Summary
Nosiseptör nöronlar ve NK hücreleri aktif olarak enflamatuar bir bağlamda etkileşime girer. Bir ortak kültür yaklaşımı, bu etkileşimi incelemeyi sağlar.
Abstract
Somatosensoriyel nöronlar, zararlı uyaranları tespit etmek ve savunma reflekslerini aktive etmek için evrimleşmiştir. İletişim araçlarını paylaşarak, nosiseptör nöronlar ayrıca bağışıklık sisteminin aktivitesini kontrol ederek konakçı savunmasını da ayarlar. Bu sistemler arasındaki iletişim çoğunlukla adaptiftir, homeostazı korumaya yardımcı olur, ayrıca kronik hastalıkların başlangıcına yol açabilir veya teşvik edebilir. Her iki sistem de, birincil ve ikincil lenfoid dokularda ve mukozada bulunan bu tür lokal etkileşime izin vermek için birlikte evrimleşmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nosiseptörlerin yabancı antijenleri, bağışıklık hücresi kaynaklı sitokinleri ve mikropları doğrudan tespit ettiğini ve bunlara yanıt verdiğini göstermiştir.
Nosiseptör aktivasyonu sadece ağrı aşırı duyarlılığı ve kaşıntı ile sonuçlanmaz, aynı zamanda nosiseptör ateşleme eşiğini düşürür ve nöropeptitlerin lokal salınımına yol açar. Nosiseptörlerin periferik terminalleri tarafından üretilen ve salınan peptitler, lenfositlerin kemotaksisini ve polarizasyonunu bloke edebilir, inflamasyonun lokalizasyonunu, süresini ve tipini kontrol edebilir. Son kanıtlar, duyusal nöronların doğuştan gelen bağışıklık hücreleriyle hücre-hücre teması yoluyla etkileşime girdiğini, örneğin doğal öldürücü (NK) hücreler üzerindeki grup 2D (NKG2D) reseptörlerini kullandığını göstermektedir.
NK hücrelerinin çeşitli nosiseptör tarafından üretilen mediatörler için konyak reseptörlerini eksprese ettiği göz önüne alındığında, nosiseptörlerin NK hücrelerinin aktivitesini kontrol etmek için nöropeptitler kullandıkları düşünülebilir. Burada, bir tabaktaki nosiseptör nöron-NK hücre etkileşimlerini incelemek için bir ko-kültür yöntemi geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, lomber nosiseptör nöronların NK hücre sitokin ekspresyonunu azalttığını bulduk. Genel olarak, böyle bir indirgemeci yöntem, tümör innerve edici nöronların NK hücrelerinin antikanser fonksiyonunu nasıl kontrol ettiğini ve NK hücrelerinin yaralı nöronların ortadan kaldırılmasını nasıl kontrol ettiğini incelemek için yararlı olabilir.
Introduction
Duyusal nöronların hücre gövdeleri dorsal kök ganglionlarından (DRG) kaynaklanır. DRG, periferik sinir sisteminde (PNS), omuriliğin dorsal boynuzu ile periferik sinir terminalleri arasında bulunur. DRG nöronlarının psödo-unipolar doğası, hedef dokuyu innerve eden periferik daldan, somatosensoriyel bilgiyi omuriliğe taşıyan merkezi dala bilgi aktarımına izin verir1. Özel iyon kanalı reseptörleri kullanarak, birinci dereceden nöronlar patojenlerin, alerjenlerin ve kirleticilerinoluşturduğu tehditleri algılar 2, bu da katyonların akışına (Na +, Ca2 +) ve bir aksiyon potansiyelinin üretilmesine yol açar 3,4,5.
Bu nöronlar ayrıca, ilk tehlike algılamasının gerçekleştiği çevreye doğru antidromik etki potansiyeli gönderir ve bu da nöropeptitlerin lokal salınımına yol açar 1,4. Bu nedenle, nosiseptör nöronlar, konağı çevresel tehlikeye karşı uyaran koruyucu bir mekanizma görevi görür 4,5,6,7.
İkinci dereceden nöronlarla iletişim kurmak için, nosiseptörler çeşitli nörotransmiterleri (örneğin, glutamat) ve nöropeptitleri (örneğin, kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), madde P (SP) ve vazoaktif bağırsak peptidi (VIP))6,7 serbest bırakır. Bu peptitler kılcal damarlara etki eder ve plazma ekstravazasyonunu, ödemi ve bağışıklık hücrelerinin lokal akışını ve modülasyonunu teşvik eder 2,4,7.
Somatosensoriyel ve bağışıklık sistemleri, sitokinler ve nöropeptitlerden ve bunların ilgili konyak reseptörlerinden oluşan ortak bir iletişim sistemi kullanır4. Bu çift yönlü iletişim, tehlikeden korunmaya ve homeostazı korumaya yardımcı olurken, aynı zamanda hastalık patofizyolojisine de katkıda bulunabilir4.
NK hücreleri doğuştan gelen lenfoid hücreler olarak sınıflandırılır ve viral olarak enfekte olmuş hücreleri ortadan kaldırmak için uzmanlaşmıştır. NK hücre fonksiyonu, aktive edici reseptör NKG2D8 de dahil olmak üzere uyarıcı ve inhibitör reseptörlerin bir dengesi tarafından yönetilir. NKG2D'nin endojen ligandı olan retinoik asit erken indüklenebilir1 (RAE1), tümörigenez ve enfeksiyon 8,9 gibi stres altındaki hücreler tarafından eksprese edilir.
Son zamanlarda yapılan araştırmalar, periferik sinir hasarının duyusal nöronları stathmin 2 (STMN2) ve RAE1 gibi uyumsuz molekülleri eksprese etmeye yönlendirdiğini göstermiştir. Böylece, hücre-hücre teması yoluyla, NKG2D eksprese eden NK hücreleri, RAE1 eksprese eden nöronlarla etkileşim yoluyla aktive edildi. Buna karşılık, NK hücreleri yaralı nosiseptör nöronları ve normalde sinir hasarı ile ilişkili künt ağrı aşırı duyarlılığını ortadan kaldırabildi10. NKG2D-RAE1 eksenine ek olarak, NK hücreleri çeşitli nosiseptör tarafından üretilen mediatörler için konyak reseptörlerini eksprese eder. Bu nedenle, bu mediatörlerin NK hücre aktivitesini modüle etmeleri mümkündür. Bu yazıda nosiseptör nöron-NK hücre etkileşiminin biyolojisini araştırmak için bir ko-kültür yöntemi sunulmaktadır. Bu yaklaşım, nosiseptör nöronların doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarını yaralanmaya, enfeksiyona veya maligniteye nasıl modüle ettiğinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Université de Montréal'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri (#22053, #22054) tüm hayvan prosedürlerini onayladı. Çözümlerin ve bileşimlerinin listesi için Tablo 1'e ve bu protokolde kullanılan malzemelerin, ekipmanların ve reaktiflerin listesi için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. NK hücre izolasyonu, kültürü ve stimülasyonu
- Nosiseptör nöronu bozulmadan üretin (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1wt::D TA fl/wt) ve ablatlanmış (TRPV1 cre::D TA fl/wt) fareler, lox-stop-lox-difteri toksin farelerini (DTA fl/fl) TRPV1cre/wt fareleri ile geçerek geçer.
- CO2 inhalasyonunu kullanarak, naif bir çöp arkadaşı kontrolü (TRPV1 wt::D TAfl/wt) faresini ötenazileştirin.
- Dalağı, 500 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
- Dalağı bir havane kullanarak homojenize edin.
- Hücreleri 1 mL steril PBS ile seyreltin.
- Karışımı 50 μm'lik bir hücre süzgecinden 15 mL'lik bir konik tüpe süzün.
- Steril PBS ile ses seviyesini (10 mL) doldurun.
- 10 μL toplayın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
- Hücreleri santrifüj edin (500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri takviyeli RPMI 1640 ortamında 108 hücre / mL konsantrasyonunda yeniden askıya alın.
- Bir fare NK hücre izolasyon kiti kullanarak dalak NK hücrelerini manyetik olarak arındırmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Akış sitometrisi11'i kullanarak NK hücre saflığını onaylayın.
- 10 μL toplayın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
- Hücreleri santrifüj edin (500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı çıkarın.
- NK hücrelerini takviyeli RPMI 1640 kültür ortamında (IL-2 ve IL-15 içeren) yeniden askıya alın.
- Kültür 2 ×96 kuyucuklu bir U-alt plakada 48 saat boyunca 10 6 NK hücresi / mL.
2. DRG nöron izolasyonu ve kültürü
- NK hücre stimülasyonunun bitiminden 24 saat önce (adım 1.15), 96 delikli bir plakayı 100 μL / laminin (1 ng / mL) ile kaplayın ve 45 dakika (37 ° C) boyunca inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukların bir biyogüvenlik kabininde hava ile kurumasına izin verin.
- CO2 inhalasyonunu kullanarak, nosiseptör nöronu bozulmadan ötenazi yapın (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1wt::D TA fl/wt) veya ablatlanmış (TRPV1cre::D TAfl/wt) fareler.
NOT: CO2 inhalasyonu, DRG'ye bağlı spinal sinirleri bozmaktan kaçındığı için servikal çıkığa tercih edilir. - Fareyi tahtaya eğilimli bir pozisyonda sabitleyin, cildi kaldırın ve cildi sırt sütunu boyunca kesin. Ayrıntılı bir video için Perner ve ark.12.
- Lumbosakral eklemi kesin ve sakrumu bel omurgasından makasla ayırın.
- Omurganın tabanına ulaşılana kadar omurganın her iki tarafındaki kasları ve kaburgaları kafatası yönünde keserek omurgayı ayırın.
- Makas kullanarak, atlanto-oksipital eklemdeki omurgayı kesin.
- Kas ve yağ dokusunu omurgadan çıkarın.
- Omuriliği çıkarmak ve DRG'ye erişmek için vertebral kolonu sabitleyin ve açın. DRG'yi, dorsal kök yoluyla omuriliğe bağlı, ancak meninkslerden ayrılmış intervertebral foraminada arayın.
- DRG'leri, 10 mL buz gibi soğuk takviyeli DMEM ile doldurulmuş 15 mL konik bir tüpe hasat edin.
- Preparatı santrifüj edin (200 × g, 5 dakika, oda sıcaklığı) ve süpernatanı çıkarın.
- Kollajenaz IV (1 mg/mL) ve Dispase II (2.4 U/mL) içeren 250 μL PBS ekleyin.
- DRG'yi Kollajenaz IV/Dispase II (C/D) çözeltisi (80 dk, 37 °C, hafif ajitasyon) ile inkübe edin. Birkaç fareden gangliyonları toplarken, ganglion başına 125 μL C / D çözeltisi oranını koruyun.
- Enzimleri inaktive etmek için, 5 mL takviyeli DMEM ortamı ekleyin.
- Çözeltiyi santrifüj edin (200 × g, 5 dakika) ve bir pipet kullanarak süpernatantı yavaşça çıkarın.
- İstenmeyen hücre kaybını önlemek için, süpernatanın ~ 100 μL'sini bırakın.
- 1 mL takviyeli DMEM ortamı ekleyin.
- Bir pipet tabancası ve boyutları azalan üç cam Pasteur pipeti kullanarak, DRG'yi tek hücreli bir preparatta yavaşça tritüre edin (Pasteur pipet boyutu başına ~10 yukarı/aşağı).
- Bir biyogüvenlik kabininde, sığır serum albüminini (BSA) steril PBS'de% 15'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin. −20 °C'de 1 mL aliquots saklayın.
- 2 mL steril PBS ekleyerek ve tüpün dibine yavaşça 1 mL% 15 BSA çözeltisi dağıtarak 15 mL'lik bir konik tüpte bir BSA gradyanı oluşturun. Pipetleri nazikçe çıkararak gradyanı bozmaktan kaçının.
- Bir P200 pipet kullanarak, tritüne gangliyon süspansiyonunu (nöronları içeren) yavaşça tüpün yan tarafına gradyana pipetleyin.
- Nöron içeren BSA gradyanını santrifüj edin (200 × g, 12 dk, oda sıcaklığı). Santrifüjün hızlanmasını ve yavaşlamasını minimum hıza ayarlayın.
NOT: Santrifüjlemeden sonra, nöronlar tüpün dibinde olurken, hücre kalıntıları BSA gradyanında sıkışıp kalacaktır. - Bir pipet kullanarak tüm süpernatantı nazikçe çıkarın.
- Hücreleri 500 μL Nörobazal içinde yeniden askıya alın.
- Laminin kaplı, düz tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada kuyu başına10 4 nöron (200 μL nörobazal / kuyu) Plaka.
NOT: Ortalama olarak, bir araştırmacı fare başına ~ 8 kuyu doldurabilecektir. - Bağlanmaya izin vermek için nöronları (gece boyunca 37 ° C) kültürleyin.
3. Ko-kültür ve akım sitometrisi
- Nörobazal'ı nöron kültüründen yavaşça çıkarın.
- IL-2 ve IL-15 ile 48 saatlik stimülasyondan sonra (bkz. adım 1.14-1.15), NK hücrelerini yeniden askıya alın ve nöron kültürüne 105 NK hücresi / kuyusu ekleyin (96 kuyucuklu düz alt plaka).
NOT: Ortalama olarak, araştırmacı fare başına ~ 6 kuyu doldurabilecektir. - Takviyeli nörobazal MX'teki hücrelerin ortak kültürü (37 ° C, 48 saat).
- Hücreleri toplayın, PBS (3x) ile yıkayın ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C).
- Süpernatantı atın ve hücreleri Viability Dpaint eFlour-780 (1:1.000, 15 dk, 4 °C) ile lekeleyin.
- Hücreleri toplayın, PBS (3x) ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C) ile yıkayın.
- CD16/32 (1:100, 15 dk, 4 °C) ile hücrelerdeki spesifik olmayan bölgeleri bloke edin.
- Hücreleri toplayın, PBS (3x) ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C) ile yıkayın.
- BV421 anti-NK-1.1 (1:100), floresein izotiyosiyanat (FITC) anti-NKp46 (1:100) ve fikoeritrin (PE) anti-GM-CSF (1:100) içeren hücreler leke (15 dk, 4 °C).
- Hücreleri toplayın, PBS (3x) ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C) ile yıkayın.
- Süpernatanı atın, FACS tamponundaki hücreleri (500 μL) yeniden askıya alın ve NK hücrelerini akış sitometrisi11 ile immünofenotipleyin. Geçit stratejisi için Şekil 1A'ya bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NK hücreleri, çöp arkadaşı kontrolünden (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) farelerin plenositlerinden manyetik olarak saflaştırıldı ve IL-2 ve IL-15 ile uyarıldı (48 saat). NK hücreleri daha sonra tek başlarına kültürlendi veya nosiseptör nörondan sağlam bir şekilde toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendi (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1wt::D TA fl/wt) veya ablatlanmış (TRPV1cre::D TAfl/wt) fareler. Hücreler daha sonra TRPV1 agonisti kapsaisin (1 μM) veya aracına maruz bırakıldı. 24 saatlik ko-kültürden sonra, NK hücreleri FACS-saflaştırıldı ve aktivasyon seviyeleri akış sitometrisi kullanılarak immünofenotiplendi (Şekil 1A).
Tek başına kültürlendiğinde, NK hücreleri bazal GM-CSF ve NKp46 seviyelerini eksprese etti. Nosiseptör bozulmamış (TRPV1wt: :D TAfl / wt) farelerden toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendiğinde, kapsaisin stimülasyonu GM-CSF'nin NK hücrelerinin ekspresyonunu azalttı. Kapsaisin, nosiseptör ablatlı (TRPV1cre: :D TAfl / wt) farelerden toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendiğinde NK hücre aktivasyonu üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır (Şekil 1A, B). Difteri toksini A (DTA) kullanılarak TRPV1krem aracılı hücre ablasyonunun, tüm TRPV1 + nöronlarını, peptiderjik ve peptiderjik olmayan (MrgD + hücreleri) ortadan kaldıracağını belirtmek gerekir13,14.
Şekil 1: TRPV1+ nöronları NK hücre aktivasyonunu kontrol eder. NK hücreleri, çöp arkadaşı kontrolünden (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) fareleri plenositlerinden manyetik olarak saflaştırıldı ve IL-2 ve IL-15 ile uyarıldı (48 saat). NK hücreleri daha sonra tek başlarına kültürlendi veya nosiseptör nörondan sağlam bir şekilde toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendi (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1wt::D TA fl/wt) veya ablatlanmış (TRPV1cre::D TAfl/wt) fareler. Hücreler daha sonra TRPV1 agonisti kapsaisin (1 μM) veya aracına maruz bırakıldı. 24 saatlik ko-kültürden sonra, NK hücreleri FACS-saflaştırıldı ve aktivasyon seviyeleri akış sitometrisi (A) kullanılarak immünofenotiplendi. Tek başına kültürlendiğinde, NK hücreleri GM-CSF ve NKp46'nın bazal seviyelerini eksprese etti. GM-CSF ekspresyonu, NK hücreleri, nosiseptör bozulmamış (TRPV1wt: :D TAfl / wt) farelerden toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendiğinde ve kapsaisin (A, B) ile uyarıldığında azaldı. NKp46 düzeyi etkilenmedi (A,B). Kapsaisin, nosiseptör ablatlı (TRPV1cre: :D TAfl / wt) farelerden (A, B) toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendiğinde NK hücre aktivasyonu üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır. Temsili FACS grafiği (A) gösterilmiştir. Veriler ortalama ± S.E.M (B) olarak sunulmaktadır. Deney üç kez tekrarlandı ve benzer sonuçlar elde edildi. Test edilen hayvan sayısı gösterilmiştir; n = 5 biyolojik replikasyon/grup (B). P değerleri şekilde gösterilir ve tek yönlü ANOVA post-hoc Bonferroni (B) ile belirlenir. Kısaltmalar: TRPV1 = geçici reseptör potansiyel katyon kanalı alt ailesi V üyesi 1; NK = doğal katil; DTA = difteri toksini A; DRG = sırt kökü ganglionu; FACS = floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama; GM-CSF = granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör; Veh = araç; Cap = kapsaisin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm | Kompozisyon | ||
| Kollajenaz/Dispaz (C/D) | Kollajenaz (1 mg/mL) ve Dispase II (2.4 U/mL) ile desteklenmiş steril PBS | ||
| cesaret | FBS (% 10), penisilin (100 I.U.) ve streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş steril DMEM | ||
| Tamamlayıcı RPMI 1640 | Steril RMPI 1640, penisilin (100 I.U.), streptomisin (100 μg / mL), fetal sığır serumu (% 10), L-glutamin (300 ng / mL), fare rekombinant IL-2 (200 U / mL) ve fare rekombinant IL-15 (10 ng / mL) ile desteklenmiştir. | ||
| Nörobazal | Steril Nörobazal, penisilin (100 I.U.), streptomisin (100 μg / mL), L-glutamin (200 μM), B-27 (% 2), NGF (50 ng / mL) ve GDNF (2 ng / mL) ile desteklenmiştir. | ||
| Nörobazal MX | Steril Nörobazal, penisilin (100 I.U.), streptomisin (100 μg / mL), L-glutamin (200 μM), B-27 (% 2), NGF (50 ng / mL), GDNF (2 ng / mL), fare rekombinant IL-2 (200 U / mL) ve fare rekombinant IL-15 (10 ng / mL) ile desteklenmiştir. | ||
| FACS sıralama tamponu | FBS (% 2) ve EDTA (1 mM) ile desteklenen steril PBS | ||
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan çözümlerin ve ortamların listesi. Kısaltmalar: NGF = sinir büyüme faktörü; GDNF = glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör; FBS = fetal sığır serumu; PBS = fosfat tamponlu salin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Davies ve ark.11 , yaralı nöronların RAE1'i yukarı regüle ettiğini bulmuşlardır. Hücre-hücre teması yoluyla , NKG2D eksprese eden NK hücreleri daha sonra RAE1 + nöronlarını tanımlayabilir ve ortadan kaldırabilir ve bu da kronik ağrıyı sınırlayabilir11. NK hücrelerinin ayrıca çeşitli nöropeptit reseptörlerini de eksprese ettiği ve bu nöropeptitlerin immünomodülatör yetenekleri ile bilindiği göz önüne alındığında, NK hücreleri ve nosiseptör nöronlar arasındaki etkileşimi in vitro olarak incelemek giderek daha önemli görünmektedir. Burada, araştırmacıların nöronların NK hücre fonksiyonunu nasıl kontrol ettiğini ve karşılıklı olarak NK hücrelerinin DRG nöronlarının işlevini nasıl modüle edebileceğini incelemelerini sağlayan basit bir ortak kültür protokolü geliştirdik. Nöronların NK hücre aktivasyonunu nasıl modüle ettiğini immünofenotiplemek için akım sitometrisi kullanıldı. Alternatif olarak, araştırmacılar FACS-saflaştırılmış hücrelerdeki transkript değişikliklerini ölçmek için qPCR veya RNA dizilemesini kullanabilir veya ELISA'ları kullanarak sitokinler veya nöropeptitler gibi salgılanan faktörlerin salgılanmasını analiz edebilirler. Ham veriler biriktirilir ve www.talbotlab.com ücretsiz olarak kullanılabilir.
Burada, kapsaisin etkisine ikincil TRPV1 + nosiseptör nöronlarının NK hücre aktivasyonunu (GM-CSF ekspresyonu) bloke ettiğini bulduk. Yüksek konsantrasyonda kullanılan kapsaisin, NK hücre fonksiyonlarını bozabilir14, NK hücre aktivitesi, peptiderjik nöronların yokluğunda kapsaisin (1 μM) maruziyetinden etkilenmediği için bu olasılığı deneysel olarak dışladık (TRPV1cre: :D TAfl / wt). Kapsaisin kalsiyum akışına ve daha sonra nöropeptitlerde salınımına yol açtığından, bu veriler NK hücre aktivasyonunun bu nedenle nöronlar tarafından salınan çözünür faktörlerin etkisine ikincil olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, böyle bir ko-kültür yaklaşımı, nöropeptitlerin salınımının NK hücre fonksiyonunu nasıl modüle edebileceğini incelemek için yararlı olmuştur. Çözünür faktörlere ek olarak, iki hücre tipi arasındaki yerel hücre-hücre etkileşimlerinin de işlevlerini modüle etmesi muhtemeldir, bu da deneysel olarak test edilmesi gereken bir şeydir (örneğin, şartlandırılmış ortamın etkisini ko-kültürün etkisiyle karşılaştırmak).
Genel olarak, böyle bir etkileşim, doku mikroçevresi içinde, NK hücre fonksiyonunun muhtemelen nosiseptör nöron terminalleri tarafından ayarlandığını göstermektedir. Bu veriler, nöronların ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin (yani NK hücrelerinin) rolünü eşzamanlı olarak inceleyerek enflamatuar yanıtları bütünsel olarak değerlendirmenin önemini vurgulamaktadır. Örneğin, NK hücre-nöron çapraz konuşması, sinir hasarı, doku hasarı, bakteriyel veya viral enfeksiyondan malignitelere kadar uzanan bağlamlarda muhtemelen önemli bir biyolojik rol oynar. Bu ortak kültür yönteminin kullanımı da dahil olmak üzere gelecekteki çalışmalara, nöron-NK hücre etkileşiminin sağlık ve hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek için ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Araştırma Fonu'nda Yeni Sınırlar (NFRFE201901326), Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (162211, 461274, 461275), Kanada İnovasyon Vakfı (37439), Kanada Araştırma Başkanı programı (950-231859), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (RGPIN-2019-06824) ve Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD16/32 | Jackson Laboratory | Cat no: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Cat no: 009669 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade | World Precision Instruments | Cat no: 504167 | |
| BV421 anti-mouse NK-1.1 | Fisher Scientific | Cat no: 12430112 | |
| Cell strainer (50 μm) | Fisher Scientific | Cat no: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat no: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/fl | Fisher Scientific | Cat no: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat no: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat no: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | Sigma | Cat no: CLS2595 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | Cat no: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | Cat no: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat no: L2020 | |
| Flat bottom 96-well plate | Sigma | Cat no: 03690 | |
| Glass Pasteur pipette | Sigma | Cat no: 470236-274 | |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) | VWR | Cat no: 02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Cat no: 03-50/31 | |
| L-Glutamine | Gibco | Cat no: A14867-01 | |
| Mouse recombinant IL-15 | Gibco | Cat no: 22400-089 | |
| Mouse recombinant IL-2 | Gibco | Cat no: 21103-049 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Life Technologies | Cat no: 13257-019 | |
| Neurobasal media | PeproTech | Cat no: 450-51-10 | |
| PE anti-mouse GM-CSF | PeproTech | Cat no: 212-12 | |
| Penicillin and Streptomycin | PeproTech | Cat no: 210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | Cat no: 19855 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biolegend | Cat no: 108732 | Clone PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Cat no: 137606 | Clone 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Cat no: 505406 | Clone MP1-22E9 |
| Tweezers and dissection tools. | Biolegend | Cat no: 65-0865-14 | |
| U-Shaped-bottom 96-well plate | Biolegend | Cat no: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
References
- Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
- Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
- Binshtok, A. M., et al.
- Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H.
- Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
- Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
- Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
- Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
- Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333 (2021).
- Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
- Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
- Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).
