Summary
Nociceptorneuronen en NK-cellen werken actief samen in een inflammatoire context. Een co-cultuurbenadering maakt het mogelijk om dit samenspel te bestuderen.
Abstract
Somatosensorische neuronen zijn geëvolueerd om schadelijke stimuli te detecteren en defensieve reflexen te activeren. Door communicatiemiddelen te delen, stemmen nociceptorneuronen ook de afweer van de gastheer af door de activiteit van het immuunsysteem te regelen. De communicatie tussen deze systemen is meestal adaptief en helpt de homeostase te beschermen, het kan ook leiden tot of het begin van chronische ziekten bevorderen. Beide systemen zijn samen geëvolueerd om een dergelijke lokale interactie mogelijk te maken, zoals gevonden in primaire en secundaire lymfoïde weefsels en slijmvliezen. Recente studies hebben aangetoond dat nociceptoren direct vreemde antigenen, van immuuncellen afgeleide cytokines en microben detecteren en erop reageren.
Nociceptoractivering resulteert niet alleen in pijnovergevoeligheid en jeuk, maar verlaagt ook de nociceptorvuurdrempel, wat leidt tot de lokale afgifte van neuropeptiden. De peptiden die worden geproduceerd door en vrijgegeven uit de perifere terminals van nociceptoren kunnen de chemotaxis en polarisatie van lymfocyten blokkeren, waardoor de lokalisatie, duur en het type ontsteking worden gecontroleerd. Recent bewijs toont aan dat sensorische neuronen interageren met aangeboren immuuncellen via cel-celcontact, bijvoorbeeld door groep 2D (NKG2D) receptoren op natural killer (NK) cellen aan te spreken.
Gezien het feit dat NK-cellen de cognate receptoren tot expressie brengen voor verschillende nociceptor-geproduceerde mediatoren, is het denkbaar dat nociceptoren neuropeptiden gebruiken om de activiteit van NK-cellen te beheersen. Hier bedenken we een co-kweekmethode om nociceptor neuron-NK celinteracties in een schotel te bestuderen. Met behulp van deze benadering ontdekten we dat lumbale nociceptorneuronen de expressie van NK-cellencytokine verminderen. Over het algemeen zou een dergelijke reductionistische methode nuttig kunnen zijn om te bestuderen hoe tumor-innervating neuronen de antikankerfunctie van NK-cellen regelen en hoe NK-cellen de eliminatie van gewonde neuronen regelen.
Introduction
De cellichamen van sensorische neuronen zijn afkomstig uit de dorsale wortelganglia (DRG). De DRG bevinden zich in het perifere zenuwstelsel (PNS), tussen de dorsale hoorn van het ruggenmerg en de perifere zenuwuiteinden. De pseudo-unipolaire aard van DRG-neuronen maakt de overdracht van informatie mogelijk van de perifere tak, die het doelweefsel innerveert, naar de centrale tak, die de somatosensorische informatie naar het ruggenmerg draagt1. Met behulp van gespecialiseerde ionkanaalreceptoren detecteren eerste-orde neuronen bedreigingen van pathogenen, allergenen en verontreinigende stoffen2, wat leidt tot de instroom van kationen (Na +, Ca2 +) en het genereren van een actiepotentiaal 3,4,5.
Deze neuronen sturen ook antidromale actiepotentiaal naar de periferie, waar de eerste gevaardetectie was opgetreden, wat leidt tot de lokale afgifte van neuropeptiden 1,4. Daarom dienen de nociceptorneuronen als een beschermend mechanisme en waarschuwen de gastheer voor omgevingsgevaar 4,5,6,7.
Om te communiceren met tweede-orde neuronen, geven de nociceptoren verschillende neurotransmitters (bijv. glutamaat) en neuropeptiden (bijv. Calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP), stof P (SP) en vasoactief intestinaal peptide (VIP))6,7 vrij. Deze peptiden werken in op haarvaten en bevorderen plasma-extravasatie, oedeem en de lokale instroom en modulatie van immuuncellen 2,4,7.
