Summary
Lo studio della guarigione delle ferite associata a lesioni muscoloscheletriche richiede spesso la valutazione delle interazioni in vitro tra cellule di Schwann (SC), cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo descrive l'isolamento, la coltura e la caratterizzazione di queste cellule primarie dal prepuzio umano.
Abstract
Questo protocollo descrive i metodi di isolamento, le condizioni di coltura e la caratterizzazione delle cellule primarie umane con alta resa e vitalità utilizzando una rapida dissociazione enzimatica della pelle. I cheratinociti primari, i fibroblasti e le cellule di Schwann sono tutti raccolti dal prepuzio neonato umano, che è disponibile seguendo le procedure standard di cura. La pelle rimossa viene disinfettata e il grasso sottocutaneo e il muscolo vengono rimossi usando un bisturi. Il metodo consiste nella separazione enzimatica e meccanica degli strati epidermico e dermico, seguita da un'ulteriore digestione enzimatica per ottenere sospensioni unicellulari da ciascuno di questi strati cutanei. Infine, le singole cellule vengono coltivate in terreni di coltura cellulare appropriati seguendo protocolli di coltura cellulare standard per mantenere la crescita e la vitalità per settimane. Insieme, questo semplice protocollo consente l'isolamento, la coltivazione e la caratterizzazione di tutti e tre i tipi di cellule da un singolo pezzo di pelle per la valutazione in vitro di modelli pelle-nervo. Inoltre, queste cellule possono essere utilizzate insieme in co-colture per valutare i loro effetti l'una sull'altra e le loro risposte al trauma in vitro sotto forma di graffi eseguiti roboticamente nella coltura associata alla guarigione delle ferite.
Introduction
Le cellule primarie derivate da tessuto vivente e coltivate in condizioni in vitro assomigliano molto allo stato fisiologico1, rendendole un modello ideale per indagare i processi fisiologici e fisiopatologici. La pelle contiene più tipi di cellule, tra cui cheratinociti, fibroblasti, sebociti, melanociti e cellule di Schwann (SC), che possono essere isolate e coltivate per esperimenti in vitro . Non sono stati descritti metodi per isolare e coltivare cheratinociti, fibroblasti e SC, da un singolo pezzo di pelle. L'obiettivo di questo protocollo è duplice: 1) stabilire un metodo affidabile e riproducibile per l'isolamento e la coltura di SC dermiche e 2) utilizzare un metodo efficiente e robusto per l'isolamento di cheratinociti, fibroblasti e SC da un singolo prepuzio umano.
Attualmente esistono protocolli consolidati per isolare i cheratinociti cutanei 2,3,4 e i fibroblasti 5,6. Questi studi descrivono l'isolamento di cheratinociti, fibroblasti o entrambi dalla pelle, ma nessun protocollo affronta come stabilire colture di SC primarie dalla pelle umana. Studi recenti suggeriscono che le SC neuronali modulano i processi cellulari dei cheratinociti e dei fibroblasti e regolano le normali funzioni fisiologiche della pelle7. Le SC sono quindi fondamentali per l'omeostasi cutanea e contribuiscono in modo sostanziale alla fisiologia regolata che influenza il comportamento dei tipi di cellule cutanee vicinepresenti 8. Pertanto, un protocollo che consente l'isolamento di ciascuno di questi tipi di cellule è ideale per esperimenti in vitro che coinvolgono la comunicazione cellula-cellula o cross-talk tra tipi di cellule.
Questo protocollo descrive la creazione di singole colture cellulari di cellule primarie da un singolo pezzo di pelle. Questo protocollo è particolarmente utile quando la quantità di tessuto disponibile è limitata. Inoltre, l'isolamento di tutti e tre i tipi di cellule da un singolo donatore consente solidi confronti tra tipi di cellule o esperimenti di co-coltura, mitigando al contempo l'influenza della genetica durante l'esperimento desiderato.
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Protocol
L'acquisizione e l'uso di tessuto del prepuzio umano de-identificato a fini di ricerca è stato esaminato e ha ricevuto la determinazione di "ricerca non umana" dal Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574).
NOTA: Seguendo il protocollo riportato di seguito, 2,4 x 106 cheratinociti, 4,4 x 106 fibroblasti e 1,1 x 106 SC sono ottenuti da un singolo prepuzio. In generale, queste cellule primarie possono essere utilizzate per 3 passaggi, a seconda delle condizioni sperimentali.
