ziekte. Chronische HBV-infectie is beladen met een risico op levercirrose en hepatocellulair carcinoom1. De huidige anti-HBV-behandeling richt zich vooral op post-virale entry met behulp van nucleos(t)ide analogen (NAs) en interferon-alfa (IFN-α)2,3. De ontdekking van een HBV-entryremmer, Myrcludex B, heeft een nieuw doelwit voor anti-HBV-middelen geïdentificeerd4. De combinatie van entryremmers en NA's bij chronische HBV heeft de virale lading aanzienlijk verminderd in vergelijking met die gericht op virale replicatie alleen 5,6. Het klassieke hepatocytenmodel voor de screening van HBV-entryremmers wordt echter beperkt door lage virale receptorniveaus (natrium taurocholaat cotransporting polypeptide, NTCP). De overexpressie van hNTCP in hepatoomcellen (d.w.z. HepG2 en Huh7) verbetert de HBV-infectiviteit 7,8. Niettemin drukken deze cellijnen lage niveaus van fase I- en II-enzymen uit die geneesmiddelen metaboliseren en vertonen ze genetische instabiliteit9. Hepatocytenmodellen die kunnen helpen bij het richten op verschillende mechanismen van kandidaat-anti-HBV-verbindingen zoals previrale invoer, NTCP-binding en virale entry, zouden de identificatie en ontwikkeling van effectieve combinatieregimes versnellen. De studie voor anti-HBV-activiteit van curcumine heeft de remming van virale entry opgehelderd als een nieuw mechanisme naast onderbreking van de post-virale binnenkomst. Dit protocol beschrijft een gastheermodel voor de screening van anti-HBV-ingangsmoleculen10.
Het doel van deze methode is om kandidaat-anti-HBV-verbindingen te onderzoeken voor virale entry-remming, met name het blokkeren van NTCP-binding en transport. Omdat NTCP-expressie een kritieke factor is voor HBV-invoer en -infectie, hebben we het hepatocytenrijpingsprotocol geoptimaliseerd om NTCP-niveaus11 te maximaliseren. Bovendien kan dit protocol het remmende effect op HBV-entry differentiëren als remming van HBV-aanhechting versus remming van internalisatie. De taurocholzuur (TCA) opnametest werd ook aangepast met behulp van een ELISA-gebaseerde methode in plaats van een radio-isotoop om NTCP-transport12,13 weer te geven. De receptor- en ligandinteractie werd bevestigd door hun 3D-structuren14,15. De remming van de NTCP-functie kan worden geëvalueerd door TCA-opnameactiviteit16 te meten. Deze techniek leverde echter geen direct bewijs van NTCP-binding aan de kandidaat-remmers. Daarom kan de binding worden onderzocht met behulp van verschillende technieken, zoals oppervlakteplasmonresonantie17, ELISA, fluorescentie-gebaseerde thermische verschuivingstest (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen en verschillende andere methoden20. Onder deze technieken is ITC een doelstandaard in bindingsanalyse omdat het warmteabsorptie of -emissie in bijna elke reactie kan observeren21. De bindingsaffiniteit (KD) van NTCP en kandidaat-verbindingen werd direct geëvalueerd met behulp van ITC; deze affiniteitswaarden waren nauwkeuriger dan die verkregen met behulp van het in silico voorspellingsmodel22.
Dit protocol heeft betrekking op technieken in hepatocytenrijping, HBV-infectie en screening op HBV-entryremmer. In het kort werd een hepatocytenmodel ontwikkeld op basis van imHC- en HepaRG-cellijnen. De gekweekte cellen werden binnen 2 weken gedifferentieerd tot volwassen hepatocyten. De upregulatie van NTCP-niveaus werd gedetecteerd met behulp van real-time PCR, western blot en flowcytometrie11. Hepatitis B-virion (HBVcc) werd geproduceerd en verzameld uit HepG2.2.15. De gedifferentieerde imHC of HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) werd profylactisch behandeld met de anti-HBV-kandidaten 2 uur voorafgaand aan de inenting met HBV-virion. De verwachte uitkomst van het experiment was de identificatie van de middelen die cellulaire HBV en infectiviteit verminderen. Anti-NTCP-activiteit werd geëvalueerd met behulp van de TCA-opnametest. NTCP-activiteit kan worden onderdrukt door de agenten die specifiek NTCP hebben gebonden. De ITC-techniek werd gebruikt om de haalbaarheid te onderzoeken van interactieve binding die remmers en hun doeleiwitten kon voorspellen, waarbij de bindingsaffiniteit (KD) van het ligand voor de receptor werd bepaald via niet-covalente interacties van het biomoleculaire complex23,24. KD ≥ 1 × 103 mM staat bijvoorbeeld voor een zwakke binding, KD ≥ 1 × 106 μM voor matige binding en KD ≤ 1 × 109 nM voor een sterke binding. De ΔG is direct gecorreleerd met bindingsinteracties. In het bijzonder is een reactie met negatieve ΔG een exergonische reactie, wat aangeeft dat binding een spontaan proces is. Een reactie met een negatieve ΔH geeft aan dat de bindingsprocessen afhankelijk zijn van waterstofbinding en Van der Waalskrachten. Zowel TCA-opname- als ITC-gegevens kunnen worden gebruikt om te screenen op anti-HBV-entry agents. De uitkomsten van deze protocollen kunnen een basis vormen voor niet alleen anti-HBV-screening, maar ook voor de interactie met NTCP zoals beoordeeld door bindingsaffiniteit en transportfunctie. Dit artikel beschrijft de voorbereiding en karakterisering van gastheercellen, experimenteel ontwerp en evaluatie van de anti-HBV-ingang samen met de NTCP-bindingsaffiniteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd in een klasse II biologische gevarenstroomkap of een laminaire stromingskap. De behandeling van HBV is ethisch goedgekeurd door de IRB (MURA2020/1545). Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle oplossingen, reagentia, apparatuur en cellijnen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Het voorbereiden van gastheercellen (volwassen hepatocyten)
- Kweekhepatocyten (3,75 × 105 cellen HepaRG of imHC) en onderhouden in een 75 cm2 kweekkolf met 10 ml DMEM/F12 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-glutamine, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine. Wacht tot de cellen 80% -90% samenvloeiing bereiken (binnen 1 week).
