Summary
Um die Einschränkungen zu vermeiden, die mit der enzymatischen oder mechanischen Passage von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) verbunden sind, die auf Feederzellen kultiviert wurden, haben wir eine schnelle, effektive, kosteneffiziente und ertragreiche Methode zur Gewinnung von hESC- oder hiPSC-Kolonien etabliert, die auf einer Feederzellschicht menschlicher Vorhautfibroblasten gehalten werden, indem wir EDTA-vermittelte Disadhäsion verwenden.
Abstract
Humane pluripotente Stammzellen (humane embryonale Stammzellen, hES-Zellen und humane induzierte pluripotente Stammzellen, hiPS-Zellen) wurden ursprünglich auf verschiedenen Arten von Feederzellen kultiviert, um sie in einem undifferenzierten Zustand in Langzeitkultur zu erhalten. Dieser Ansatz wurde weitgehend durch feederfreie Kulturprotokolle ersetzt, die jedoch teurere Reagenzien beinhalten und einen Übergang in einen primierten Zustand fördern können, was die Differenzierungsfähigkeit der Zellen einschränkt. Sowohl unter Feeder- als auch unter Feeder-freien Bedingungen ist die Ernte von hESC- oder hiPSC-Kolonien für die Passage ein notwendiges Verfahren zur Vermehrung der Kulturen.
Um ein einfaches und ergiebiges Verfahren für die Passage von hES-/hiPS-Zellen zu ermöglichen, die auf Feeder-Zellen kultiviert wurden, haben wir eine Erntemethode etabliert, bei der die Disadhäsion durch den Kalziumchelator Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hervorgerufen wird. Wir haben die Ausbeute und Qualität der resultierenden Passagezellen bewertet, indem wir diesen Ansatz mit dem ursprünglichen mechanischen Ernteansatz verglichen haben, bei dem die Kolonien mit einem Skalpell unter einem Mikroskop isoliert werden (die mechanische Ernte wurde als Komparator gewählt, um die mit der enzymatischen Ernte verbundene Reagenzienvariabilität zu vermeiden).
In einer Reihe von Experimenten wurden zwei verschiedene hESC-Linien auf einer Feederzellschicht menschlicher Vorhautfibroblasten aufrechterhalten. Jede Linie wurde mehreren Passagen mittels EDTA-basierter oder mechanischer Ernte unterzogen und auf Koloniegröße und -morphologie, Zelldichte, Expression von Stammzellmarkern, Differenzierung zu den drei Keimblättern in Embryoidkörpern und genomische Aberrationen untersucht. In einer anderen Reihe von Experimenten haben wir EDTA-basiertes Harvesting auf zwei verschiedenen hiPSC-Linien verwendet und ähnliche Ergebnisse erzielt. Die EDTA-induzierte Disadhäsion sparte Zeit und führte zu einer höheren Ausbeute an Kolonien mit einer günstigeren Größe und einer gleichmäßigeren Morphologie im Vergleich zur mechanischen Ernte. Es war auch schneller als die enzymatische Ernte und nicht anfällig für die Variabilität der Enzymchargen. Die EDTA-induzierte Disadhäsionsmethode erleichtert auch den Transfer von hESC/hiPSC-Linien aus der Feeder-Zell-basierten Kultur in feederfreie Bedingungen, wenn dies für die nachgelagerte Verwendung und Analyse gewünscht wird.
Introduction
Die ordnungsgemäße Aufrechterhaltung von hES-Zellen und hiPS-Zellen in vitro ist eine grundlegende und bequeme Methode für verschiedene Forschungsrichtungen in der menschlichen Zell- und Entwicklungsbiologie. Aufgrund des inhärenten Drangs von hES-Zellen und hiPS-Zellen zur Differenzierung erfordert die Aufrechterhaltung des undifferenzierten Zustands in vitro besondere Sorgfalt und Aufmerksamkeit. Daher ist die Entwicklung kosteneffizienter Protokolle für die Wartung und Passage von hES-Zellen und hiPS-Zellen mit möglichst geringer methodischer Variabilität von großem allgemeinem Nutzen.
Ursprünglich wurden hES-Zellen und hiPS-Zellen auf verschiedenen Arten von Feeder-Zellen kultiviert, um die langfristige Kultivierung und Aufrechterhaltung des undifferenzierten Zustands zu unterstützen 1,2,3. In jüngster Zeit ist die Kultur unter feederfreien Bedingungen zur Norm geworden, da sie den Umgang mit Feederzellen gänzlich vermeidet4. Einige Labore und Core Facilities kultivieren jedoch immer noch hES-Zellen oder hiPS-Zellen auf Feeder-Zellen. Die feederfreie Kultur ist teurer, da sie die Verwendung von Nährmedien mit speziellen Zusammensetzungen und eine Form der Beschichtung der Kulturoberfläche erfordert, um die Adhärenz der Kolonie zu gewährleisten (Hauptkomponenten der extrazellulären Matrix [EZM] oder eine kommerzielle ECM-Verbindung oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher beschichteter Platten). Der Aufwand ist nicht trivial und stellt ein potenzielles finanzielles Hindernis für einige Laboratorien dar, die an hESC- oder hiPSC-basierter Forschung und Entwicklung interessiert sind. Darüber hinaus neigt die Kultur unter feederfreien Bedingungen dazu, die hES-Zellen und hiPS-Zellen in einen weniger naiven Zustand zuversetzen, als dies auf Feederzellen 5 der Fall ist, was die spätere Differenzierung beeinträchtigen und zu genetischen Variationen führenkann 6.