1. Isolamento delle cellule primarie e condizioni di coltura
- Procedura di separazione dell'epidermide e del derma
- Acquisire il prepuzio neonatale seguendo le procedure standard di cura da parte di un medico in base ai protocolli normativi ospedalieri approvati. Il medico determina i tempi della circoncisione dopo la nascita e la quantità di pelle rimossa.
- Posizionare il prepuzio asportato in un tubo microcentrifuga contenente 8-10 ml di mezzo basale DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco ghiacciato e trasportare immediatamente il prepuzio al laboratorio di coltura cellulare per l'isolamento cellulare. Risciacquare la pelle due volte con 20-25 ml di 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) contenente 1x antibiotico/antimicotico.
NOTA: per la massima vitalità cellulare, il prepuzio asportato deve essere posto a 4 °C fino alla lavorazione e le cellule devono essere raccolte entro 24 ore. - Dopo il risciacquo in DPBS / antibiotici, immergere il prepuzio in 25-30 ml di mezzo basale DMEM ghiacciato per 10-15 minuti in un piatto di coltura tissutale di 10 cm. Eseguire tutte le fasi di lavorazione in una cappa di coltura tissutale utilizzando una tecnica sterile.
- Usando un bisturi, affettare con cura il prepuzio ed esporre il derma e il tessuto adiposo sottocutaneo.
- Rimuovere il tessuto adiposo sottocutaneo usando pinze, lama di bisturi e forbici, se necessario. Scartare il tessuto adiposo. Tagliare il prepuzio pulito in tre o cinque pezzi più piccoli.
- Trasferire i pezzi di pelle in un tubo conico sterile contenente 16-20 mL di mezzo dispase-I/DMEM (4 mg/mL nel mezzo basale DMEM).
- Mescolare i pezzi di pelle nel tubo conico per inversione, a intermittenza, durante i primi 30 minuti di incubazione con dispase-I. Quindi posizionare il tubo conico a 4 °C per 16-18 ore, facendo attenzione a immergere i pezzi di pelle in dispase-I/media.
NOTA: La soluzione di Dispase-I deve essere preparata poco prima dell'aggiunta utilizzando un mezzo basale DMEM freddo, filtrato con un filtro da 0,22 μm e mantenuto a 4 °C. - Dopo la digestione durante la notte con dispase-I, rimuovere i pezzi di pelle e metterli su un piatto di coltura asciutto e sterile. Srotolare ogni pezzo di pelle in modo che lo strato epidermico esterno tocchi il piatto di coltura.
- Usando due serie di pinze, separare accuratamente l'epidermide dal derma. Inizia sul bordo del tessuto e stacca l'epidermide lontano dal derma.
NOTA: Se lo strato dell'epidermide è difficile da separare dal derma, la digestione dispase-I non è stata sufficiente. Opzioni di risoluzione dei problemi: 1) restituire i pezzi di pelle alla soluzione dispase-I/DMEM e incubare per ulteriori 2-3 ore a 4 °C; 2) mettere i pezzi di pelle in dispase-I/DMEM fresco e incubare a 4 °C per 2-3 ore in più. - Utilizzare l'epidermide e il derma separati per isolare i cheratinociti (epidermide) e i fibroblasti e le cellule di Schwann (derma).
NOTA: seguire i passaggi riportati di seguito per le condizioni di isolamento e coltura di tipi di cellule specifici.
- Isolamento dei cheratinociti dall'epidermide
- Aggiungere 5 ml di soluzione salina tampone HEPES (HBS) a un piatto di coltura di 10 cm e aggiungere i frammenti di epidermide separati. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 10 min.
- Dopo l'incubazione di HBS, raccogliere la soluzione di HBS in un tubo conico da 50 ml. Aggiungere 5 mL di tampone di neutralizzazione della tripsina (TNB) (Tabella dei materiali) in un tubo conico da 50 mL e mettere da parte.
- Aggiungere 3 ml di soluzione di tripsina ai frammenti epidermici. Incubare a 37 °C per 10 min.
- Agitare delicatamente i frammenti epidermici usando una pinza fino a quando la soluzione di tripsina diventa torbida.
