Summary
侵害受容器ニューロンとNK細胞は、炎症性の状況において活発に相互作用する。共同文化アプローチは、この相互作用を研究することを可能にします。
Abstract
体性感覚ニューロンは、有害な刺激を検出し、防御反射を活性化するように進化してきました。侵害受容器ニューロンは、コミュニケーション手段を共有することにより、免疫系の活動を制御することによって宿主防御も調整します。これらのシステム間の通信は主に適応的であり、恒常性を保護するのに役立ち、慢性疾患の発症につながるか、または促進する可能性もあります。両方のシステムは、一次および二次リンパ組織および粘膜に見られるような局所相互作用を可能にするために共進化した。最近の研究では、侵害受容器が外来抗原、免疫細胞由来サイトカイン、および微生物を直接検出して応答することが実証されています。
侵害受容器の活性化は、疼痛過敏症およびかゆみをもたらすだけでなく、侵害受容器発火閾値を低下させ、神経ペプチドの局所放出をもたらす。侵害受容器の末梢末端によって産生され、そこから放出されるペプチドは、リンパ球の走化性および分極をブロックし、炎症の局在、持続時間、およびタイプを制御することができる。最近の証拠は、感覚ニューロンが細胞間接触 を介して 自然免疫細胞と相互作用し、例えばナチュラルキラー(NK)細胞上のグループ2D(NKG2D)受容体に関与することを示しています。
NK細胞が様々な侵害受容器産生メディエーターの同族受容体を発現していることを考えると、侵害受容器は神経ペプチドを用いてNK細胞の活性を制御していると考えられます。ここでは、ディッシュ中で侵害受容器ニューロン-NK細胞の相互作用を研究するための共培養法を考案します。このアプローチを用いて、腰椎侵害受容器ニューロンがNK細胞のサイトカイン発現を低下させることを見出しました。全体として、このような還元主義的方法は、腫瘍神経支配ニューロンがNK細胞の抗癌機能をどのように制御するか、およびNK細胞が損傷ニューロンの排除をどのように制御するかを研究するのに役立つ可能性があります。
Introduction
感覚ニューロンの細胞体は、後根神経節(DRG)に由来します。DRGは、脊髄の背角と末梢神経終末の間の末梢神経系(PNS)に位置しています。DRGニューロンの擬似単極性は、標的組織を神経支配する末梢枝から、体性感覚情報を脊髄に運ぶ中心枝への情報の伝達を可能にする1。特殊なイオンチャネル受容体を使用して、一次ニューロンは病原体、アレルゲン、汚染物質2によってもたらされる脅威を感知し、陽イオン(Na+、Ca2+)の流入と活動電位3,4,5の生成につながります。
これらのニューロンはまた、最初の危険感知が起こった末梢に向かってアンチドロミック活動電位を送り、それが神経ペプチドの局所放出をもたらす1,4。したがって、侵害受容器ニューロンは保護メカニズムとして機能し、宿主に環境の危険を警告します4,5,6,7。
侵害受容器は、二次ニューロンと通信するために、様々な神経伝達物質(例えば、グルタミン酸)および神経ペプチド(例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、サブスタンスP(SP)、および血管作動性腸管ペプチド(VIP))を放出する6,7。これらのペプチドは毛細血管に作用し、血漿外漏出、浮腫、および免疫細胞の局所流入および調節を促進する2、4、7。
体性感覚系と免疫系は、サイトカインと神経ペプチド、およびそれぞれの同族受容体で構成される共有コミュニケーションシステムを利用しています4。この双方向通信は、危険からの保護と恒常性の維持に役立ちますが、疾患の病態生理にも貢献する可能性があります4。
NK細胞は自然リンパ系細胞に分類され、ウイルス感染細胞を排除することに特化しています。NK細胞機能は、活性化受容体NKG2D8を含む刺激受容体と抑制受容体のバランスによって支配されています。NKG2Dの内因性リガンドは、レチノイン酸初期誘導性1(RAE1)、腫瘍形成や感染などのストレスを受けている細胞によって発現される8,9。
最近の研究では、末梢神経損傷が感覚ニューロンを駆り立てて、スタスミン2(STMN2)やRAE1などの不適応分子を発現させることが示されています。このように、細胞間接触 を介して 、NKG2D発現NK細胞は、RAE1発現ニューロンとの相互作用によって活性化された。次に、NK細胞は、損傷した侵害受容器ニューロンと、通常は神経損傷に関連する鈍的疼痛過敏症を排除することができました10。NKG2D-RAE1軸に加えて、NK細胞は様々な侵害受容器産生メディエーターの同族受容体を発現する。したがって、これらのメディエーターがNK細胞活性を調節する可能性があります。この論文は、侵害受容器ニューロン-NK細胞相互作用の生物学を調べるための共培養法を提示します。このアプローチは、侵害受容器ニューロンが損傷、感染、または悪性腫瘍に対する自然免疫細胞の応答をどのように調節するかについての理解を深めるのに役立ちます。
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Protocol
モントリオール大学の施設動物管理および使用委員会(#22053、#22054)は、すべての動物の手順を承認しました。溶液とその組成のリストについては表 1 を、このプロトコルで使用される材料、機器、および試薬のリストについては 材料表 を参照してください。
1. NK細胞の単離、培養、刺激
