Summary
Nous présentons un protocole pour dépister les composés anti-virus de l’hépatite B (VHB) ciblant les étapes du cycle de vie d’entrée pré et post-virale, en utilisant la calorimétrie de titrage isotherme pour mesurer l’affinité de liaison (KD) avec le polypeptide cotransportant le taurocholate de sodium de l’hôte. L’efficacité antivirale a été déterminée par la suppression des marqueurs du cycle de vie viral (formation d’ADNcc, transcription et assemblage viral).
Abstract
L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) a été considérée comme un facteur de risque crucial pour le carcinome hépatocellulaire. Le traitement actuel ne peut que réduire la charge virale, mais n’entraîne pas de rémission complète. Un modèle hépatocytes efficace pour l’infection par le VHB offrirait un cycle de vie viral réaliste qui serait crucial pour le dépistage des agents thérapeutiques. La plupart des agents anti-VHB disponibles ciblent les étapes du cycle de vie après l’entrée virale, mais pas avant l’entrée virale. Ce protocole détaille la génération d’un modèle d’hépatocytes compétent capable de dépister des agents thérapeutiques ciblant les étapes du cycle de vie de l’entrée prévirale et post-entrée virale. Cela comprend le ciblage de la liaison au polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium (NTCP), la formation d’ADNCC, la transcription et l’assemblage viral basés sur l’imHC ou l’HepaRG en tant que cellules hôtes. Ici, le test d’inhibition de l’entrée du VHB a utilisé la curcumine pour inhiber les fonctions de liaison et de transport du VHB via NTCP. L’affinité de liaison (KD) avec le PNCB avec le PNCB a été évaluée à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC), un outil universel pour le dépistage des médicaments contre le VHB basé sur des paramètres thermodynamiques.
Introduction
L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est considérée comme une maladie potentiellement mortelle dans le monde entier. L’infection chronique par le VHB est chargée d’un risque de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire1. Le traitement anti-VHB actuel se concentre principalement sur l’entrée post-virale à l’aide d’analogues nucléos(t)ide (NA) et d’interféron alpha (IFN-α)2,3. La découverte d’un inhibiteur de l’entrée du VHB, Myrcludex B, a permis d’identifier une nouvelle cible pour les agents anti-VHB4. La combinaison d’inhibiteurs d’entrée et d’AN dans le VHB chronique a considérablement réduit la charge virale par rapport à ceux ciblant uniquement la réplication virale 5,6. Cependant, le modèle classique d’hépatocytes pour le dépistage des inhibiteurs de l’entrée du VHB est limité par de faibles niveaux de récepteurs viraux (polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium, NTCP). La surexpression du PCNh dans les cellules d’hépatome (c.-à-d. HepG2 et Huh7) améliore l’infectiositédu VHB 7,8. Néanmoins, ces lignées cellulaires expriment de faibles niveaux d’enzymes métabolisant les médicaments de phase I et II et présentent une instabilité génétique9. Les modèles hépatocytes qui peuvent aider à cibler des mécanismes distincts des composés anti-VHB candidats tels que l’entrée prévirale, la liaison au PNCP et l’entrée virale accéléreraient l’identification et le développement de schémas thérapeutiques combinés efficaces. L’étude sur l’activité anti-VHB de la curcumine a élucidé l’inhibition de l’entrée virale en tant que nouveau mécanisme en plus de l’interruption post-entrée virale. Ce protocole détaille un modèle hôte pour le criblage des molécules d’entrée anti-VHB10.
L’objectif de cette méthode est d’explorer des composés anti-VHB candidats pour l’inhibition de l’entrée virale, en particulier le blocage de la liaison et du transport du NTCP. Comme l’expression du PNCP est un facteur critique pour l’entrée et l’infection du VHB, nous avons optimisé le protocole de maturation des hépatocytes pour maximiser les niveaux de NTCP11. En outre, ce protocole peut différencier l’effet inhibiteur sur l’entrée du VHB comme inhibition de l’attachement du VHB par rapport à l’inhibition de l’internalisation. Le test d’absorption de l’acide taurocholique (TCA) a également été modifié à l’aide d’une méthode basée sur ELISA au lieu d’un radio-isotope pour représenter le transport du PNCC12,13. L’interaction récepteur et ligand a été confirmée par leurs structures 3D14,15. L’inhibition de la fonction du PNCC peut être évaluée en mesurant l’activité d’absorption du TCA16. Cependant, cette technique n’a pas fourni de preuve directe de la liaison du PNCC aux inhibiteurs candidats. Par conséquent, la liaison peut être étudiée à l’aide de diverses techniques, telles que la résonance plasmoniquede surface 17, ELISA, le test de décalage thermique basé sur la fluorescence (FTSA)18, FRET 19, AlphaScreen et diverses autres méthodes20. Parmi ces techniques, l’ITC est un standard d’objectif dans l’analyse de liaison car il permet d’observer l’absorption ou l’émission de chaleur dans presque toutes les réactions21. L’affinité de liaison (KD) du PNCC et des composés candidats a été directement évaluée à l’aide de l’ITC; Ces valeurs d’affinité étaient plus précises que celles obtenues à l’aide du modèle de prédiction in silico 22.
