Summary
For å unngå begrensningene forbundet med enzymatisk eller mekanisk passering av humane embryonale stamceller (hESCs) og humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) dyrket på materceller, har vi etablert en rask, effektiv, kostnadseffektiv metode med høy avkastning for høsting av hESC- eller hiPSC-kolonier opprettholdt på et matercellelag av humane forhudsfibroblaster ved bruk av EDTA-mediert dis-adhesjon.
Abstract
Humane pluripotente stamceller (humane embryonale stamceller, hESC og humane induserte pluripotente stamceller, hiPSCs) ble opprinnelig dyrket på forskjellige typer materceller for vedlikehold i en udifferensiert tilstand i langtidskultur. Denne tilnærmingen har i stor grad blitt erstattet av materfrie kulturprotokoller, men disse involverer mer kostbare reagenser og kan fremme en overgang til en primet tilstand, noe som begrenser cellens differensieringskapasitet. I både mater- og materfrie forhold er høsting av hESC- eller hiPSC-kolonier for passering en nødvendig prosedyre for å utvide kulturene.
For å gi en enkel prosedyre med høy avkastning for passering av hESC / hiPSCs dyrket på materceller, har vi etablert en høstingsmetode ved bruk av dis-adhesjon fremkalt av kalsiumkelatoren etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Vi har vurdert utbyttet og kvaliteten til de resulterende passasjecellene ved å sammenligne denne tilnærmingen med den opprinnelige mekaniske høstingsmetoden, der kolonier isoleres med en skalpell under et mikroskop (mekanisk høsting ble valgt som komparator for å unngå reagensvariabiliteten forbundet med enzymatisk høsting).
I ett sett med eksperimenter ble to forskjellige hESC-linjer opprettholdt på et matercellelag av humane forhudfibroblaster. Hver linje ble utsatt for flere passasjer ved hjelp av EDTA-basert eller mekanisk høsting og vurdert for kolonistørrelse og morfologi, celletetthet, stammemarkøruttrykk, differensiering til de tre kimlagene i embryoidlegemer og genomiske avvik. I et annet sett med eksperimenter brukte vi EDTA-basert høsting på to forskjellige hiPSC-linjer og oppnådde lignende resultater. EDTA-indusert dis-adhesjon sparte tid og ga et høyere utbytte av kolonier av gunstigere størrelse og mer ensartet morfologi sammenlignet med mekanisk høsting. Det var også raskere enn enzymatisk høsting og ikke utsatt for enzymbatchvariabilitet. Den EDTA-induserte dis-adhesjonsmetoden letter også overføringen av hESC / hiPSC-linjer fra matercellebasert kultur til materfrie forhold hvis ønskelig for nedstrøms bruk og analyse.
Introduction
Riktig vedlikehold av hESC og hiPSC in vitro er en grunnleggende og praktisk metodikk for flere veier for forskning innen humancelle- og utviklingsbiologi. På grunn av hESCs og hiPSCs iboende drivkraft for å differensiere, krever opprettholdelse av den udifferensierte tilstanden in vitro spesiell forsiktighet og oppmerksomhet. Derfor er utvikling av kostnadseffektive protokoller for vedlikehold og passering av hESCs og hiPSCs med så liten metodologisk variabilitet som mulig av stor generell nytte.
Opprinnelig ble hESC og hiPSC dyrket på forskjellige typer materceller for å bistå i langsiktig kultur og vedlikehold av den udifferensierte tilstanden 1,2,3. Mer nylig har kultur under materfrie forhold blitt normen, da det unngår å håndtere materceller helt4. Noen laboratorier og kjernefasiliteter dyrker imidlertid fortsatt hESC eller hiPSC på materceller. Materfri kultur er dyrere fordi det krever bruk av kulturmedier av spesielle sammensetninger og en form for belegg av kulturoverflaten for å sikre koloniadherens (store ekstracellulære matrikskomponenter [ECM] eller en kommersiell ECM-forbindelse, eller ved bruk av kommersielt tilgjengelige belagte plater). Utgiftene er ikke trivielle og utgjør en potensiell økonomisk hindring for noen laboratorier som er interessert i å drive hESC- eller hiPSC-basert forskning og utvikling. Videre har kultur under materfrie forhold en tendens til å drive hESCene og hiPSCene til en mindre naiv tilstand enn det som opprettholdes på materceller5, og dette kan kompromittere påfølgende differensiering og føre til genetiske variasjoner6.