- Aggiungere la soluzione di tripsina/cheratinociti al tubo contenente HBS e TNB al punto 1.2.2.
- Per eventuali frammenti epidermici rimanenti che non si sono sciolti nella digestione iniziale della tripsina, aggiungere 3 ml di tripsina allo 0,25%/acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare a 37 °C per 10 minuti e ripetere i passaggi 1.2.4 e 1.2.5.
- Aggiungere 2 ml di siero bovino fetale (FBS) alla soluzione di tripsina/EDTA contenente tubi di soluzione HBS e TNB.
- Centrifugare il tubo di raccolta contenente HBS/TNB/tripsina e cheratinociti a 870 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Aspirare il surnatante e risospescere il pellet cellulare in 3 mL di mezzo di crescita completo dei cheratinociti (Tabella dei materiali).
- Filtrare la sospensione cellulare con un filtro sterile da 100 μM in un tubo conico sterile da 50 ml per rimuovere i detriti.
- Quantificare il numero di cellule e la vitalità cellulare.
NOTA: Qui, un dispositivo specializzato per il campionamento e la colorazione delle cellule (Tabella dei materiali) è stato utilizzato per quantificare il numero di celle e la vitalità seguendo le istruzioni del produttore. - Piastre di coltura di semi necessarie per gli esperimenti. La densità di semina raccomandata è di ~ 45.000 cellule / cm2.
- Posizionare le piastre di coltura in un'incubatrice a 37 °C in 5% di CO2 per 2 giorni per consentire ai cheratinociti di aderire al piatto.
- Dopo 2 giorni, aspirare eventuali cellule non aderenti. Aggiornare i terreni di coltura cellulare a giorni alterni fino a quando i cheratinociti raggiungono la confluenza desiderata per il passaggio o gli esperimenti a valle (confluenza del 50%-80%).
- Isolamento delle cellule di Schwann (SC) e dei fibroblasti dal derma
- Palloni T25 pre-rivestiti con poli-L-lisina (PLL, 0,01 μg/μL) utilizzando 5 mL di 1x DPBS. Posizionare i palloni preverniciati a 37 °C per 3 ore. Lavare due volte la matrice di rivestimento PLL utilizzando 1x DPBS (5 mL).
NOTA: i palloni T25 possono essere preparati in anticipo. - Risciacquare i pezzi isolati del derma con 5 ml di mezzo basale DMEM.
- Tritare il derma in piccoli pezzi con le forbici o un bisturi.
- Digerire il derma tritato con 5 mL di collagenasi (2 mg/mL nel mezzo basale DMEM) a 37 °C per 2,5 ore. Triturare delicatamente il derma tritato con una punta di pipetta ogni 30 minuti fino a quando il derma non si dissocia completamente.
- Filtrare la sospensione cellulare con un filtro cellulare da 70 μM. È necessario applicare la forza meccanica utilizzando una siringa da 1 mL per filtrare completamente la sospensione.
- Diluire la sospensione cellulare filtrata con 5 mL di mezzo DMEM completo (mezzo basale DMEM + 5% FBS + 1x di antibiotico) per fermare l'attività enzimatica della collagenasi.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 870 x g per 5 minuti a RT per pellettizzare le celle.
- Da questo pellet cellulare si otterranno sia fibroblasti che SC. Sospendere il pellet cellulare in 2 mL di mezzo completo DMEM per dividere le celle (1 mL di sospensione/tubo cellulare) e centrifugare a 870 x g per 5 minuti a RT.
- Per la coltura di SC, seguire i passaggi 1.3.10-1.3.17 e per la coltura di fibroblasti, seguire i passaggi 1.3.18-1.3.22.
- Dal passo 1.3.8, aspirare il surnatante. Risospendare il pellet cellulare in 5 mL di mezzo dmem completo fresco.
- Quantificare il numero di cellule e la vitalità.
NOTA: Qui, un dispositivo specializzato per il campionamento e la colorazione delle cellule (Tabella dei materiali) è stato utilizzato per quantificare il numero di celle e la vitalità seguendo le istruzioni del produttore. - Seminare i palloni T25 preverniciati con 5 mL di celle risospese ad una densità 4,0 x 103 celle/mL. Incubare il matraccio a 37 °C in presenza del 5% di CO2 durante la notte (~12-16 h incubazione).