Het somatosensorische en immuunsysteem maken gebruik van een gedeeld communicatiesysteem dat bestaat uit cytokines en neuropeptiden, en hun respectieve verwante receptoren4. Hoewel deze bidirectionele communicatie helpt beschermen tegen gevaar en homeostase behouden, kan het ook bijdragen aan ziekte pathofysiologie4.
NK-cellen worden geclassificeerd als aangeboren lymfoïde cellen en zijn gespecialiseerd om viraal geïnfecteerde cellen te elimineren. Nk-celfunctie wordt geregeld door een balans van stimulerende en remmende receptoren, waaronder de activerende receptor NKG2D8. Het endogene ligand van NKG2D, retinoïnezuur early inducible1 (RAE1), wordt tot expressie gebracht door cellen die stress ondergaan zoals tumorigenese en infectie 8,9.
Recente onderzoeken hebben aangetoond dat perifeer zenuwletsel sensorische neuronen drijft om onaangepaste moleculen zoals stathmin 2 (STMN2) en RAE1 tot expressie te brengen. Dus, via cel-celcontact, werden NKG2D-expresserende NK-cellen geactiveerd door interactie met RAE1-expresserende neuronen. Nk-cellen waren op hun beurt in staat om gewonde nociceptorneuronen en stompe pijnovergevoeligheid te elimineren die normaal geassocieerd wordt met zenuwletsel10. Naast de NKG2D-RAE1-as drukken NK-cellen de cognatereceptoren uit voor verschillende nociceptor-geproduceerde mediatoren. Het is daarom mogelijk dat deze mediatoren de NK-celactiviteit moduleren. Dit artikel presenteert een co-kweekmethode om de biologie van de nociceptor neuron-NK celinteractie te onderzoeken. Deze aanpak zal helpen het begrip te vergroten van hoe nociceptorneuronen aangeboren immuuncelreacties op letsel, infectie of maligniteit moduleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Institutional Animal Care and Use Committees van de Université de Montréal (#22053, #22054) keurden alle dierprocedures goed. Zie tabel 1 voor een lijst van oplossingen en hun samenstelling en de tabel met materialen voor een lijst van materialen, apparatuur en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.
1. NK-celisolatie, -cultuur en -stimulatie
- Genereer nociceptorneuron intact (nestgenootcontrole; TRPV1wt::D TAfl/wt) en ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) muizen door lox-stop-lox-difterie toxine muizen (DTAfl/fl) te kruisen met TRPV1cre/wt muizen.
- Gebruik CO 2-inademing om een naïeve nestgenootcontrole (TRPV1wt::D TAfl/wt) muis te euthanaseren.
- Verzamel de milt in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 500 μL steriele fosfaatbufferzoutoplossing (PBS).
- Homogeniseer de milt met behulp van een stamper.
- Verdun de cellen met 1 ml steriel PBS.
- Filtreer het mengsel door een celzeef van 50 μm in een conische buis van 15 ml.
- Vul het volume (10 ml) aan met steriel PBS.
- Verzamel 10 μL en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
- Centrifugeer de cellen (500 × g, 5 min) en verwijder het supernatant.
- Resuspensie van de cellen in een concentratie van 108 cellen /ml in aangevuld RPMI 1640 medium.
- Volg de instructies van de fabrikant om NK-miltcellen magnetisch te zuiveren met behulp van een NK-celisolatiekit voor muizen. Bevestig nk-celzuiverheid met behulp van flowcytometrie11.
- Verzamel 10 μL en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
- Centrifugeer de cellen (500 × g, 5 min) en verwijder het supernatant.
- Resuspensie van de NK-cellen in aangevuld RPMI 1640 kweekmedium (met IL-2 en IL-15).
- Kweek 2 × 106 NK cellen/ml in een 96-well U-bodemplaat gedurende 48 uur.
2. DRG neuron isolatie en cultuur
- Bekleed 24 uur voor het einde van de NK-celstimulatie (stap 1.15) een 96-wellsplaat met 100 μL/put laminine (1 ng/ml) en incubeer gedurende 45 min (37 °C).
