Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

إثارة التفاعل بين الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا العصبية المستقبلة للألم

Published: June 30, 2022 doi: 10.3791/63800
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal

Summary

تتفاعل الخلايا العصبية المستقبلة للألم والخلايا القاتلة الطبيعية بنشاط في سياق التهابي. يتيح نهج الثقافة المشتركة دراسة هذا التفاعل.

Abstract

تطورت الخلايا العصبية الحسية الجسدية للكشف عن المنبهات الضارة وتنشيط ردود الفعل الدفاعية. من خلال مشاركة وسائل الاتصال ، تقوم الخلايا العصبية المستقبلة للألم أيضا بضبط دفاعات المضيف من خلال التحكم في نشاط الجهاز المناعي. يكون الاتصال بين هذه الأنظمة في الغالب تكيفيا ، مما يساعد على حماية التوازن ، ويمكن أن يؤدي أيضا إلى ظهور الأمراض المزمنة أو يعززها. تطور كلا النظامين معا للسماح بمثل هذا التفاعل المحلي ، كما هو موجود في الأنسجة اللمفاوية الأولية والثانوية والغشاء المخاطي. أظهرت الدراسات الحديثة أن مستقبلات الألم تكتشف وتستجيب مباشرة للمستضدات الأجنبية والسيتوكينات المشتقة من الخلايا المناعية والميكروبات.

لا يؤدي تنشيط مستقبلات الألم إلى فرط الحساسية والحكة فحسب ، بل يقلل من عتبة إطلاق مستقبلات الألم ، مما يؤدي إلى إطلاق الببتيدات العصبية محليا. يمكن للببتيدات التي تنتجها الطرفيات الطرفية لمستقبلات الألم وتنطلق منها أن تمنع الانجذاب الكيميائي واستقطاب الخلايا الليمفاوية ، وتتحكم في توطين الالتهاب ومدته ونوعه. تظهر الأدلة الحديثة أن الخلايا العصبية الحسية تتفاعل مع الخلايا المناعية الفطرية عن طريق الاتصال بالخلايا الخلوية ، على سبيل المثال ، إشراك مستقبلات المجموعة 2D (NKG2D) على الخلايا القاتلة الطبيعية (NK).

بالنظر إلى أن الخلايا القاتلة الطبيعية تعبر عن المستقبلات المشابهة لمختلف الوسطاء الذين ينتجهم مستقبلات الألم ، فمن المتصور أن مستقبلات الألم تستخدم الببتيدات العصبية للتحكم في نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية. هنا ، نبتكر طريقة زراعة مشتركة لدراسة تفاعلات الخلايا العصبية القاتلة الطبيعية في طبق. باستخدام هذا النهج ، وجدنا أن الخلايا العصبية القطنية المستقبلة للألم تقلل من تعبير السيتوكين في الخلايا القاتلة الطبيعية. بشكل عام ، يمكن أن تكون هذه الطريقة الاختزالية مفيدة لدراسة كيفية تحكم الخلايا العصبية المعصبة للورم في الوظيفة المضادة للسرطان للخلايا القاتلة الطبيعية وكيف تتحكم الخلايا القاتلة الطبيعية في القضاء على الخلايا العصبية المصابة.

Introduction

تنشأ الأجسام الخلوية للخلايا العصبية الحسية في العقد الجذرية الظهرية (DRG). تقع DRG في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) ، بين القرن الظهري للحبل الشوكي وأطراف الأعصاب الطرفية. تسمح الطبيعة الزائفة أحادية القطب للخلايا العصبية DRG بنقل المعلومات من الفرع المحيطي ، الذي يعصب الأنسجة المستهدفة ، إلى الفرع المركزي ، الذي يحمل المعلومات الحسية الجسدية إلى الحبل الشوكي1. باستخدام مستقبلات القناة الأيونية المتخصصة ، تستشعر الخلايا العصبية من الدرجة الأولى التهديدات التي تشكلها مسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية والملوثات2 ، مما يؤدي إلى تدفق الكاتيونات (Na + ، Ca2+) وتوليد جهد الفعل3،4،5.