- Dopo 16 ore, confermare l'adesione cellulare al microscopio (Tabella dei materiali) con ingrandimento 10x.
- Rimuovere le celle non aderenti e lavare il pallone 3x con 5 mL di 1x DPBS.
- Aggiungere 5 mL di 10 μM di citosina arabinoside (agente antimitotico, uccide i fibroblasti) nel mezzo completo DMEM. Incubare il matraccio a 37 °C in presenza del 5% di CO2 per 24 ore.
- Aspirare il mezzo contenente citosina arabinoside dal matraccio. Risciacquare il pallone 3x con 5 mL di 1x DPBS.
- Riempire il matraccio di coltura con 5 mL di terreno di coltura completo SC (Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C in presenza del 5% di CO2 per 48 ore. Aggiorna il terreno di coltura completo SC a giorni alterni fino a quando gli SC raggiungono l'80% di confluenza.
- Aspirare il surnatante dallo strato dermonico dissociato (fase 1.3.8) e risospescere il pellet cellulare con 5 mL di mezzo completo fibroblastico (mezzo basale fibroblastico + 5% FBS + 1x antibiotico).
- Quantificare il numero di cellule e la vitalità cellulare.
NOTA: Qui, un dispositivo specializzato per il campionamento e la colorazione delle cellule (Tabella dei materiali) è stato utilizzato per quantificare il numero di celle e la vitalità seguendo le istruzioni del produttore. - Placcare i fibroblasti ad una densità cellulare di 4,0 x 103 cellule/mL in palloni di coltura T25 (non pre-rivestiti) utilizzando 5 mL di mezzo completo per fibroblasti. Incubare a 37 °C in presenza del 5% di CO2 durante la notte (~12-16 h incubazione).
- Dopo 16-24 ore, confermare l'adesione cellulare al microscopio (Tabella dei materiali) con ingrandimento 10x. Aspirare le cellule non aderenti dal matraccio e lavare il matraccio due volte con 5 ml di 1x DPBS.
- Aggiungere 5 mL di fibroblasti freschi mezzo completo e incubare a 37 °C in presenza del 5% di CO2 per 48 ore. Aggiornare il terreno di coltura a giorni alterni fino a quando i fibroblasti raggiungono la confluenza desiderata per i test di passaggio o a valle (confluenza del 50%-80%).
- Palloni T25 pre-rivestiti con poli-L-lisina (PLL, 0,01 μg/μL) utilizzando 5 mL di 1x DPBS. Posizionare i palloni preverniciati a 37 °C per 3 ore. Lavare due volte la matrice di rivestimento PLL utilizzando 1x DPBS (5 mL).
2. Verifica dei cheratinociti epidermici, delle SC dermiche e dei marcatori proteici dei fibroblasti mediante immunofluorescenza
- Giorno 1 - Vetrini in camera di rivestimento e celle di stacco
- Vetrini a camera a 4 pozzetti pre-rivestiti con collagene-I per i cheratinociti, o PLL per SC o, solo 1x DPBS per fibroblasti (0,5 ml ciascun pozzetto). Assicurarsi di rivestire l'intera superficie. La camera di incubazione scorre a 37 °C per 2 ore. Durante l'incubazione, preparare le cellule.
- Dopo che le cellule coltivate raggiungono il 50% -80% di confluenza, lavare i palloni con 1x DPBS 3x (1 mL per ciascun pozzetto).
- Staccare le cellule aderenti con 5 mL di soluzione di tripsina-EDTA (TE) allo 0,25% incubando a 37 °C in presenza di CO 2 al 5% per2 minuti, fino a quando le cellule iniziano a diventare rotonde. Visualizza il distacco cellulare con microscopia (Table of Materials) con ingrandimento 10x.
- Dopo l'incubazione, trasferire la soluzione di TE contenente cellule in un tubo conico con 5 ml di siero bovino fetale (FBS).
- Aggiungere 5 ml di tampone di neutralizzazione della tripsina (TNB) al pallone di coltura e quindi trasferire il contenuto al tubo centrifugo sopra menzionato (celle con TE e FBS). Visualizza il distacco cellulare con microscopia (Table of Materials) con ingrandimento 10x.