In der Vergangenheit beinhaltete die Passage von hES-Zellen und hiPS-Zellen, die auf Feeder-Zellen kultiviert wurden, eine mechanische Ernte - mit einem Skalpell, um Kolonien unter einem Mikroskop zu entfernen7 -, aber dies wurde später weitgehend durch enzymatische Verdauung mit oder ohne sanftes Schaben ersetzt, um Kolonien oder dissoziierte Zellen zu isolieren. Die maschinelle Ernte ist langwierig und erfordert eine präzise Mikrochirurgie. Die enzymatische Ernte kann aufgrund von Enzymunterschieden von Charge zu Charge variieren und neigt dazu, eine vollständige Dissoziation zu begünstigen, die den Zelltod fördert, sofern sie nicht durch ROCK-Inhibitoren 8,9 konterkariert wird, und die Inzidenz abnormaler Karyotypen erhöht9.
Um die Vorteile des geringeren Aufwands und des größeren Differenzierungspotenzials der Kultivierung von hES-Zellen und hiPS-Zellen auf Feeder-Zellen zu nutzen und gleichzeitig die Nachteile der mechanischen und enzymatischen Ernte zu vermeiden, haben wir eine schnelle, effektive, kosteneffiziente und ertragreiche Methode zur Gewinnung von hESC- und hiPSC-Kolonien etabliert, die auf einer Feeder-Schicht menschlicher Vorhautfibroblasten unter Verwendung von EDTA-vermittelter Disadhäsion gehalten werden. Wir haben die Ausbeute, die Variabilität und die Qualität der Stammzellen mit der bei der mechanischen Ernte verglichen (wir haben sie nicht mit der enzymatischen Verdauung verglichen, da dieser Ansatz eine zusätzliche Variabilität mit sich bringt). Wir stellen fest, dass die EDTA-vermittelte Disadhäsion auch gut für den Transfer von Kolonien von Feeder-basierten Kulturen zu feederfreien Bedingungen funktioniert, falls dies für die nachgelagerte Verwendung und Analyse gewünscht wird. Diese Methode bietet einen Übergang mit einer konsistenten Passageierungsmethode, da die EDTA-induzierte Disadhäsion ein beliebter Ansatz für feederfreie Kulturen ist.
Protocol
In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Kultivierung humaner Fibroblastenzellen und Vorbereitung der Feederzellschicht
- Samen Sie 0,5 × 106 menschliche Vorhautfibroblasten (im Folgenden als "Feederzellen" bezeichnet) pro T-75-Kulturkolben (Anzahl der Kolben nach Bedarf) mit 20 ml Modified Dulbecco's Medium (IMDM) von Iscove mit (w/) 10% fötalem Kälberserum (FBS), im Folgenden als "Feederzellmedium" bezeichnet.
- Wenn die Feeder-Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, entfernen Sie das Medium und waschen Sie es 3x mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco pro Flasche, um die Hemmung von Trypsin durch Faktoren im Medium zu vermeiden. In jeden Kolben werden 2 ml Trypsin-EDTA gegeben und die Kolben 5 Minuten lang in einen 37 °C/5 % CO2 -Inkubator gestellt oder bis sich die Zuführzellen von dem/den Kolben(en) gelöst haben. Beobachten Sie die Ablösung der Zellen unter dem Mikroskop als schwimmende Aggregate von Zellen oder einzelnen Zellen.
- Geben Sie 5 ml frisches, vorgewärmtes Feeder-Zellmedium in jeden Kolben, um das Trypsin-EDTA zu inaktivieren, und suspendieren Sie die Feeder-Zellen vorsichtig durch Pipettieren.
- Die Feeder-Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen. Verschließen Sie das Röhrchen und pelletieren Sie die Speiserzellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 Minuten.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet der Feeder-Zelle zu stören. Anschließend wird das Pellet vorsichtig in 4 ml frischem Feeder-Zellmedium resuspendiert. Stellen Sie sicher, dass die Zuführzellen vor der Zählung mit einer Zellzählkammer oder einem anderen Zellzählgerät gründlich resuspendiert werden.
- Geben Sie 0,5 × 106 Feederzellen zur erforderlichen Anzahl neuer T-75-Kulturflaschen zur Expansion und geben Sie 20 ml frisches Feeder-Zellmedium in jeden Kolben. Die Kulturflasche (die Kulturkolben) werden in einem 37 °C/5 % CO2 -Inkubator inkubiert, bis die Feederzellen eine 90%ige Konfluenz erreicht haben.
HINWEIS: Feeder-Zellen können bis mindestens 25 Passage verwendet werden. - Berechnen Sie die Anzahl der Feeder-Zellen, die für die Anzahl der 35-mm-Gewebekulturschalen benötigt werden, die für die Kultivierung der hES-/hiPS-Zellen verwendet werden.
