Summary
Studien av sårheling forbundet med muskel- og skjelettskader krever ofte vurdering av in vitro interaksjoner mellom Schwann-celler (SCer), keratinocytter og fibroblaster. Denne protokollen beskriver isolasjon, dyrking og karakterisering av disse primære cellene fra den menneskelige forhuden.
Abstract
Denne protokollen beskriver isolasjonsmetoder, fortykningsforhold og karakterisering av menneskelige primærceller med høyt utbytte og levedyktighet ved hjelp av rask enzymatisk dissosiasjon av huden. Primære keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler høstes alle fra det nyfødte forhuden, som er tilgjengelig etter standard omsorgsprosedyrer. Den fjernede huden desinfiseres, og det subkutane fettet og muskelen fjernes ved hjelp av en skalpell. Metoden består av enzymatisk og mekanisk separasjon av epidermale og dermale lag, etterfulgt av ytterligere enzymatisk fordøyelse for å oppnå encellede suspensjoner fra hvert av disse hudlagene. Til slutt vokser enkeltceller i passende cellekulturmedier etter standard cellekulturprotokoller for å opprettholde vekst og levedyktighet over uker. Sammen tillater denne enkle protokollen isolasjon, culturing og karakterisering av alle tre celletyper fra et enkelt stykke hud for in vitro-evaluering av hudnervemodeller. I tillegg kan disse cellene brukes sammen i samkulturer for å måle deres effekter på hverandre og deres respons på in vitro traumer i form av riper utført robotisert i kulturen forbundet med sårheling.
Introduction
Primærceller avledet fra levende vev og dyrket under in vitro-forhold ligner nært på den fysiologiske tilstanden1, noe som gjør dem til en ideell modell for å undersøke fysiologiske og patofysiologiske prosesser. Huden inneholder flere celletyper, inkludert keratinocytter, fibroblaster, sebocytter, melanocytter og Schwann-celler (SCer), som kan isoleres og dyrkes for in vitro-eksperimenter . Metoder for å isolere og dyrke keratinocytter, fibroblaster og SCer, fra et enkelt stykke hud, har ikke blitt beskrevet. Målet med denne protokollen er todelt: 1) å etablere en pålitelig og reproduserbar metode for isolering og dyrking av dermale SCer og 2) å bruke en effektiv, robust metode for isolering av keratinocytter, fibroblaster og SCer fra et enkelt menneskelig forhud.
For tiden er det etablerte protokoller for å isolere hud keratinocytter 2,3,4 og fibroblaster 5,6. Disse studiene beskriver isolasjonen av enten keratinocytter, fibroblaster eller begge deler fra huden, men ingen protokoll tar for seg hvordan man etablerer kulturer av primære SCer fra menneskelig hud. Nyere studier tyder på at nevronale SCs modulerer keratinocytt og fibroblast cellulære prosesser og regulerer normale hudfysiologiske funksjoner7. SCs er dermed kritiske for huden homeostase og bidrar vesentlig til regulere fysiologi som påvirker oppførselen til nærliggende hudcelletyper tilstede8. Derfor er en protokoll som tillater isolering av hver av disse celletypene, ideell for in vitro-eksperimenter som involverer cellecellekommunikasjon eller kryssprat mellom celletyper.
Denne protokollen beskriver etableringen av individuelle cellekulturer av primærceller fra et enkelt stykke hud. Denne protokollen er spesielt nyttig når mengden vev som er tilgjengelig er begrenset. Videre tillater isolasjon av alle tre celletyper fra en enkelt donor robuste sammenligninger mellom celletyper eller samkultureksperimenter samtidig som genetikken reduseres under ønsket eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Oppkjøp og bruk av av-identifisert humant forhudsvev til forskningsformål ble gjennomgått og fikk bestemmelsen om "ikke menneskelig forskning" av Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574).