- Gooi het oude medium uit de kolf en was de cellen met 4 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Aspirateer de PBS en voeg 4 ml 0,05% trypsine-EDTA toe.
- Incubeer de kolf in de incubator van 37 °C gedurende 2-3 minuten en controleer de aanhangende cellen met een omgekeerde microscoop met een 10x objectieflens. Zorg ervoor dat de monolaag is losgemaakt van het kweekoppervlak.
- Rem het trypsine door 4 ml van het kweekmedium aangevuld met 10% FBS aan de kolf toe te voegen en de geoogste cellen zorgvuldig te resuspeneren. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 300 × g, 25 °C.
- Aspirateer het supernatant uit de celpellet en resuspenseer met 1-2 ml van het voorgewarmde kweekmedium aangevuld met 10% FBS en antibiotica.
- Meng 10 μL elk van de celsuspensie en trypan blue en tel de cellen met behulp van een hemacytometer. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cel hoger is dan 90% voordat u doorgaat naar de volgende stap.
- Zaad 1 × 106 cellen per 2 ml in elke put van een 6-well plaat en handhaven in DME / F12 volledig medium totdat de cellen 100% samenvloeiing bereiken.
- Bereid voor leverrijping hepatisch rijpingsmedium (Williams' E-medium aangevuld met 10% FBS, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 5 μg/ml insuline, 50 μM hydrocortison, 2 mM L-glutamine en 2% DMSO).
- Vervang het kweekmedium 2x per week.
- Houd de hepatocyten gedurende 2 weken in rijpingsmedium om rijpe hepatocyten te verkrijgen die klaar zijn voor HBV-infectie.
2. Kwantificering van cellulaire NTCP
- NTCP-expressie meten met behulp van real-time PCR
- Verzamel de pellet van volwassen hepatocyten door trypsinisatie (zie stappen 1.2-1.5).
- Extraheer totaal RNA uit de celpellet met behulp van een RNA-extractiekit met DNase I-behandeling.
- Synthetiseer cDNA uit 200 ng totaal RNA met behulp van een oligo-dT primer en reverse-transcriptiesysteem volgens de instructies van de fabrikant.
- Verdun het cDNA tot 50 ng/μL en gebruik het als sjabloon voor de PCR-reactie. Meng 2 μL van het verdunde cDNA met de PCR master mix reagentia die SYBR groene qRT-PCR Kit oplossing bevatten met 5 μM NTCP-specifieke primers (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' en 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
- Gebruik voor normalisatie GAPDH als huishoudgen met specifieke primers (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' en 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTCTC-3').
- Versterk de cDNA-monsters met behulp van een thermische cycler onder de volgende temperatuuromstandigheden: 1 cyclus van 3 minuten bij 95 °C (initiële denaturatie); 40 cycli van 30 s bij 95 °C (denaturatie), 30 s bij 60 °C tot 65 °C (gloeien), 30 s bij 72 °C (extensie); 1 cyclus van 5 min bij 72 °C (laatste verlenging).
- Bereken de NTCP-vouwverandering in volwassen hepatocyten over ongedifferentieerde cellen met behulp van GAPDH als kalibratorgen op basis van de 2-ΔΔCT-methode .
- NTCP kwantificeren met behulp van western blot-analyse
- Oogst hepatocyten met behulp van een celschraper en centrifugeer ze bij 300 x g, 25 °C gedurende 5 minuten om de celpellet te verzamelen.
- Volg de instructies van de RIPA-bufferfabrikant om het cellulaire eiwit te extraheren met 100 μL RIPA-buffer met 1x proteaseremmer.
- Meet de totale eiwitconcentratie met behulp van de bicinchonininezuur (BCA) methode.
- Meng 12,5 μL eiwit met 2x ladende kleurstof in een volumeverhouding van 1:1.
- Kook het eiwitmengsel en de standaardladder gedurende 5 min op 95 °C.
- Voeg 1x loopbuffer toe aan de elektroforesekamer.
- Laad 5 μL van de eiwitstandaardladder of 20 μL van het gekookte eiwitmengsel in een polyacrylamidegel van 10% (w/v).
- Voer gel-elektroforese uit: 50 V gedurende 30 minuten gevolgd door 90 V gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid een PVDF-membraan voor door het gedurende 30 s in methanol te weken, was het met dubbel gedestilleerd water gedurende 1-2 minuten en week het samen met twee stukken filterpapier in transferbuffer gedurende 10 minuten of tot gebruik.