Historisk sett involverte passering av hESC og hiPSC dyrket på materceller mekanisk høsting - ved hjelp av en skalpell for å skjære kolonier under et mikroskop7 - men dette ble senere i stor grad erstattet av enzymatisk fordøyelse med eller uten skånsom skraping for å isolere kolonier eller dissosierte celler. Mekanisk høsting er kjedelig og krever presisjonsmikrokirurgi. Enzymatisk høsting kan variere i effektivitet på grunn av batch-til-batch enzymforskjeller og har en tendens til å favorisere fullstendig dissosiasjon, noe som fremmer celledød med mindre det motvirkes av ROCK-hemmere 8,9 og øker forekomsten av unormale karyotyper9.
For å dra nytte av de lavere kostnadene og det større differensieringspotensialet ved dyrking av hESC og hiPSC på materceller, samtidig som vi unngår ulempene ved mekanisk og enzymatisk høsting, har vi etablert en rask, effektiv, kostnadseffektiv metode med høy avkastning for høsting av hESC- og hiPSC-kolonier opprettholdt på et materlag av humane forhudsfibroblaster ved bruk av EDTA-mediert dis-adhesjon. Vi har sammenlignet utbyttet, variabiliteten og stamcellekvaliteten med det som oppnås ved mekanisk høsting (vi sammenlignet ikke med enzymatisk fordøyelse på grunn av den ekstra variabiliteten denne tilnærmingen innebærer). Vi bemerker at EDTA-mediert dis-adhesjon også fungerer bra for overføring av kolonier fra materbasert kultur til materfrie forhold, om ønskelig for nedstrøms bruk og analyser. Denne metoden gir en overgang med en konsekvent passasjemetode, siden EDTA-indusert dis-adhesjon er en populær tilnærming som brukes til materfrie kulturer.
Protocol
Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen.
1. Dyrking av humane fibroblastceller og fremstilling av matercellelaget
- Frø 0,5 × 106 humane forhudsfibroblaster (heretter kalt "materceller") per hver T-75 kulturkolbe (antall kolber etter behov) med 20 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) med (m /) 10% føtal bovint serum (FBS), heretter kalt "matercellemedium."
- Når matercellene når 90% sammenløp, fjern mediet og vask 3x med 10 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) per kolbe for å unngå hemming av trypsin av faktorer i mediet. Tilsett 2 ml trypsin-EDTA til hver kolbe, og plasser kolben (e) i en 37 ° C / 5% CO2 inkubator i 5 minutter eller til matercellene har løsnet fra kolben (e). Observer løsningen av cellene under et mikroskop som flytende aggregater av celler eller enkeltceller.
- Tilsett 5 ml ferskt forvarmet matercellemedium til hver kolbe for å inaktivere trypsin-EDTA, og suspender matercellene forsiktig ved pipettering.
- Overfør matercellene til et 15 ml sentrifugerør. Dekk røret, og pellet matercellene ved sentrifugering ved 200 × g i 5 minutter.
- Fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre matercellepelleten. Deretter resuspenderer pelleten forsiktig i 4 ml ferskmatercellemedium. Forsikre deg om at matercellene er grundig resuspendert før telling ved hjelp av et celletellingskammer eller annet celletellingsapparat.
- Tilsett 0,5 × 106 materceller til ønsket antall nye T-75 kulturflasker for utvidelse, og tilsett 20 ml ferskmatercellemedium til hver kolbe. Inkuber dyrkningskolben(e) i en 37 °C/5 % CO2 -inkubator til matercellene har nådd 90 % samløp.
MERK: Materceller kan brukes opp til minst passasje 25. - Beregn antall materceller som kreves for antall 35 mm vevskulturskåler som skal brukes til dyrking av hESCs/hiPSCs.
MERK: Vanligvis er 3,0 × 105 materceller per vevskulturskål tilstrekkelig til å generere et konfluent lag av materceller. - For å unngå spredning av matercellene, sørg for at de blir mitotisk arrestert på en av to måter.
MERK: For begge metodene kan en stor gruppe mitotisk arresterte materceller genereres og fryses ned i alikoter for senere bruk.- Utfør mitotisk arrestasjon ved gammabestråling ved å overføre alle matercellene som trengs til et 50 ml sentrifugerør og fylle på med matercellemedium til et totalt volum på 5 ml. Transporter umiddelbart ved romtemperatur til en gammabestrålingsmaskin, og bestråle for å mitotisk arrestere matercellene (300 kV og 10 mA i 20 minutter).