ترسل هذه الخلايا العصبية أيضا إمكانات عمل مضادة للدروم نحو المحيط ، حيث حدث استشعار الخطر الأولي ، مما يؤدي إلى الإطلاق المحلي للببتيدات العصبية 1,4. لذلك ، تعمل الخلايا العصبية مستقبلات الألم كآلية وقائية ، تنبه المضيف إلى الخطر البيئي4،5،6،7.

للتواصل مع الخلايا العصبية من الدرجة الثانية ، تطلق مستقبلات الألم العديد من الناقلات العصبية (مثل الغلوتامات) والببتيدات العصبية (على سبيل المثال ، الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) ، والمادة P (SP) ، والببتيد المعوي النشط في الأوعية (VIP))6,7. تعمل هذه الببتيدات على الشعيرات الدموية وتعزز تسرب البلازما والوذمة والتدفق المحلي وتعديل الخلايا المناعية2،4،7.

يستخدم الجهاز الحسي الجسدي والجهاز المناعي نظام اتصال مشترك يتكون من السيتوكينات والببتيدات العصبية ، ومستقبلاتها المشابهة4. في حين أن هذا الاتصال ثنائي الاتجاه يساعد على الحماية من الخطر والحفاظ على التوازن ، فإنه يمكن أن يساهم أيضا في الفيزيولوجيا المرضيةللأمراض 4.

تصنف الخلايا القاتلة الطبيعية على أنها خلايا لمفاوية فطرية وهي متخصصة في القضاء على الخلايا المصابة بالفيروس. تخضع وظيفة الخلية القاتلة الطبيعية لتوازن المستقبلات التحفيزية والمثبطة ، بما في ذلك المستقبل المنشط NKG2D8. يتم التعبير عن الرباط الداخلي ل NKG2D ، حمض الريتينويك المحرض المبكر 1 (RAE1) ، من خلال الخلايا التي تخضع للإجهاد مثل تكوين الورم والعدوى 8,9.

أظهرت التحقيقات الحديثة أن إصابة الأعصاب الطرفية تدفع الخلايا العصبية الحسية للتعبير عن جزيئات غير قادرة على التكيف مثل stathmin 2 (STMN2) و RAE1. وهكذا ، عن طريق الاتصال بالخلية الخلوية ، تم تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية المعبرة عن NKG2D عن طريق التفاعل مع الخلايا العصبية المعبرة عن RAE1. في المقابل ، تمكنت الخلايا القاتلة الطبيعية من القضاء على الخلايا العصبية المصابة مستقبلات الألم وفرط الحساسية الحاد للألم المرتبط عادة بإصابة الأعصاب10. بالإضافة إلى محور NKG2D-RAE1 ، تعبر الخلايا القاتلة الطبيعية عن المستقبلات المشابهة لمختلف الوسطاء الذين ينتجهم مستقبلات الألم. لذلك من الممكن أن يقوم هؤلاء الوسطاء بتعديل نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية. تقدم هذه الورقة طريقة استزراع مشترك للتحقيق في بيولوجيا تفاعل الخلايا العصبية القاتلة الطبيعية مستقبلات للألم. سيساعد هذا النهج في تعزيز فهم كيفية تعديل الخلايا العصبية المستقبلة للألم لاستجابات الخلايا المناعية الفطرية للإصابة أو العدوى أو الورم الخبيث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وافقت لجان رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة مونتريال (# 22053 ، # 22054) على جميع إجراءات الحيوانات. انظر الجدول 1 للحصول على قائمة بالمحاليل وتكوينها وجدول المواد للحصول على قائمة بالمواد والمعدات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. عزل الخلايا القاتلة الطبيعية والثقافة والتحفيز

