Summary
伤害感受器神经元和NK细胞在炎症环境中积极相互作用。共同文化方法可以研究这种相互作用。
Abstract
体感神经元已经进化到可以检测有害刺激并激活防御反射。通过共享通信方式，伤害感受器神经元还通过控制免疫系统的活动来调整宿主的防御。这些系统之间的通信大多是自适应的，有助于保护体内平衡，它也可以导致或促进慢性疾病的发作。这两个系统共同进化以允许这种局部相互作用，如在原发性和继发性淋巴组织和粘膜中发现的那样。最近的研究表明，伤害感受器直接检测和响应外来抗原、免疫细胞来源的细胞因子和微生物。
伤害感受器激活不仅会导致疼痛超敏反应和瘙痒，而且会降低伤害感受器的发射阈值，导致神经肽的局部释放。由伤害感受器的外周末端产生和释放的肽可以阻断淋巴细胞的趋化性和极化，控制炎症的定位、持续时间和类型。最近的证据表明，感觉神经元通过细胞间接触与先天免疫细胞相互作用，例如， 与 自然杀伤（NK）细胞上的2D组（NKG2D）受体接触。
鉴于NK细胞表达各种伤害感受器产生的介质的同源受体，可以想象伤害感受器使用神经肽来控制NK细胞的活性。在这里，我们设计了一种共培养方法来研究培养皿中的伤害感受器神经元-NK细胞相互作用。使用这种方法，我们发现腰椎伤害感受器神经元降低NK细胞因子表达。总体而言，这种还原论方法可能有助于研究肿瘤支配神经元如何控制NK细胞的抗癌功能以及NK细胞如何控制受损神经元的消除。
Introduction
感觉神经元的细胞体起源于背根神经节（DRG）。DRG位于周围神经系统（PNS）中，位于脊髓背角和周围神经末梢之间。DRG神经元的伪单极性质允许将信息从支配靶组织的外周分支传递到中枢分支，中央分支将体感信息传递到脊髓1。使用专门的离子通道受体，一级神经元感知病原体、过敏原和污染物带来的威胁2，导致阳离子（Na+、Ca2+）的流入和动作电位3，4，5 的产生。
这些神经元还将反潜动作电位发送到发生初始危险感知的外围，这导致神经肽1，4的局部释放。因此，伤害感受器神经元作为一种保护机制，提醒宿主注意环境危险4，5，6，7。
为了与二级神经元通信，伤害感受器释放各种神经递质（例如谷氨酸）和神经肽（例如降钙素基因相关肽（CGRP），P物质（SP）和血管活性肠肽（VIP））6，7。这些肽作用于毛细血管，促进血浆外渗、水肿以及免疫细胞的局部流入和调节2，4，7。
体感和免疫系统利用由细胞因子和神经肽及其各自的同源受体组成的共享通信系统4。虽然这种双向通信有助于防止危险并保持体内平衡，但它也有助于疾病病理生理学4。
NK细胞被归类为先天淋巴细胞，专门用于消除病毒感染的细胞。NK细胞功能由刺激性和抑制性受体的平衡控制，包括激活受体NKG2D8。NKG2D的内源性配体，维甲酸早期诱导1（RAE1），由经历肿瘤发生和感染等应激的细胞表达8，9。
最近的研究表明，周围神经损伤驱动感觉神经元表达适应不良的分子，如stathmin 2（STMN2）和RAE1。因此， 通过 细胞间接触，表达NKG2D的NK细胞通过与表达RAE1的神经元相互作用而被激活。反过来，NK细胞能够消除通常与神经损伤相关的损伤伤害感受器神经元和钝性疼痛超敏反应10。除了NKG2D-RAE1轴外，NK细胞还表达各种伤害感受器产生的介质的同源受体。因此，这些介质有可能调节NK细胞活性。本文提出了一种共培养方法来研究伤害感受器神经元-NK细胞相互作用的生物学。这种方法将有助于促进对伤害感受神经元如何调节先天免疫细胞对损伤、感染或恶性肿瘤的反应的理解。
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Protocol
蒙特利尔大学的机构动物护理和使用委员会（#22053，#22054）批准了所有动物程序。有关溶液及其组成的列表，请参阅表 1 ，有关本协议中使用的材料，设备和试剂的列表，请参阅 材料表 。
1. NK细胞分离、培养和刺激
- 产生完整的伤害感受器神经元（同窝控制;TRPV1wt：:D TAfl/wt）和消融（TRPV1cre：:D TAfl/wt）小鼠通过将lox-stop-lox-白喉毒素小鼠（DTA fl/fl）与TRPV1cre/wt 小鼠杂交。
- 使用 CO2 吸入，对幼稚同窝对照 （TRPV1wt：:D TAfl/wt） 小鼠实施安乐死。
- 将脾脏收集在含有 500 μL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 1.5 mL 微量离心管中。