MERK: Ved å følge protokollen nedenfor oppnås 2,4 x 106 keratinocytter, 4,4 x 106 fibroblaster og 1,1 x 106 SCer fra et enkelt forhud. Generelt kan disse primære cellene brukes til 3 passasjer, avhengig av de eksperimentelle forholdene.
1. Isolering av primærceller og kulturforhold
- Epidermis og dermis separasjon prosedyre
- Anskaffe neonatal forhud etter standard av omsorg prosedyrer av en lege under godkjente sykehus regulatoriske protokoller. Legen bestemmer tidspunktet for omskjæring etter fødselen og mengden hud fjernet.
- Plasser det utskilte forhuden i et mikrocentrifugerør som inneholder 8-10 ml iskaldt Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) basalmedium og transporter umiddelbart forhuden til cellekulturlaboratoriet for celleisolering. Skyll huden to ganger med 20-25 ml 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) som inneholder 1x antibiotika/antimykotika.
MERK: For maksimal celle levedyktighet bør den utskilte forhuden plasseres ved 4 °C til bearbeiding, og cellene skal høstes innen 24 timer. - Etter skylling i DPBS/antibiotika, suge forhuden i 25-30 ml iskaldt DMEM basal medium i 10-15 min i en 10 cm vev kulturrett. Utfør alle behandlingstrinn i en vevskulturhette ved hjelp av steril teknikk.
- Bruk en skalpell, skjær forsiktig forhuden åpen og eksponer dermis og subkutan fettvev.
- Fjern det subkutane fettvevet ved hjelp av tang, skalpellblad og saks etter behov. Kast fettvevet. Klipp det rensede forhuden i tre til fem mindre stykker.
- Overfør hudstykker til et sterilt konisk rør som inneholder 16-20 ml dispase-I/DMEM medium (4 mg/ml i DMEM basalmedium).
- Bland hudstykkene i det koniske røret ved inversjon, periodisk, i løpet av de første 30 min inkubasjon med dispase-I. Plasser deretter det koniske røret ved 4 °C i 16-18 timer, og vær oppmerksom på å nedsenke hudstykkene i dispase-I/media.
MERK: Dispase-I-oppløsningen bør fremstilles like før tilsetning med kaldt DMEM basalmedium, filtrert med en 0,22 μm sil og oppbevares ved 4 °C. - Etter fordøyelsen over natten med dispase-I, fjern hudstykkene og legg dem på en tørr, steril kulturrett. Rull ut hvert stykke hud slik at det ytre epidermale laget berører kulturretten.
- Bruk to sett med tang, separer epidermis forsiktig fra dermis. Start på kanten av vevet og skrell epidermis bort fra dermis.
MERK: Hvis epidermislaget er vanskelig å skille fra dermis, var dispase-I-fordøyelsen ikke tilstrekkelig. Feilsøkingsalternativer: 1) returnere hudstykker til dispase-I/DMEM-oppløsning og inkubere i ytterligere 2-3 timer ved 4 °C; 2) plasser hudstykker i frisk dispase-I/DMEM og inkuber ved 4 °C i 2-3 timer mer. - Bruk separert epidermis og dermis til å isolere keratinocytter (epidermis) og fibroblaster og Schwann celler (dermis).
MERK: Følg trinnene nedenfor for spesifikke celletyper isolasjon og kulturforhold.
- Keratinocyttisolasjon fra epidermis
- Tilsett 5 ml HEPES buffer saltvann (HBS) i en 10 cm kulturrett og tilsett de separerte epidermisfragmentene. Inkuber ved romtemperatur (RT) i 10 min.
- Etter HBS-inkubasjon samler du HBS-løsningen i et 50 ml konisk rør. Tilsett 5 ml trypsinnøytraliseringsbuffer (TNB) (materialtabell) i et 50 ml konisk rør og sett til side.
- Tilsett 3 ml trypsinoppløsning til epidermale fragmenter. Inkuber ved 37 °C i 10 minutter.
- Rør forsiktig de epidermale fragmentene ved hjelp av tang til trypsinoppløsningen blir uklar.