  1. توليد الخلايا العصبية nociceptor سليمة (السيطرة على littermate; TRPV1بالوزن: :D TA fl / wt) والفئران المستأصلة (TRPV1 cre: :D TA fl / wt) عن طريق عبور الفئران السامة lox-stop-lox-diphtheria (DTA fl /fl) مع الفئران TRPV1cre / wt.
  2. باستخدام استنشاق CO2 ، قم بالقتل الرحيم لماوس التحكم في القمامة الساذج (TRPV1 wt: :D TAfl / wt).
  3. اجمع الطحال في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
  4. تجانس الطحال باستخدام مدقة.
  5. تمييع الخلايا مع 1 مل من PBS معقمة.
  6. قم بتصفية الخليط من خلال مصفاة خلية 50 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  7. قم بتعبئة مستوى الصوت (10 مل) باستخدام PBS معقم.
  8. جمع 10 ميكرولتر وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
  9. جهاز طرد مركزي للخلايا (500 × جم ، 5 دقائق) وإزالة المادة الطافية.
  10. أعد تعليق الخلايا بتركيز 108 خلايا / مل في وسط RPMI 1640 المكمل .
  11. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتنقية خلايا الطحال القاتلة الطبيعية مغناطيسيا باستخدام مجموعة عزل الخلايا القاتلة الطبيعية للفأر. تأكد من نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام قياس التدفق الخلوي11.
  12. جمع 10 ميكرولتر وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
  13. أجهزة الطرد المركزي للخلايا (500 × جم ، 5 دقائق) وإزالة المادة الطافية.
  14. أعد تعليق الخلايا القاتلة الطبيعية في وسط ثقافة RPMI 1640 المكمل (يحتوي على IL-2 و IL-15).
  15. الثقافة 2 × 106 خلايا NK / مل في لوحة قاع U ذات 96 بئرا لمدة 48 ساعة.

2. عزل الخلايا العصبية DRG والثقافة

  1. قبل 24 ساعة من نهاية تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية (الخطوة 1.15) ، قم بتغطية صفيحة 96 بئرا ب 100 ميكرولتر / بئر من اللامينين (1 نانوغرام / مل) واحتضانها لمدة 45 دقيقة (37 درجة مئوية).
  2. بعد الحضانة ، قم بإزالة المحلول واترك الآبار تجف في الهواء في خزانة السلامة البيولوجية.
  3. باستخدام استنشاق CO2 ، القتل الرحيم الخلايا العصبية nociceptor سليمة (السيطرة على littermate; TRPV1بالوزن: :D TA fl / wt) أو الفئران المستأصلة (TRPV1cre: :D TAfl / wt).
    ملاحظة: يفضل استنشاق CO2 على خلع عنق الرحم لأنه يتجنب تعطيل الأعصاب الشوكية المتصلة ب DRG.
  4. ثبت الماوس على السبورة في وضع الانبطاح ، وارفع الجلد ، وشق الجلد على طول العمود الظهري. ارجع إلى Perner et al. للحصول على فيديو مفصل12.
  5. قطع المفصل القطني العجزي وفصل العجز عن العمود الفقري القطني بالمقص.
  6. افصل العمود الفقري عن طريق قطع العضلات والأضلاع على جانبي العمود الفقري في اتجاه الجمجمة حتى يتم الوصول إلى قاعدة الجمجمة.
  7. باستخدام مقص ، وقطع العمود الفقري في المفصل القذالي الأطلسي.
  8. إزالة العضلات والأنسجة الدهنية من العمود الفقري.
  9. دبوس وفتح العمود الفقري لإزالة الحبل الشوكي والوصول إلى DRG. ابحث عن DRG في الثقبة الفقرية المتصلة بالحبل الشوكي من خلال الجذر الظهري ولكنها منفصلة عن السحايا.
  10. احصد DRGs في أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء ب 10 مل من DMEM المكمل بالثلج البارد.
  11. جهاز طرد مركزي التحضير (200 × جم ، 5 دقائق ، درجة حرارة الغرفة) وإزالة المادة الطافية.
  12. أضف 250 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على كولاجيناز IV (1 مجم / مل) و Dispase II (2.4 وحدة / مل).
  13. احتضان DRG بمحلول كولاجيناز IV / Dispase II (C / D) (80 دقيقة ، 37 درجة مئوية ، تقليب خفيف). عند تجميع العقد من عدة فئران ، حافظ على نسبة 125 ميكرولتر من محلول C / D لكل عقدة.
  14. لتعطيل الإنزيمات ، أضف 5 مل من وسط DMEM المكمل .
  15. جهاز طرد مركزي المحلول (200 × جم ، 5 دقائق) وقم بإزالة المادة الطافية برفق باستخدام ماصة.
  16. لتجنب فقدان الخلايا غير المرغوب فيه ، اترك ~ 100 ميكرولتر من المادة الطافية.
  17. أضف 1 مل من وسط DMEM المكمل.
  18. باستخدام مسدس ماصة وثلاثة ماصات باستور زجاجية ذات أحجام متناقصة ، قم بسحن بلطف (~ 10 لأعلى / لأسفل لكل حجم ماصة باستور) DRG في إعداد خلية واحدة.
  19. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتخفيف ألبومين مصل الأبقار (BSA) في PBS المعقم إلى تركيز نهائي بنسبة 15٪. قم بتخزين 1 مل من القسمة عند -20 درجة مئوية.
  20. قم بإنشاء تدرج BSA في أنبوب مخروطي سعة 15 مل عن طريق إضافة 2 مل من PBS المعقم والاستغناء ببطء عن 1 مل من محلول BSA بنسبة 15٪ في الجزء السفلي من الأنبوب. تجنب تعطيل التدرج عن طريق إزالة الماصة برفق.
  21. باستخدام ماصة P200 ، ماصة ببطء تعليق العقد المستحن (الذي يحتوي على الخلايا العصبية) على جانب الأنبوب في التدرج.
  22. جهاز طرد مركزي لتدرج BSA المحتوي على الخلايا العصبية (200 × جم ، 12 دقيقة ، درجة حرارة الغرفة). اضبط تسارع وتباطؤ أجهزة الطرد المركزي على الحد الأدنى للسرعة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، ستكون الخلايا العصبية في قاع الأنبوب بينما سيتم احتجاز حطام الخلية في تدرج BSA.
  23. قم بإزالة كل المادة الطافية برفق باستخدام ماصة.
  24. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من Neurobasal.
  25. لوحة 104 خلايا عصبية لكل بئر (200 ميكرولتر من القاعدية العصبية / البئر) في صفيحة 96 بئرا مطلية بالصفيحة ذات القاع المسطح 96.
    ملاحظة: في المتوسط ، سيتمكن المحقق من ملء ~ 8 آبار لكل فأر.
  26. استزرع الخلايا العصبية (37 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها) للسماح بالتعلق.