- 用杵使脾脏均匀化。
- 用 1 mL 无菌 PBS 稀释细胞。
- 通过 50 μm 细胞过滤器将混合物过滤到 15 mL 锥形管中。
- 用无菌 PBS 加满体积 （10 mL）。
- 收集 10 μL 并使用血细胞计数器计数细胞。
- 离心细胞（500× g，5分钟）并除去上清液。
- 将细胞以 108 个细胞/mL 的浓度重悬于补充的 RPMI 1640 培养基中。
- 按照制造商的说明，使用小鼠NK细胞分离试剂盒对脾脏NK细胞进行磁性纯化。使用流式细胞术确认NK细胞纯度11。
- 收集 10 μL 并使用血细胞计数器计数细胞。
- 离心细胞（500× g，5分钟）并除去上清液。
- 将NK细胞重悬于补充的RPMI 1640培养基（含有IL-2和IL-15）中。
- 在96孔U底板中培养2×106NK 细胞/ mL48小时。
2. DRG神经元分离与培养
- 在NK细胞刺激结束前24小时（步骤1.15），用100μL /孔层粘连蛋白（1ng / mL）涂覆96孔板并孵育45分钟（37°C）。
- 孵育后，取出溶液，让孔在生物安全柜中风干。
- 使用CO2 吸入，对伤害感受器神经元完整实施安乐死（同窝控制;TRPV1wt：:D TAfl/wt）或消融（TRPV1cre：:D TAfl/wt）小鼠。
注意：吸入CO2 优于颈椎脱位，因为它可避免破坏连接到DRG的脊神经。 - 将鼠标固定在板上的俯卧位置，抬起皮肤，并沿背柱切开皮肤。有关详细视频，请参阅Perner等人12。
- 切断腰骶关节，用剪刀将骶骨与腰椎分开。
- 通过在颅骨方向切割脊柱两侧的肌肉和肋骨来分离脊柱，直到到达颅底。
- 用剪刀剪掉寰枕关节处的脊柱。
- 从脊柱上去除肌肉和脂肪组织。
- 固定并打开椎柱以去除脊髓并进入DRG。在椎间孔中寻找通过背根连接到脊髓但与脑膜分离的 DRG。
- 将 DRG 收获到装有 10 mL 冰冷补充 DMEM 的 15 mL 锥形管中。
- 离心制剂（200× g，5分钟，室温）并除去上清液。
- 加入 250 μL 含有胶原酶 IV （1 mg/mL） 和分散酶 II （2.4 U/mL） 的 PBS。
- 用胶原酶IV /分散酶II（C / D）溶液（80分钟，37°C，轻度搅拌）孵育DRG。当汇集来自几只小鼠的神经节时，保持每个神经节 125 μL C/D 溶液的比例。
- 要灭活酶，请加入 5 mL 补充的 DMEM 培养基。
- 离心溶液（200× g，5分钟），并使用移液管轻轻除去上清液。
- 为避免不必要的细胞损失，留下~100μL上清液。
- 加入 1 mL 补充的 DMEM 培养基。
- 使用移液枪和三个尺寸递减的玻璃巴斯德移液器，将DRG轻轻研磨（每个巴斯德移液器尺寸~10上/下）到单细胞制剂中。
- 在生物安全柜中，将牛血清白蛋白（BSA）在无菌PBS中稀释至终浓度为15%。将1mL等分试样储存在-20°C。
- 通过添加 2 mL 无菌 PBS 并在管底部缓慢分配 1 mL 15% BSA 溶液，在 15 mL 锥形管中创建 BSA 梯度。通过轻轻取出移液器来避免破坏梯度。
- 使用 P200 移液器，将研磨的神经节悬浮液（包含神经元）缓慢移液到管的一侧进入梯度。
- 离心含有神经元的BSA梯度（200× g，12分钟，室温）。将离心机的加速和减速设置为最小速度。
注意：离心后，神经元将位于管的底部，而细胞碎片将被困在BSA梯度中。 - 使用移液管轻轻除去所有上清液。
- 将细胞重悬于500μL神经基础中。
- 板 10 每孔4 个 神经元（200 μL 神经基础/孔）在层粘连蛋白包被的平底 96 孔板中。
注意：平均而言，研究者每只小鼠将能够填充~8个孔。 - 培养神经元（37°C，过夜）以允许附着。
3. 共培养和流式细胞术
- 从神经元培养物中缓慢去除神经基底。
- 用IL-2和IL-15刺激48小时后（参见步骤1.14-1.15），重悬NK细胞并向神经元培养物（96孔平底板）中加入10个5 个NK细胞/孔。
注意：平均而言，研究者将能够为每只小鼠填充~6个孔。 - 在补充的神经基础MX（37°C，48小时）中共培养细胞。
- 收集细胞，用PBS（3x）洗涤，离心（500× g，5分钟，4°C）。
- 弃去上清液并用活力染料eFlour-780（1：1，000，15分钟，4°C）染色细胞。