- Plaats het filtreerpapier op de anodeplaat van een halfdroge overdrachtscel; plaats vervolgens het PVDF-membraan, de gel en het filterpapier erop, in die volgorde.
- Breng de eiwitten van de gel over naar het PVDF-membraan bij 10 V gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur.
- Blokkeer het membraan met WB-blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer het membraan met anti-natrium taurocholaat cotransporting polypeptide (anti-NTCP) (1:100 verdunning) bij 4 °C 's nachts.
- Was het membraan 3 x 10 min met TBST.
- Incubeer het membraan met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd geitenantikonijnantilichaam (1:10.000 verdunning) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was het membraan 3 x 10 min met TBST en vervolgens 1 x 5 min met TBS.
- Detecteer NTCP met behulp van een HRP-substraat (zie de tabel met materialen).
- Voeg ten minste 0,1 ml HRP-substraatoplossing/cm2 van het membraan toe en incubeer het membraan gedurende 3-5 minuten in het donker.
- Visualiseer NTCP met behulp van een Gel Documentation System in de chemiluminescentiemodus, selecteer de markeroptie voor het membraan, pas de belichtingstijd elke 1 min aan met de accumulatieve modus en maak de foto met verschillende belichtingstijden gedurende 5 minuten.
- Strip en sondeer de vlek met muis anti-GAPDH antilichaam (1:200.000 verdunning) en HRP-geconjugeerde geiten anti-muis secundair antilichaam (1:10.000 verdunning).
- Het NTCP-niveau meten met behulp van flowcytometrie
- Verzamel de celpellets van volwassen hepatocyten door de cellen gedurende 15 minuten te incuberen met 8 mM EDTA.
OPMERKING: Vermijd het gebruik van trypsine of andere proteasen die de receptoren van het celoppervlak kunnen verstoren. Omdat NTCP een celoppervlakreceptoreiwit is, kan schade als gevolg van trypsinisatie negatieve resultaten geven. - Fixeer de hepatocyten met 300 μL 3,7% paraformaldehyde in 1x PBS gedurende 15 min. Breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 × g, 25 °C.
- Was de cellen 2x met 700 μL 1x PBS met 1% FBS (v/v), centrifugeer gedurende 10 min bij 300 × g, 25 °C, voeg 300 μL van 0,05% Triton X-100 in PBS toe aan de celpellet en incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om ze te permeabiliseren.
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 300 × g, 25 °C, was de celpellet 3 x 1 min met 700 μL PBS met 1% FBS (v/v). Incubeer de cellen met het primaire antilichaam tegen NTCP (1:100 verdunning) bij 4 °C gedurende 30 min. Was de cellen 3 x 1 min met Perm/Wash buffer en centrifugeer gedurende 10 min bij 300 × g, 25 °C.
- Kleur de cellen met secundair antilichaam geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 bij 4 °C gedurende 30 minuten. Was de cellen 3 x 1 min met Perm/Wash buffer en centrifugeer gedurende 10 min bij 300 × g, 25 °C. Resuspendeer de celpellet met 200 μL PBS met 1% FBS (v/v).
- Schakel de flowcytometer in, warm de laser gedurende 15 minuten op en voer routinematige reiniging uit.
- Selecteer de meetparameters, waaronder forward scatter (FSC), side scatter (SSC) en fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) of phycoerythrin (PE), en stel de automatische compensatieaanpassing door de software in. Neem de compensatiecontrolemonsters op: niet-gebeitste controle, FITC-gekleurde controle en PE-gekleurde controle.
OPMERKING: FSC- en SSC-parameters worden gebruikt om de grootte en granulariteit van individuele cellen te bepalen om de celpopulatie te selecteren voor gating-analyse. De fluorescentiekanaaldetector heeft FITC- en PE-kanalen. Selecteer voor dit protocol het FITC-kanaal om Alexa Fluor 488 te detecteren. - Voer het niet-gekleurde monster uit met een gemiddeld vloeibaar debiet (60 μL/min), pas de drempel van FSC en SSC aan totdat ze de relevante celpopulatie bestrijken, markeer het poortgebied in dit gebied en pas alle compensatiecontroles toe.
- Stel de fluorescentiefotomultiplicatorbuis (PMT) in met behulp van de niet-gekleurde regeling en pas de PMT-spanning van FITC of PE in het negatieve kwadrant aan. Voer het positief gekleurde monster uit en pas FITC of PE aan in de positieve kwadrantschaal. Voer de niet-gekleurde, FITC-gekleurde of PE-gekleurde besturingselementen uit, bereken de compensatie en pas deze toe op de monsterinstellingen. Voer het hepatocytenmonster uit om het NTCP-niveau te meten.
- Analyseer de gekleurde hepatocyten met behulp van flowcytometersoftware (zie de tabel met materialen).
- Klik onder BD FACSuite-vensters op de bedieningsbuis op het tabblad Gegevensbronnen en wacht tot de onbewerkte gegevens verschijnen.
- Klik op het tabblad Werkblad aan de rechterkant op de knop Ellipse Gate , selecteer de celpopulatie in SSC en de FSC-dot plot met behulp van de muiscursor en wacht tot de cirkel P1 verschijnt.