HINWEIS: In der Regel reichen 3,0 ×10 5 Feederzellen pro Gewebekulturschale aus, um eine konfluierende Schicht von Feederzellen zu erzeugen. - Um die Proliferation der Feeder-Zellen zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass sie auf eine von zwei Arten mitotisch arretiert werden.
HINWEIS: Für beide Methoden kann eine große Charge mitotisch arretierter Feederzellen erzeugt und in Aliquoten für die spätere Verwendung eingefroren werden.- Führen Sie einen mitotischen Stillstand durch Gammabestrahlung durch, indem Sie alle benötigten Feederzellen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und mit Feeder-Zellmedium auf ein Gesamtvolumen von 5 ml auffüllen. Sofort bei Raumtemperatur zu einem Gammabestrahlungsgerät transportieren und bestrahlen, um die Feederzellen (300 kV und 10 mA für 20 min) mitotisch zu arretieren.
HINWEIS: Eine Verzögerung des Transports kann zu einer unerwünschten Befestigung der Feederzellen an der Wand des 50-ml-Zentrifugenröhrchens führen. Wenn der Transport länger als ein paar Minuten dauert, stellen Sie sicher, dass die Zuführzellen während des Transports in der Schwebe bleiben, indem Sie das Röhrchen kontinuierlich bewegen. - Führen Sie einen mitotischen Stillstand mit Mitomycin C durch, indem Sie alle benötigten Feeder-Zellen in 5 ml Feeder-Zellmedium in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und dann 15 ml Feeder-Zellmedium mit 20 μg/ml Mitomycin C hinzufügen und 3 h lang in einem 37 °C/5 % CO2-Inkubator inkubieren. 20 ml PBS bei 37 °C zugeben, die Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 Minuten pelletieren, die PBS-Wäsche zwei weitere Male wiederholen und im Feeder-Zellmedium resuspendieren.
- Führen Sie einen mitotischen Stillstand durch Gammabestrahlung durch, indem Sie alle benötigten Feederzellen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und mit Feeder-Zellmedium auf ein Gesamtvolumen von 5 ml auffüllen. Sofort bei Raumtemperatur zu einem Gammabestrahlungsgerät transportieren und bestrahlen, um die Feederzellen (300 kV und 10 mA für 20 min) mitotisch zu arretieren.
- Nachdem die Feederzellen mitotisch fixiert wurden, kehren Sie zur Gewebekulturhaube zurück und verteilen die Feederzellen bei 3,0 × 105 Zellen pro 35-mm-Gewebekulturschale wie folgt. Stellen Sie sicher, dass die Feeder-Zellen vollständig resuspendiert sind, fügen Sie Feeder-Zellmedium hinzu, um eine Feeder-Zellkonzentration von 1,5 × 105 pro ml zu erreichen, und geben Sie 2 ml dieser Feeder-Zellsuspension in jede 35-mm-Gewebekulturschale.
- Die Kulturschalen werden in einen Inkubator mit 37 °C/5 % CO2 überführt. Um eine gleichmäßige Verteilung der Feederzellen zu gewährleisten, bewegen Sie die Kulturschalen auf dem Inkubatorregal langsam aber sicher 3x vor und zurück, gefolgt von einer Pause, und führen Sie dann die gleiche Aktion von links nach rechts 3x durch. Bewegen Sie das Geschirr nicht mehr und schließen Sie vorsichtig die Tür des Inkubators.
- Nach 24 Stunden von Feeder-Zellmedium auf IMDM mit 10% Serumersatz (SR) umstellen. Tauschen Sie dieses Medium danach jeden dritten Tag aus. Die Feederzellen sind nach den ersten 3 Tagen einsatzbereit.
2. Maschinelle Ernte der hESC- oder hiPSC-Kolonien
- Vorwärmtes hESC-Medium, bestehend aus 80 % Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 20 % SR, 1 mM Glutaminersatz 100x, 1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1 mM Penicillin/Streptomycin (P/S), 0,1 mM 2-Mercaptoethanol und 10 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF). Das hESC-Medium wird für die Kultivierung der hES-Zellen oder der hiPS-Zellen auf den Feederzellen verwendet.
- Nehmen Sie frische 35-mm-Gewebekulturschalen mit mitotisch arretierten Feederzellen und ersetzen Sie das Feeder-Zellmedium mindestens 30 Minuten vor dem Transfer der hESC/hiPSC-Kolonien durch 1,2 ml bFGF-haltiges hESC-Medium.
- Eine Kulturschale mit hESC/hiPSC-Kolonien wird auf mitotisch arretierten Feederzellen unter einem Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung in eine Laminar-Flow-Haube gelegt. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um vorsichtig um den Umfang jeder Kolonie herum zu schneiden, und schneiden Sie dann jede Kolonie in 5-6 etwa gleiche Stücke. Heben Sie die Koloniestücke vorsichtig mit der Spitze der Skalpellklinge an, so dass sie sich von der Feederzellschicht lösen und frei im Medium schwimmen.