- 收集细胞，用PBS（3x）洗涤，并离心（500× g，5分钟，4°C）。
- 用CD16 / 32（1：100，15分钟，4°C）阻断细胞上的非特异性位点。
- 收集细胞，用PBS（3x）洗涤并离心（500× g，5分钟，4°C）。
- 用BV421抗NK-1.1（1：100），异硫氰酸荧光素（FITC）抗NKp46（1：100）和藻红蛋白（PE）抗GM-CSF（1：100）染色（15分钟，4°C）细胞。
- 收集细胞，用PBS（3x）洗涤，离心（500× g，5分钟，4°C）。
- 弃去上清液，将细胞重悬于FACS缓冲液（500μL）中，并通过流式细胞术对NK细胞进行免疫表型分析11。有关门控策略，请参见 图1A 。
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Representative Results
从同窝对照（TRPV1wt：:D TAfl / wt）小鼠脾细胞中磁纯化NK细胞，并用IL-2和IL-15刺激（48小时）。然后将NK细胞单独培养或与从伤害感受器神经元中收获的DRG神经元共培养（同窝对照;TRPV1wt：:D TAfl/wt）或消融（TRPV1cre：:D TAfl/wt）小鼠。然后将细胞暴露于TRPV1激动剂辣椒素（1μM）或其载体中。共培养24小时后，对NK细胞进行FACS纯化，并使用流式细胞术对其活化水平进行免疫表型分析（图1A）。
当单独培养时，NK细胞表达GM-CSF和NKp46的基础水平。当与从伤害感受器完整（TRPV1wt：:D TAfl/wt）小鼠收获的DRG神经元共培养时，辣椒素刺激降低了GM-CSF的NK细胞表达。辣椒素与从伤害感受器消融（TRPV1cre：:D TAfl/wt）小鼠获得的DRG神经元共培养时，对NK细胞活化没有影响（图1A，B）。值得注意的是，使用白喉毒素A（DTA）的TRPV1cre 介导的细胞消融将消除所有TRPV1 + 神经元，肽能和非肽能（MrgD + 细胞）13，14。
图1：TRPV1+神经元控制NK细胞活化。从同窝对照（TRPV1wt：:D TAfl / wt）小鼠脾细胞中磁纯化NK细胞，并用IL-2和IL-15刺激（48小时）。然后将NK细胞单独培养或与从伤害感受器神经元中收获的DRG神经元共培养（同窝对照;TRPV1wt：:D TAfl/wt）或消融（TRPV1cre：:D TAfl/wt）小鼠。然后将细胞暴露于TRPV1激动剂辣椒素（1μM）或其载体中。共培养24小时后，对NK细胞进行FACS纯化，并使用流式细胞术（A）对其活化水平进行免疫表型分析。当单独培养时，NK细胞表达GM-CSF和NKp46的基础水平。 当NK细胞与从伤害感受器完整（TRPV1 wt：:D TAfl / wt）小鼠收获的DRG神经元共培养并用辣椒素（A，B）刺激时，GM-CSF表达降低。NKp46水平未受影响（A，B）。辣椒素与从伤害感受器消融（TRPV1cre：:D TAfl/wt）小鼠（A，B）收获的DRG神经元共培养时，对NK细胞活化没有影响。代表性的FACS图如图所示（A）。数据以平均± S.E.M （B） 表示。实验重复三次，得出相似的结论。显示测试的动物数量;n = 5个生物学重复/组（B）。P值如图所示，由单因素方差分析事后邦弗朗尼（B）确定。缩写：TRPV1=瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1;NK = 自然杀手;DTA = 白喉毒素 A;DRG = 背根神经节;FACS = 荧光激活细胞分选;GM-CSF = 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;Veh = 车辆;帽=辣椒素。请点击此处查看此图的大图。
| 溶液 | 组成 | ||
| 胶原酶/分散酶 （C/D） | 补充胶原酶（1 mg/mL）和分散酶II（2.4 U/mL）的无菌PBS | ||
| DMEM | 添加FBS（10%），青霉素（100 国际单位）和链霉素（100μg/mL）的无菌DMEM | ||
| 补充 RPMI 1640 | 无菌 RMPI 1640 补充青霉素 （100 国际单位）、链霉素 （100 μg/mL）、胎牛血清 （10%）、L-谷氨酰胺 （300 ng/mL）、小鼠重组 IL-2 （200 U/mL） 和小鼠重组 IL-15 （10 ng/mL） | ||