- Klik op de intervalpoortknop en markeer het gebied in het FITC-histogram, beginnend bij de hoogste fluorescentie-intensiteitswaarde aan de rechterkant. Let op de lijn P2 die verschijnt.
- Klik op de experimentbuis en merk op dat de gegevens op het tabblad Werkblad veranderen. Klik op de knop Statistieken en vervolgens op de lege ruimte in het werkblad. Observeer de statistische waarden van de NTCP-populatie die verschijnen.
- Verzamel de celpellets van volwassen hepatocyten door de cellen gedurende 15 minuten te incuberen met 8 mM EDTA.
3. Productie van de van celcultuur afgeleide HBV-deeltjes (HBVcc)
- Kweek HepG2.2.15 in volledig medium (DMEM aangevuld met 10% FBS, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) in een petrischaaltje van 10 cm gedurende 24 uur.
- Vervang het volledige medium aangevuld met 380 μg/ml geneticine (G418) wanneer de HepG2.2.15 60%-70% samenvloeiing bereikt. Oogst het geconditioneerde medium om de 2 dagen; bewaar het medium dat HBV bevat bij 4 °C.
- Verwijder celresten door het supernatant gedurende 20 minuten te centrifugeren bij 5.000 × g, 4 °C. Verzamel het geconditioneerde medium met behulp van een spuit van 20 ml en filter het door een 0,45 μm eiwitarm filter om celresten te verwijderen.
- Om HBV te concentreren, verdunt u 1 volume concentrator met 3 volumes van het gefilterde supernatant uit stap 3.3 in een conische centrifugebuis en mengt u de oplossing zorgvuldig door buisinversie. Breng het mengsel gedurende 1 uur op 4 °C. Centrifugeer de oplossing gedurende 1 uur bij 1.500 × g, 4 °C en zorg ervoor dat een gebroken witte pellet zichtbaar is.
OPMERKING: Voeg voor elke 30 ml gefilterd supernatant uit stap 3.3 10 ml van de concentrator toe om 40 ml totaal volume te bereiken. - Evalueer de HBV-titer (genoomequivalent) met HBV 1,3-mer WT-replicon als een standaardcurve variërend van 1 × 102 tot 1 × 1010 met behulp van absolute real-time PCR, zoals eerder beschreven11.
- Reconstitueer de pellet voorzichtig in FBS en bewaar deze gedurende maximaal 1 jaar bij −80 °C in aliquots voor eenmalig gebruik.
4. Anti-HBV-invoertest
- Onderhoud 100% confluente imHC of HepaRG in 6-well platen in rijpingsmedium (2% DMSO in Williams' E medium, 10% FBS, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 5 μg/ml insuline, 50 μM hydrocortison en 2 mM L-glutamine) gedurende 2 weken en verander het medium 2x per week.
- Aspirateer het medium en voeg vervolgens de curcumine (10-30 μM) of 4 μM ciclosporine A (CsA) verdund met William's E-medium gedurende 2 uur toe. Aspirateer de kandidaat HBV entry inhibitor en vervang deze door 1 ml William's E medium met 4% polyethyleenglycol.
- Voeg HBV-deeltjes toe aan het kweekmedium bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 100 per put en incubeer bij 37 °C gedurende 18 uur. Gooi het supernatant weg, voeg 2 ml koude PBS toe en draai voorzichtig om het oude medium af te spoelen met ongebonden HBV.
- Voeg 2 ml compleet William's E medium en cultuur toe gedurende 7 dagen. Aspirateer het medium, was de cellen met 1x PBS en fixeer de cellen met 3,7% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Permeabiliseer en blokkeer de geïnfecteerde cellen met IF-blokkerende oplossing (0,2% Triton X-100 en 3% runderserumalbumine in PBS) en incubeer ze gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het primaire antilichaam (anti-HBV-kernantigeen) toe bij 1:200 verdunning in de blokoplossing en incubeer een nacht bij 4 °C. Was de cellen 3 x 1 min met wasoplossing (0,5% Tween 20 in PBS).
- Voeg secundair antilichaam (1:500 verdunning) toe aan de IF-blokkerende oplossing, incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en was de cellen 3 x 1 min met wasoplossing.
- Monteer het monster met antifade montagemedium met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) en dek af met een glazen afdeklip. Detecteer het fluorescentiesignaal met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een DAPI-filter (Ex 352-402 nM en Em 417-477) en een PE-filter (Ex 542-582 en Em 604-644), samen met een 20x objectieve lens, en bepaal de anti-HBV-entry-activiteit van de kandidaat-verbindingen.
5. Hbv-celbindingstest
- Onderhoud 100% confluente imHC of HepaRG in 6-well platen in rijpingsmedium (2% DMSO in Williams' E medium, 10% FBS, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 5 μg/ml insuline, 50 μM hydrocortison en 2 mM L-glutamine) gedurende 2 weken en verander het medium 2x per week.
- Aspirateer het medium en voeg vervolgens curcumine (10-30 μM) of ciclosporine A (4 μM) verdund in William's E-medium gedurende 2 uur toe. Aspirateer de HBV entry inhibitor en vervang deze door 1 ml William's E medium met 4% polyethyleenglycol.
- Voeg HBV-deeltjes toe aan het kweekmedium met een MOI van 100 per put en incubeer bij 4 °C gedurende 2 uur om HBV-binding aan de hepatocyten mogelijk te maken. Gooi het medium met ongebonden HBV weg, voeg 2 ml koude PBS toe en draai voorzichtig om sporen van het gebruikte medium te verwijderen.
- Oogst de geïnfecteerde cellen met behulp van een celschraper en verstoor de cellen met lysisbuffer. Breng het lysaat over naar een verzamelbuis en extraheer totaal DNA om het HBV-DNA te evalueren met behulp van real-time PCR met specifieke primers voor HBV (voorwaartse primer: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', en omgekeerde primer: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') met behulp van PRNP (forward primer: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', reverse primer: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') als interne controle.
- Versterk de PCR-producten in een thermische cycler met behulp van de temperatuuromstandigheden beschreven in stap 2.1.
- Bereken relatieve HBV DNA-niveaus/1 × 106 cellen in behandeling versus controle met BEHULP VAN PRNP als het kalibratorgen op basis van de 2-ΔΔCT-methode .
6. Taurocholzuur (TCA) opnametest
- Behoud 100% confluente imHC- en HepaRG-cellen in rijpingsmedium gedurende 14 dagen.
- Aspirateer het medium en was de hepatocyten met 1x PBS. Voeg curcumine of ciclosporine A (10-50 μM) verdund toe in William's E medium gedurende 2 uur. Vervang het medium door de natrium taurocholzuuroplossing (0,5 M natrium taurocholaathydraat in 1x HEPES) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspirateer de natrium taurocholzuuroplossing en was 3x met koude 1x HEPES. Voeg 300-500 μL koude 1x HEPES toe en oogst de cellen met celschrapers op ijs.
- Homogeniseer de cellen door ultrasoon geluid met een frequentie van 20 kHz gedurende 20 s en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Centrifugeer de lysaten bij 10.000 × g gedurende 20 minuten om celresten neer te slaan. Verzamel het supernatant en evalueer de intracellulaire taurocholzuurconcentratie met behulp van een TCA ELISA-testkit (zie de tabel met materialen).
7. Bepaling van eiwit-ligandinteracties met behulp van isothermische titratiecalorimetrie
OPMERKING: Dit testsysteem is ontwikkeld op basis van de MicroCal PEAQ-ITC (ITC-software).
- Bereid de buffer voor (50 mM Tris-HCl buffer, pH 7,0).
- Bereid 15 μM NTCP in de buffer.
- Bereid 150 μM kandidaat HBV-invoerremmeroplossingen in de buffer.
- Was de monstercel, de referentiecel en de spuit in het ITC-instrument met behulp van de buffer (stap 7.1.).
- Start de ITC-software door te dubbelklikken op het softwarepictogram in Windows-systemen. Selecteer onder het tabblad Experiment highlight uitvoeren de optie microCal-methode voor 19 Injection.itcm en klik op openen. Wanneer een nieuw venster wordt geopend, klikt u op het tabblad Schoon en selecteert u in het venster Reinigingsmethode de knop Wassen voor Celreinigingsmethode en de spoelknop voor Spuitreinigingsmethode. Klik op Volgende en volg de instructies op het scherm.
OPMERKING: De wasstap kan 1,4 uur in beslag nemen.
- Start de ITC-software door te dubbelklikken op het softwarepictogram in Windows-systemen. Selecteer onder het tabblad Experiment highlight uitvoeren de optie microCal-methode voor 19 Injection.itcm en klik op openen. Wanneer een nieuw venster wordt geopend, klikt u op het tabblad Schoon en selecteert u in het venster Reinigingsmethode de knop Wassen voor Celreinigingsmethode en de spoelknop voor Spuitreinigingsmethode. Klik op Volgende en volg de instructies op het scherm.
- Laad het monster in de ITC; klik op het tabblad Experiment uitvoeren op de knop Laden en lees de instructies op het scherm. Klik op Volgende en volg de video-instructies totdat deze laadstap is voltooid.
- Vul de referentiecel met een oplossingsbuffer met behulp van een spuit. Vul de monstercel met 15 μM NTCP in buffer met behulp van een spuit en verwijder de overtollige NTCP-oplossing over de monstercel. Vul de spuit met 150 μM oplossing van de curcumine (ligand) en vermijd luchtbellen in de spuit.
- Voer het voorbeeld uit en klik op het tabblad Experiment uitvoeren op de knop Uitvoeren . Observeer de vensters aan de linkerkant met experimentele informatie en experimentele instellingen. Voer de ligand- en eiwitconcentraties in als 150 μM in [Syr], 15 μM in [Cel] en 25 °C in temperatuur.
- Klik in de software op start om het injectieproces uit te voeren en wacht 1,4 uur totdat de eiwit-ligandinteractie is voltooid.
OPMERKING: De vervaagde analyseknop verschijnt onder de softwarevensters. - Merk op dat de analyseknop helderder wordt nadat de injectie is voltooid. Klik op de analyseknop in de besturingssoftware om de onbewerkte gegevens te analyseren met behulp van de analysesoftware. Klik op overzicht om de onbewerkte gegevens weer te geven en kies het montagemodel als One Set of Binding Site.
- Zorg ervoor dat de bindingsstatus de experimentele gegevens weergeeft (binding, geen binding, controle of controlegegevens) en dat de experimentwaarden (KD, ΔG, ΔH, TΔS en N) worden weergegeven in het softwarepaneel.
- Exporteer de thermodynamische parameters die de interactiebinding voorspellen, waaronder waterstofbrug, van der Waals-binding en hydrofobe interactie in tif- of jpeg-formaat.
- Nadat het experiment is voltooid, wast u de monstercel volgens stap 7.4.
8. Statistische analyse
- Voer alle experimenten uit in drie onafhankelijke replicaties (n = 3).
- Presenteer experimentele gegevens als middel ± SD en voer statistische analyses uit met behulp van de gewenste statistische analysesoftware.
- Gebruik een tweezijdige ongepaarde studentent-test om twee gemiddelde waarden te vergelijken of pas eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) toe met Dunnett voor meerdere vergelijkingen tussen meerdere waarden tot een controlewaarde. Stel het significantieniveau in op p ≤ 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatische rijpingskenmerken werden waargenomen, waaronder binucleated cellen en polygonaalvormige morfologie (figuur 1), vooral in het gedifferentieerde stadium van imHC (figuur 1A). Een grote toename van NTCP-expressie werd gemeten in d-HepaRG en d-imHC bij respectievelijk 7-voudig en 40-voudig (figuur 1B). De sterk geglycosyleerde vorm van NTCP, waarvan wordt gepostuleerd dat deze vatbaar is voor HBV-entry, werd meer gedetecteerd in d-imHC dan in d-HepaRG (figuur 1C). De gedifferentieerde imHC bevatte 65,9% hogere NTCP-waarden dan de ongedifferentieerde cellen (figuur 1D).
Figuur 2A toont een samenvatting van de profylactische behandeling. Figuur 2B toont HBV-immunofluorescentiekleuring uitgevoerd om de anti-HBV-entry-activiteiten op dag 7 na infectie te evalueren, terwijl figuur 2C het HBV-bindingstestprotocol schetst. Het niveau van HBV-binding op de celoppervlakreceptor werd geëvalueerd met real-time PCR (figuur 2D). Om te bepalen of NTCP de receptor was voor HBV-hechting, werd de TCA-opname bepaald voor de kandidaat-bindingsremmers (figuur 2E). Op basis van dit model verminderde de vermeende remmende activiteit van kandidaat-verbindingen de HBV-binding via NTCP.
De calorimetrische verandering werd gedetecteerd met continue injecties in de monstercel (figuur 3). Een standaard niet-lineaire kleinste kwadratenregressie werd uitgezet op basis van één bindingsplaats die goed bij de gegevens paste. De ononderbroken lijn gaf aan wat het beste bij de experimentele waarden paste (figuur 3A,B). Tabel 1 toont thermodynamische parameters gecorreleerd met de binding van NTCP met ciclosporine A (CsA) of een kandidaat-verbinding.
Figuur 1: Leverrijping van HepaRG en imHC met NTCP-karakterisering. Beide cellijnen werden gedurende 2 weken gekweekt in leverrijpingsmedium. (A) Hepatocytenkenmerken zoals binucleated cellen en polygonaalvormige morfologie werden uitsluitend waargenomen in de rijpingsfase van imHC. Schaalstaven = 50 μm. (B) De expressie van NTCP werd zowel in HepaRG als imHC geupreguleerd. NTCP genormaliseerd met GAPDH was hoger in imHC dan in HepaRG. (C) Een sterk geglycosyleerde vorm van NTCP werd waargenomen na rijping. (D) Percentage van NTCP-verhoging in d-imHC werd geëvalueerd met behulp van flowcytometrie. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. *, **, en *** vertegenwoordigen statistisch verschil met respectievelijk p < 0,05, p < 0,01 en p < 0,001. Afkortingen: NTCP = natrium taurocholaat cotransporting polypeptide; GAPDH = glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase; NTCP-FITC = fluoresceïne isothiocyanaat-gelabeld NTCP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Profylactische CCM-behandeling verminderde virale entry, intracellulair HBV-DNA en TCA-opnameactiviteit. (A) d-imHC werden voorbehandeld met CCM gedurende 2 uur voorafgaand aan de inenting met HBV. (B) Anti-HBV entry activiteit werd bepaald door immunofluorescentie kleuring op dag 7 na infectie. (C) Een schematisch schema van het HBV-bindingsprotocol wordt gepresenteerd. (D) Het niveau van gebonden HBV-DNA op hepatocyten werd geëvalueerd en vergeleken met 4 μM CsA en de klassieke HBV-entryremmer 25 eenheden/ml heparine. (E) Het effect van de 10-30 μM CCM op de TCA-opnameremming werd gemedieerd via de NTCP-receptor. Afkortingen: CCM = curcumine; HBV = hepatitis B-virus; TCA = taurocholzuur; d-imHC = gedifferentieerde imHC; CsA = ciclosporine A; HP = heparine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De affiniteit van NTCP met individuele moleculen (CsA of kandidaat-verbinding) werd aangetoond met behulp van ITC. Het ITC-profiel voor de combinatie van NTCP met (A) CsA of (B) curcumine werd gegenereerd door sequentiële injectie van een verbinding (150 μM CsA of kandidaat) in de NTCP-oplossing (15 μM NTCP, pH 7,0, 25 °C). De calorimetrische ruwe gegevens tussen differentieel vermogen (μcal/s) en tijd (min) werden uitgezet. De gegevens werden geanalyseerd op basis van een bindingsmodel op één locatie waarbij de ononderbroken lijnen de best passende resultaten aangaven. Tijdens de injectie van liganden (CSA of curcumine) in de NTCP-oplossing veranderde de enthalpie (ΔH) na een toename van de ligandconcentratie in de monstercel. Deze gegevens geven aan dat de bindingsreactie heeft plaatsgevonden. Afkortingen: CsA = cyclosporine A; NTCP = natrium taurocholaat cotransporting polypeptide; ITC = isothermische titratiecalorimetrie; DP = differentieel vermogen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Eiwit | Ligand | Bindingsconstante (KD) | Enthalpie verandering (ΔH) | Entropie verandering (ΔTΔS) | Gibbs Vrije Energie verandering (ΔG) | Type binding |
| (M-1) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | |||
| Menselijke NTCP (SLA10A1) | CCM | 1,21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | Waterstofbrug |
| Menselijke NTCP (SLA10A1) | TCA | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | Hydrofobe interactie |
Tabel 1: Thermodynamische parameters die het gevolg zijn van de interactie tussen NTCP en individuele verbindingen (CCM en TCA) met behulp van ITC. Afkortingen: NTCP = natrium taurocholaat cotransporting polypeptide; CCM = curcumine; TCA = taurocholzuur; ITC = isothermische titratiecalorimetrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HBV-infectie wordt geïnitieerd via binding met lage affiniteit aan heparansulfaatproteoglycanen (HSPG's) op hepatocyten25, gevolgd door de binding aan NTCP met daaropvolgende internalisatie via endocytose26. Aangezien NTCP een cruciale receptor is voor HBV-entry, kan targeting hbv-entry klinisch worden vertaald om de novo infectie, moeder-op-kindtransmissie (MTCT) en recidief na levertransplantatie te verminderen. Het onderbreken van virale invoer zou een haalbare alternatieve remedie zijn voor chronische HBV-infectie.
Enkele kritieke stappen in het bovengenoemde protocol worden hier samengevat. Zorg er bij het voorbereiden van gastheercellen voor dat hepatocyten 100% samenvloeiing bereiken voordat u het rijpingsmedium met 2% DMSO toevoegt. Het kweken van subconfluente hepatocyten in 2% DMSO zal leiden tot celdood en onthechting. De rijpingsperiode kan worden verlengd tot 4 weken om NTCP-expressie27,28 te maximaliseren, hoewel een rijpingsperiode van 2 weken wordt aanbevolen.
Er zijn drie technieken voorgesteld voor de kwantificering van cellulaire NTCP-expressie. Het wordt aanbevolen dat gebruikers de techniek selecteren waarmee ze het meest vertrouwd zijn; hier gaven we de voorkeur aan flowcytometrie boven western blot-analyse omdat het handig, snel en gemakkelijk is.
Voor de productie van de van celkweek afgeleide HBV-deeltjes (HBVcc) werd HepG2.2.15 afgeleid van HepG2 door voorbijgaande transfectie met HBV-genoom over de volledige lengte samen met het resistentiegen geneticïne (G418)29. Het kweekmedium moet 380-500 μg/ml geneticine bevatten, anders produceren de cellen geen HBVcc. Het laag-eiwitbindende filter van 0,45 μm moet worden gebruikt om het supernatant te verduidelijken om te voorkomen dat de HBV-opbrengst verloren gaat. Voor het concentreren van HBV werd polyethyleenglycol (PEG) gebruikt met een standaardcentrifuge. HBV-deeltjes kunnen ook worden geconcentreerd met behulp van een sucrosegradiënt en ultracentrifugatie. Meerdere vries- en dooicycli moeten worden vermeden, omdat de infectiviteit zal afnemen.
In de anti-HBV entry assay moeten de hepatocyten 100% confluence bereiken vóór rijpingsinductie. Dit protocol is ontwikkeld op basis van profylactische behandeling. Gastheercellen werden gedurende 2 uur voorafgaand aan de infectie met HBV12 blootgesteld aan de kandidaat-verbindingen. Na 7 dagen na de infectie werd de HBV-infectiviteit geëvalueerd met behulp van immunofluorescentie. Alle componenten, concentraties van de blokkerende oplossing, primaire en secundaire antilichamen en wasstappen moeten worden geoptimaliseerd om het beste resultaat te bereiken met minimale niet-specifieke kleuring. Hier hebben we geoptimaliseerde concentraties en technieken geleverd.
Het TCA-opnametestprotocol beschrijft de gouden standaard voor de remming van NTCP-transport. We hebben het protocol aangepast om radioactieve TCA te vermijden. De kritieke stappen voor de TCA-opnametest zijn het wassen en oogsten van cellen. Al deze procedures moeten de hele tijd op ijs worden uitgevoerd om verdere cellulaire activiteit-internalisatie van de verbinding te voorkomen. Na het homogeniseren van de cellen en het pelleteren van celresten, moet het supernatant voorzichtig worden geaspireerd zonder de pellet te verstoren. Als de faciliteit van de gebruiker het gebruik van de vloeibare scintillatietechniek toestaat, wordt 3H-taurocholzuur vaak gebruikt in TCA-transport- en opnamestudies. Omdat we de opname van TCA met behulp van ELISA hebben gevalideerd, kan deze alternatieve techniek het gebruik van de radioactieve verbinding vervangen.
ITC is een biofysische methode die veel wordt gebruikt om de thermodynamische parameters te bepalen die verband houden met de interacties tussen oplosbare eiwitten en liganden met een klein molecuulgewicht30,31. Deze techniek kan worden gebruikt om de interactie van verschillende liganden met een klein molecuul of eiwit te onderzoeken. ITC is een directe en niet-invasieve methode zonder extra stappen voor signaaldetectie, geen moleculaire gewichtsbeperkingen en geen etikettering, immobilisatie of andere chemische modificatie. De beperking van ITC is de voorwaarde voor hoge concentraties van de op elkaar inwerkende materialen. Eiwit en ligand moeten sterk gezuiverd zijn en voldoende oplosbaar in water (10-100 μM) bij 25 °C gedurende 1 uur met roeren. De onstabiele eiwitoplossing kan worden gedetecteerd door warmtesignaalverandering als functie van de tijd.
Human enhanced-NTCP hepatocyten bieden een alternatief model voor de in vitro studie van HBV-infectie, maar zijn vergelijkbaar met HepaRG en primaire menselijke hepatocyten. Deze hostmodellen worden gehinderd door hun beperkte betrouwbaarheid en gevoeligheid 8,33. De inefficiënte HBV-propagatie in HepG2-NTCP- of Huh7-NTCP-cellen werd aangetoond door lage HBV-entmateriaal afgeleid van HBVcc-producerende cellen. In verschillende studies werd HBV gebruikt om de doelcellen te infecteren bij een MOI van 1.00033,34. De subvirale deeltjes in HBVcc bevatten HBV-enveloppe-eiwit (L/M/S) en binden NTCP competitief, wat resulteert in verminderde infectiviteit35. Om deze beperking te overwinnen, heeft dit protocol HepaRG- of imHC-cultuur aangepast met een rijpingsprotocol om de NTCP-niveaus te maximaliseren. HBVcc afgeleid van HepG2.2.15 werd geconcentreerd voordat het als entmateriaal werd gebruikt. De HBV-infectiviteit was hoger dan 80% in gedifferentieerde imHC op basis van de meting van het HBV-kernantigeen11.
We hebben de identificatie beschreven van anti-HBV-verbindingen gericht op NTCP om virale binnenkomst te onderbreken en hebben een leverrijpingsprocedure aangenomen om de NTCP-niveaus te verhogen. Om entryremmers te identificeren, werden hepatocyten voorbehandeld met kandidaat-verbindingen gedurende 2 uur vóór de infectie met HBV bij 4 °C om virale binding mogelijk te maken, maar geen entry. De afname van hbv-infectiviteit werd geëvalueerd op dag 7 na infectie. De representatieve gegevens omvatten ciclosporine A, een klassieke NTCP-remmer, als een positieve controle om het model te valideren.
Aangezien NTCP zowel transporter- als receptorgemedieerde endocytosefuncties faciliteert, kunnen HBV-entryremmers zich op ten minste één van deze mechanismen richten. De remming van NTCP-transport kan worden geëvalueerd met behulp van een TCA-opnametest op basis van ELISA, waarbij de radioactieve TCA uit het klassieke protocol36 wordt geëlimineerd. De affiniteit tussen NTCP en de entryremmer werd gemeten met behulp van ITC. Deze techniek leverde essentiële thermodynamische parameters op, waaronder de stoichiometrie (n), dissociatieconstante (KD), verandering in vrije energie (ΔG), enthalpie (ΔH), entropie (ΔS) en warmtecapaciteit van binding (ΔCp). Verschillende anti-HBV-middelen zijn geïdentificeerd door moleculaire docking, zoals quercetine, rutine, hesperidine en luperol, die specifiek HBV reverse transcriptase kunnen binden, vergelijkbaar met lamivudine, een nucleoside-analoog. De verbindingen werden onderzocht met behulp van ITC en vertoonden negatieve Gibb-energie (−ΔG) variërend van −9,3 tot -5,2 kcal/mol en KD van 1 × 10-6 tot 1 × 10-3 M met HBV-polymerase37. Alles bij elkaar genomen zullen de gegevens verkregen uit deze bovengenoemde assays helpen bij het screenen van de antivirale werkzaamheid van kandidaat-verbindingen die fungeren als HBV-entryremmers. Het vastgestelde protocol zal nuttig zijn voor het ontdekken van nieuwe NTCP-antagonisten/-remmers. De onderdrukking van virale binnenkomst kan nuttig zijn bij profylactische en therapeutische behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Dit onderzoeksproject wordt ondersteund door Mahidol University en de Thailand Science Research and Innovation (TSRI) afzonderlijk toegekend aan A. Wongkajornsilp en K. Sa-ngiamsuntorn. Dit werk werd financieel ondersteund door het Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council via de Program Management Unit for Competitiveness (subsidienummer C10F630093). A. Wongkajornsilp is een ontvanger van een Chalermprakiat-beurs van de Faculteit der Geneeskunde Siriraj Hospital, Mahidol University. De auteurs willen miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) bedanken voor haar hulp bij de ITC-techniek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J.
- Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
- Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
- Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
- Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
- Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
- Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
- Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
- Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
- Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
- Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
- Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
- Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
- Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
- Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
- Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
- Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
- Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
- Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
- Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
- Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
- Srivastava, V. K., Yadav, R. Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).
- Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
- Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
- Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
- Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
- Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
- Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).