- Tilsett trypsinoppløsningen/keratinocyttene i HBS og TNB som inneholder rør i trinn 1.2.2.
- For eventuelle gjenværende epidermale fragmenter som ikke har oppløst i den første trypsin fordøyelsen, tilsett 3 ml 0,25% trypsin / Etylendiaminetetraacetic acid (EDTA). Inkuber ved 37 °C i 10 minutter og gjenta trinn 1.2.4 og 1.2.5.
- Tilsett 2 ml foster bovint serum (FBS) i trypsin/EDTA-oppløsningen som inneholder HBS- og TNB-løsningsrør.
- Sentrifuger oppsamlingsrøret som inneholder HBS/TNB/trypsin og keratinocytter ved 870 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 3 ml keratinocytt komplett vekstmedium (Materialtabell).
- Filtrer celleopphenget med et sterilt 100 μM filter i et sterilt 50 ml konisk rør for å fjerne rusk.
- Kvantifisere cellenummeret og celle levedyktigheten.
MERK: Her ble en spesialisert celleprøvetakings- og fargingsenhet (Materialfortegnelse) brukt til å kvantifisere cellenummeret og levedyktigheten i henhold til produsentens instruksjoner. - Frøkulturplater etter behov for eksperimenter. Anbefalt såingstetthet er ~ 45 000 celler / cm2.
- Plasser kulturplatene i en inkubator ved 37 °C i 5 % CO2 i 2 dager for å la keratinocytter holde seg til retten.
- Etter 2 dager aspirerer du eventuelle ikke-fulgte celler. Oppdater cellekulturmediene annenhver dag til keratinocytter når ønsket samløp for passivisering eller nedstrøms eksperimenter (50% -80% samløp).
- Isolering av Schwann-celler (SCer) og fibroblaster fra dermis
- Pre-coat T25 kolber med poly-L-lysin (PLL, 0,01 μg/μL) ved hjelp av 5 ml 1x DPBS. Plasser de forhåndsbelagte kolbeene ved 37 °C i 3 timer. Vask PLL-beleggmatrisen to ganger ved hjelp av 1x DPBS (5 ml).
MERK: T25-kolber kan tilberedes på forhånd. - Skyll de isolerte delene av dermis med 5 ml DMEM basal medium.
- Hakk dermis i små biter med saks eller en skalpell.
- Fordøye hakket dermis med 5 ml kollagen (2 mg/ml i DMEM basal medium) ved 37 °C i 2,5 timer. Trianturer forsiktig hakket dermis med en pipettespiss hver 30.
- Filtrer celleopphenget med en 70 μM cellesil. Det er nødvendig å bruke mekanisk kraft ved hjelp av en 1 ml sprøyte for å filtrere suspensjonen fullt ut.
- Fortynn den filtrerte cellefjæringen med 5 ml komplett DMEM-medium (DMEM basal medium + 5% FBS + 1x antibiotika) for å stoppe den enzymatiske aktiviteten til kollagenal.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 870 x g i 5 min ved RT for å pellet cellene.
- Fra denne cellepelleten vil både fibroblaster og SCer bli oppnådd. Resuspend cellepellet i 2 ml DMEM komplett medium for å dele cellene (1 ml celle suspensjon / rør) og sentrifuge ved 870 x g i 5 min ved RT.
- For SCs-kultur følger du trinn 1.3.10-1.3.17 og for fibroblastkultur følger du trinn 1.3.18-1.3.22.
- Fra trinn 1.3.8 aspirerer du supernatanten. Resuspend cellepellet i 5 ml fersk DMEM komplett medium.
- Kvantifisere cellenummeret og levedyktigheten.
MERK: Her ble en spesialisert celleprøvetakings- og fargingsenhet (Materialfortegnelse) brukt til å kvantifisere cellenummeret og levedyktigheten i henhold til produsentens instruksjoner. - Frø de forhåndsbelagte T25-kolbeene med 5 ml resuspenderte celler med en tetthet på 4,0 x 103 celler/ml. Inkuber kolben ved 37 °C i nærvær av 5 % CO2 over natten (~12-16 t inkubasjon).