Ce protocole couvre les techniques de maturation des hépatocytes, d’infection par le VHB et de dépistage des inhibiteurs d’entrée du VHB. En bref, un modèle d’hépatocytes a été développé à partir de lignées cellulaires imHC et HepaRG. Les cellules en culture ont été différenciées en hépatocytes matures en 2 semaines. La régulation positive des niveaux de NTCP a été détectée à l’aide de la PCR en temps réel, du transfert Western et de la cytométrieen flux 11. Le virion de l’hépatite B (VHB) a été produit et recueilli à partir de l’hépatite HepG2.2.15. L’icHC différencié ou HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) a été traité de manière prophylactique avec les candidats anti-VHB 2 h avant l’inoculation avec le virion du VHB. Le résultat attendu de l’expérience était l’identification des agents qui diminuent le VHB cellulaire et l’infectiosité. L’activité anti-PNCC a été évaluée à l’aide du test d’absorption du TCA. L’activité du PNCP pouvait être supprimée par les agents qui liaient spécifiquement le PNCP. La technique ITC a été utilisée pour étudier la faisabilité d’une liaison interactive qui pourrait prédire les inhibiteurs et leurs protéines cibles, en déterminant l’affinité de liaison (KD) du ligand pour le récepteur via des interactions non covalentes du complexe biomoléculaire23,24. Par exemple, K D ≥ 1 × 103 mM représente une liaison faible, K D ≥ 1 × 106 μM représente une liaison modérée et K D ≤ 1 × 109 nM représente une liaison forte. Le ΔG est directement corrélé avec les interactions de liaison. En particulier, une réaction avec ΔG négatif est une réaction exergonique, indiquant que la liaison est un processus spontané. Une réaction avec un ΔH négatif indique que les processus de liaison dépendent de la liaison hydrogène et des forces de Van der Waals. L’absorption du TCA et les données de l’ITC pourraient être utilisées pour dépister les agents anti-VHB. Les résultats de ces protocoles peuvent fournir une base non seulement pour le dépistage anti-VHB, mais aussi pour l’interaction avec le PNCP telle qu’évaluée par affinité de liaison et fonction de transport. Cet article décrit la préparation et la caractérisation des cellules hôtes, la conception expérimentale et l’évaluation de l’entrée anti-VHB ainsi que l’affinité de liaison NTCP.
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Protocol
NOTA: Les procédures suivantes doivent être effectuées dans une hotte à écoulement à risque biologique de classe II ou une hotte à écoulement laminaire. La manipulation du VHB a été approuvée sur le plan éthique par la CISR (MURA2020/1545). Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur toutes les solutions, réactifs, équipements et lignées cellulaires utilisés dans ce protocole.
1. Préparation des cellules hôtes (hépatocytes matures)
- Cultiver les hépatocytes (3,75 × 105 cellules HepaRG ou imHC) et conserver dans une fiole de culture de 75 cm2 avec 10 mL de milieu DMEM/F12 complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 % de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Attendez que les cellules atteignent 80%-90% de confluence (dans 1 semaine).
- Jeter l’ancien milieu de la fiole et laver les cellules avec 4 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Aspirer le PBS et ajouter 4 mL de trypsine-EDTA à 0,05%.
- Incuber la fiole dans l’incubateur à 37 °C pendant 2-3 min, et vérifier les cellules adhérentes à l’aide d’un microscope inversé avec une lentille d’objectif 10x. Assurez-vous que la monocouche s’est détachée de la surface de culture.
- Inhiber la trypsine en ajoutant 4 mL du milieu de culture supplémenté avec 10% de FBS dans le ballon et remettre soigneusement en suspension les cellules récoltées. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et centrifuger pendant 3 min à 300 × g, 25 °C.
- Aspirer le surnageant de la pastille cellulaire et remettre en suspension avec 1-2 mL du milieu de culture préchauffé complété avec 10% FBS et antibiotiques.
- Mélanger 10 μL de la suspension cellulaire et du bleu de trypan et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Assurez-vous que la viabilité de la cellule est supérieure à 90% avant de passer à l’étape suivante.
- Ensemencer 1 × 106 cellules par 2 mL dans chaque puits d’une plaque à 6 puits et maintenir dans un milieu complet DME/F12 jusqu’à ce que les cellules atteignent 100 % de confluence.
- Pour la maturation hépatique, préparer un milieu de maturation hépatique (milieu E de Williams complété par 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μM d’hydrocortisone, 2 mM de L-glutamine et 2 % de DMSO).
- Remplacez le milieu de culture 2x par semaine.
- Maintenir les hépatocytes dans le milieu de maturation pendant 2 semaines pour obtenir des hépatocytes matures prêts pour l’infection par le VHB.
2. Quantification du PNÇ cellulaire
- Mesure de l’expression du PNCC à l’aide de la PCR en temps réel
- Recueillir la pastille d’hépatocytes matures par trypsinisation (voir les étapes 1.2-1.5).
- Extraire l’ARN total de la pastille cellulaire à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN avec traitement à la DNase I.
- Synthétiser l’ADNc à partir de 200 ng d’ARN total à l’aide d’une amorce oligo-dT et d’un système de transcription inverse en suivant les instructions du fabricant.
- Diluer l’ADNc à 50 ng / μL et l’utiliser comme modèle pour la réaction PCR. Mélanger 2 μL de l’ADNc dilué avec les réactifs du mélange maître de PCR contenant la solution du kit qRT-PCR vert SYBR avec 5 μM d’amorces spécifiques au PNCT (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' et 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
- Pour la normalisation, utiliser GAPDH comme gène d’entretien ménager avec des amorces spécifiques (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' et 5'-AAATGAGCCAGCCTTCTC-3').
- Amplifier les échantillons d’ADNc à l’aide d’un thermocycleur dans les conditions de température suivantes : 1 cycle de 3 min à 95 °C (dénaturation initiale) ; 40 cycles de 30 s à 95 °C (dénaturation), 30 s à 60 °C à 65 °C (recuit), 30 s à 72 °C (extension); 1 cycle de 5 min à 72 °C (extension finale).