- Verwijder na incubatie de oplossing en laat de putten aan de lucht drogen in een bioveiligheidskast.
- Gebruik CO 2-inademing, euthanaseer nociceptorneuron intact (nestmate controle; TRPV1wt::D TAfl/wt) of ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) muizen.
OPMERKING: CO 2-inhalatie heeft de voorkeur boven cervicale dislocatie omdat het voorkomt dat de spinale zenuwen die verbonden zijn met de DRG worden verstoord. - Zet de muis op het bord in buikligging, til de huid op en snijd de huid langs de dorsale kolom. Refereer naar Perner et al. voor een gedetailleerde video12.
- Knip het lumbosacrale gewricht af en scheid het heiligbeen van de lumbale wervelkolom met een schaar.
- Scheid de wervelkolom door de spieren en ribben aan beide zijden van de wervelkolom in de schedelrichting te snijden totdat de basis van de schedel is bereikt.
- Knip met een schaar de wervelkolom af bij het atlanto-occipitale gewricht.
- Verwijder spier- en vetweefsel uit de wervelkolom.
- Pin en open de wervelkolom om het ruggenmerg te verwijderen en toegang te krijgen tot de DRG. Zoek naar de DRG in de tussenwervel foramina verbonden met het ruggenmerg via de dorsale wortel, maar gescheiden van de hersenvliezen.
- Oogst de DRG's in een conische buis van 15 ml gevuld met 10 ml ijskoude dmem.
- Centrifugeer het preparaat (200 × g, 5 min, kamertemperatuur) en verwijder het supernatant.
- Voeg 250 μL PBS met Collagenase IV (1 mg/ml) en Dispase II (2,4 U/ml) toe.
- Incubeer de DRG met Collagenase IV/Dispase II (C/D) oplossing (80 min, 37 °C, lichte agitatie). Bij het poolen van ganglia van meerdere muizen, handhaaf dan een verhouding van 125 μL C/D-oplossing per ganglion.
- Om de enzymen te inactiveren, voegt u 5 ml aangevuld DMEM-medium toe.
- Centrifugeer de oplossing (200 × g, 5 min) en verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet.
- Om ongewenst celverlies te voorkomen, laat ~100 μL van het supernatant.
- Voeg 1 ml aangevuld DMEM-medium toe.
- Gebruik een pipetpistool en drie glazen Pasteur-pipetten van afnemende grootte, triturate de DRG voorzichtig (~ 10 omhoog / omlaag per Pasteur-pipetmaat) in een eencellig preparaat.
- Verdun in een bioveiligheidskast runderserumalbumine (BSA) in steriel PBS tot een eindconcentratie van 15%. Bewaar 1 ml aliquots bij −20 °C.
- Maak een BSA-gradiënt in een conische buis van 15 ml door 2 ml steriele PBS toe te voegen en langzaam 1 ml 15% BSA-oplossing aan de onderkant van de buis af te geven. Verstoor het verloop niet door de pipet voorzichtig te verwijderen.
- Pipetteer met behulp van een P200-pipet langzaam de triturated ganglia-suspensie (die de neuronen bevat) op de zijkant van de buis in de gradiënt.
- Centrifugeer de neuronbevattende BSA-gradiënt (200 × g, 12 min, kamertemperatuur). Stel de versnelling en vertraging van de centrifuge in op de minimumsnelheid.
OPMERKING: Na centrifugatie bevinden de neuronen zich aan de onderkant van de buis, terwijl het celafval wordt opgesloten in de BSA-gradiënt. - Verwijder voorzichtig al het supernatant met een pipet.
- Resuspendeer de cellen in 500 μL Neurobasal.
- Plaat 104 neuronen per put (200 μL neurobasaal/putje) in een laminine-gecoate, platbodem 96-well plaat.
OPMERKING: Gemiddeld kan een onderzoeker ~ 8 putten per muis vullen. - Kweek de neuronen (37 °C, 's nachts) om hechting mogelijk te maken.