- Etter 16 timer bekrefter du celleadhesjon ved mikroskopi (Materialfortegnelse) ved 10x forstørrelse.
- Fjern ikke-tilhengercellene og vask kolben 3x med 5 ml 1x DPBS.
- Tilsett 5 ml 10 μM cytosin arabinoside (antimitotisk middel, dreper fibroblaster) i DMEM komplett medium. Inkuber kolben ved 37 °C i nærvær av 5 % CO2 i 24 timer.
- Aspirer cytosin arabinosiden som inneholder medium fra kolben. Skyll kolben 3x med 5 ml 1x DPBS.
- Fyll på kulturflasken med 5 ml SCs komplett kulturmedium (Materialbord) og inkuber ved 37 °C i nærvær av 5 % CO2 i 48 timer. Oppdater SC komplett kulturmedium annenhver dag til SCer når 80% samløp.
- Aspirer supernatanten fra det dissosierte dermale laget (trinn 1.3.8) og resuspend cellepellet med 5 ml fibroblast komplett medium (fibroblast basal medium + 5% FBS + 1x antibiotika).
- Kvantifisere cellenummer og celle levedyktighet.
MERK: Her ble en spesialisert celleprøvetakings- og fargingsenhet (Materialfortegnelse) brukt til å kvantifisere cellenummeret og levedyktigheten i henhold til produsentens instruksjoner. - Plater fibroblaster med en celletetthet på 4,0 x 103 celler/ml i T25-kulturflasker (ikke forhåndsbelagt) ved hjelp av 5 ml fibroblast komplett medium. Inkuber ved 37 °C i nærvær av 5 % CO2 over natten (~12-16 t inkubasjon).
- Etter 16-24 timer, bekreft celleadhesjon ved mikroskopi (Materialfortegnelse) ved 10x forstørrelse. Aspirere ikke-tilhengerceller fra kolben og vask kolben to ganger med 5 ml 1x DPBS.
- Tilsett 5 ml fersk fibroblast komplett medium og inkuber ved 37 °C i nærvær av 5 % CO2 i 48 timer. Oppdater kulturmediet annenhver dag til fibroblaster når ønsket samløp for passaging eller nedstrømsanalyser (50% -80% samløp).
- Pre-coat T25 kolber med poly-L-lysin (PLL, 0,01 μg/μL) ved hjelp av 5 ml 1x DPBS. Plasser de forhåndsbelagte kolbeene ved 37 °C i 3 timer. Vask PLL-beleggmatrisen to ganger ved hjelp av 1x DPBS (5 ml).
2. Verifisering av epidermale keratinocytter, dermale SCer og fibroblaster proteinmarkør ved immunfluorescens
- Dag 1- Glassglass fra kappekammer glir og løsner celler
- Pre-coat 4-brønns kammer glass lysbilder med kollagen-I for keratinocytter, eller PLL for SCs eller, bare 1x DPBS for fibroblaster (0,5 ml hver brønn). Sørg for å belegge hele overflaten. Inkuber kammeret glir ved 37 °C i 2 timer. Under inkubasjon, forbered cellene.
- Etter at dyrkede celler når 50% -80% samløp, vask kolbeene med 1x DPBS 3x (1 ml for hver brønn).
- Løsne de vedlagte cellene med 5 ml 0,25 % trypsin-EDTA (TE)-løsning ved å inkubere ved 37 °C i nærvær av 5 % CO2 i 2 minutter, til cellene begynner å bli runde. Visualiser celleavløsning med mikroskopi (Materialtabell) ved 10x forstørrelse.
- Etter inkubasjon, overfør TE-løsning som inneholder celler til et konisk rør med 5 ml foster bovint serum (FBS).