3. الثقافة المشتركة وقياس التدفق الخلوي

  1. إزالة ببطء neurobasal من ثقافة الخلايا العصبية.
  2. بعد 48 ساعة من التحفيز باستخدام IL-2 و IL-15 (انظر الخطوات 1.14-1.15) ، أعد تعليق الخلايا القاتلة الطبيعية وأضف 105 خلايا NK / بئر إلى مزرعة الخلايا العصبية (96 صفيحة سفلية مسطحة).
    ملاحظة: في المتوسط ، سيكون المحقق قادرا على ملء ~ 6 آبار لكل فأر.
  3. شارك في زراعة الخلايا في MX العصبي القاعدي المكمل (37 درجة مئوية ، 48 ساعة).
  4. اجمع الخلايا واغسلها باستخدام PBS (3x) وأجهزة الطرد المركزي (500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية).
  5. تخلص من المادة الطافية وقم بتلطيخ الخلايا باستخدام صبغة الصلاحية eFlour-780 (1:1,000 ، 15 دقيقة ، 4 درجات مئوية).
  6. اجمع الخلايا واغسلها باستخدام PBS (3x) وأجهزة الطرد المركزي (500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية).
  7. حظر المواقع غير المحددة على الخلايا باستخدام CD16 / 32 (1: 100 ، 15 دقيقة ، 4 درجات مئوية).
  8. اجمع الخلايا واغسلها باستخدام PBS (3x) وأجهزة الطرد المركزي (500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية).
  9. صبغ (15 دقيقة ، 4 درجات مئوية) الخلايا مع BV421 anti-NK-1.1 (1: 100) ، فلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) anti-NKp46 (1: 100) ، و phycoerythrin (PE) anti-GM-CSF (1: 100).
  10. اجمع الخلايا واغسلها باستخدام PBS (3x) وأجهزة الطرد المركزي (500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية).
  11. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS (500 ميكرولتر) والنمط المناعي للخلايا القاتلة الطبيعية عن طريق قياس التدفق الخلوي11. انظر الشكل 1 أ لاستراتيجية البوابات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية مغناطيسيا من خلايا الطحال في الفئران (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) وتحفيزها (48 ساعة) باستخدام IL-2 و IL-15. ثم تم استزراع الخلايا القاتلة الطبيعية بمفردها أو استزراعها مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من الخلايا العصبية المستقبلة للألم سليمة (التحكم في القمامة. TRPV1بالوزن: :D TA fl / wt) أو الفئران المستأصلة (TRPV1cre: :D TAfl / wt). ثم تعرضت الخلايا لكبخاخات ناهض TRPV1 (1 ميكرومتر) أو مركبتها. بعد 24 ساعة من الاستزراع المشترك ، تم تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية FACS وتم تحديد مستويات تنشيطها باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 1 أ).