3. Co-kweek en flowcytometrie
- Verwijder langzaam het neurobasale uit de neuroncultuur.
- Na 48 uur stimulatie met IL-2 en IL-15 (zie stappen 1.14-1.15), resuspensie de NK-cellen en voeg 105 NK-cellen/put toe aan de neuroncultuur (96-well platte bodemplaat).
OPMERKING: Gemiddeld kan de onderzoeker ~ 6 putten per muis vullen. - Co-kweek de cellen in aangevulde neurobasale MX (37 °C, 48 h).
- Verzamel de cellen, was met PBS (3x) en centrifugeer (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Gooi het supernatant weg en kleur de cellen met Viability Dye eFlour-780 (1:1.000, 15 min, 4 °C).
- Verzamel de cellen, was met PBS (3x) en centrifugeer (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Blokkeer niet-specifieke plaatsen op de cellen met CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).
- Verzamel de cellen, was met PBS (3x) en centrifugeer (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Kleur (15 min, 4 °C) de cellen met BV421 anti-NK-1.1 (1:100), fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) anti-NKp46 (1:100), en phycoerythrin (PE) anti-GM-CSF (1:100).
- Verzamel de cellen, was met PBS (3x) en centrifugeer (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Gooi het supernatant weg, resuspensieer de cellen in FACS-buffer (500 μL) en immunofenotypeer de NK-cellen door flowcytometrie11. Zie figuur 1A voor de gatingstrategie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NK-cellen werden magnetisch gezuiverd van littermate control (TRPV1wt::D TAfl/wt) muizensplenocyten en gestimuleerd (48 h) met IL-2 en IL-15. De NK-cellen werden vervolgens alleen gekweekt of samen gekweekt met DRG-neuronen geoogst uit nociceptorneuron intact (nestmate control; TRPV1wt::D TAfl/wt) of ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) muizen. De cellen werden vervolgens blootgesteld aan de TRPV1-agonist capsaïcine (1 μM) of het voertuig ervan. Na 24 uur co-kweek werden de NK-cellen FACS-gezuiverd en werden hun activeringsniveaus immunofenotypeerd met behulp van flowcytometrie (figuur 1A).
Wanneer ze alleen werden gekweekt, brachten NK-cellen basale niveaus van GM-CSF en NKp46 tot expressie. Wanneer co-gekweekt met DRG-neuronen geoogst van nociceptor intacte (TRPV1wt: :D TAfl / wt) muizen, capsaïcine stimulatie verminderde NK-cellen expressie van GM-CSF. Capsaïcine had geen invloed op nk-celactivatie wanneer het samen werd gekweekt met DRG-neuronen geoogst van nociceptor ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) muizen (figuur 1A,B). Het is vermeldenswaard dat TRPV1cre gemedieerde celablatie met behulp van difterietoxine A (DTA) alle TRPV1 + neuronen zal elimineren, zowel peptiderge als niet-peptiderge (MrgD + -cellen)13,14.