NOTA: TNB o FBS o entrambi possono essere utilizzati per neutralizzare l'attività della tripsina. - Centrifugare il tubo conico contenente celle/TE/TNB a 870 x g per 5 min. Trasferire il surnatante in un altro tubo e risospescere il pellet cellulare nel corrispondente terreno di coltura completo. Misurare la vitalità cellulare come indicato al punto 1.2.11.
- Risciacquare i vetrini preverniciati (punto 2.1.1) con 1x DPBS (1 mL per ogni pozzetto) 3x.
- Semi-asciugare i vetrini all'interno della cappa di coltura tissutale e seminare cheratinociti, SC o fibroblasti ad una densità appropriata (30.000 cellule / 0,5 ml / camera) in un terreno di coltura cellulare completo appropriato.
- Incubare i vetrini della camera a 37 °C durante la notte per consentire alle cellule di aderire.
- Giorno 2- Blocco del vetrino della camera con albumina sierica bovina (BSA) e incubazione di anticorpi primari
- Aspirare il supporto cellulare dalle diapositive della camera e lavare 3 volte con 1 mL di 1x DPBS.
- Fissare le cellule aderenti con il 4% di paraformaldeide in 1x DPBS (1 mL per ogni pozzetto) e incubare per 15 minuti a RT all'interno della cappa di coltura tissutale.
- Aspirare il 4% di paraformaldeide dalle diapositive della camera e lavare le diapositive della camera 3 volte con 1x DPBS (1 mL per ciascun pozzetto).
- Permeabilizzare le membrane cellulari con l'1% di TritonX-100 in 1x DPBS (1 mL per ogni pozzetto) e incubare per 15 minuti a RT.
- Aspirare la soluzione di blocco dalle diapositive della camera, lavare 3x con 1x DPBS (1 mL per ciascun pozzetto) per 30 s e quindi aspirare 1x DPBS dal pozzo.
- Bloccare i vetrini della camera con il 5% di BSA (0,5 ml per ciascun pozzetto) e incubare per 45 minuti a RT.
- Aspirare la soluzione di blocco dalle diapositive della camera, lavare 3x con 1x DPBS (1 mL per ogni pozzetto) per 30 s ciascuno e quindi aspirare 1x DPBS dal pozzo.
- Diluire gli anticorpi primari con il 5% di BSA (0,2 ml per ciascun pozzetto) (Diluizioni di anticorpi primari: cheratinociti: anticorpo citocheratina 14 di topo (1:100) e anticorpo citocheratina 10 (1:100); Cellule di Schwann: anticorpo S100 di topo (1:200) e recettore del fattore di crescita del nervo di coniglio (p75-NTR) (1:500); Fibroblasti: anticorpo vimentina di coniglio (1:200) e anticorpo actina della muscolatura alfa-liscia del topo (α-SMA) (1:200)).
- Aggiungere gli anticorpi primari alle cellule corrispondenti sul vetrino della camera e incubare per circa 15-16 ore (durante la notte) a 4 °C in una camera umidificata.
- Aspirare gli anticorpi primari dai vetrini della camera, lavare 3 volte con 1x DPBS (1 mL per ogni pozzetto) per 30 s ciascuno e quindi aspirare 1x DPBS dal pozzo.
- Diluire gli anticorpi secondari (Goat anti-rabbit IgG Secondary Antibody-Alexa Fluor 488 (1:500) e Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody-Alexa Fluor 594 (1:500)) con 0,5% BSA. Aggiungere un anticorpo secondario appropriato a ciascun pozzetto (0,2 ml per ciascun pozzetto). Incubare per 45 minuti a RT.
- Aspirare l'anticorpo secondario dai vetrini della camera, lavare 3x con 1x DPBS (1 mL per ogni pozzetto) per 30 s ciascuno e quindi aspirare 1x DBPS dal pozzo.
- Rimuovere la guarnizione sulla slitta a camera a 4 pozzetti utilizzando il dispositivo di rimozione della guarnizione. Cerca di non lasciare alcun adesivo sul vetrino in quanto ciò interferisce con l'applicazione di coverslip. Aggiungere una goccia di terreno di montaggio con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). In alternativa, contromacchiare i pozzetti con DAPI e utilizzare un mezzo di montaggio non contenente etichette.
- Posizionare con attenzione il coperchio sul vetrino evitando bolle d'aria e sigillare l'estremità del coperchio con colla. Osservare i modelli di colorazione a immunofluorescenza al microscopio (Table of Materials) con ingrandimento 10x e/o 20x.
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Representative Results
Il prepuzio neonatale normale è stato utilizzato per l'isolamento dei cheratinociti epidermici primari e delle SC e dei fibroblasti dermici. Le cellule primarie isolate sono state coltivate in rispettivi terreni di coltura cellulare contenenti fattori di crescita. Dopo la semina di SC e fibroblasti in palloni di coltura, la maggior parte delle cellule ha aderito al fondo del pallone entro 2 ore. Nel caso dei cheratinociti, la maggior parte dei cheratinociti ha aderito entro 24 ore. I cheratinociti primari epidermici isolati hanno raggiunto l'85% di confluenza entro il giorno 7 e hanno mostrato una morfologia cellulare caratteristica (forma di ciottolo) (Figura 1A). Le SC hanno raggiunto il 95% di confluenza entro il giorno 5 e sono apparse di forma bipolare o tripolare (Figura 1B). Le colture di fibroblasti hanno raggiunto il 95% di confluenza entro il giorno 4 e la maggior parte delle cellule ha mostrato una morfologia a forma di fuso (Figura 1C). L'espressione proteica specifica del tipo di cellula è stata confermata in queste colture mediante colorazione a immunofluorescenza. I cheratinociti sono risultati positivi per le proteine K10 (marcatore di differenziazione) e K14 (marcatore di proliferazione) (Figura 2A); allo stesso modo, le SC sono risultate positive per S100 e p75-NTR (Figura 2C). I fibroblasti hanno espresso positivamente la vimentina, ma non hanno espresso il marcatore dei miofibroblasti, l'actina alfa della muscolatura liscia (α-SMA) (Figura 2E).
Le immagini unite di immunofluorescenza alla cheratina e colorazione nucleare DAPI (Figura 2A) hanno indicato che il 97,8% delle cellule nelle colture erano cheratinociti (Figura 2B). Le doppie cellule di Schwann positive S100 e p75-NTR suggeriscono una purezza del 95,2% di SC in coltura secondo il protocollo (Figura 2C,D). Allo stesso modo, il 97,2% delle cellule in colture di fibroblasti ha espresso positivamente la vimentina (Figura 2E, F). Pertanto, l'espressione proteica caratteristica si trova nei rispettivi tipi di cellule e il protocollo consente l'isolamento di popolazioni di cellule relativamente pure.
Figura 1: Isolamento di cheratinociti primari derivati dal prepuzio umano, cellule di Schwann e fibroblasti. (A) cheratinociti, (B) cellule di Schwann e (C) fibroblasti al microscopio a contrasto di fase; barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione dei cheratinociti primari derivati dal prepuzio umano, delle cellule di Schwann e dei fibroblasti. (A) I cheratinociti sono stati identificati utilizzando cheratina 14 (K14, cheratinociti proliferativi) e K10 (cheratina 10, marcatore di differenziazione dei cheratinociti); scala bar = 100 μm. (B) Analisi statistica della purezza dei cheratinociti in coltura utilizzando immunofluorescenze a cellule a doppia colorazione. (C) Le cellule di Schwann sono state identificate utilizzando S100 e p75-NTR (recettore del fattore di crescita nervoso); barra di scala = 100 μm. (D) Analisi statistica della purezza delle SC coltivate utilizzando immunofluorescenze a cellule a doppia colorazione. (E) I fibroblasti sono stati identificati utilizzando vimentina (fibroblasti) e actina della muscolatura α liscia (differenziazione dei fibroblasti, miofibroblasti); scala bar = 100 μm. (F) Analisi statistica della purezza dei fibroblasti in coltura utilizzando immunofluorescenze cellule colorate con vimentina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per isolare tre distinte popolazioni cellulari da un singolo pezzo del prepuzio, vale a dire cheratinociti, fibroblasti e cellule di Schwann. Sono disponibili alcuni protocolli di isolamento per isolare cheratinociti e fibroblasti 2,3,5,6, ma nessuno descrive l'isolamento SC. Oltre alle cellule strutturali chiave della pelle, dei cheratinociti e dei fibroblasti, la pelle è anche altamente innervata da strutture afferenti sensoriali ed efferenti autonomi. Le afferenze sensoriali svolgono un ruolo significativo nella trasmissione di tocco leggero, vibrazioni, dolore, prurito e sensazioni di caldo e freddo. Gli efferenti autonomi innervano le ghiandole sudoripare e i muscoli arrector pili9. Ogni assone nervoso è rivestito da un SC, le cellule gliali del sistema nervoso periferico. La ricerca e gli interessi clinici nelle SC sono aumentati considerevolmente poiché le SC supportano la rigenerazione assonale10,11. I nervi cutanei sono importanti regolatori della fisiologia cutanea e della patologia della malattia attraverso segnali di comunicazione (neuromodulatori/neuromediatori) alle cellule non neurali 12,13,14.
Nonostante l'ampia distribuzione delle SC nervose nella pelle, esistono informazioni limitate sul ruolo specifico delle SC nella fisiologia della pelle. In che modo le SC nella pelle interagiscono con altre cellule non neuronali della pelle? Rispondere a questa domanda è stato ostacolato dalla mancanza di modelli affidabili di coltura cellulare in vitro . Pertanto, con questo protocollo, l'analisi di ogni singola cellula e le loro interazioni con le cellule dello stesso tessuto possono rivelare con precisione le caratteristiche dei ruoli delle cellule di Schwann nell'omeostasi cutanea e nella fisiopatologia.
Uno dei principali vantaggi di questo protocollo è una procedura sperimentale semplice ed economica per stabilire tre cellule primarie (SC, cheratinociti e fibroblasti) da un singolo prepuzio umano. Ha anche il vantaggio di isolare tutti e tre i tipi di cellule dallo stesso tessuto, mitigando così le differenze genetiche nei confronti cellulari e ottimizzando gli isolamenti cellulari quando il tessuto è in quantità limitata. Questo protocollo richiede 2 giorni per essere eseguito e semplifica la procedura di isolamento per tre cellule primarie dal tessuto cutaneo e dalle condizioni di coltura. Questo protocollo produce in modo affidabile un numero elevato di cellule vitali e i passaggi iniziali di queste cellule hanno raggiunto una confluenza di circa il 90% entro 4-7 giorni dalla placcatura iniziale. Abbiamo usato cheratinociti per almeno 3 passaggi (~ 21 giorni) e fibroblasti e cellule di Schwann possono essere utilizzati per 5-6 passaggi (~ 40 giorni in coltura).
Questo protocollo non è privo di sfide tecniche. Una sufficiente rimozione del tessuto adiposo sottostante e un'efficiente separazione epidermica/ dermica prima della digestione enzimatica sono fondamentali per ottenere popolazioni relativamente pure di cellule da ogni strato cutaneo. Le SC dermiche sono più difficili da isolare dalla pelle a causa della loro prevalenza relativamente bassa nella pelle rispetto ai fibroblasti più numerosi. Qualsiasi riporto di fibroblasti in colture SC supererà rapidamente le SC15. Per migliorare l'aderenza SC, abbiamo optato per la coltura di tessuti pre-rivestiti con PLL in quanto ciò aumenta l'adesione di SC16. Per mitigare ulteriormente la contaminazione dei fibroblasti, la citosina arabinoside (agente antimitotico) è stata aggiunta dopo che le cellule avevano aderito per un breve periodo di tempo per rimuovere i fibroblasti in rapida divisione dalle colture di SC. Tuttavia, un'esposizione più lunga alla citosina arabinoside può anche essere dannosa per le SC.
L'adozione del protocollo sopra descritto consente di isolare singole SC cutanee, cheratinociti e colture di fibroblasti per esperimenti in vitro . Queste distinte popolazioni cellulari possono essere utilizzate per studiare SC, cheratinociti e fibroblasti singolarmente o in combinazione durante la normale fisiologia della pelle, la guarigione delle ferite o in condizioni che imitano un setting di malattia.
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Disclosures
Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la Dott.ssa Fadia Kamal e la Dott.ssa Reyad Elbarbary per averci permesso di utilizzare strumenti di laboratorio e supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del NIH (K08 AR060164-01A) e DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E. oltre al supporto istituzionale della Pennsylvania State University Hershey Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
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- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
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