- Versuchen Sie, Regionen der Kolonien zu vermeiden, die differenzierende Zellen enthalten, die als Inseln kleinerer Zellen mit weniger ausgeprägten Kernen im Vergleich zu hESCs/hiPSCs innerhalb einer Kolonie erscheinen.
- Übertragen Sie die frei schwebenden Kolonien mit einer 1-ml-Pipette in die neuen Kulturschalen, die die Feederzellen enthalten. Versuchen Sie, die Kolonien getrennt zu halten, damit sie später nicht ineinander hineinwachsen. Bringen Sie die Kulturschalen vorsichtig in einen Zellinkubator und vermeiden Sie es, die Schalen bis zum nächsten Tag zu stören.
- Am nächsten Tag werden vorsichtig 600 μl bFGF-haltiges hESC-Medium zu einem Endvolumen von 1,8 ml zugegeben. Tauschen Sie das hESC + bFGF-Medium danach jeden Tag bis zur nächsten Passage (in der Regel nach 1 Woche) aus.
3. Ernte der hESC- oder hiPSC-Kolonien mittels EDTA-vermittelter Disadhäsion
- Nehmen Sie frische Kulturschalen mit mitotisch arretierten Feederzellen und wechseln Sie mindestens 30 Minuten vor dem Transfer der Kolonien von IMDM mit 10 % SR auf 1,2 ml vorgewärmtes hESC + bFGF-Medium.
- Behandeln Sie jeweils eine Kulturschale mit hESC- oder hiPSC-Kolonien. Entfernen Sie das hESC + bFGF-Medium und waschen Sie die Kolonien mit 1 ml DPBS bei Raumtemperatur, um mögliche nicht anhaftende Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. 1 ml 0,5 mM EDTA zugeben und 1 Minute bei 37 °C inkubieren. Wenn die Laminar-Flow-Haube über eine Warmhalteplatte verfügt, führen Sie diesen Schritt und die Schritte in Abschnitt 4 auf der Warmhalteplatte durch, um eine bessere Enthaftung zu erzielen.
- Nach der 1-minütigen Inkubation entfernen Sie die EDTA-Lösung und fügen vorsichtig 1 ml hESC + bFGF-Medium mit einer 1-ml-Pipette hinzu. Mit derselben Pipette vorsichtig verreiben, um die Kolonien aus der Feederzellschicht zu lösen. Fahren Sie vorsichtig fort, bis sich die Feeder-Zellschicht lockert und sich in einem separaten Klumpen auf sich selbst faltet. Ziehen Sie die Feederzellschicht mit der Pipettenspitze ab.
- Übertragen Sie die suspendierten hESC/hiPSC-Kolonien mit einer neuen 1-ml-Pipette in neue Kulturschalen, die die Feederzellen und das hESC + bFGF-Medium enthalten, und teilen Sie sich im Verhältnis 1:5. Die Völker neigen dazu, sich gleichmäßig in jeder neuen Kulturschale zu verteilen, erleichtern dies jedoch, indem sie die Schale vorsichtig von einer Seite zur anderen bewegen. Tauschen Sie das hESC + bFGF-Medium danach jeden Tag bis zur nächsten Passage (in der Regel nach 1 Woche) aus.
Representative Results
In den unten dokumentierten Assays und Vergleichen verwendeten wir zwei hESC-Linien (H9 und HS429 von WiCell bzw. dem Karolinska-Institut) und zwei hiPSC-Linien (NCS001 und NCS002, beide von der norwegischen Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells). Die in den Abbildungen und Tabellen dargestellten Daten stammen von den hESC-Linien, aber es wurden völlig ähnliche Ergebnisse aus den hiPSC-Linien erzielt.
In unseren Händen führte die mechanische Ernte dazu, dass die Kolonien in etwa fünf bis sechs Klumpen von ~200-250 μm Durchmesser aufgeteilt wurden, während bei EDTA-induzierter Disadhäsion gefolgt von Reibung jede Kolonie in ~10-20 Klumpen mit ~60 μm Durchmesser aufgeteilt wurde. Wir schätzen, dass die Anzahl der Zellen in jedem EDTA-geernteten Klumpen ~20 beträgt. Da es unpraktisch ist, eine Kolonie mit einem Skalpell in Klumpen dieser Größe zu spalten, ist in dieser Hinsicht die EDTA-induzierte Disadhäsion überlegen, da sie Klumpen in einer Größe erzeugt, die für das Überleben der Koloniezellen günstiger ist10,11.
Die mit EDTA geernteten hESC/hiPSC-Kolonien waren auch homogener in Größe und Form als die mechanisch geernteten Kolonien (Abbildung 1A-F). Denn der für die maschinelle Ernte erforderliche Schnitt erzeugt unebene Kanten und unterschiedliche Klumpengrößen. Um dies quantitativ zu bewerten, haben wir die Koloniezirkularität (als Maß dafür, wie abgerundet die Kolonieränder waren; ein Wert von 1 steht für einen perfekten Kreis) 5 Tage nach der Passage mit dem ImageJ-win64-Protokoll12 bewertet. Die Zirkularität der Kolonien war in den mechanisch geernteten Kolonien signifikant geringer (mechanische Ernte: 0,61 ± 0,10; Ernte auf EDTA-Basis: 0,84 ± 0,01; n = 10, p < 0,001, Mann-Whitney-U-Test, U = 10).