MERK: En forsinkelse i transporten kan føre til uønsket festing av matercellene til veggen i 50 ml sentrifugerøret. Hvis transporten krever mer enn noen få minutter, må du sørge for at matercellene forblir suspendert under transport ved kontinuerlig omrøring av røret. - Utfør mitotisk stans ved bruk av mitomycin C ved å overføre alle matercellene som trengs i 5 ml matercellemedium til et 50 ml sentrifugerør, og tilsett deretter 15 ml matercellemedium inneholdende 20 μg / ml mitomycin C, og inkuber i en 37 ° C / 5% CO2-inkubator i 3 timer. Tilsett 20 ml 37 °C PBS, pellet cellene ved sentrifugering ved 200 × g i 5 minutter, gjenta PBS-vasken ytterligere to ganger, og resuspender i matercellemedium.
- Utfør mitotisk arrestasjon ved gammabestråling ved å overføre alle matercellene som trengs til et 50 ml sentrifugerør og fylle på med matercellemedium til et totalt volum på 5 ml. Transporter umiddelbart ved romtemperatur til en gammabestrålingsmaskin, og bestråle for å mitotisk arrestere matercellene (300 kV og 10 mA i 20 minutter).
- Etter at matercellene har blitt mitotisk arrestert, gå tilbake til vevskulturhetten og plate ut matercellene ved 3,0 × 105 celler per 35 mm vevskulturskål, som følger. Forsikre deg om at matercellene er fullstendig resuspendert, tilsett matercellemedium for å nå en matercellekonsentrasjon på 1,5 × 105 per ml, og tilsett 2 ml av denne matercellesuspensjonen til hver 35 mm vevskulturskål.
- Overfør kulturrettene til en 37 °C/5% CO2 -inkubator. For å sikre en jevn fordeling av matercellene, flytt kulturfatene sakte, men fast på inkubatorhyllen fremover og bakover 3x, etterfulgt av en pause, og utfør deretter samme handling fra venstre til høyre 3x. Ikke flytt oppvasken igjen, og lukk forsiktig inkubatordøren.
- Etter 24 timer, bytt fra matercellemedium til IMDM m / 10% serumerstatning (SR). Bytt ut dette mediet deretter hver tredje dag. Matercellene er klare til bruk etter de første 3 dagene.
2. Mekanisk høsting av hESC- eller hiPSC-koloniene
- Forvarm hESC-medium bestående av 80% Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM), 20% SR, 1 mM glutaminsubstitutt 100x, 1 mM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 1 mM penicillin/streptomycin (P/S), 0,1 mM 2-merkaptoetanol og 10 ng/ml basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF). hESC-mediet brukes til kulturen av enten hESCs eller hiPSCs på matercellene.
- Ta ferske 35 mm vevskulturskåler som inneholder mitotisk arresterte materceller, og erstatt matercellemediet med 1,2 ml hESC-medium som inneholder bFGF minst 30 minutter før overføring av hESC/hiPSC-koloniene.
- Plasser en dyrkningsskål som inneholder hESC / hiPSC-kolonier på mitotisk arresterte materceller under et mikroskop med 10x forstørrelse plassert i en laminær strømningshette. Bruk en steril skalpell til å skjære forsiktig rundt omkretsen av hver koloni og kutt deretter hver koloni i 5-6 omtrent like store biter. Løft forsiktig opp kolonibitene med spissen av skalpellbladet slik at de løsner fra matercellelaget og flyter fritt i mediet.
- Prøv å unngå regioner i koloniene som inneholder differensierende celler, som vises som øyer av mindre celler med mindre distinkte kjerner sammenlignet med hESCs / hiPSCs i en koloni.
- Overfør de fritt flytende koloniene med en 1 ml pipette til de nye dyrkningsskålene som inneholder matercellene. Prøv å holde koloniene atskilt slik at de ikke vokser inn i hverandre senere. Flytt kulturoppvasken forsiktig til en celleinkubator, og unngå å forstyrre oppvasken til neste dag.
- Neste dag, tilsett forsiktig 600 μL hESC-medium som inneholder bFGF til et endelig volum på 1,8 ml. Bytt ut hESC + bFGF-mediet hver dag deretter til neste passasje (vanligvis etter 1 uke).