عند استزراعها بمفردها ، عبرت الخلايا القاتلة الطبيعية عن المستويات القاعدية من GM-CSF و NKp46. عند الاستزراع المشترك مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من مستقبلات الألم سليمة (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) الفئران ، قلل تحفيز الكابسيسين من تعبير الخلايا القاتلة الطبيعية عن GM-CSF. لم يكن للكبخاخات أي تأثير على تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية عند زراعته مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من الفئران المستأصلة (TRPV1cre: :D TAfl / wt) (الشكل 1A ، B). تجدر الإشارة إلى أن استئصال الخلايا بوساطة TRPV1cre باستخدام توكسين الخناق A (DTA) سيقضي على جميع الخلايا العصبية TRPV1 + ، الببتيدرجية وغير الببتيديرجيك على حد سواء (خلايا MrgD +)13,14.

Figure 1
الشكل 1: تتحكم الخلايا العصبية TRPV1+ في تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية. تم تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية مغناطيسيا من خلايا الطحال في الفئران (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) وحفزها (48 ساعة) باستخدام IL-2 و IL-15. ثم تم استزراع الخلايا القاتلة الطبيعية بمفردها أو استزراعها مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من الخلايا العصبية المستقبلة للألم سليمة (التحكم في القمامة. TRPV1 بالوزن: :D TA fl / wt) أو الفئران المستأصلة (TRPV1cre: :D TAfl / wt). ثم تعرضت الخلايا لكبخاخات ناهض TRPV1 (1 ميكرومتر) أو مركبتها. بعد 24 ساعة من الاستزراع المشترك ، تم تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية FACS وتم تحديد مستويات تنشيطها باستخدام قياس التدفق الخلوي (A). عند استزراعها بمفردها ، عبرت الخلايا القاتلة الطبيعية عن المستويات القاعدية من GM-CSF و NKp46. انخفض تعبير GM-CSF عندما تم استزراع الخلايا القاتلة الطبيعية مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من مستقبلات الألم سليمة (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) الفئران وحفزها مع كبخاخات (A ، B). لم يتأثر مستوى NKp46 (A ، B). لم يكن للكبخاخات أي تأثير على تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية عند زراعته مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من مستقبلات الألم المستأصلة (TRPV1cre: :D TAfl / wt) الفئران (A ، B). يتم عرض مخطط FACS التمثيلي (A). وتعرض البيانات على النحو المتوسط ± S.E.M (B). تكررت التجربة ثلاث مرات وتم الحصول على استنتاجات مماثلة. يظهر عدد الحيوانات التي تم اختبارها ؛ n = 5 مكررات بيولوجية / مجموعة (B). يتم عرض قيم P في الشكل ويتم تحديدها بواسطة Bonferroni أحادي الاتجاه بعد المخصص (B). الاختصارات: TRPV1 = مستقبل عابر محتمل لقناة الكاتيون الفرعية عضو V 1 ؛ NK = القاتل الطبيعي ؛ DTA = سم الخناق أ ؛ DRG = عقدة الجذر الظهرية ؛ FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق ؛ GM-CSF = عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم ؛ Veh = مركبة ؛ كاب = كبخاخات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