Die Zelldichte in den geernteten und umplattierten Kolonien, die ein Maß für die Zell-Zell-Interaktionen nach der Ernte während der Koloniebildung ist, war ähnlich wie bei EDTA-basierter Ernte und mechanischer Ernte (Tabelle 1 und Abbildung 1G,H). Die mechanisch geernteten Kolonien hatten eine größere Tendenz zur Nekrose in ihren zentralen Regionen (Abbildung 1J). Dies war wahrscheinlich auf die Variabilität in der Form und vor allem auf die Größe der mechanisch isolierten Zellklumpen zurückzuführen, denn wenn diese Klumpen zu groß sind, können sie sich leicht in sich selbst falten, wenn sie in neue Kulturschalen übertragen werden. Dies war bei den mit EDTA geernteten Völkern nicht der Fall, die einheitlich ein durchscheinendes Erscheinungsbild mit deutlichen Kanten aufwiesen (Abbildung 1I).
Mit Hilfe der EDTA-basierten Ernte konnten wir innerhalb von 2-3 Minuten im Wesentlichen alle Kolonien sammeln, die sich in einem Brunnen etabliert hatten. Mit Hilfe der maschinellen Ernte wäre das Sammeln aller Kolonien in einem Brunnen mühsam und zeitaufwändig. In der Regel gelang es uns, nur ~30% oder ~20-25 Völker mit mechanischer Ernte zu sammeln, und das dauerte ~20 Minuten. Ebenso war es mit Kollagenase-Verdauung, gefolgt von sanftem Schaben, in der Regel schwierig, alle Kolonien zu ernten, obwohl die gesamte Prozedur nur wenige Minuten dauerte. Somit ist die EDTA-basierte Ernte genauso schnell oder schneller als die enzymatische Ernte und effizienter als die mechanische oder enzymatische Ernte.
Um den Einfluss der verschiedenen Erntemethoden auf die Stamm- und Pluripotenz zu beurteilen, unterzogen wir die Kolonien, die nach 20 Passagen mittels EDTA-basierter oder mechanischer Ernte gewonnen wurden, zunächst einer qPCR-Analyse (Abbildung 2) und einer immunzytochemischen Färbung (Abbildung 3 und Abbildung 4) auf Stammmarkmarker. Die Kolonien, die mit beiden Methoden gewonnen wurden, zeigten eine stabile Expression von Stammzellmarkern sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Anschließend wurde die Pluripotenz durch Differenzierung zu den drei Keimblättern in Embryoidkörpern beurteilt (Abbildung 5 und Abbildung 6). Die Embryoidkörper, die aus den hES-Zellen oder hiPS-Zellen erzeugt wurden, die nach 20 Passagen mit beiden Methoden erhalten wurden, enthielten eine Mischung von Zellen, die häufig bewertete Marker für Ektoderm, Mesoderm und Endoderm exprimierten.
Schließlich untersuchten wir die Häufigkeit von genomischen Aberrationen in hES-Zellen und hiPS-Zellen, die von jeder Methode mit Hilfe von qPCR-basierter genetischer Analyse durchlaufen wurden (siehe Materialtabelle). Die Kolonien, die nach 20 Passagen mit einer der beiden Erntemethoden gewonnen wurden, zeigten einige Beispiele für eine bescheidene Abweichung von einem diploiden Chromosomenmuster (die untersuchten Anomalien waren diejenigen, die üblicherweise mit der Reprogrammierung von hiPSCs in Verbindung gebracht werden, können aber auch in hES-Zellen beobachtet werden) (Abbildung 7). Das Muster dieser Abweichungen war jedoch bei den Kolonien, die nach beiden Erntemethoden gewonnen wurden, im Wesentlichen gleich, was darauf hindeutet, dass sie nicht mit der Erntemethode in Verbindung standen.