3. Høsting av hESC- eller hiPSC-koloniene ved bruk av EDTA-mediert dis-adhesjon
- Ta ferske kulturretter med mitotisk arresterte materceller, og bytt fra IMDM m / 10% SR til 1,2 ml forvarmet hESC + bFGF medium minst 30 minutter før overføringen av koloniene.
- Håndter en kulturrett som inneholder hESC- eller hiPSC-kolonier om gangen. Fjern hESC + bFGF-mediet, og vask koloniene med 1 ml romtemperatur DPBS for å eliminere eventuelle ufestede celler og celleavfall. Tilsett 1 ml 0,5 mM EDTA, og inkuber i 1 minutt ved 37 °C. Hvis den laminære strømningshetten har en varmeplate, utfør dette trinnet og trinnene i avsnitt 4 på varmeplaten for bedre vedheft.
- Etter 1 min inkubasjon, fjern EDTA-oppløsningen, og tilsett forsiktig 1 ml hESC + bFGF medium med en 1 ml pipette. Triturer forsiktig med samme pipette for å frigjøre koloniene fra matercellelaget. Fortsett å triturere forsiktig til matercellelaget løsner og bretter seg på seg selv i en separat klump. Trekk bort matercellelaget med pipettespissen.
- Overfør de suspenderte hESC/hiPSC-koloniene med en ny 1 ml pipette til nye dyrkningsskåler som inneholder materceller og hESC + bFGF-medium, splittet i forholdet 1:5. Koloniene har en tendens til å fordele seg jevnt innenfor hver ny kulturrett, men letter dette ved å flytte retten forsiktig fra side til side. Bytt ut hESC + bFGF-mediet hver dag deretter til neste passasje (vanligvis etter 1 uke).
Representative Results
I analysene og sammenligningene dokumentert nedenfor brukte vi to hESC-linjer (H9 og HS429, fra henholdsvis WiCell og Karolinska Institutet) og to hiPSC-linjer (NCS001 og NCS002, begge generert av Norsk kjernefasilitet for humane pluripotente stamceller). Dataene som presenteres i figurene og tabellene er fra hESC-linjene, men helt tilsvarende resultater ble hentet fra hiPSC-linjene.
I våre hender resulterte mekanisk høsting i at koloniene ble delt inn i omtrent fem til seks klumper på ~ 200-250 μm i diameter, mens med EDTA-indusert dis-adhesjon etterfulgt av triturering, ble hver koloni delt inn i ~ 10-20 klumper på ~ 60 μm i diameter. Vi anslår at antall celler i hver EDTA-høstet klump er ~ 20. Siden det er upraktisk å dele en koloni i klumper av denne størrelsen med en skalpell, er EDTA-indusert dis-adhesjon i denne forbindelse overlegen, da den genererer klumper av en størrelse som er gunstigere for kolonicelleoverlevelse10,11.
HESC/hiPSC-koloniene høstet med EDTA var også mer homogene i størrelse og form sammenlignet med koloniene høstet mekanisk (figur 1A-F). Dette skyldes at skjæringen som kreves for mekanisk høsting genererer ujevne kanter og varierende klumpstørrelser. For å evaluere dette kvantitativt, vurderte vi koloniens sirkularitet (som et mål på hvor avrundede kolonikantene var; en verdi på 1 indikerer en perfekt sirkel) 5 dager etter passering ved hjelp av ImageJ-win64-protokollen12. Koloniens sirkularitet var signifikant lavere i koloniene høstet mekanisk (mekanisk høsting: 0,61 ± 0,10; EDTA-basert høsting: 0,84 ± 0,01; n = 10, p < 0,001, Mann-Whitney U-test, U = 10).
Celletettheten i de høstede og replaterte koloniene, som er et mål på cellecelleinteraksjoner etter høsting under kolonidannelse, var lik EDTA-basert høsting og mekanisk høsting (tabell 1 og figur 1G,H). De mekanisk høstede koloniene hadde en større tendens til å utvikle nekrose i sine sentrale regioner (figur 1J). Dette skyldtes sannsynligvis variasjon i formen og spesielt størrelsen på de mekanisk isolerte celleklumpene, som når disse klumpene er for store, kan de lett brette seg på seg selv når de overføres til nye kulturretter. Dette var ikke tilfelle med koloniene høstet ved hjelp av EDTA, som jevnt viste et gjennomsiktig utseende med tydelige kanter (figur 1I).