- Legg til 5 ml trypsinnøytraliseringsbuffer (TNB) i kulturflasken og overfør deretter innholdet til ovennevnte sentrifugerør (celler med TE og FBS). Visualiser celleavløsning med mikroskopi (Materialtabell) ved 10x forstørrelse.
MERK: TNB eller FBS eller begge deler kan brukes til å nøytralisere trypsinaktivitet. - Sentrifuger det koniske røret som inneholder celler/TE/TNB ved 870 x g i 5 minutter. Overfør supernatanten til et annet rør og resuspender cellepelleten i det tilsvarende komplette kulturmediet. Mål celle levedyktigheten som nevnt i trinn 1.2.11.
- Skyll de forhåndsbelagte kammerglasssklierene (trinn 2.1.1) med 1x DPBS (1 ml for hver brønn) 3x.
- Halvtørr lysbildene inne i vevskulturhetten og frø keratinocytter, SCer eller fibroblaster med passende tetthet (30 000 celler / 0,5 ml / kammer) i et passende komplett cellekulturmedium.
- Inkuber kammeret glir ved 37 °C over natten slik at cellene kan feste seg.
- Dag 2- Blokkering av kammerglasssklie med Bovine Serum Albumin (BSA) og primære antistoffinkubasjon
- Aspirer cellemediet fra kammerlysbildene og vask 3x med 1 ml 1x DPBS.
- Fest de festede cellene med 4% paraformaldehyd i 1x DPBS (1 ml for hver brønn) og inkuber i 15 min ved RT inne i vevskulturhetten.
- Aspirer 4% paraformaldehyd fra kammersklier og vask kammeret 3x med 1x DPBS (1 ml for hver brønn).
- Permeabiliser cellemembranene med 1% TritonX-100 i 1x DPBS (1 ml for hver brønn) og inkuber i 15 min ved RT.
- Aspirer blokkeringsløsningen fra kammersklier, vask 3x med 1x DPBS (1 ml for hver brønn) i 30 s og aspirer deretter 1x DPBS fra brønnen.
- Blokker kammersklier med 5% BSA (0,5 ml for hver brønn) og inkuber i 45 min på RT.
- Aspirer blokkeringsløsningen fra kammersklier, vask 3x med 1x DPBS (1 ml for hver brønn) i 30 s hver og aspirer deretter 1x DPBS fra brønnen.
- Fortynn de primære antistoffene med 5% BSA (0,2 ml for hver brønn) (Primære antistoffer fortynning: Keratinocytter: mus cytokeratin 14 antistoff (1:100) og, cytokeratin 10 antistoff (1:100); Schwann celler: mus S100 antistoff (1:200), og kanin nerve vekstfaktor reseptor (p75-NTR) antistoff (1:500); Fibroblaster: kanin vimentin antistoff (1:200), og mus alfa-glatt muskel actin (α-SMA) antistoff (1:200)).
- Tilsett de primære antistoffene til de tilsvarende cellene på kammerglasssklie og inkuber i ca. 15-16 timer (over natten) ved 4 °C i et fuktet kammer.
- Aspirer de primære antistoffene fra kammersklier, vask 3 ganger med 1x DPBS (1 ml for hver brønn) i 30 s hver og aspirer deretter 1x DPBS fra brønnen.
- Fortynn de sekundære antistoffene (Goat anti-rabbit IgG Secondary Antibody-Alexa Fluor 488 (1:500) og Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody-Alexa Fluor 594 (1:500)) med 0,5% BSA. Tilsett passende sekundært antistoff til hver brønn (0,2 ml for hver brønn). Inkuber i 45 min på RT.
- Aspirer det sekundære antistoffet fra kammersklier, vask 3x med 1x DPBS (1 ml for hver brønn) i 30 s hver og aspirer deretter 1x DBPS fra brønnen.
- Fjern pakningen på 4-brønnskammerskuffen ved hjelp av pakningsfjerner. Prøv å ikke etterlate lim på lysbildet, da dette forstyrrer dekslerlip-applikasjonen. Tilsett en dråpe monteringsmedium med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Alternativt kan du motflekke brønnene med DAPI og bruke et ikke-etikettholdig monteringsmedium.