Abbildung 1: Koloniemorphologie und Zelldichte nach EDTA-basierter oder mechanischer Ernte. (A-F) Repräsentative Hellfeldbilder von H9 hESC-Kolonien, die nach 20 Passagen mit (A-C) EDTA-basierter oder (D-F) mechanischer Ernte für 5 Tage in feederfreier Kultur etabliert wurden. (G,H) Repräsentative Fluoreszenzbilder der Zelldichte in H9 hESC-Kolonien, die nach 20 Passagen mittels (G) EDTA-basierter oder (H) mechanischer Ernte erstellt wurden. Die Zellkerne werden mit DAPI gefärbt. (I,J) Repräsentative Hellfeldbilder von H9 hESC-Kolonien, die nach 20 Passagen mit (I) EDTA-basierter oder (J) mechanischer Ernte etabliert wurden. Man beachte die nekrotische Zentralregion in der Kolonie, die mechanisch geerntet wird (Pfeil in J). Alle Bilder wurden 5 Tage nach der 20. Passage aufgenommen. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: hESC = humane embryonale Stammzelle; EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Expression von Stammmarkmarker-mRNA in zwei hESC-Linien (H9 und HS429), die nach EDTA-basierter oder mechanischer Ernte erzeugt wurden. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion der angegebenen Marker in H9 (oberes Bild) und HS429 (unteres Bild) hES-Zellen nach einer einzigen Passage mit mechanischer Ernte, nach 20 Passagen mit mechanischer Ernte und nach 20 Passagen mit EDTA-basierter Ernte (1:5-Verdünnung). Das Expressionsniveau ist relativ zu dem des Housekeeping-Gens ACTB (Beta-Aktin). Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Abkürzungen: hESC = humane embryonale Stammzelle; EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Expression von Stamm-Marker-Proteinen in der H9 hESC-Linie nach verschiedenen Erntebedingungen. Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von H9 hESC-Kolonien, die vor der weiteren Passage mechanisch (A-E), (F-J) nach 20 Passagen mit mechanischer Ernte und (K-O) nach 20 Passagen mit EDTA-basierter Ernte geerntet wurden. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: hESC = humane embryonale Stammzelle; EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Expression von Stammmarkerproteinen in der HS429 hESC-Linie nach verschiedenen Erntebedingungen. Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von HS429 hESC-Kolonien, die vor der weiteren Passage mechanisch (A-E), (F-J) nach 20 Passagen mit mechanischer Ernte und (K-O) nach 20 Passagen mit EDTA-basierter Ernte geerntet wurden. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: hESC = humane embryonale Stammzelle; EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Expression von Markern für die drei Keimblätter in Embryoidkörpern, die aus der H9 hESC-Linie nach mechanischer oder EDTA-basierter Entnahme generiert wurden. Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von Markern für (A- und D-Reihen) Ektoderm (ECTO, TUJI), (B- und E-Reihen) Endoderm (ENDO, AFP) und (C- und F-Reihen) Mesoderm (MESO, SMA). EBs, die (A-C) nach 20 Durchgängen mechanischer Ernte oder (D-F) nach 20 Durchgängen EDTA-basierter Ernte erzeugt wurden. Maßstabsbalken = 40 μm. Abkürzungen: hESC = humane embryonale Stammzelle; EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; EBs = Embryoidkörper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Expression von Markern für die drei Keimblätter in Embryoidkörpern, die aus der HS429 hESC-Linie nach mechanischer oder EDTA-basierter Entnahme generiert wurden. Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von Markern für (A- und D-Reihen) Ektoderm (ECTO, TUJI), (B- und E-Reihen) Endoderm (ENDO, AFP) und (C- und F-Reihen) Mesoderm (MESO, SMA). EBs, die nach 20 Durchgängen mechanischer Ernte (A-C) oder (D-F) nach 20 Durchgängen EDTA-basierter Ernte erzeugt wurden (A-C). Maßstabsbalken = 40 μm. Abkürzungen: hESC = humane embryonale Stammzelle; EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; EBs = Embryoidkörper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: qPCR-basierte genetische Analyse häufiger genomischer Aberrationen in den ESC-Linien HS9 und HS429 und der iPSC-Linie NCS002 nach 20 Passagen mit mechanischer oder EDTA-basierter Ernte. Der Ausgangswert bei Wert 2 stellt eine normale Diploidie an allen Chromosomenmarkern dar. Ein Wert von 1 oder 3 würde einen Verlust bzw. Gewinn des angegebenen Chromosomenmarkers in allen Zellen darstellen. Zwischenwerte zwischen 1 und 2 oder zwischen 2 und 3 zeigen das Vorhandensein eines Verlusts oder Gewinns des angegebenen Markers in einem Bruchteil der Zellen an. Beachten Sie, dass das Muster der Aberrationen unter den beiden Erntebedingungen ähnlich ist. Abkürzungen: ESC = embryonale Stammzelle; EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; iPSC = induzierte pluripotente Stammzelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Zelldichte (Zellen/mm2) | ||
| H9-KARTON | bedeuten | stdev |
| Maschinelle Ernte vor der weiteren Passage | 3918 | 263.3 |
| Mechanische Ernte 20 Mal | 3868 | 197.7 |
| EDTA-Ernte 20 Mal | 4080 | 127.8 |
| HS429-KARTON | bedeuten | stdev |
| Maschinelle Ernte vor der weiteren Passage | 5249 | 565.4 |
| Mechanische Ernte 20 Mal | 5247 | 726.3 |
| EDTA-Ernte 20 Mal | 4963 | 448.8 |
Tabelle 1: Vergleich der Zelldichten in den Kolonien der beiden hESC-Linien (H9 und HS429), die nach EDTA-basierter oder mechanischer Ernte erzeugt wurden. Die Zelldichten wurden entweder nach einer einzigen Passage mit mechanischer Ernte, nach 20 Passagen mit mechanischer Ernte oder nach 20 Passagen mit EDTA-basierter Ernte (bei 1:5-Verdünnung) bestimmt. In allen Fällen n = 5 Kolonien.