- 侵害受容器ニューロンを無傷で生成する(同腹仔制御;ロックストップロックス-ジフテリア毒素マウス(DTA fl/fl)とTRPV1cre/wtマウスを交配することにより、TRPV1 wt::D TAfl/wt)およびアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウス。
- CO2吸入を使用して、ナイーブ同腹仔対照(TRPV1 wt::D TAfl / wt)マウスを安楽死させます。
- 500 μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む1.5 mLの微量遠心チューブで脾臓を収集します。
- 乳棒を使用して脾臓を均質化します。
- 細胞を1 mLの滅菌PBSで希釈します。
- 混合物を50 μmのセルストレーナーを通して15 mLのコニカルチューブにろ過します。
- 容量(10 mL)に滅菌PBSを補充します。
- 10μLを収集し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
- 細胞を遠心分離し(500 × g、5分間)、上清を除去します。
- 補充したRPMI 1640培地に108 細胞/mLの濃度で細胞を再懸濁します。
- 製造元の指示に従って、マウスNK細胞分離キットを使用して脾臓NK細胞を磁気的に精製します。NK細胞の純度をフローサイトメトリーで確認する 11.
- 10μLを収集し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
- 細胞を遠心分離し(500 × g、5分間)、上清を除去します。
- NK細胞を補充したRPMI 1640培養培地(IL-2およびIL-15を含む)に再懸濁します。
- 2 ×10 6 NK細胞/mLを96ウェルUボトムプレートで48時間培養します。
2. DRGニューロンの単離と培養
- NK細胞刺激が終了する24時間前(ステップ1.15)に、96ウェルプレートに100 μL/ウェルのラミニン(1 ng/mL)をコーティングし、45分間インキュベートします(37°C)。
- インキュベーション後、溶液を取り出し、ウェルをバイオセーフティキャビネット内で風乾させます。
- CO2吸入を用いて、侵害受容器ニューロンを無傷で安楽死させる(同腹仔対照;TRPV1wt::D TAfl/wt)またはアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウス。
注:CO2 吸入は、DRGに接続された脊髄神経の破壊を回避するため、頸部脱臼よりも好ましい。 - マウスを腹臥位でボードに固定し、皮膚を持ち上げ、背柱に沿って皮膚を切開します。詳細なビデオについては、Pernerらを参照してください12。
- 腰仙関節を切り取り、はさみで仙骨を腰椎から分離します。
- 頭蓋骨の基部に達するまで、脊椎の両側の筋肉と肋骨を頭蓋方向に切断して、脊椎を分離します。
- ハサミを使用して、大西洋 - 後頭関節で脊椎を切り取ります。
- 脊椎から筋肉と脂肪組織を取り除きます。
- 脊柱をピン留めして開き、脊髄を取り除き、DRGにアクセスします。背根を介して脊髄に接続されているが髄膜から分離されている椎間孔のDRGを探します。
- DRGを、10 mLの氷冷補給DMEMで満たされた15 mLのコニカルチューブに収穫します。
- 調製物を遠心分離し(200 × g、5分間、室温)、上清を除去する。
- コラゲナーゼIV(1 mg/mL)およびディスパーゼII(2.4 U/mL)を含むPBSを250 μL添加します。
- DRGをコラゲナーゼIV/ディスパーゼII(C/D)溶液でインキュベートします(80分、37°C、穏やかな攪拌)。複数のマウスから神経節をプールする場合は、神経節あたり125 μLのC / D溶液の比率を維持します。
- 酵素を不活性化するには、5 mLの添加DMEM培地を追加します。
- 溶液を遠心分離し(200 × g、5分間)、ピペットを使用して上清を静かに除去します。
- 不要な細胞損失を避けるために、~100 μLの上清を残してください。
- 1 mLの添加DMEM培地を追加します。
- ピペットガンとサイズが小さくなる3つのガラス製パスツールピペットを使用して、DRGを穏やかに粉砕(パスツールピペットサイズあたり~10アップ/ダウン)してシングルセル調製物にします。
- バイオセーフティキャビネットで、滅菌PBS中のウシ血清アルブミン(BSA)を最終濃度15%に希釈します。1 mL アリコートを -20 °C で保存します。
- 2 mLの滅菌PBSを加え、チューブの底に1 mLの15%BSA溶液をゆっくりと分注することにより、15 mLのコニカルチューブにBSAグラジエントを作成します。ピペットをそっと取り外して、勾配を乱さないようにしてください。
- P200ピペットを使用して、粉砕された神経節懸濁液(ニューロンを含む)をチューブの側面にゆっくりとピペットで勾配にします。
- ニューロン含有BSA勾配を遠心分離する(200 × g、12分、室温)。遠心分離機の加速と減速を最低速度に設定します。
注:遠心分離後、ニューロンはチューブの底にあり、細胞破片はBSA勾配に閉じ込められます。 - ピペットを使用してすべての上清を静かに取り除きます。
- 細胞を500 μLのニューロバクサルに再懸濁します。
- プレート10 ウェルあたり4 ニューロン(200 μLの神経基盤/ウェル)をラミニンコーティングされた平底96ウェルプレートに入れます。
注:平均して、研究者はマウスあたり~8ウェルを満たすことができます。 - ニューロンを培養(37°C、一晩)して付着させる。
3. 共培養とフローサイトメトリー
- ニューロン培養から神経基盤をゆっくりと取り除きます。
- IL-2およびIL-15による48時間の刺激後(ステップ1.14-1.15を参照)、NK細胞を再懸濁し、10個の5 NK細胞/ウェルをニューロン培養液(96ウェルフラットボトムプレート)に追加します。
注:平均して、研究者はマウスあたり~6ウェルを満たすことができます。 - 細胞を補充したニューロバクサルMX(37°C、48時間)で共培養する。
- 細胞を回収し、PBS(3x)で洗浄し、遠心分離機(500 × g、5分、4°C)で洗浄します。
- 上清を廃棄し、生存率色素eFlour-780(1:1,000、15分、4°C)で細胞を染色します。
- 細胞を回収し、PBS(3x)で洗浄し、遠心分離機(500 × g、5分、4°C)します。
- 細胞上の非特異的部位をCD16/32(1:100、15分、4°C)でブロックします。
- 細胞を回収し、PBS(3x)で洗浄し、遠心分離機(500 × g、5分、4°C)で洗浄します。
- BV421抗NK-1.1(1:100)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)抗NKp46(1:100)、およびフィコエリスリン(PE)抗GM-CSF(1:100)で細胞を染色(15分、4°C)します。
- 細胞を回収し、PBS(3x)で洗浄し、遠心分離機(500 × g、5分、4°C)で洗浄します。
- 上清を捨て、細胞をFACS緩衝液(500μL)に再懸濁し、フローサイトメトリー11によりNK細胞を免疫表現型化した。ゲーティング戦略については 、図 1A を参照してください。
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Representative Results
NK細胞をリターメイトコントロール(TRPV1wt::D TAfl/wt)マウス脾細胞から磁気精製し、IL-2およびIL-15で刺激(48時間)しました。次いで、NK細胞を単独で培養するか、侵害受容器ニューロンから採取したDRGニューロンと無傷で共培養した(同腹仔対照;TRPV1wt::D TAfl/wt)またはアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウス。次いで、細胞をTRPV1アゴニストカプサイシン(1μM)またはそのビヒクルに曝露した。共培養の24時間後、NK細胞をFACS精製し、フローサイトメトリーを用いてそれらの活性化レベルを免疫表現型決定した(図1A)。
単独で培養した場合、NK細胞はGM-CSFおよびNKp46の基礎レベルを発現した。侵害受容器から採取したDRGニューロンと共培養した場合(TRPV1wt::D TAfl/wt)マウスは、カプサイシン刺激によりNK細胞のGM-CSFの発現が低下しました。カプサイシンは、侵害受容器アブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウスから採取したDRGニューロンと共培養した場合、NK細胞の活性化に影響を与えませんでした(図1A、B)。ジフテリア毒素A(DTA)を用いたTRPV1cre媒介細胞アブレーションは、ペプチド作動性および非ペプチド作動性を問わず、すべてのTRPV1+ニューロン(MrgD+細胞)を排除することは注目に値します13,14。
図1:TRPV1+ニューロンはNK細胞の活性化を制御する。NK細胞を同腹仔対照(TRPV1 wt::D TA fl/wt)マウス脾細胞から磁気精製し、IL-2およびIL-15で刺激(48時間)した。次いで、NK細胞を単独で培養するか、侵害受容器ニューロンから採取したDRGニューロンと無傷で共培養した(同腹仔対照;TRPV1wt::D TAfl/wt)またはアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウス。次いで、細胞をTRPV1アゴニストカプサイシン(1μM)またはそのビヒクルに曝露した。共培養の24時間後、NK細胞をFACS精製し、フローサイトメトリーを用いてそれらの活性化レベルを免疫表現型化した(A)。単独で培養した場合、NK細胞はGM-CSFおよびNKp46の基礎レベルを発現した。 侵害受容器から採取したDRGニューロンとNK細胞をそのまま培養し(TRPV1 wt::D TAfl/wt)、カプサイシン(A、B)で刺激すると、GM-CSF発現は減少した。NKp46のレベルは影響を受けなかった(A、B)。カプサイシンは、侵害受容器アブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウス(A、B)から採取したDRGニューロンと共培養した場合、NK細胞の活性化に影響を与えませんでした。代表的なFACSプロットを示す(A)。データは、S.E.M(B)±平均値として表されます。実験を3回繰り返し、同様の結論を得た。テストされた動物の数が表示されます。n = 5生物学的複製/グループ(B)。P値は図に示され、一元配置分散分析ポストホックボンフェローニ(B)によって決定されます。略語:TRPV1=一過性受容器電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1;NK =ナチュラルキラー;DTA =ジフテリア毒素A;DRG =後根神経節;FACS = 蛍光活性化細胞選別;GM-CSF =顆粒球 - マクロファージコロニー刺激因子;Veh = 車両;キャップ=カプサイシン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決 | 組成 | ||
| コラゲナーゼ/ディスパーゼ(C/D) | コラゲナーゼ(1 mg/mL)およびディスパーゼII(2.4 U/mL)を添加した滅菌PBS | ||
| ティッカー | FBS(10%)、ペニシリン(100 I.U.)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)を添加した滅菌DMEM | ||
| RPMI 1640 を補足 | ペニシリン(100 I.U)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、ウシ胎児血清(10%)、L-グルタミン(300 ng/mL)、マウス組換えIL-2(200 U/mL)、およびマウス組換えIL-15(10 ng/mL)を添加した滅菌RMPI 1640 | ||
| 神経基礎 | ペニシリン(100 I.U)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、L-グルタミン(200 μM)、B-27(2%)、NGF(50 ng/mL)、およびGDNF(2 ng/mL)を添加した滅菌ニューロバカサル | ||
| ニューロバクサルMX | ペニシリン(100 I.U)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、L-グルタミン(200 μM)、B-27(2%)、NGF(50 ng/mL)、GDNF(2 ng/mL)、マウス組換えIL-2(200 U/mL)、およびマウス組換えIL-15(10 ng/mL)を添加した滅菌ニューロバカサル | ||
| FACS ソートバッファ | FBS(2%)およびEDTA(1 mM)を添加した滅菌PBS | ||
表1:このプロトコルで使用されるソリューションとメディアのリスト。 略語:NGF =神経成長因子;GDNF =グリア細胞由来神経栄養因子;FBS =ウシ胎児血清;PBS =リン酸緩衝生理食塩水。
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Discussion
Daviesら11 は、損傷したニューロンがRAE1をアップレギュレートすることを発見した。その後、細胞間接触 を介して 、NKG2D発現NK細胞はRAE1+ ニューロンを同定して排除することができ、それが慢性疼痛を制限しました11。NK細胞も様々な神経ペプチド受容体を発現しており、その免疫調節能が知られていることから、NK細胞と侵害受容器神経細胞との相互作用を in vitroで研究することがますます重要になっていると考えられます。ここでは、ニューロンがNK細胞の機能をどのように制御し、NK細胞がDRGニューロンの機能をどのように調節できるかを相互に研究できる簡単な共培養プロトコルを考案しました。フローサイトメトリーは、ニューロンがNK細胞の活性化をどのように調節するかを免疫表現型決定するために使用されました。あるいは、研究者はqPCRまたはRNAシーケンシングを使用して、FACS精製細胞の転写産物の変化を測定したり、ELISAを使用してサイトカインや神経ペプチドなどの分泌因子の分泌を分析したりすることもできます。生データは預けられ、www.talbotlab.com で自由に利用できます。
今回、カプサイシンの作用に続発するTRPV1+ 侵害受容器ニューロンがNK細胞の活性化(GM-CSF発現)を阻害することを見出しました。カプサイシンを高濃度で使用するとNK細胞の機能が損なわれる可能性がありますが14、ペプチド作動性ニューロン(TRPV1cre::D TAfl/wt)の非存在下では、NK細胞の活性はカプサイシン(1 μM)曝露の影響を受けなかったため、実験的にこの可能性を排除しました。カプサイシンはカルシウムの流入とそれに続く神経ペプチドの放出につながるため、これらのデータは、NK細胞の活性化がニューロンによって放出される可溶性因子の作用に続発する可能性が高いことを示唆しています。したがって、このような共培養アプローチは、神経ペプチドの放出がNK細胞機能をどのように調節するかを研究するのに有用でした。可溶性因子に加えて、2つの細胞型間の局所的な細胞間相互作用もそれらの機能を調節する可能性があり、実験的にテストする必要があります(たとえば、コンディショニング培地の影響を共培養の影響と比較するなど)。
全体として、このような相互作用は、組織微小環境内で、NK細胞機能が侵害受容器ニューロン終末によって調整されている可能性が高いことを示唆しています。これらのデータは、ニューロンと自然免疫細胞(すなわちNK細胞)の役割を同時に研究することにより、炎症反応を総合的に評価することの重要性を強調しています。たとえば、NK細胞とニューロンのクロストークは、神経損傷、組織損傷、細菌またはウイルス感染から悪性腫瘍に至るまで、さまざまな状況で重要な生物学的役割を果たす可能性があります。この共培養法の使用を含む将来の研究は、健康と病気におけるニューロンとNK細胞の相互作用の影響を評価するために必要です。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、研究基金のニューフロンティア(NFRFE201901326)、カナダ健康研究所(162211、461274、461275)、カナダイノベーション財団(37439)、カナダ研究委員長プログラム(950-231859)、カナダ自然科学工学研究評議会(RGPIN-2019-06824)、およびケベック自然と技術財団(253380)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD16/32 | Jackson Laboratory | Cat no: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Cat no: 009669 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade | World Precision Instruments | Cat no: 504167 | |
| BV421 anti-mouse NK-1.1 | Fisher Scientific | Cat no: 12430112 | |
| Cell strainer (50 μm) | Fisher Scientific | Cat no: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat no: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/fl | Fisher Scientific | Cat no: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat no: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat no: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | Sigma | Cat no: CLS2595 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | Cat no: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | Cat no: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat no: L2020 | |
| Flat bottom 96-well plate | Sigma | Cat no: 03690 | |
| Glass Pasteur pipette | Sigma | Cat no: 470236-274 | |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) | VWR | Cat no: 02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Cat no: 03-50/31 | |
| L-Glutamine | Gibco | Cat no: A14867-01 | |
| Mouse recombinant IL-15 | Gibco | Cat no: 22400-089 | |
| Mouse recombinant IL-2 | Gibco | Cat no: 21103-049 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Life Technologies | Cat no: 13257-019 | |
| Neurobasal media | PeproTech | Cat no: 450-51-10 | |
| PE anti-mouse GM-CSF | PeproTech | Cat no: 212-12 | |
| Penicillin and Streptomycin | PeproTech | Cat no: 210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | Cat no: 19855 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biolegend | Cat no: 108732 | Clone PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Cat no: 137606 | Clone 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Cat no: 505406 | Clone MP1-22E9 |
| Tweezers and dissection tools. | Biolegend | Cat no: 65-0865-14 | |
| U-Shaped-bottom 96-well plate | Biolegend | Cat no: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
References
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