- Calculer le changement de pli NTCP dans les hépatocytes matures sur les cellules indifférenciées en utilisant GAPDH comme gène calibrateur basé sur la méthode 2-ΔΔCT .
- Quantifier le PNCC à l’aide de l’analyse par transfert Western
- Récolter les hépatocytes à l’aide d’un grattoir cellulaire et les centrifuger à 300 x g, 25 °C pendant 5 min pour recueillir la pastille cellulaire.
- Suivez les instructions du fabricant du tampon RIPA pour extraire la protéine cellulaire avec 100 μL de tampon RIPA contenant 1x inhibiteur de protéase.
- Mesurer la concentration totale de protéines à l’aide de la méthode de l’acide bicinchoninique (BCA).
- Mélanger 12,5 μL de protéines avec 2x colorant de charge dans un rapport de 1:1 par volume.
- Faire bouillir le mélange de protéines et l’échelle étalon à 95 °C pendant 5 min.
- Ajouter 1x tampon courant à la chambre d’électrophorèse.
- Charge 5 μL de l’échelle étalon des protéines ou 20 μL du mélange de protéines bouillies dans un gel de polyacrylamide à 10 % (p/v).
- Effectuer une électrophorèse sur gel : 50 V pendant 30 min puis 90 V pendant 1 h à température ambiante.
- Préparez une membrane PVDF en la trempant dans du méthanol pendant 30 s, lavez-la à l’eau bidistillée pendant 1-2 min, et faites-la tremper avec deux morceaux de papier filtre dans un tampon de transfert pendant 10 min ou jusqu’à utilisation.
- Placer le papier filtre sur la plaque anodique d’une cellule de transfert semi-sèche; Ensuite, placez la membrane PVDF, le gel et le papier filtre sur le dessus, dans cet ordre.
- Transférer les protéines du gel à la membrane PVDF à 10 V pendant 25 min à température ambiante.
- Bloquer la membrane avec une solution de blocage WB pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber la membrane avec un polypeptide cotransportant du taurocholate antisodique (anti-NTCP) (dilution 1:100) à 4 °C pendant une nuit.
- Laver la membrane 3 x 10 min avec TBST.
- Incuber la membrane avec un anticorps anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (dilution de 1:10 000) pendant 1 h à température ambiante.
- Laver la membrane 3 x 10 min avec TBST puis 1 x 5 min avec TBS.
- Détecter le PNCC à l’aide d’un substrat HRP (voir le tableau des matériaux).
- Ajouter au moins 0,1 mL de solution de substrat HRP/cm2 de la membrane et incuber la membrane pendant 3 à 5 minutes dans l’obscurité.
- Visualisez le PNCC à l’aide d’un système de documentation sur gel en mode chimiluminescence, sélectionnez l’option de marqueur pour la membrane, ajustez le temps d’exposition avec le mode cumulatif toutes les 1 minutes et prenez la photo avec différents temps d’exposition pendant 5 minutes.
- Stripper et sonder le transfert avec un anticorps anti-GAPDH de souris (dilution de 1:200 000) et un anticorps secondaire anti-souris de chèvre conjugué HRP (dilution de 1:10 000).
- Mesure du niveau de PNCC à l’aide de la cytométrie en flux
- Recueillir les granulés cellulaires des hépatocytes matures en incubant les cellules avec 8 mM d’EDTA pendant 15 min.
REMARQUE: Évitez d’utiliser de la trypsine ou d’autres protéases qui peuvent perturber les récepteurs de surface cellulaire. Comme le NTCP est une protéine réceptrice de surface cellulaire, les dommages dus à la trypsinisation peuvent donner des résultats négatifs. - Fixer les hépatocytes avec 300 μL de paraformaldéhyde à 3,7% dans 1x PBS pendant 15 min. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger pendant 10 min à 300 × g, 25 °C.
- Laver les cellules 2x avec 700 μL de 1x PBS avec 1% FBS (v/v), centrifuger pendant 10 min à 300 × g, 25 °C, ajouter 300 μL de Triton X-100 à 0,05% dans du PBS à la pastille de cellule, et incuber les cellules à température ambiante pendant 20 min pour les perméabiliser.
- Centrifuger pendant 10 min à 300 × g, 25 °C, laver la pastille de la cellule 3 x 1 min avec 700 μL de PBS contenant 1% FBS (v/v). Incuber les cellules avec l’anticorps primaire contre le PNCP (dilution 1:100) à 4 °C pendant 30 min. Laver les cellules 3 x 1 min avec un tampon Perm/Wash et une centrifugeuse pendant 10 min à 300 × g, 25 °C.
- Colorer les cellules avec l’anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488 à 4 °C pendant 30 min. Laver les cellules 3 x 1 min avec un tampon Perm/Wash et une centrifugeuse pendant 10 min à 300 × g, 25 °C. Remettez en suspension la pastille de la cellule avec 200 μL de PBS avec 1% FBS (v / v).
- Allumez le cytomètre en flux, réchauffez le laser pendant 15 minutes et effectuez un nettoyage de routine.
- Sélectionnez les paramètres de mesure, y compris la diffusion directe (FSC), la diffusion latérale (SSC) et l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou la phycoérythrine (PE), et réglez le réglage de la compensation automatique par le logiciel. Inclure les échantillons de contrôle de compensation : contrôle non coloré, contrôle coloré FITC et contrôle coloré PE.