| 神经基础 | 补充青霉素 （100 国际单位）、链霉素 （100 微克/毫升）、L-谷氨酰胺 （200 微米）、B-27 （2%）、NGF（50 纳克/毫升）和 GDNF （2 纳克/毫升）的无菌神经基础 | ||
| 神经基底肌瘤 | 补充青霉素 （100 国际单位）、链霉素 （100 μg/mL）、L-谷氨酰胺 （200 μM）、B-27 （2%）、NGF （50 ng/mL）、GDNF （2 ng/mL）、小鼠重组 IL-2 （200 U/mL） 和小鼠重组 IL-15 （10 ng/mL） 的无菌神经基础 | ||
| FACS 分选缓冲液 | 无菌PBS补充FBS（2%）和EDTA（1mM） | ||
表1：本协议中使用的溶液和介质列表。 缩写：NGF = 神经生长因子;GDNF = 神经胶质细胞来源的神经营养因子;FBS = 胎牛血清;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。
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Discussion
Davies等人11 发现受伤的神经元上调RAE1。 通过 细胞间接触，表达NKG2D的NK细胞能够识别和消除RAE1+ 神经元，这反过来又限制了慢性疼痛11。鉴于NK细胞也表达各种神经肽受体，并且这些神经肽以其免疫调节能力而闻名，因此在 体外研究NK细胞与伤害感受器神经元之间的相互作用似乎越来越重要。在这里，我们设计了一个简单的共培养方案，允许研究人员研究神经元如何控制NK细胞功能，并反过来研究NK细胞如何调节DRG神经元的功能。流式细胞术用于免疫表型神经元如何调节NK细胞活化。或者，研究人员可以使用qPCR或RNA测序来测量FACS纯化细胞中的转录本变化，或使用ELISA分析分泌因子（如细胞因子或神经肽）的分泌。原始数据存放在 www.talbotlab.com 上并免费提供。
在这里，我们发现继发于辣椒素作用的TRPV1 + 伤害感受神经元阻断NK细胞活化（GM-CSF表达）。虽然高浓度使用的辣椒素可能会损害NK细胞功能14，但我们在实验上排除了这种可能性，因为在没有肽能神经元（TRPV1cre：:D TAfl / wt）的情况下，NK细胞活性不受辣椒素（1μM）暴露的影响。由于辣椒素导致钙内流并随后在神经肽中释放，这些数据表明NK细胞活化可能继发于神经元释放的可溶性因子的作用。因此，这种共培养方法有助于研究神经肽的释放如何调节NK细胞功能。除了可溶性因子外，两种细胞类型之间的局部细胞-细胞相互作用也可能调节其功能，这应该通过实验进行测试（例如，将条件培养基的影响与共培养的影响进行比较）。
总体而言，这种相互作用表明，在组织微环境中，NK细胞功能可能由伤害感受器神经元末端调节。这些数据强调了通过同时研究神经元和先天免疫细胞（即NK细胞）的作用来全面评估炎症反应的重要性。例如，NK细胞-神经元串扰可能在从神经损伤，组织损伤，细菌或病毒感染到恶性肿瘤的环境中发挥重要的生物学作用。未来的工作，包括使用这种共培养方法，需要评估神经元 - NK细胞相互作用对健康和疾病的影响。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了研究基金新前沿（NFRFE201901326）、加拿大卫生研究院（162211，461274，461275），加拿大创新基金会（37439），加拿大研究主席计划（950-231859），加拿大自然科学和工程研究委员会（RGPIN-2019-06824）和魁北克自然与技术研究基金会（253380）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD16/32 | Jackson Laboratory | Cat no: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Cat no: 009669 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade | World Precision Instruments | Cat no: 504167 | |
| BV421 anti-mouse NK-1.1 | Fisher Scientific | Cat no: 12430112 | |
| Cell strainer (50 μm) | Fisher Scientific | Cat no: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat no: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/fl | Fisher Scientific | Cat no: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat no: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat no: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | Sigma | Cat no: CLS2595 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | Cat no: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | Cat no: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat no: L2020 | |
| Flat bottom 96-well plate | Sigma | Cat no: 03690 | |
| Glass Pasteur pipette | Sigma | Cat no: 470236-274 | |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) | VWR | Cat no: 02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Cat no: 03-50/31 | |
| L-Glutamine | Gibco | Cat no: A14867-01 | |
| Mouse recombinant IL-15 | Gibco | Cat no: 22400-089 | |
| Mouse recombinant IL-2 | Gibco | Cat no: 21103-049 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Life Technologies | Cat no: 13257-019 | |
| Neurobasal media | PeproTech | Cat no: 450-51-10 | |
| PE anti-mouse GM-CSF | PeproTech | Cat no: 212-12 | |
| Penicillin and Streptomycin | PeproTech | Cat no: 210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | Cat no: 19855 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biolegend | Cat no: 108732 | Clone PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Cat no: 137606 | Clone 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Cat no: 505406 | Clone MP1-22E9 |
| Tweezers and dissection tools. | Biolegend | Cat no: 65-0865-14 | |
| U-Shaped-bottom 96-well plate | Biolegend | Cat no: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
References
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