Figuur 1: TRPV1+ neuronen controleren NK-celactivering. NK-cellen werden magnetisch gezuiverd van littermate control (TRPV1wt::D TAfl/wt) muizensplenocyten en gestimuleerd (48 h) met IL-2 en IL-15. De NK-cellen werden vervolgens alleen gekweekt of samen gekweekt met DRG-neuronen geoogst uit nociceptorneuron intact (nestmate control; TRPV1wt::D TAfl/wt) of ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) muizen. De cellen werden vervolgens blootgesteld aan de TRPV1-agonist capsaïcine (1 μM) of het voertuig ervan. Na 24 uur co-kweek werden de NK-cellen FACS-gezuiverd en hun activeringsniveaus werden immunofenotypeerd met behulp van flowcytometrie (A). Wanneer ze alleen werden gekweekt, brachten NK-cellen basale niveaus van GM-CSF en NKp46 tot expressie. GM-CSF-expressie nam af wanneer NK-cellen werden gecokweekt met DRG-neuronen geoogst van nociceptor intacte (TRPV1wt: :D TAfl / wt) muizen en gestimuleerd met capsaïcine (A, B). Het niveau van NKp46 werd niet beïnvloed (A,B). Capsaïcine had geen invloed op NK-celactivatie wanneer het samen met DRG-neuronen werd gekweekt van nociceptor-ablated (TRPV1cre: :D TAfl / wt) muizen (A, B). Representatieve FACS-plot wordt getoond (A). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± S.E.M (B). Het experiment werd drie keer herhaald en vergelijkbare conclusies werden verkregen. Het aantal geteste dieren wordt weergegeven; n = 5 biologische duplo's/groep (B). P-waarden worden weergegeven in de figuur en bepaald door eenrichtings ANOVA post-hoc Bonferroni (B). Afkortingen: TRPV1 = transient receptor potential cation channel subfamily V lid 1; NK = natuurlijke killer; DTA = difterietoxine A; DRG = dorsaal wortel ganglion; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; GM-CSF = granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor; Veh = voertuig; Cap = capsaïcine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Compositie | ||
| Collagenase/Dispase (C/D) | Steriele PBS aangevuld met collagenase (1 mg/ml) en Dispase II (2,4 E/ml) | ||
| Dmem | Steriele DMEM aangevuld met FBS (10%), penicilline (100 I.E.) en streptomycine (100 μg/ml) | ||
| Aangevuld RPMI 1640 | Steriele RMPI 1640 aangevuld met penicilline (100 I.E.), streptomycine (100 μg/ml), foetaal runderserum (10%), L-glutamine (300 ng/ml), muisrecombinant IL-2 (200 U/ml) en muisrecombinant IL-15 (10 ng/ml) | ||
| Neurobasaal | Steriele neurobasaal aangevuld met penicilline (100 I.E.), streptomycine (100 μg/ml), L-glutamine (200 μM), B-27 (2%), NGF (50 ng/ml) en GDNF (2 ng/ml) | ||
| Neurobasale MX | Steriele Neurobasal aangevuld met penicilline (100 I.E.), streptomycine (100 μg/ml), L-glutamine (200 μM), B-27 (2%), NGF (50 ng/ml), GDNF (2 ng/ml), muisrecombinant IL-2 (200 U/ml) en muisrecombinant IL-15 (10 ng/ml) | ||
| FACS sorteerbuffer | Steriele PBS aangevuld met FBS (2%) en EDTA (1 mM) | ||
Tabel 1: Lijst van oplossingen en media die in dit protocol worden gebruikt. Afkortingen: NGF = zenuwgroeifactor; GDNF = van gliacellen afgeleide neurotrofe factor; FBS = foetaal runderserum; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Davies et al.11 ontdekten dat gewonde neuronen RAE1 upreguleren. Via cel-celcontact waren NKG2D-tot expressie brengende NK-cellen vervolgens in staat om RAE1 + -neuronen te identificeren en te elimineren, die op hun beurt chronische pijn beperken11. Gezien het feit dat NK-cellen ook verschillende neuropeptidereceptoren tot expressie brengen en dat die neuropeptiden bekend staan om hun immunomodulerende mogelijkheden, lijkt het steeds belangrijker om de interactie tussen NK-cellen en nociceptorneuronen in vitro te bestuderen. Hier hebben we een eenvoudig co-kweekprotocol ontwikkeld waarmee onderzoekers kunnen bestuderen hoe neuronen de NK-celfunctie beheersen en omgekeerd hoe NK-cellen de functie van DRG-neuronen kunnen moduleren. Flowcytometrie werd gebruikt om immunofenotype te geven hoe neuronen NK-celactivatie moduleren. Als alternatief kunnen onderzoekers qPCR of RNA-sequencing gebruiken om transcriptveranderingen in FACS-gezuiverde cellen te meten of de secretie van uitgescheiden factoren, zoals cytokines of neuropeptiden, te analyseren met behulp van ELISA's. Ruwe gegevens worden gedeponeerd en zijn vrij beschikbaar op www.talbotlab.com.