- Plasser forsiktig dekslene på glasssklie ved å unngå luftbobler og forsegle enden av dekslene med lim. Vær oppmerksom på immunfluorescensfargingsmønstre ved mikroskopi (materialtabell) ved 10x og/eller 20x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normal neonatal forhud ble brukt til isolering av primære epidermale keratinocytter og dermale SCer og fibroblaster. De isolerte primærcellene ble dyrket i respektive cellekulturmedier som inneholdt vekstfaktorer. Etter sådd av SCs og fibroblast i kulturflasker, festet de fleste cellene seg til bunnen av kolben innen 2 timer. Når det gjelder keratinocytter, ble de fleste keratinocytter festet med 24 timer. Isolerte epidermale primære keratinocytter nådde 85% samløp etter dag 7 og viste karakteristisk cellemorfologi (brosteinsform) (figur 1A). SCene nådde 95% samløp etter dag 5 og virket bipolar eller tri-polar i form (figur 1B). Fibroblastkulturer nådde 95% samløp etter dag 4, og de fleste cellene viste en spindelformmorfologi (figur 1C). Celle-type-spesifikt proteinuttrykk ble bekreftet i disse kulturene ved immunfluorescensfarging. Keratinocytter var positive for K10 (differensieringsmarkør) og K14 (spredningsmarkør) proteiner (figur 2A); på samme måte var SCer positive for S100 og p75-NTR (figur 2C). Fibroblaster uttrykte positivt vimentin, men uttrykte ikke myofibroblastmarkøren, alfa glatt muskel actin (α-SMA) (figur 2E).
De sammenslåtte bildene av keratinimmunofluorescens og DAPI-kjernefysisk farging (figur 2A) indikerte at 97,8 % av cellene i kulturene var keratinocytter (figur 2B). Doble S100- og p75-NTR-positive Schwann-celler antyder renhet på 95,2 % SCer i kultur etter protokollen (figur 2C, D). Tilsvarende uttrykte 97,2% av cellene i fibroblastkulturer positivt vimentin (figur 2E, F). Dermed finnes karakteristisk proteinuttrykk i de respektive celletypene, og protokollen tillater isolering av relativt rene populasjoner av celler.
Figur 1: Isolering av humane forhudsavledede primære keratinocytter, Schwann-celler og fibroblaster. (A) Keratinocytter, (B) Schwann-celler og (C) Fibroblaster under fasekontrastmikroskop; skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering av humane forhudsavledede primære keratinocytter, Schwann-celler og fibroblaster. (A) Keratinocytter ble identifisert ved hjelp av keratin 14 (K14, proliferative keratinocytter) og K10 (keratin 10, keratinocyttdifferensieringsmarkør); skala bar = 100 μm. (B) Statistisk analyse av renhet av dyrkede keratinocytter ved hjelp av immunfluorescenser doble fargede celler. (C) Schwann celler ble identifisert ved hjelp av S100 og p75-NTR (nerve vekstfaktor reseptor); skala bar = 100 μm. (D) Statistisk analyse av renhet av dyrkede SCer ved hjelp av immunfluorescences doble fargede celler. (E) Fibroblaster ble identifisert ved hjelp av vimentin (fibroblast) og α glatt muskel actin (fibroblast differensiering, myofibroblast); skala bar = 100 μm. (F) Statistisk analyse av renheten av dyrkede fibroblaster ved hjelp av immunfluorescens vimentin fargede celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for å isolere tre forskjellige cellepopulasjoner fra en enkelt del av forhuden, nemlig keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler. Det er noen få isolasjonsprotokoller tilgjengelig for å isolere keratinocytter og fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolasjon. Bortsett fra de viktigste strukturelle cellene i huden, keratinocytter og fibroblaster, er huden også svært innervated av sensoriske afferent strukturer og autonome sprudlende. Sensoriske afferenter spiller en viktig rolle i overføringen av lett berøring, vibrasjon, smerte, kløe og varme og kalde opplevelser. Autonome sprudlende innervate svettekjertler og arrector pili muskler9. Hver nerve axon er innhyllet av en SC, glialcellene i det perifere nervesystemet. Forskning og kliniske interesser i SCs har økt betydelig ettersom SCer støtter axonal regenerering10,11. Hudnervene er viktige regulatorer for hudfysiologi og sykdomspatologi gjennom kommunikasjonssignaler (nevromodulatorer/nevromediatorer) til ikke-nevrale celler 12,13,14.