Discussion
Wir haben eine schnelle und kostengünstige Methode zur Gewinnung von hES-Zellen und hiPS-Zellen beschrieben, die auf Feederzellen mittels EDTA-vermittelter Disadhäsion kultiviert wurden, und diese vor allem mit der konventionellen Methode der mechanischen Ernte mit einem Skalpell verglichen. Wir verglichen die EDTA-basierte Ernte auch mit der enzymatischen Ernte in Bezug auf die Geschwindigkeit der Methode, aber nicht in Bezug auf Aspekte der resultierenden Koloniequalität. Der Grund dafür ist, dass die enzymatische Ernte von Natur aus variabler ist und mit einer höheren Prävalenz von genomischen Aberrationen in Verbindung gebracht wurde5, was die Unterschiede zwischen den Methoden verschleiern könnte.
Wir zeigen, dass die EDTA-basierte Ernte schneller und effizienter ist als jede der anderen Methoden und kleinere und morphologisch homogenere Kolonien erzeugt als die maschinelle Ernte. Letzteres ist vorteilhaft für das Überleben der Zellen, da die größeren Klumpen, die durch mechanische Ernte gewonnen werden, anfällig für zentrale Nekrose sind, während die enzymatische Verdauung dazu neigt, isolierte hES-Zellen und hiPS-Zellen zu erzeugen, die anfälliger für Apoptose sind und eine zusätzliche Behandlung, z. B. mit ROCK-Inhibitoren, benötigen, um zu überleben. Die EDTA-basierte Ernte kann für mindestens 20 Passagen verwendet werden. Die EDTA-basierten und mechanischen Harvesting-Methoden sind vergleichbar, wenn es um die Dichte der Koloniezellen, die mRNA- und Proteinexpression von Stammgenen, die Differenzierung der drei Keimblätter in embryoidischen Körpern und genomische Anomalien geht. Wenn das Ziel Effizienz, höherer Ertrag, geringere Variabilität und ein schonenderer Umgang mit den hES-Zellen und hiPS-Zellen ist, ist die EDTA-basierte Ernte vorzuziehen.
Wir stellen auch fest, dass die EDTA-basierte Ernte von hES-Zellen und hiPS-Zellen, die auf Feeder-Zellen kultiviert wurden, eine kostengünstige Möglichkeit ist, einen naiveren Zustand aufrechtzuerhalten und einen reibungslosen Übergang von feeder-basierten zu feederfreien Kulturen ermöglicht, wenn dies wünschenswert ist.
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Die kritischsten Schritte der EDTA-vermittelten Disadhäsion sind Protokollabschnitt 3 (Inkubation in der EDTA-Lösung) und Abschnitt 4 (Reibung). Wenn die Exposition gegenüber der EDTA-Lösung länger als 1 Minute dauert, erhöht sich das Risiko einer vollständigen Dissoziation zu einzelnen Zellen. Dies kann auch auftreten, wenn die Reibung zu langwierig oder zu stark ist. Letzteres wird durch die Größe der Pipettenspitze beeinflusst. Die Verwendung von 1-ml-Zellkulturpipetten, wie hier beschrieben, ist ideal. Die Verwendung eines anderen Pipettentyps mit einem kleineren Spitzendurchmesser ist riskant.
Fehlerbehebung
Wenn sich die Feederzellen weiter vermehren, war der mitotische Stillstand nicht wirksam, und es muss eine neue Charge entnommen und das Verfahren neu gestartet werden. Wenn sich die Kolonien nicht von der Feeder-Zellschicht lösen, muss sichergestellt werden, dass kein Ca2+ in der EDTA vorhanden ist und dass die Kulturschale mit den Kolonien vor der Zugabe des EDTA gut mit PBS gespült wird, um das restliche Zellkulturmedium zu entfernen. Eine zu starke Dissoziation, die isolierte Zellen oder zu kleine Zellklumpen erzeugt, kann durch übermäßige Verreibung entstehen und die Etablierung neuer Kolonien beeinträchtigen. Der Grad der Verreibung sollte empirisch in Testläufen des Protokolls bestimmt werden, um zu bestätigen, dass die resultierenden Zellklumpen einen Durchmesser von ~60 μm haben. Wenn sich die Feederschicht spontan von der Kulturschale löst, insbesondere bevor die hESCs/hiPSCs erntereif sind, könnte dies daran liegen, dass die Feederzellen nicht innerhalb von ~7 Tagen nach der Zubereitung verwendet wurden. Daher sollte der Zeitrahmen für die Verwendung der Feederzellen sorgfältig überwacht werden. Wenn die Feeder-Schicht während der EDTA-Exposition dissoziiert (was wir bei den hier verwendeten Feeder-Zellen noch nie beobachtet haben), muss entweder die Art der Feeder-Zelle oder ihre Kulturmethode geändert werden.
Grenzen der Technik
Die Haupteinschränkung der Technik besteht darin, dass sie eine visuelle Inspektion des Adhäsionsprozesses erfordert, um ein erfolgreiches Ergebnis zu erzielen. Das bedeutet, dass Anwender lernen müssen, zu erkennen, wann sich die Kolonien von der Feeder-Zellschicht lösen und die Feeder-Zellschicht sich vom Substrat löst. Dies ist jedoch nicht schwierig, und unserer Erfahrung nach können neue Benutzer der Technik sie innerhalb weniger Versuche beherrschen.
Es besteht auch die Möglichkeit, dass die geernteten hES-Zellen oder hiPS-Zellen durch einige wenige Feeder-Zellen kontaminiert sind. Wenn beabsichtigt wird, unter Nicht-Feeder-Bedingungen zu übergehen oder die hES-Zellen oder hiPS-Zellen für Assays zu isolieren, würde eine solche Kontamination die Reinheit beeinträchtigen. Wir stellen fest, dass es mit den hier verwendeten Feederzellen (menschliche Vorhautfibroblasten) extrem schwierig ist, die Feederzellschicht zu dissoziieren, selbst bei enzymatischem Verdau (nicht gezeigt). Da die undissoziierte Feederzellschicht in toto entfernt wird, ist die Kontamination der geernteten hES-Zellen oder hiPS-Zellen wahrscheinlich vernachlässigbar. Da die Feeder-Zellen außerdem mitotisch fixiert sind, würde jede Kontamination schließlich auf Null sinken, wenn die hES-Zellen oder hiPS-Zellen weiter passieren.
Bedeutung in Bezug auf bestehende Methoden
Die derzeitige Norm für die Kultivierung von hES-Zellen und HiPS-Zellen besteht darin, dies unter feederfreien Bedingungen zu tun, für die die Verwendung von EDTA für die Passage weit verbreitet ist. Die feederfreie Kultur hängt von der Verwendung speziell formulierter Medien und Kultursubstrate ab, die die Adhärenz gewährleisten. Diese Reagenzien sind mit zusätzlichen Kosten verbunden, die einige Laborbudgets übersteigen können. Darüber hinaus wurde die Kultur unter feederfreien Bedingungen mit einem gestörten Differenzierungspotenzial aufgrund des Fehlens spezifischer Faktoren in den feederfreien Nährmedien und einem daraus resultierenden Übergang vom naiven in den primierten Zustand in Verbindung gebracht. Die Züchtung auf mitotisch verriegelten Feederzellen vermeidet diesen Übergang und kann die Gesamtkosten auf ein überschaubares Niveau senken, was den breiteren Einsatz pluripotenter Stammzellen in der Laborforschung erleichtert.
Disclosures
Joel C. Glover ist der Direktor und Hege Brincker Fjerdingstad ist die tägliche Leiterin der norwegischen Core Facility für humane pluripotente Stammzellen. Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Lars Moen für die Unterstützung bei den vorbereitenden Experimenten und der norwegischen Core Facility für humane pluripotente Stammzellen am Norwegischen Zentrum für Stammzellforschung des Universitätsklinikums Oslo für die Nutzung der Einrichtungen. Die H9 hESC-Linie wurde von WiCell bezogen, und die HS429 hESC-Linie wurde von Outi Hovatta am Karolinska-Institut bezogen. Beide wurden in Übereinstimmung mit Materialtransfervereinbarungen verwendet. Die hiPSC-Linien NCS001 und NCS002 wurden von der norwegischen Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells generiert. Diese Neuprogrammierung und alle hier berichteten Arbeiten wurden mit Genehmigung der regionalen Ethikkommission für Südostnorwegen (Genehmigung REK 2017/110) durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | AF-100-18B-250UG | |
| Brand Bürker Chamber | Fisher Scientific | 10628431 | |
| Disposable scalpels no.15 | Susann-Morton | 505 | |
| DPBS (1x) without Ca/Mg | Gibco | 14190-094 | |
| Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm | Falcon | 353001 | |
| Eppendorf pipette 1 mL | Eppendorf | ||
| Eppendorf pipette 200 μL | Eppendorf | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter tip 1,000 μL | Sarstedt | 70.1186.210 | |
| Filter tip 200 μL | Sarstedt | 70.760.211 | |
| Gamma Cell 3000 ELAN irradiation machine (alternatively, use Mitomycin C to arrest proliferation) | Best Theratronics | BT/MTS 8007 GC3000E | |
| Glutamax 100x | Gibco | 35050-038 | |
| Growth Factor Reduced Matrixgel | Corning | 734-0269 | |
| H9 hESC line | WiCell | WAe009-A | |
| hPSC Genetic Analysis Kit | Stem Cell Technologies | #07550 | |
| HS429 hESC line | ECACC | KIe024-A | |
| Human Foreskin Fibroblasts -CRL2429 line | ATTC | CRL2429 | |
| IMDM (1x) | Gibco | 21980-032 | |
| iPSC lines | Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells | NCS001 & NCS002 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope or equivalent (we use the LSM 700 from Zeiss) | Zeiss | ||
| Microscope | CETI | ||
| Mitomycin C | Sigma Aldrich | M4287 | |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140.035 | |
| Pipettes, plastic 10 mL | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipettes, plastic, 5 mL | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serum Replacement (SR) | Gibco | 10828-028 | |
| Sterile filters 0.22 um | Sarstedt | 83.1826.102 | |
| T-75 culture flask | ThermoScientific | 156499 | |
| Trypan Blue Stain (0.4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA, 500 mL | Gibco | 25300062 |
References
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- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9 (2015).
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