Ved hjelp av EDTA-basert høsting klarte vi å samle stort sett alle koloniene som var etablert i en brønn innen 2-3 min. Ved hjelp av mekanisk høsting ville det være kjedelig og tidkrevende å samle alle koloniene i en brønn. Vi klarte vanligvis å samle bare ~ 30%, eller ~ 20-25 kolonier, ved hjelp av mekanisk høsting, og dette tok ~ 20 min. På samme måte, ved hjelp av kollagenase fordøyelse etterfulgt av forsiktig skraping, var det vanligvis vanskelig å høste alle koloniene, selv om den totale prosedyren bare tok noen få minutter. Dermed er EDTA-basert høsting like rask eller raskere enn enzymatisk høsting og mer effektiv enn enten mekanisk eller enzymatisk høsting.
For å vurdere effekten av de ulike høstingsmetodene på stamme og pluripotens utsatte vi først koloniene oppnådd etter 20 passeringer med EDTA-basert eller mekanisk høsting for qPCR-analyse (figur 2) og immuncytokjemisk farging (figur 3 og figur 4) for stamhetsmarkører. Koloniene oppnådd ved hjelp av begge metodene viste et stabilt uttrykk av stammemarkører både på mRNA- og proteinnivå. Deretter vurderte vi pluripotens ved differensiering til de tre kimlagene i embryoide legemer (figur 5 og figur 6). Embryoidlegemene generert fra hESCs eller hiPSCs oppnådd etter 20 passasjer ved bruk av hver metode inneholdt en blanding av celler som uttrykker ofte vurderte markører for ektoderm, mesoderm og endoderm.
Til slutt vurderte vi forekomsten av genomiske avvik i hESC og hiPSC passasjert ved hver metode ved hjelp av qPCR-basert genetisk analyse (se materialtabellen). Koloniene oppnådd etter 20 passasjer ved bruk av enten høstingsmetode viste noen eksempler på beskjedent avvik fra et referanse diploid kromosomalt mønster (avvikene som ble vurdert var de som vanligvis er forbundet med omprogrammering av hissc, men kan også fås i hESCs) (figur 7). Imidlertid var mønsteret av disse avvikene i hovedsak det samme i koloniene oppnådd etter begge høstingsmetodene, noe som indikerer at de ikke var knyttet til høstingsmetoden.
Figur 1: Kolonimorfologi og celletetthet etter EDTA-basert eller mekanisk høsting. (A-F) Representative lysfeltbilder av H9 hESC-kolonier etablert i fôrfri kultur i 5 dager etter 20 passeringer ved bruk av (A-C) EDTA-basert eller (D-F) mekanisk høsting. (G,H) Representative fluorescensbilder av celletettheten i H9 hESC-kolonier etablert etter 20 passasjer ved bruk av (G) EDTA-basert eller (H) mekanisk høsting. Cellekjernene er farget med DAPI. (I,J) Representative brightfield-bilder av H9 hESC-kolonier etablert etter 20 passasjer ved bruk av (I) EDTA-basert eller (J) mekanisk høsting. Legg merke til den nekrotiske sentrale regionen i kolonien høstet mekanisk (pil i J). Alle bildene ble anskaffet 5 dager etter den 20. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: hESC = menneskelig embryonal stamcelle; EDTA = etylendiamintetraeddiksyre; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ekspresjon av stammemarkør mRNA i to hESC-linjer (H9 og HS429) generert etter EDTA-basert eller mekanisk høsting. Kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon av de angitte markørene i H9 (øvre panel) og HS429 (nedre panel) hESC etter en enkelt passasje ved bruk av mekanisk høsting, etter 20 passasjer ved bruk av mekanisk høsting, og etter 20 passeringer ved bruk av EDTA-basert høsting (1:5 fortynning). Ekspresjonsnivået er relativt til husholdningsgenet ACTB (beta-aktin). Feilfeltene angir standardavviket. Forkortelser: hESC = menneskelig embryonal stamcelle; EDTA = etylendiamintetraeddiksyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ekspresjon av stammemarkørproteiner i H9 hESC-linjen etter ulike høstingsbetingelser. Representativ immunfluorescensfarging av H9 hESC-kolonier høstet mekanisk (A-E) før videre passering, (F-J) etter 20 passeringer ved bruk av mekanisk høsting, og (K-O) etter 20 passeringer ved bruk av EDTA-basert høsting. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: hESC = menneskelig embryonal stamcelle; EDTA = etylendiamintetraeddiksyre; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Ekspresjon av stammemarkørproteiner i HS429 hESC-linjen etter ulike høstingsbetingelser. Representativ immunfluorescensfarging av HS429 hESC-kolonier høstet mekanisk (A-E) før videre passering, (F-J) etter 20 passeringer ved bruk av mekanisk høsting, og (K-O) etter 20 passeringer ved bruk av EDTA-basert høsting. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: hESC = menneskelig embryonal stamcelle; EDTA = etylendiamintetraeddiksyre; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Ekspresjon av markører for de tre kimlagene i embryoidlegemer generert fra H9 hESC-linjen etter mekanisk eller EDTA-basert høsting. Representativ immunfluorescensfarging av markører for (A- og D-rader) ektoderm (ECTO, TUJI), (B- og E-rader) endoderm (ENDO, AFP) og (C- og F-rader) mesoderm (MESO, SMA). EB generert (A-C) etter 20 passeringer av mekanisk høsting eller (D-F) etter 20 passeringer av EDTA-basert høsting. Skalastenger = 40 μm. Forkortelser: hESC = menneskelig embryonal stamcelle; EDTA = etylendiamintetraeddiksyre; EB = embryoide legemer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Ekspresjon av markører for de tre kimlagene i embryoidlegemer generert fra HS429 hESC-linjen etter mekanisk eller EDTA-basert høsting. Representativ immunfluorescensfarging av markører for (A- og D-rader) ektoderm (ECTO, TUJI), (B- og E-rader) endoderm (ENDO, AFP) og (C- og F-rader) mesoderm (MESO, SMA). EB generert (A-C) etter 20 passeringer av mekanisk høsting (A-C) eller (D-F) etter 20 passeringer av EDTA-basert høsting. Skalastenger = 40 μm. Forkortelser: hESC = menneskelig embryonal stamcelle; EDTA = etylendiamintetraeddiksyre; EB = embryoide legemer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: qPCR-basert genetisk analyse av vanlige genomiske avvik i HS9- og HS429 ESC-linjene og NCS002 iPSC-linjen etter 20 passeringer ved bruk av mekanisk eller EDTA-basert høsting. Utgangsverdien ved verdi 2 representerer normal diploidi ved alle kromosommarkørene. En verdi på 1 eller 3 vil representere henholdsvis tap eller gevinst av den angitte kromosomale markøren i alle cellene. Mellomliggende verdier mellom 1 og 2 eller mellom 2 og 3 indikerer tilstedeværelsen av tap eller gevinst av den angitte markøren i en brøkdel av cellene. Legg merke til at mønsteret av avvik er likt i de to høstingsbetingelsene. Forkortelser: ESC = embryonal stamcelle; EDTA = etylendiamintetraeddiksyre; iPSC = indusert pluripotent stamcelle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Celletetthet (celler/mm2) | ||
| H9 | bety | STDEV |
| Mekanisk høsting før videre passering | 3918 | 263.3 |
| Mekanisk høst 20 ganger | 3868 | 197.7 |
| EDTA høster 20 ganger | 4080 | 127.8 |
| HS429 | bety | STDEV |
| Mekanisk høsting før videre passering | 5249 | 565.4 |
| Mekanisk høst 20 ganger | 5247 | 726.3 |
| EDTA høster 20 ganger | 4963 | 448.8 |
Tabell 1: Sammenligning av celletetthetene i koloniene fra de to hESC-linjene (H9 og HS429) generert etter EDTA-basert eller mekanisk høsting. Celletettheten ble vurdert enten etter en enkelt passasje ved hjelp av mekanisk høsting, etter 20 passeringer med mekanisk høsting, eller etter 20 passeringer med EDTA-basert høsting (ved 1:5 fortynning). I alle tilfeller er n = 5 kolonier.
Discussion
Vi har beskrevet en rask og kostnadseffektiv metode for høsting av hESC og hiPSC dyrket på materceller ved bruk av EDTA-mediert dis-adhesjon og sammenlignet dette primært med den konvensjonelle metoden for mekanisk høsting ved hjelp av en skalpell. Vi sammenlignet også EDTA-basert høsting med enzymatisk høsting med hensyn til metodens hastighet, men ikke aspekter av den resulterende kolonikvaliteten. Årsaken til dette er at enzymatisk høsting er iboende mer variabel og har vært knyttet til en høyere forekomst av genomiske avvik5, noe som kan skjule forskjellene mellom metodene.
Vi demonstrerer at EDTA-basert høsting er raskere og mer effektiv enn noen av de andre metodene og genererer mindre og morfologisk mer homogene kolonier enn mekanisk høsting. Denne sistnevnte egenskapen er gunstig med hensyn til celleoverlevelse, siden de større klumpene oppnådd ved mekanisk høsting er utsatt for sentral nekrose, mens enzymatisk fordøyelse har en tendens til å generere isolerte hESCer og hiPSCer, som er mer tilbøyelige til apoptose og krever ekstra behandling, for eksempel med ROCK-hemmere, for å overleve. EDTA-basert høsting kan brukes i minst 20 passeringer. De EDTA-baserte og mekaniske høstingsmetodene er sammenlignbare når det gjelder kolonicelletetthet, mRNA og proteinuttrykk av stamgener, differensiering av de tre kimlagene i embryoide legemer og genomiske abnormiteter. Hvis målet er effektivitet, høyere utbytte, mindre variabilitet og mer skånsom håndtering av hESC og hiPSCs, er EDTA-basert høsting å foretrekke.
Vi bemerker også at EDTA-basert høsting av hESC og hiPSC dyrket på materceller er en billig måte å opprettholde en mer naiv tilstand og gir en jevn overgang fra feederbasert til feederfri kultur der dette er ønskelig.
Kritiske trinn i protokollen
De mest kritiske trinnene i EDTA-mediert disadhesjon er protokollseksjon 3 (inkubasjon i EDTA-løsningen) og seksjon 4 (triturering). Hvis eksponeringen for EDTA-løsningen er lengre enn 1 min, øker risikoen for fullstendig dissosiasjon til enkeltceller. Dette kan også oppstå hvis triturasjonen er for langvarig eller for hard. Sistnevnte påvirkes av størrelsen på pipettespissen. Bruk av 1 ml cellekulturpipetter som beskrevet her er ideelt. Det er risikabelt å bruke en annen type pipette med mindre spissdiameter.
Feilsøking
Hvis matercellene fortsetter å spre seg, har mitotisk arrest ikke vært effektiv, og en ny batch må tas og prosedyren startes på nytt. Hvis koloniene ikke løsner fra matercellelaget, må man sørge for at det ikke er Ca2+ i EDTA og at dyrkningsskålen som inneholder koloniene skylles godt med PBS for å fjerne gjenværende cellekulturmedium før man tilsetter EDTA. For mye dissosiasjon, som genererer isolerte celler eller celleklumper som er for små, kan oppstå på grunn av overdreven triturering og kompromitterer etableringen av nye kolonier. Graden av triturering bør bestemmes empirisk i prøvekjøringer av protokollen for å bekrefte at de resulterende celleklumpene er ~ 60 μm i diameter. Hvis materlaget løsner spontant fra dyrkingsfatet, spesielt før hESC-ene/hiPSCene er klare for høsting, kan det skyldes at matercellene ikke har blitt brukt innen ~7 dager etter tilberedning. Derfor bør tidsrammen for bruk av matercellene overvåkes nøye. Hvis materlaget dissosieres under EDTA-eksponering (noe vi aldri har observert med matercellene som brukes her), må enten typen matercelle eller deres kulturmetode endres.
Begrensninger av teknikken
Hovedbegrensningen til teknikken er at den krever visuell inspeksjon av dis-adhesjonsprosessen for å oppnå et vellykket resultat. Dette betyr at brukerne må lære å identifisere når koloniene frigjøres fra matercellelaget og matercellelaget løsner fra substratet. Dette er imidlertid ikke vanskelig, og vår erfaring er at nye brukere av teknikken kan mestre den i løpet av et par forsøk.
Det er også en iboende mulighet for at de høstede hESC-ene eller hiPSCene kan være forurenset av noen få materceller. Hvis hensikten er å overføre til ikke-materforhold eller å isolere hESC-ene eller hiPSCene for analyser, vil slik forurensning kompromittere renheten. Vi bemerker at med matercellene som brukes her (humane forhudsfibroblaster), er det ekstremt vanskelig å dissociere matercellelaget, selv med enzymatisk fordøyelse (ikke vist). Siden det ikke-dissosierte matercellelaget fjernes i toto, vil forurensning av de høstede hESC-ene eller hiPSCene sannsynligvis være ubetydelig. Siden matercellene dessuten er mitotisk stanset, vil eventuell forurensning til slutt reduseres til null med ytterligere passering av hESC eller hiPSCs.
Betydning i forhold til eksisterende metoder
Den nåværende normen for dyrking av hESC og hiPSC er å gjøre det under materfrie forhold, hvor bruk av EDTA for passasje er utbredt. Materfri kultur er avhengig av bruk av spesielt formulerte medie- og kultursubstrater som sikrer etterlevelse. Disse reagensene medfører en ekstra kostnad som kan overstige noen laboratoriebudsjetter. I tillegg har kultur under materfrie forhold vært assosiert med et forstyrret differensieringspotensial på grunn av mangelen på spesifikke faktorer i de materfrie kulturmediene og en resulterende overgang fra den naive tilstanden til den primede tilstanden. Vekst på mitotisk arresterte materceller unngår denne overgangen og kan bringe de totale kostnadene ned til et håndterbart nivå, og dermed legge til rette for bredere bruk av pluripotente stamceller i laboratorieforskning.
Disclosures
Joel C. Glover er direktør og Hege Brincker Fjerdingstad er daglig leder for Norsk kjernefasilitet for humane pluripotente stamceller. Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi takker Lars Moen for hjelp under innledende forsøk og Norsk kjernefasilitet for humane pluripotente stamceller ved Norsk senter for stamcelleforskning, Oslo universitetssykehus, for bruk av fasiliteter. H9 hESC-linjen ble hentet fra WiCell, og HS429 hESC-linjen ble hentet fra Outi Hovatta ved Karolinska Institutet. Begge ble brukt i samsvar med materialoverføringsavtaler. HiPSC-linjene NCS001 og NCS002 ble generert av Norsk kjernefasilitet for humane pluripotente stamceller. Den omprogrammeringen og alt arbeidet som er rapportert her, ble utført med godkjenning av regional etisk komité i Sørøst-Norge (godkjenning REK 2017/110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | AF-100-18B-250UG | |
| Brand Bürker Chamber | Fisher Scientific | 10628431 | |
| Disposable scalpels no.15 | Susann-Morton | 505 | |
| DPBS (1x) without Ca/Mg | Gibco | 14190-094 | |
| Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm | Falcon | 353001 | |
| Eppendorf pipette 1 mL | Eppendorf | ||
| Eppendorf pipette 200 μL | Eppendorf | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter tip 1,000 μL | Sarstedt | 70.1186.210 | |
| Filter tip 200 μL | Sarstedt | 70.760.211 | |
| Gamma Cell 3000 ELAN irradiation machine (alternatively, use Mitomycin C to arrest proliferation) | Best Theratronics | BT/MTS 8007 GC3000E | |
| Glutamax 100x | Gibco | 35050-038 | |
| Growth Factor Reduced Matrixgel | Corning | 734-0269 | |
| H9 hESC line | WiCell | WAe009-A | |
| hPSC Genetic Analysis Kit | Stem Cell Technologies | #07550 | |
| HS429 hESC line | ECACC | KIe024-A | |
| Human Foreskin Fibroblasts -CRL2429 line | ATTC | CRL2429 | |
| IMDM (1x) | Gibco | 21980-032 | |
| iPSC lines | Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells | NCS001 & NCS002 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope or equivalent (we use the LSM 700 from Zeiss) | Zeiss | ||
| Microscope | CETI | ||
| Mitomycin C | Sigma Aldrich | M4287 | |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140.035 | |
| Pipettes, plastic 10 mL | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipettes, plastic, 5 mL | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serum Replacement (SR) | Gibco | 10828-028 | |
| Sterile filters 0.22 um | Sarstedt | 83.1826.102 | |
| T-75 culture flask | ThermoScientific | 156499 | |
| Trypan Blue Stain (0.4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA, 500 mL | Gibco | 25300062 |
References
- Skottman, H., Hovet, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132 (5), 691-698 (2006).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9 (2015).
- Villa-Diaz, L. G., et al. Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 28 (6), 581-583 (2010).
- Watanabe, M., et al. TGFb superfamily signaling regulates the state of human stem cell pluripotency and capacity to create well-structured telencephalic organoids. Stem Cell Reports. 17 (10), 2220-2238 (2022).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10 (2), e0118307 (2015).
- Inzunza, J., et al. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Rivera, T., Zhao, Y., Ni, Y., Wang, J. Human-induced pluripotent stem cell culture methods under cGMP conditions. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 117 (2020).
- Castro-Viñuelas, R., et al. Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 23, 569-581 (2021).
- Meng, G., Rancourt, D. E. Derivation and maintenance of undifferentiated human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 873, 69-90 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