Til tross for den brede fordelingen av nerve-SCer i huden, finnes det begrenset informasjon om SCs spesifikke rolle i hudfysiologi. Hvordan samhandler SCer i huden med andre ikke-nevronale celler i huden? Å svare på dette spørsmålet har blitt hindret av mangelen på pålitelige in vitro-cellekulturmodeller . Således, med denne protokollen, kan analysen av hver enkelt celle og deres interaksjoner med celler fra samme vev nøyaktig avsløre de karakteristiske egenskapene til Schwann-cellenes roller i hud homeostase og patofysiologi.
En av de viktigste fordelene med denne protokollen er en enkel, billig eksperimentell prosedyre for å etablere tre primære celler (SCer, keratinocytter og fibroblast) fra et enkelt menneskelig forhud. Det har også fordelen av at alle tre celletyper blir isolert fra samme vev, og dermed reduserer genetiske forskjeller i cellesammenligninger og optimaliserer celleisolasjoner når vev er i begrenset forsyning. Denne protokollen tar 2 dager å utføre og forenkler isolasjonsprosedyren for tre primære celler fra hudvev og tilstander. Denne protokollen gir pålitelig høyt antall levedyktige celler, og innledende passasjer av disse cellene nådde ~ 90% samløp med 4-7 dager etter første plating. Vi har brukt keratinocytter i minst 3 passasjer (~ 21 dager) og fibroblast- og Schwann-celler kan brukes i 5-6 passasjer (~ 40 dager i kultur).
Denne protokollen er ikke uten tekniske utfordringer. Tilstrekkelig fjerning av det underliggende fettvevet og effektiv epidermal/dermal separasjon før enzymatisk fordøyelse er nøkkelen til å oppnå relativt rene populasjoner av celler fra hvert hudlag. Dermal SCs er vanskeligere å isolere fra huden på grunn av deres relativt lave utbredelse i huden sammenlignet med de mer tallrike fibroblaster. Enhver overføring av fibroblaster i SC-kulturer vil raskt vokse ut av SCs15. For å forbedre SC-tilslutningen valgte vi å pre-coat vev kultur ware med PLL som dette øker vedheft av SCs16. For ytterligere å redusere fibroblastforurensning ble cytosin arabinoside (antimitotisk middel) tilsatt etter at cellene hadde holdt seg i en kort periode for å fjerne de raskt delte fibroblaster fra SCs kulturer. Imidlertid kan lengre eksponering for cytosin arabinoside også være skadelig for SCer.
Ved å ta i bruk den ovenfor beskrevne protokollen gjør det mulig å isolere individuelle hud-SCer, keratinocytter og fibroblaster kulturer for in vitro eksperimenter. Disse distinkte cellepopulasjonene kan brukes til å undersøke SCer, keratinocytter og fibroblaster individuelt eller i kombinasjon under normal hudfysiologi, sårheling eller under forhold som etterligner en sykdomsinnstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle andre forfattere erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil takke Dr. Fadia Kamal, og Dr. Reyad Elbarbary for at vi kunne bruke laboratorieinstrumenter og teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH (K08 AR060164-01A) og DOD (W81XWH-16-1-0725) til J. C. E. i tillegg til institusjonell støtte fra Pennsylvania State University Hershey Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