حل تكوين
كولاجيناز / ديسباز (C / D) PBS معقم مكمل بالكولاجيناز (1 مجم / مل) و Dispase II (2.4 وحدة / مل)
دمم مكمل DMEM معقم ب FBS (10٪) ، بنسلين (100 وحدة دولية) وستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)
مكمل RPMI 1640 RMPI 1640 المعقم المكمل بالبنسلين (100 وحدة دولية) ، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، مصل الأبقار الجنينية (10٪) ، L- الجلوتامين (300 نانوغرام / مل) ، المؤتلف للفأر IL-2 (200 وحدة / مل) ، والمؤتلف للفأر IL-15 (10 نانوغرام / مل)
العصبية القاعدية عصبي قاعدي معقم مكمل بالبنسلين (100 وحدة دولية) ، ستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، إل-جلوتامين (200 ميكرومتر) ، ب-27 (2٪) ، NGF (50 نانوغرام / مل) ، و GDNF (2 نانوغرام / مل)
العصبية القاعدية MX عصبي قاعدي معقم مكمل بالبنسلين (100 وحدة دولية) ، ستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، إل-جلوتامين (200 ميكرومتر) ، ب-27 (2٪) ، NGF (50 نانوغرام / مل) ، GDNF (2 نانوغرام / مل) ، مؤتلف الماوس IL-2 (200 وحدة / مل) ، ومؤتلف الماوس IL-15 (10 نانوغرام / مل)
المخزن المؤقت لفرز FACS برنامج تلفزيوني معقم مكمل ب FBS (2٪) و EDTA (1 مللي مول)

الجدول 1: قائمة الحلول والوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول. الاختصارات: NGF = عامل نمو العصب. GDNF = عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية ؛ FBS = مصل بقري جنيني ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وجد Davies et al.11 أن الخلايا العصبية المصابة تنظم RAE1. من خلال الاتصال بالخلايا الخلوية ، تمكنت خلايا NKG2D التي تعبر عن NKG من تحديد الخلايا العصبية RAE1 + والقضاء عليها ، والتي بدورها تحد من الألم المزمن11. بالنظر إلى أن الخلايا القاتلة الطبيعية تعبر أيضا عن مستقبلات الببتيد العصبي المختلفة ، وأن تلك الببتيدات العصبية معروفة بقدراتها المناعية ، يبدو من المهم بشكل متزايد دراسة التفاعل بين الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا العصبية المستقبلة للألم في المختبر. هنا ابتكرنا بروتوكولا بسيطا للثقافة المشتركة يسمح للباحثين بدراسة كيفية تحكم الخلايا العصبية في وظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية ، وبالمثل ، كيف يمكن للخلايا القاتلة الطبيعية تعديل وظيفة الخلايا العصبية DRG. تم استخدام قياس التدفق الخلوي للنمط المناعي لكيفية تعديل الخلايا العصبية لتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية. بدلا من ذلك ، يمكن للباحثين استخدام تسلسل qPCR أو RNA لقياس تغيرات النسخ في الخلايا المنقاة FACS أو تحليل إفراز العوامل المفرزة ، مثل السيتوكينات أو الببتيدات العصبية ، باستخدام ELISAs. يتم إيداع البيانات الأولية وإتاحتها مجانا على www.talbotlab.com.