REMARQUE : Les paramètres FSC et SSC sont utilisés pour déterminer la taille et la granularité des cellules individuelles afin de sélectionner la population cellulaire pour l’analyse de contrôle. Le détecteur de canal de fluorescence a des canaux FITC et PE . Pour ce protocole, sélectionnez le canal FITC pour détecter Alexa Fluor 488. - Exécuter l’échantillon non coloré avec un débit fluidique moyen (60 μL/min), ajuster le seuil de FSC et de SSC jusqu’à ce qu’ils couvrent la population cellulaire d’intérêt, marquer la région de la porte dans cette zone et appliquer à tous les contrôles de compensation.
- Réglez le tube photomultiplicateur de fluorescence (PMT) à l’aide de la commande non colorée et ajustez la tension PMT de FITC ou PE dans le quadrant négatif. Exécutez l’échantillon coloré positif et ajustez FITC ou PE dans l’échelle du quadrant positif. Exécutez les contrôles non tachés, FITC ou PE, calculez la compensation et appliquez-la aux paramètres de l’échantillon. Exécutez l’échantillon d’hépatocytes pour mesurer le niveau NTCP.
- Analyser les hépatocytes colorés à l’aide d’un logiciel de cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux).
- Sous les fenêtres BD FACSuite, cliquez sur le tube de contrôle dans l’onglet Sources de données et attendez que les données brutes apparaissent.
- Dans l’onglet Feuille de calcul sur le côté droit, cliquez sur le bouton Porte d’ellipse , sélectionnez la population de cellules dans SSC et le diagramme à points FSC à l’aide du curseur de la souris, puis attendez que le cercle P1 apparaisse.
- Cliquez sur le bouton Interval Gate et marquez la région dans l’histogramme FITC, en commençant par la valeur d’intensité de fluorescence la plus élevée vers la droite. Observez la ligne P2 qui apparaît.
- Cliquez sur le tube d’expérience et observez que les données de l’onglet Feuille de calcul changent. Cliquez sur le bouton Statistiques , puis sur l’espace vide dans la feuille de calcul. Observez les valeurs statistiques de la population du PNCET qui apparaissent.
- Recueillir les granulés cellulaires des hépatocytes matures en incubant les cellules avec 8 mM d’EDTA pendant 15 min.
3. Production des particules HBV dérivées de cultures cellulaires (HBVcc)
- Culture HepG2.2.15 en milieu complet (DMEM supplémenté avec 10% FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) dans une boîte de Petri de 10 cm pendant 24 h.
- Remplacer le milieu complet supplémenté par 380 μg/mL de génétique (G418) lorsque l’hépatite HepG2.2.15 atteint une confluence de 60 % à 70 %. Récolter le milieu conditionné tous les 2 jours; conserver le milieu contenant le VHB à 4 °C.
- Enlevez les débris cellulaires en centrifugeant le surnageant à 5 000 × g, 4 °C pendant 20 min. Prélever le milieu conditionné à l’aide d’une seringue de 20 mL et le filtrer à travers un filtre à faible liaison aux protéines de 0,45 μm pour éliminer les débris cellulaires.
- Pour concentrer le VHB, diluer 1 volume de concentrateur avec 3 volumes du surnageant filtré de l’étape 3.3 dans un tube centrifuge conique et mélanger soigneusement la solution par inversion de tube. Placer le mélange à 4 °C pendant 1 h. Centrifuger la solution pendant 1 h à 1 500 × g, 4 °C et s’assurer qu’une pastille blanc cassé est visible.
REMARQUE : Pour chaque tranche de 30 mL de surnageant filtré de l’étape 3.3, ajouter 10 mL du concentrateur pour atteindre 40 mL de volume total. - Évaluer le titre du VHB (équivalent du génome) avec le réplicon WT HBV 1,3-mer comme courbe standard allant de 1 × 102 à 1 × 1010 en utilisant la PCR absolue en temps réel, comme décrit précédemment11.
- Reconstituer délicatement la pastille dans du FBS et conserver jusqu’à 1 an à −80 °C dans des aliquotes à usage unique.
4. Test d’entrée anti-VHB
- Maintenir 100 % d’imHC confluent ou HepaRG dans des plaques à 6 puits dans un milieu de maturation (2 % de DMSO dans le milieu E de Williams, 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μM d’hydrocortisone et 2 mM de L-glutamine) pendant 2 semaines et changer le milieu 2x par semaine.
- Aspirer le milieu, puis ajouter la curcumine (10-30 μM) ou 4 μM de cyclosporine A (CsA) diluée avec le milieu E de William pendant 2 h. Aspirer le candidat inhibiteur d’entrée du VHB et le remplacer par 1 mL de milieu E de William contenant 4 % de polyéthylène glycol.
- Ajouter les particules de VHB au milieu de culture à une multiplicité d’infection (MOI) de 100 par puits et incuber à 37 °C pendant 18 h. Jeter le surnageant, ajouter 2 ml de PBS froid et agiter doucement pour rincer l’ancien milieu avec le VHB non lié.
- Ajouter 2 ml de milieu complet William’s E et cultiver pendant 7 jours. Aspirer le milieu, laver les cellules avec 1x PBS et fixer les cellules avec 3,7% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Perméabiliser et bloquer les cellules infectées avec une solution bloquante de l’IF (0,2% de Triton X-100 et 3% d’albumine sérique bovine dans du PBS) et les incuber pendant 60 min à température ambiante.
- Ajouter l’anticorps primaire (antigène central anti-VHB) à 1:200 de dilution dans la solution bloquante et incuber pendant une nuit à 4 °C. Laver les cellules 3 x 1 min avec une solution de lavage (0,5% Tween 20 dans PBS).
- Ajouter l’anticorps secondaire (dilution 1:500) à la solution bloquante de l’IF, incuber pendant 1 h à température ambiante et laver les cellules 3 x 1 min avec une solution de lavage.
- Montez l’échantillon avec un support de montage antifade avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et couvrez avec un couvercle en verre. Détecter le signal de fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un filtre DAPI (Ex 352-402 nM et Em 417-477) et d’un filtre PE (Ex 542-582 et Em 604-644), ainsi que d’une lentille d’objectif 20x, et déterminer l’activité d’entrée anti-HBV des composés candidats.
5. Test de liaison aux cellules HBV
- Maintenir 100 % d’imHC confluent ou HepaRG dans des plaques à 6 puits dans un milieu de maturation (2 % de DMSO dans le milieu E de Williams, 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μM d’hydrocortisone et 2 mM de L-glutamine) pendant 2 semaines et changer le milieu 2x par semaine.
- Aspirer le milieu, puis ajouter de la curcumine (10-30 μM) ou de la cyclosporine A (4 μM) diluée dans le milieu E de William pendant 2 h. Aspirer l’inhibiteur d’entrée du VHB et le remplacer par 1 mL de milieu E de William contenant 4 % de polyéthylèneglycol.
- Ajouter les particules de VHB au milieu de culture à une MOI de 100 par puits et incuber à 4 °C pendant 2 h pour permettre la liaison du VHB aux hépatocytes. Jeter le milieu contenant le VHB non lié, ajouter 2 mL de PBS froid et agiter doucement pour éliminer les traces du milieu usé.
- Récoltez les cellules infectées à l’aide d’un grattoir cellulaire et perturbez les cellules avec un tampon de lyse. Transférer le lysat dans un tube de prélèvement et extraire l’ADN total pour évaluer l’ADN du VHB en utilisant la PCR en temps réel avec des amorces spécifiques pour le VHB (amorce directe: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', et amorce inverse: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') en utilisant PRNP (amorce avant: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', amorce inverse: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') comme contrôle interne.
- Amplifier les produits de PCR dans un thermocycleur en utilisant les conditions de température décrites à l’étape 2.1.
- Calculer les taux relatifs d’ADN du VHB/1 × 106 cellules dans le traitement par rapport au contrôle en utilisant PRNP comme gène calibrateur basé sur la méthode 2-ΔΔCT .
6. Test d’absorption de l’acide taurocholique (TCA)
- Maintenir 100% de cellules confluentes imHC et HepaRG dans le milieu de maturation pendant 14 jours.
- Aspirer le milieu et laver les hépatocytes avec 1x PBS. Ajouter la curcumine ou la cyclosporine A (10-50 μM) diluée dans le milieu E de William pendant 2 h. Remplacer le milieu par la solution d’acide taurocholique sodique (0,5 M d’hydrate de taurocholate de sodium dans 1x HEPES) et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Aspirer la solution d’acide taurocholique sodique et laver 3x avec froid 1x HEPES. Ajouter 300-500 μL de froid 1x HEPES et récolter les cellules avec des grattoirs cellulaires sur de la glace.
- Homogénéiser les cellules par ultrasons à une fréquence de 20 kHz pendant 20 s et incuber sur glace pendant 5 min. Centrifuger les lysats à 10 000 × g pendant 20 min pour précipiter les débris cellulaires. Prélever le surnageant et évaluer la concentration intracellulaire d’acide taurocholique à l’aide d’une trousse de dosage TCA ELISA (voir le tableau des matériaux).
7. Détermination des interactions protéine-ligand par titrage calorimétrique isotherme
REMARQUE : Ce système d’analyse a été développé à partir du logiciel MicroCal PEAQ-ITC (ITC).
- Préparer le tampon (tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,0).
- Préparer 15 μM de NTCP dans le tampon.
- Préparer des solutions candidates d’inhibiteur d’entrée du VHB de 150 μM dans le tampon.
- Lavez la cellule d’échantillon, la cellule de référence et la seringue dans l’instrument ITC à l’aide du tampon (étape 7.1.).
- Lancez le logiciel ITC en double-cliquant sur l’icône du logiciel dans les systèmes Windows. Sous l’onglet Run experiment highlight (Exécuter la mise en surbrillance de l’expérience), sélectionnez microCal Method for 19 Injection.itcm (Méthode microCal pour 19 Injection.itcm) et cliquez sur Open (Ouvrir). Lorsqu’une nouvelle fenêtre s’ouvre, cliquez sur l’onglet Nettoyer, et dans la fenêtre Méthode de nettoyage, sélectionnez le bouton Lavage pour Méthode de nettoyage des cellules et le bouton Rincer pour Méthode de nettoyage à la seringue. Cliquez sur Suivant et suivez les instructions à l’écran.
REMARQUE: L’étape de lavage peut prendre 1,4 heure.
- Lancez le logiciel ITC en double-cliquant sur l’icône du logiciel dans les systèmes Windows. Sous l’onglet Run experiment highlight (Exécuter la mise en surbrillance de l’expérience), sélectionnez microCal Method for 19 Injection.itcm (Méthode microCal pour 19 Injection.itcm) et cliquez sur Open (Ouvrir). Lorsqu’une nouvelle fenêtre s’ouvre, cliquez sur l’onglet Nettoyer, et dans la fenêtre Méthode de nettoyage, sélectionnez le bouton Lavage pour Méthode de nettoyage des cellules et le bouton Rincer pour Méthode de nettoyage à la seringue. Cliquez sur Suivant et suivez les instructions à l’écran.
- Charger l’échantillon dans l’ITC; sous l’onglet Exécuter l’expérience , cliquez sur le bouton Charger et lisez les instructions à l’écran. Cliquez sur suivant et suivez les instructions vidéo jusqu’à ce que cette étape de chargement soit terminée.
- Remplir la cellule de référence avec un tampon de solution à l’aide d’une seringue. Remplir la cellule d’échantillon avec 15 μM de PNCE dans un tampon à l’aide d’une seringue et retirer l’excès de solution de PNCNT sur la cellule d’échantillon. Remplissez la seringue avec une solution de curcumine (ligand) de 150 μM, en évitant les bulles d’air dans la seringue.
- Exécutez l’exemple et, sous l’onglet Run Experiment (Exécuter l’expérience ), cliquez sur le bouton Run (Exécuter ). Observez les fenêtres sur le côté gauche montrant les informations expérimentales et le cadre expérimental. Entrez les concentrations de ligand et de protéines comme 150 μM dans [ Syr], 15 μM dans [Cell] et 25 °C en température.
- Dans le logiciel, cliquez sur Démarrer pour effectuer le processus d’injection et attendez 1,4 h pour que l’interaction protéine-ligand soit terminée.
REMARQUE: Le bouton d’analyse fané apparaît sous les fenêtres du logiciel. - Observez que le bouton d’analyse s’éclaircit une fois l’injection terminée. Cliquez sur le bouton d’analyse dans le logiciel de contrôle pour analyser les données brutes à l’aide du logiciel d’analyse . Cliquez sur Vue d’ensemble pour afficher les données brutes et choisissez le modèle d’ajustement comme un ensemble de site de liaison.
- Assurez-vous que l’état de liaison affiche les données expérimentales (données de liaison, d’absence de liaison, de contrôle ou de vérification) et que les valeurs d’expérience (KD, ΔG, ΔH, TΔS et N) sont présentées sur le panneau du logiciel.
- Exportez les paramètres thermodynamiques qui prédisent la liaison d’interaction, y compris la liaison hydrogène, la liaison van der Waals et l’interaction hydrophobe au format tif ou jpeg.
- Une fois l’expérience terminée, laver la cellule d’échantillon en suivant l’étape 7.4.
8. Analyse statistique
- Effectuer toutes les expériences dans trois répétitions indépendantes (n = 3).
- Présenter les données expérimentales comme moyen ± SD et effectuer des analyses statistiques à l’aide du logiciel d’analyse statistique souhaité.
- Utilisez un test t de Students bilatéral non apparié pour comparer deux valeurs moyennes ou appliquez une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) avec Dunnett pour des comparaisons multiples entre plusieurs valeurs et une valeur de contrôle. Définissez le seuil de signification à p ≤ 0,05.
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Representative Results
Des caractéristiques de maturation hépatique ont été observées, y compris des cellules binucléées et une morphologie de forme polygonale (Figure 1), en particulier au stade différencié de l’HCi (Figure 1A). Une forte augmentation de l’expression du PNNT a été mesurée dans le d-HepaRG et le d-imHC à 7 fois et 40 fois, respectivement (Figure 1B). La forme hautement glycosylée du PNCP, supposée conférer une susceptibilité à l’entrée du VHB, a été détectée davantage dans le d-HCm que dans le d-HepaRG (figure 1C). L’imHC différencié contenait des niveaux de NTCP 65,9 % plus élevés que les cellules indifférenciées (Figure 1D).
La figure 2A présente un résumé du traitement prophylactique. La figure 2B montre la coloration par immunofluorescence du VHB effectuée pour évaluer les activités d’entrée anti-VHB au jour 7 après l’infection, tandis que la figure 2C décrit le protocole de dosage de liaison du VHB. Le niveau de liaison du VHB sur le récepteur de surface cellulaire a été évalué par PCR en temps réel (Figure 2D). Pour déterminer si le PNCP était le récepteur de la fixation du VHB, l’absorption du TCA a été déterminée pour les inhibiteurs de liaison candidats (figure 2E). Sur la base de ce modèle, l’activité inhibitrice présumée des composés candidats a diminué la liaison du VHB par le NTCP.
L’altération calorimétrique a été détectée par des injections continues dans la cellule d’échantillonnage (Figure 3). Une régression standard des moindres carrés non linéaires a été tracée sur la base d’un site de liaison bien adapté aux données. La ligne continue indiquait le meilleur ajustement aux valeurs expérimentales (figure 3A,B). Le tableau 1 montre les paramètres thermodynamiques corrélés avec la liaison du PNCC avec la cyclosporine A (CsA) ou un composé candidat.
Figure 1 : Maturation hépatique de l’hépaRG et de l’HCim avec caractérisation du PNCP. Les deux lignées cellulaires ont été cultivées dans un milieu de maturation hépatique pendant 2 semaines. (A) Les caractéristiques des hépatocytes telles que les cellules binucléées et la morphologie polygonale ont été observées exclusivement au stade de maturation de l’HCim. Barres d’échelle = 50 μm. (B) L’expression du PNCC a été régulée à la hausse dans l’hépatite hépatique et l’HCim. Le PNCC normalisé avec GAPDH était plus élevé dans l’HCmi que dans l’hépatite HepaRG. (C) Une forme hautement glycosylée de NTCP a été observée après maturation. (D) Le pourcentage d’élévation du PNCC dans le d-imHC a été évalué par cytométrie en flux. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. *, **, et *** représentent la différence statistique avec p < 0,05, p < 0,01 et p < 0,001, respectivement. Abréviations : PNCE = polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium; GAPDH = glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase; NTCP-FITC = NTCP marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Le traitement prophylactique par CCM a diminué l’entrée virale, l’ADN intracellulaire du VHB et l’activité d’absorption du TCA. (A) Les HCm d ont été prétraités avec une ICN pendant 2 heures avant l’inoculation avec le VHB. (B) L’activité d’entrée anti-VHB a été déterminée par coloration par immunofluorescence le jour 7 après l’infection. (C) Un schéma du protocole de liaison du VHB est présenté. (D) Le niveau d’ADN lié du VHB sur les hépatocytes a été évalué et comparé à 4 μM CsA et à l’inhibiteur d’entrée classique du VHB 25 unités/ml d’héparine. (E) L’effet de la CCM de 10 à 30 μM sur l’inhibition de l’absorption du TCA a été médié par le récepteur NTCP. Abréviations : CCM = curcumine; VHB = virus de l’hépatite B; TCA = acide taurocholique; d-icHC = HCim différencié; CsA = cyclosporine A; HP = héparine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’affinité du PNCC pour des molécules individuelles (CsA ou composé candidat) a été démontrée à l’aide de l’ITC. Le profil ITC pour la combinaison du PNCC avec (A) CsA ou (B) curcumine a été généré par injection séquentielle d’un composé (150 μM CsA ou candidat) dans la solution NTCP (15 μM de PNCT, pH 7,0, 25 °C). Les données calorimétriques brutes entre la puissance différentielle (μcal/s) et le temps (min) ont été tracées. Les données ont été analysées sur la base d’un modèle de liaison à un seul site où les lignes continues indiquaient les résultats les mieux ajustés. Lors de l’injection de ligands (CSA ou curcumine) dans la solution NTCP, l’enthalpie (ΔH) a changé après une augmentation de la concentration du ligand dans la cellule échantillon. Ces données indiquent que la réaction de liaison s’est produite. Abréviations : CsA = cyclosporine A; PNCC = polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium; ITC = titrage calorimétrique isotherme; DP = puissance différentielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Protéine | Ligand | Constante de liaison (KD) | Changement d’enthalpie (ΔH) | Changement d’entropie (ΔTΔS) | Changement d’énergie libre de Gibbs (ΔG) | Type de reliure |
| (M-1) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | |||
| PNCC humain (SLA10A1) | CCM | 1.21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | Liaison hydrogène |
| PNCC humain (SLA10A1) | TCA | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | Interaction hydrophobe |
Tableau 1 : Paramètres thermodynamiques résultant de l’interaction entre le PNCC et les composés individuels (CCM et TCA) à l’aide de l’ITC. Abréviations : PNCE = polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium; CCM = curcumine; TCA = acide taurocholique; ITC = titrage calorimétrique isotherme.
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Discussion
L’infection par le VHB est initiée par une liaison de faible affinité aux protéoglycanes sulfate d’héparane (HSPG) sur les hépatocytes25, suivie de la liaison au PNCP avec internalisation ultérieure par endocytose26. Comme le PNCP est un récepteur crucial pour l’entrée du VHB, cibler l’entrée du VHB peut être cliniquement traduit pour diminuer l’infection de novo , la transmission mère-enfant (TME) et la récidive après une transplantation hépatique. L’interruption de l’entrée virale serait un remède alternatif réalisable pour l’infection chronique par le VHB.
Certaines étapes critiques du protocole susmentionné sont résumées ici. Lors de la préparation des cellules hôtes, assurez-vous que les hépatocytes atteignent 100% de confluence avant d’ajouter le milieu de maturation avec 2% de DMSO. La culture d’hépatocytes sous-confluents dans du DMSO à 2% entraînera la mort cellulaire et le détachement. La période de maturation peut être prolongée jusqu’à 4 semaines pour maximiser l’expression du PNCC27,28, bien qu’une période de maturation de 2 semaines soit recommandée.
Trois techniques ont été proposées pour la quantification de l’expression cellulaire du PNCP. Il est recommandé aux utilisateurs de choisir la technique qu’ils connaissent le mieux; Ici, nous avons préféré la cytométrie en flux à l’analyse par transfert Western parce qu’elle est pratique, rapide et facile.
Pour la production des particules HBV dérivées de cultures cellulaires (HBVcc), l’HepG2.2.15 a été dérivée de l’hépatite HepG2 par transfection transitoire avec le génome complet du VHB et le gène de résistance à la génétique (G418)29. Le milieu de culture doit contenir de la génétique de 380 à 500 μg/mL, sinon les cellules ne produiront pas le VHBVCC. Le filtre de 0,45 μm à faible liaison aux protéines doit être utilisé pour clarifier le surnageant afin d’éviter de perdre le rendement du VHB. Pour concentrer le VHB, le polyéthylène glycol (PEG) a été utilisé avec une centrifugeuse standard. Les particules de VHB peuvent également être concentrées à l’aide d’un gradient de saccharose et d’une ultracentrifugation. Les cycles multiples de gel et de dégel doivent être évités car l’infectiosité sera réduite.
Dans le test d’entrée anti-VHB, les hépatocytes doivent atteindre 100% de confluence avant l’induction de maturation. Ce protocole a été développé sur la base d’un traitement prophylactique. Les cellules hôtes ont été exposées aux composés candidats pendant 2 heures avant l’infection par le VHB12. 7 jours après l’infection, l’infectiosité du VHB a été évaluée par immunofluorescence. Tous les composants, les concentrations de la solution bloquante, les anticorps primaires et secondaires et les étapes de lavage doivent être optimisés pour obtenir le meilleur résultat avec un minimum de coloration non spécifique. Ici, nous avons fourni des concentrations et des techniques optimisées.
Le protocole d’essai d’absorption du TCA décrit l’étalon-or pour l’inhibition du transport du PNCP. Nous avons modifié le protocole pour éviter le TCA radioactif. Les étapes critiques pour l’essai d’absorption du TCA sont le lavage et la récolte des cellules. Toutes ces procédures doivent être effectuées sur de la glace tout le temps pour empêcher toute nouvelle internalisation de l’activité cellulaire du composé. Après homogénéisation des cellules et enrobage des débris cellulaires, le surnageant doit être aspiré doucement sans perturber la pastille. Si l’installation de l’utilisateur permet l’utilisation de la technique de scintillation liquide, l’acide 3H-taurocholique est couramment utilisé dans les études de transport et d’absorption du TCA. Comme nous avons validé l’absorption du TCA à l’aide d’ELISA, cette technique alternative peut remplacer l’utilisation du composé radioactif.
L’ITC est une méthode biophysique largement utilisée pour déterminer les paramètres thermodynamiques liés aux interactions entre les protéines solubles et les ligands de faible poids moléculaire30,31. Cette technique peut être utilisée pour étudier l’interaction de divers ligands avec une petite molécule ou une protéine. ITC est une méthode directe et non invasive sans étapes supplémentaires pour la détection du signal, sans limitation de poids moléculaire, et sans étiquetage, immobilisation ou toute autre modification chimique. La limitation de l’ITC est la condition préalable à de fortes concentrations des matériaux en interaction. Les protéines et les ligands doivent être hautement purifiés et suffisamment solubles dans l’eau (10-100 μM) à 25 °C pendant 1 h sous agitation. La solution protéique instable peut être détectée par changement de signal thermique en fonction du temps.
Les hépatocytes du PNCP améliorés chez l’homme fournissent un modèle alternatif pour l’étude in vitro de l’infection par le VHB, mais sont similaires à l’hépatite et aux hépatocytes humains primaires. Ces modèles hôtes sont entravés par leur fiabilité et leur sensibilité limitées 8,33. La propagation inefficace du VHB dans les cellules HepG2-NTCP ou Huh7-NTCP a été mise en évidence par un faible inoculum du VHB dérivé de cellules productrices de HBVcc. Dans plusieurs études, le VHB a été utilisé pour infecter les cellules cibles à une MOI de 1 00033,34. Les particules sous-virales dans HBVcc contiennent la protéine d’enveloppe du VHB (L / M / S) et se lient de manière compétitive au PNCP, ce qui entraîne une diminution de l’infectiosité35. Pour surmonter cette limitation, ce protocole a modifié la culture HepaRG ou imHC avec un protocole de maturation pour maximiser les niveaux de NTCP. Le VHBCC dérivé de l’HepG2.2.15 a été concentré avant d’être utilisé comme inoculum. L’infectiosité du VHB était supérieure à 80 % dans l’HCim différencié d’après la mesure de l’antigène11 du noyau du VHB.
Nous avons décrit l’identification de composés anti-VHB ciblant le PNCP pour interrompre l’entrée virale et adopté une procédure de maturation hépatique pour augmenter les niveaux de NTCP. Pour identifier les inhibiteurs d’entrée, les hépatocytes ont été prétraités avec des composés candidats pendant 2 h avant l’infection par le VHB à 4 °C pour permettre la liaison virale mais pas l’entrée. La diminution de l’infectiosité du VHB a été évaluée au jour 7 après l’infection. Les données représentatives incluaient la cyclosporine A, un inhibiteur classique du PNCD, comme témoin positif pour valider le modèle.
Étant donné que le PNCC facilite à la fois les fonctions d’endocytose médiées par le transporteur et les récepteurs, les inhibiteurs de l’entrée du VHB pourraient cibler au moins un de ces mécanismes. L’inhibition du transport du PNCC peut être évaluée à l’aide d’un test d’absorption du TCA basé sur ELISA, éliminant ainsi le TCA radioactif du protocole classique36. L’affinité entre le PNCP et l’inhibiteur d’entrée a été mesurée à l’aide de l’ITC. Cette technique a fourni des paramètres thermodynamiques essentiels, notamment la stœchiométrie (n), la constante de dissociation (KD), le changement d’énergie libre (ΔG), l’enthalpie (ΔH), l’entropie (ΔS) et la capacité thermique de liaison (ΔCp). Divers agents anti-VHB ont été identifiés par amarrage moléculaire, tels que la quercétine, la rutine, l’hespéridine et le lupérol, qui pourraient spécifiquement se lier à la transcriptase inverse du VHB comparable à la lamivudine, un analogue nucléosidique. Les composés ont été étudiés à l’aide de l’ITC et présentaient une énergie Gibb négative (−ΔG) allant de -9,3 à -5,2 kcal/mol et KD de 1 × 10-6 à 1 × 10-3 M avec la polymérase HBV37. Prises ensemble, les données obtenues à partir de ces tests susmentionnés aideront à dépister l’efficacité antivirale des composés candidats qui agissent comme inhibiteurs de l’entrée du VHB. Le protocole établi sera utile pour découvrir de nouveaux antagonistes et inhibiteurs du PNCP. La suppression de l’entrée virale pourrait être utile dans le traitement prophylactique et thérapeutique.
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Disclosures
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Ce projet de recherche est soutenu par l’Université Mahidol et le Thailand Science Research and Innovation (TSRI) attribué séparément à A. Wongkajornsilp et K. Sa-ngiamsuntorn. Ces travaux ont été soutenus financièrement par le Conseil de la politique de l’Office of National Higher Education, Science, Recherche et Innovation par l’intermédiaire de l’Unité de gestion du programme pour la compétitivité (numéro de subvention C10F630093). A. Wongkajornsilp est récipiendaire d’une bourse Chalermprakiat de la Faculté de médecine de l’hôpital Siriraj de l’Université Mahidol. Les auteurs tiennent à remercier Mlle Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculté des sciences, Université Mahidol) pour son aide avec la technique ITC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
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