Hier vonden we dat TRPV1 + nociceptorneuronen, secundair aan de werking van capsaïcine, NK-celactivering blokkeren (GM-CSF-expressie). Hoewel capsaïcine gebruikt in een hoge concentratie NK-celfuncties kan aantasten14, hebben we deze mogelijkheid experimenteel uitgesloten omdat NK-celactiviteit niet werd beïnvloed door blootstelling aan capsaïcine (1 μM) in afwezigheid van peptiderge neuronen (TRPV1cre: :D TAfl / wt). Aangezien capsaïcine leidt tot calciuminstroom en hun daaropvolgende afgifte in neuropeptiden, suggereren deze gegevens dat NK-celactivering daarom waarschijnlijk secundair is aan de werking van oplosbare factoren die door neuronen worden vrijgegeven. Daarom was een dergelijke co-kweekbenadering nuttig om te bestuderen hoe de afgifte van neuropeptiden de NK-celfunctie kan moduleren. Naast oplosbare factoren zullen de lokale cel-celinteracties tussen de twee celtypen waarschijnlijk ook hun functies moduleren, iets dat experimenteel moet worden getest (bijvoorbeeld door de impact van geconditioneerd medium te vergelijken met die van co-kweek).
Over het algemeen suggereert een dergelijk samenspel dat binnen de weefselmicro-omgeving de NK-celfunctie waarschijnlijk wordt afgestemd door nociceptorneuronterminals. Deze gegevens benadrukken het belang van het holistisch beoordelen van ontstekingsreacties door tegelijkertijd de rol van neuronen en aangeboren immuuncellen (d.w.z. NK-cellen) te bestuderen. Nk-cel-neuron-overspraak speelt bijvoorbeeld waarschijnlijk een belangrijke biologische rol in contexten variërend van zenuwletsel, weefselletsel, bacteriële of virale infectie tot maligniteiten. Toekomstig werk, waaronder het gebruik van deze co-kweekmethode, is nodig om de impact van neuron-NK-celinteractie in gezondheid en ziekte te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), de Canadian Institutes of Health Research (162211, 461274, 461275), de Canadian Foundation for Innovation (37439), Canada Research Chair-programma (950-231859), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06824) en het Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD16/32 | Jackson Laboratory | Cat no: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Cat no: 009669 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade | World Precision Instruments | Cat no: 504167 | |
| BV421 anti-mouse NK-1.1 | Fisher Scientific | Cat no: 12430112 | |
| Cell strainer (50 μm) | Fisher Scientific | Cat no: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat no: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/fl | Fisher Scientific | Cat no: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat no: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat no: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | Sigma | Cat no: CLS2595 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | Cat no: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | Cat no: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat no: L2020 | |
| Flat bottom 96-well plate | Sigma | Cat no: 03690 | |
| Glass Pasteur pipette | Sigma | Cat no: 470236-274 | |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) | VWR | Cat no: 02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Cat no: 03-50/31 | |
| L-Glutamine | Gibco | Cat no: A14867-01 | |
| Mouse recombinant IL-15 | Gibco | Cat no: 22400-089 | |
| Mouse recombinant IL-2 | Gibco | Cat no: 21103-049 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Life Technologies | Cat no: 13257-019 | |
| Neurobasal media | PeproTech | Cat no: 450-51-10 | |
| PE anti-mouse GM-CSF | PeproTech | Cat no: 212-12 | |
| Penicillin and Streptomycin | PeproTech | Cat no: 210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | Cat no: 19855 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biolegend | Cat no: 108732 | Clone PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Cat no: 137606 | Clone 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Cat no: 505406 | Clone MP1-22E9 |
| Tweezers and dissection tools. | Biolegend | Cat no: 65-0865-14 | |
| U-Shaped-bottom 96-well plate | Biolegend | Cat no: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
References
- Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
- Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
- Binshtok, A. M., et al.
- Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H.
- Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
- Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
- Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
- Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
- Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333 (2021).
- Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
- Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
- Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).