هنا وجدنا أن الخلايا العصبية TRPV1 + nociceptor ، الثانوية لعمل كبخاخات ، تمنع تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية (تعبير GM-CSF). في حين أن الكابسيسين المستخدم بتركيز عال قد يضعف وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية14 ، فقد استبعدنا هذا الاحتمال تجريبيا لأن نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية لم يتأثر بالتعرض للكبخاخات (1 ميكرومتر) في غياب الخلايا العصبية الببتيديرجينية (TRPV1cre: :D TAfl / wt). نظرا لأن الكابسيسين يؤدي إلى تدفق الكالسيوم وإطلاقه لاحقا في الببتيدات العصبية ، تشير هذه البيانات إلى أن تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية من المحتمل أن يكون ثانويا لعمل العوامل القابلة للذوبان التي تطلقها الخلايا العصبية. لذلك ، كان نهج الاستزراع المشترك هذا مفيدا لدراسة كيف يمكن أن يؤدي إطلاق الببتيدات العصبية إلى تعديل وظيفة الخلية القاتلة الطبيعية. بالإضافة إلى العوامل القابلة للذوبان ، من المرجح أيضا أن تؤدي تفاعلات الخلية الخلوية المحلية بين نوعي الخلايا إلى تعديل وظائفها ، وهو أمر يجب اختباره تجريبيا (على سبيل المثال ، مقارنة تأثير الوسط المشروط بتأثير الثقافة المشتركة).

بشكل عام ، يشير هذا التفاعل إلى أنه داخل البيئة الدقيقة للأنسجة ، من المحتمل أن يتم ضبط وظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية بواسطة أطراف الخلايا العصبية المستقبلة للألم. تؤكد هذه البيانات على أهمية تقييم الاستجابات الالتهابية بشكل كلي من خلال دراسة دور الخلايا العصبية والخلايا المناعية الفطرية (أي الخلايا القاتلة الطبيعية). على سبيل المثال ، من المحتمل أن يلعب الحديث المتبادل بين الخلايا العصبية القاتلة الطبيعية دورا بيولوجيا مهما في السياقات التي تمتد من إصابة الأعصاب أو إصابة الأنسجة أو العدوى البكتيرية أو الفيروسية إلى الأورام الخبيثة. هناك حاجة إلى العمل في المستقبل ، بما في ذلك استخدام طريقة الاستزراع المشترك هذه ، لتقييم تأثير تفاعل الخلايا العصبية القاتلة الطبيعية في الصحة والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل صندوق الحدود الجديدة في الأبحاث (NFRFE201901326) ، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (162211 ، 461274 ، 461275) ، والمؤسسة الكندية للابتكار (37439) ، وبرنامج كرسي الأبحاث الكندي (950-231859) ، ومجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (RGPIN-2019-06824) ، وصندوق أبحاث الطبيعة والتقنيات في كيبيك (253380).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse CD16/32 Jackson Laboratory Cat no: 017769
B-27 Jackson Laboratory Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade World Precision Instruments Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1 Fisher Scientific Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm) Fisher Scientific Cat no: A3160702
Collagenase IV Fisher Scientific Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl Fisher Scientific Cat no: SH3057402
Dispase II Fisher Scientific Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit Sigma Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Cat no: C0130
FACSAria III Sigma Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS) Sigma Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46 Sigma Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate Sigma Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette Sigma Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) VWR Cat no: 02-0131
Laminin Cedarlane Cat no: 03-50/31
L-Glutamine Gibco Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15 Gibco Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2 Gibco Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF) Life Technologies Cat no: 13257-019
Neurobasal media PeproTech Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF PeproTech Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin PeproTech Cat no: 210-15
Pestles Stem Cell Technology Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS) Biolegend Cat no: 108732 Clone PK136
RPMI 1640 media Biolegend Cat no: 137606 Clone 29A1.4
TRPV1Cre Biolegend Cat no: 505406 Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools. Biolegend Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate Biolegend Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780 Becton Dickinson

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
  2. Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
  3. Binshtok, A. M., et al. Nociceptors are interleukin-1beta sensors. Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).
  4. Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. Neuro-immune regulation of mucosal physiology. Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).
  5. Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
  6. Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
  7. Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
  8. Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
  9. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
  10. Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
  11. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333 (2021).
  12. Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
  13. Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
  14. Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 184 ، المناعة العصبية ، الببتيدات العصبية ، الخلايا القاتلة الطبيعية ، NKG2D ، RAE1
إثارة التفاعل بين الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا العصبية المستقبلة للألم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmadi, A., Balood, M., Roversi, K., … More

Ahmadi, A., Balood, M., Roversi, K., Ahmadi, M., Rafei, M., Talbot, S. Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons. J. Vis. Exp. (184), e63800, doi:10.3791/63800 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter