Summary
I neuroni nocicettori e le cellule NK interagiscono attivamente in un contesto infiammatorio. Un approccio di co-cultura consente di studiare questa interazione.
Abstract
I neuroni somatosensoriali si sono evoluti per rilevare stimoli nocivi e attivare riflessi difensivi. Condividendo i mezzi di comunicazione, i neuroni nocicettori sintonizzano anche le difese dell'ospite controllando l'attività del sistema immunitario. La comunicazione tra questi sistemi è per lo più adattiva, contribuendo a proteggere l'omeostasi, può anche portare a, o promuovere, l'insorgenza di malattie croniche. Entrambi i sistemi si sono co-evoluti per consentire tale interazione locale, come si trova nei tessuti linfoidi primari e secondari e nelle mucose. Studi recenti hanno dimostrato che i nocicettori rilevano e rispondono direttamente agli antigeni estranei, alle citochine derivate dalle cellule immunitarie e ai microbi.
L'attivazione dei nocicettori non solo provoca ipersensibilità al dolore e prurito, ma abbassa la soglia di attivazione del nocicettore, portando al rilascio locale di neuropeptidi. I peptidi prodotti e rilasciati dai terminali periferici dei nocicettori possono bloccare la chemiotassi e la polarizzazione dei linfociti, controllando la localizzazione, la durata e il tipo di infiammazione. Prove recenti mostrano che i neuroni sensoriali interagiscono con le cellule immunitarie innate attraverso il contatto cellula-cellula, ad esempio, coinvolgendo i recettori di gruppo 2D (NKG2D) sulle cellule natural killer (NK).
Dato che le cellule NK esprimono i recettori affini per vari mediatori prodotti dai nocicettori, è concepibile che i nocicettori utilizzino neuropeptidi per controllare l'attività delle cellule NK. Qui, abbiamo ideato un metodo di co-coltura per studiare le interazioni delle cellule neuron-NK dei nocicettori in un piatto. Utilizzando questo approccio, abbiamo scoperto che i neuroni nocicettori lombari riducono l'espressione delle citochine delle cellule NK. Nel complesso, un tale metodo riduzionista potrebbe essere utile per studiare come i neuroni innervanti del tumore controllano la funzione antitumorale delle cellule NK e come le cellule NK controllano l'eliminazione dei neuroni danneggiati.
Introduction
I corpi cellulari dei neuroni sensoriali hanno origine nei gangli della radice dorsale (DRG). I DRG si trovano nel sistema nervoso periferico (PNS), tra il corno dorsale del midollo spinale e i terminali nervosi periferici. La natura pseudo-unipolare dei neuroni DRG consente il trasferimento di informazioni dal ramo periferico, che innerva il tessuto bersaglio, al ramo centrale, che trasporta le informazioni somatosensoriali al midollo spinale1. Utilizzando recettori dei canali ionici specializzati, i neuroni del primo ordine percepiscono le minacce poste da agenti patogeni, allergeni e inquinanti2, portando all'afflusso di cationi (Na+, Ca2+) e alla generazione di un potenziale d'azione 3,4,5.
Questi neuroni inviano anche il potenziale d'azione antidromica verso la periferia, dove si era verificato il rilevamento iniziale del pericolo, che porta al rilascio locale di neuropeptidi 1,4. Pertanto, i neuroni nocicettori fungono da meccanismo protettivo, avvisando l'ospite del pericolo ambientale 4,5,6,7.
Per comunicare con i neuroni di secondo ordine, i nocicettori rilasciano vari neurotrasmettitori (ad esempio, glutammato) e neuropeptidi (ad esempio, peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP), sostanza P (SP) e peptide intestinale vasoattivo (VIP)6,7. Questi peptidi agiscono sui capillari e promuovono lo stravaso plasmatico, l'edema e l'afflusso locale e la modulazione delle cellule immunitarie 2,4,7.
Il sistema somatosensoriale e immunitario utilizza un sistema di comunicazione condiviso composto da citochine e neuropeptidi e dai rispettivi recettori affini4. Mentre questa comunicazione bidirezionale aiuta a proteggere dal pericolo e preservare l'omeostasi, può anche contribuire alla fisiopatologia della malattia4.
Le cellule NK sono classificate come cellule linfoidi innate e sono specializzate per eliminare le cellule infettate viralmente. La funzione delle cellule NK è governata da un equilibrio di recettori stimolatori e inibitori, incluso il recettore attivante NKG2D8. Il ligando endogeno di NKG2D, acido retinoico inducibile precocemente1 (RAE1), è espresso da cellule sottoposte a stress come tumorigenesi e infezione 8,9.
Recenti indagini hanno dimostrato che la lesione dei nervi periferici spinge i neuroni sensoriali ad esprimere molecole disadattive come la statina 2 (STMN2) e RAE1. Pertanto, tramite il contatto cellula-cellula, le cellule NK che esprimono NKG2D sono state attivate dall'interazione con i neuroni che esprimono RAE1. A loro volta, le cellule NK sono state in grado di eliminare i neuroni nocicettori feriti e l'ipersensibilità al dolore contundente normalmente associata a lesioni nervose10. Oltre all'asse NKG2D-RAE1, le cellule NK esprimono i recettori affini per vari mediatori prodotti dai nocicettori. È quindi possibile che questi mediatori modulano l'attività delle cellule NK. Questo articolo presenta un metodo di co-coltura per studiare la biologia dell'interazione neurone-cellule NK nocicettori. Questo approccio aiuterà a far progredire la comprensione di come i neuroni nocicettori modulano le risposte delle cellule immunitarie innate a lesioni, infezioni o tumori maligni.
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Protocol
I comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali dell'Université de Montréal (# 22053, # 22054) hanno approvato tutte le procedure sugli animali. Vedere la Tabella 1 per un elenco delle soluzioni e la loro composizione e la Tabella dei materiali per un elenco dei materiali, delle attrezzature e dei reagenti utilizzati in questo protocollo.
1. Isolamento, coltura e stimolazione delle cellule NK
- Generare neuroni nocicettori intatti (controllo della cucciolata; TRPV1wt::D TA fl/wt) e topi ablati (TRPV1 cre::D TA fl/wt) incrociando topi con tossina lox-stop-lox-difterite (DTA fl/fl) con topi TRPV1cre/wt.
- Utilizzando l'inalazione di CO2, eutanasia di un topo naïve di controllo dei compagni di cucciolata (TRPV1 wt::D TAfl/wt).
- Raccogliere la milza in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml contenente 500 μL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
- Omogeneizzare la milza usando un pestello.
- Diluire le cellule con 1 mL di PBS sterile.
- Filtrare la miscela attraverso un filtro cellulare da 50 μm in un tubo conico da 15 ml.
- Ricarica il volume (10 ml) con PBS sterile.
- Raccogliere 10 μL e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Centrifugare le cellule (500 × g, 5 min) e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule ad una concentrazione di 108 cellule/ml in mezzo RPMI 1640 integrato.
- Seguire le istruzioni del produttore per purificare magneticamente le cellule NK della milza utilizzando un kit di isolamento delle cellule NK del topo. Confermare la purezza delle cellule NK utilizzando la citometria a flusso11.
- Raccogliere 10 μL e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Centrifugare le cellule (500 × g, 5 min) e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule NK in terreno di coltura RPMI 1640 integrato (contenente IL-2 e IL-15).
- Coltura 2 × 106 cellule NK/ml in una piastra inferiore a U a 96 pozzetti per 48 ore.
2. Isolamento e coltura dei neuroni DRG
- A 24 ore prima della fine della stimolazione delle cellule NK (fase 1.15), rivestire una piastra da 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto di laminina (1 ng/ml) e incubare per 45 minuti (37 °C).
- Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione e lasciare asciugare i pozzetti all'aria in un armadio di biosicurezza.
- Utilizzando l'inalazione di CO2, eutanasia neurone nocicettore intatto (controllo della cucciolata; TRPV1wt::D TA fl/wt) o ablato (TRPV1cre::D TAfl/wt) topi.
NOTA: l'inalazione di CO2 è preferibile alla lussazione cervicale in quanto evita di interrompere i nervi spinali collegati al DRG. - Fissare il mouse sulla tavola in posizione prona, sollevare la pelle e incidere la pelle lungo la colonna dorsale. Fare riferimento a Perner et al. per un video dettagliato12.
- Tagliare l'articolazione lombosacrale e separare l'osso sacro dalla colonna lombare con le forbici.
- Separare la colonna vertebrale tagliando i muscoli e le costole su entrambi i lati della colonna vertebrale nella direzione cranica fino a raggiungere la base del cranio.
- Usando le forbici, tagliare la colonna vertebrale all'articolazione atlanto-occipitale.
- Rimuovere il muscolo e il tessuto adiposo dalla colonna vertebrale.
- Pin e aprire la colonna vertebrale per rimuovere il midollo spinale e accedere al DRG. Cerca il DRG nei forami intervertebrali collegati al midollo spinale attraverso la radice dorsale ma separati dalle meningi.
- Raccogliere i DRG in un tubo conico da 15 ml riempito con 10 ml di DMEM integrato ghiacciato.
- Centrifugare il preparato (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 250 μL di PBS contenente collagenasi IV (1 mg/ml) e dispasi II (2,4 U/ml).
- Incubare il DRG con la soluzione di collagenasi IV/Dispasi II (C/D) (80 min, 37 °C, lieve agitazione). Quando si raggruppano i gangli di diversi topi, mantenere un rapporto di 125 μL di soluzione C / D per gantaglio.
- Per inattivare gli enzimi, aggiungere 5 ml di mezzo DMEM integrato.
- Centrifugare la soluzione (200 × g, 5 min) e rimuovere delicatamente il surnatante usando una pipetta.
- Per evitare perdite cellulari indesiderate, lasciare ~ 100 μL del surnatante.
- Aggiungere 1 mL di mezzo DMEM integrato.
- Utilizzando una pistola per pipette e tre pipette Pasteur in vetro di dimensioni decrescenti, triturare delicatamente (~10 su/giù per pipetta Pasteur) il DRG in una preparazione a cella singola.
- In un armadio di biosicurezza, diluire l'albumina sierica bovina (BSA) in PBS sterile fino a una concentrazione finale del 15%. Conservare 1 mL di aliquote a -20 °C.
- Creare un gradiente BSA in un tubo conico da 15 mL aggiungendo 2 mL di PBS sterile ed erogando lentamente 1 mL di soluzione BSA al 15% sul fondo del tubo. Evitare di interrompere la sfumatura rimuovendo delicatamente la pipetta.
- Utilizzando una pipetta P200, pipettare lentamente la sospensione di gangli triturati (che contiene i neuroni) sul lato del tubo nel gradiente.
- Centrifugare il gradiente BSA contenente neuroni (200 × g, 12 min, temperatura ambiente). Impostare l'accelerazione e la decelerazione della centrifuga alla velocità minima.
NOTA: Dopo la centrifugazione, i neuroni saranno sul fondo del tubo mentre i detriti cellulari saranno intrappolati nel gradiente BSA. - Rimuovere delicatamente tutto il surnatante con una pipetta.
- Risospendere le cellule in 500 μL di Neurobasale.
- Piastra 104 neuroni per pozzetto (200 μL di neurobasale/pozzetto) in una piastra a 96 pozzetti rivestita di laminina, fondo piatto.
NOTA: In media, un investigatore sarà in grado di riempire ~ 8 pozzi per topo. - Coltivare i neuroni (37 °C, durante la notte) per consentire l'attaccamento.
3. Co-coltura e citometria a flusso
- Rimuovere lentamente il neurobasale dalla coltura neuronale.
- Dopo 48 ore di stimolazione con IL-2 e IL-15 (vedere punti 1.14-1.15), risospendere le cellule NK e aggiungere 105 cellule NK/pozzetto alla coltura neuronale (piastra inferiore piatta a 96 pozzetti).
NOTA: In media, l'investigatore sarà in grado di riempire ~ 6 pozzi per topo. - Co-coltura delle cellule in MX neurobasale integrato (37 °C, 48 h).
- Raccogliere le cellule, lavare con PBS (3x) e centrifugare (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Scartare il surnatante e colorare le cellule con Viability Dye eFlour-780 (1:1.000, 15 min, 4 °C).
- Raccogliere le cellule, lavare con PBS (3x) e centrifugare (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Bloccare siti non specifici sulle cellule con CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).
- Raccogliere le celle, lavare con PBS (3x) e centrifugare (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Colorare (15 min, 4 °C) le cellule con BV421 anti-NK-1.1 (1:100), fluoresceina isotiocianato (FITC) anti-NKp46 (1:100) e ficoeritrina (PE) anti-GM-CSF (1:100).
- Raccogliere le cellule, lavare con PBS (3x) e centrifugare (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Scartare il surnatante, risospendere le cellule nel tampone FACS (500 μL) e immunofenotipo le cellule NK mediante citometria a flusso11. Vedere la Figura 1A per la strategia di gating.
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Representative Results
Le cellule NK sono state purificate magneticamente dal controllo della cucciolata (TRPV1 wt::D TAfl/wt) splenociti di topi e stimolate (48 h) con IL-2 e IL-15. Le cellule NK sono state quindi coltivate da sole o co-coltivate con neuroni DRG raccolti dal neurone nocicettore intatto (controllo della cucciolata; TRPV1wt::D TA fl/wt) o ablato (TRPV1cre::D TAfl/wt) topi. Le cellule sono state quindi esposte alla capsaicina agonista TRPV1 (1 μM) o al suo veicolo. Dopo 24 ore di co-coltura, le cellule NK sono state purificate con FACS e i loro livelli di attivazione sono stati immunofenotipizzati utilizzando la citometria a flusso (Figura 1A).
Quando coltivate da sole, le cellule NK hanno espresso livelli basali di GM-CSF e NKp46. Quando co-coltivato con neuroni DRG raccolti da nocicettori intatti (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) topi, la stimolazione della capsaicina ha diminuito l'espressione delle cellule NK di GM-CSF. La capsaicina non ha avuto alcun impatto sull'attivazione delle cellule NK quando co-coltivata con neuroni DRG raccolti da topi ablati con nocicettori (TRPV1cre::D TAfl/wt) (Figura 1A,B). Vale la pena notare che l'ablazione cellulare mediata da TRPV1cre utilizzando la tossina difterica A (DTA) eliminerà tutti i neuroni TRPV1+, peptidergici e non peptidergici (cellule MrgD+)13,14.
Figura 1: I neuroni TRPV1+ controllano l'attivazione delle cellule NK. Le cellule NK sono state purificate magneticamente dal controllo della cucciolata (TRPV1 wt::D TAfl/wt) splenociti di topi e stimolate (48 h) con IL-2 e IL-15. Le cellule NK sono state quindi coltivate da sole o co-coltivate con neuroni DRG raccolti dal neurone nocicettore intatto (controllo della cucciolata; TRPV1wt::D TA fl/wt) o ablato (TRPV1cre::D TAfl/wt) topi. Le cellule sono state quindi esposte alla capsaicina agonista TRPV1 (1 μM) o al suo veicolo. Dopo 24 ore di co-coltura, le cellule NK sono state purificate con FACS e i loro livelli di attivazione sono stati immunofenotipizzati utilizzando la citometria a flusso (A). Quando coltivate da sole, le cellule NK hanno espresso livelli basali di GM-CSF e NKp46. L'espressione di GM-CSF è diminuita quando le cellule NK sono state co-coltivate con neuroni DRG raccolti da topi nocicettori intatti (TRPV1 wt::D TAfl/wt) e stimolati con capsaicina (A,B). Il livello di NKp46 non è stato influenzato (A,B). La capsaicina non ha avuto alcun impatto sull'attivazione delle cellule NK quando co-coltivata con neuroni DRG raccolti da topi ablati con nocicettori (TRPV1cre::D TAfl/wt) (A,B). I grafici FACS rappresentativi sono mostrati (A). I dati sono presentati come media ± S.E.M (B). L'esperimento è stato ripetuto tre volte e sono state ottenute conclusioni simili. è indicato il numero di animali testati; n = 5 repliche biologiche/gruppo (B). I valori di P sono riportati in figura e determinati da un unidirezionale ANOVA post-hoc Bonferroni (B). Abbreviazioni: TRPV1 = potenziale recettore transitorio sottofamiglia V del canale cationico membro 1; NK = natural killer; DTA = tossina difterica A; DRG = ganglio della radice dorsale; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza; GM-CSF = fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi; Veh = veicolo; Cap = capsaicina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Soluzione | Composizione | ||
| Collagenasi/Dispasi (C/D) | PBS sterile integrato con collagenasi (1 mg/ml) e Dispasi II (2,4 U/mL) | ||
| DMEM · | DMEM sterile integrato con FBS (10%), penicillina (100 U.I.) e streptomicina (100 μg/ml) | ||
| RPMI 1640 integrato | RMPI 1640 sterile integrato con penicillina (100 U.I.), streptomicina (100 μg/mL), siero fetale bovino (10%), L-glutammina (300 ng/mL), topo ricombinante IL-2 (200 U/mL) e topo ricombinante IL-15 (10 ng/mL) | ||
| Neurobasale | Neurobasale sterile integrato con penicillina (100 U.I.), streptomicina (100 μg / mL), L-glutammina (200 μM), B-27 (2%), NGF (50 ng / mL) e GDNF (2 ng / mL) | ||
| MX neurobasale | Neurobasale sterile integrato con penicillina (100 U.I.), streptomicina (100 μg/mL), L-glutammina (200 μM), B-27 (2%), NGF (50 ng/mL), GDNF (2 ng/mL), topo ricombinante IL-2 (200 U/mL) e topo ricombinante IL-15 (10 ng/mL) | ||
| Buffer di ordinamento FACS | PBS sterile integrato con FBS (2%) ed EDTA (1 mM) | ||
Tabella 1: Elenco delle soluzioni e dei supporti utilizzati in questo protocollo. Abbreviazioni: NGF = fattore di crescita nervoso; GDNF = fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali; FBS = siero fetale bovino; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato.
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Discussion
Davies et al.11 hanno scoperto che i neuroni feriti sovraregolano RAE1. Attraverso il contatto cellula-cellula, le cellule NK che esprimono NKG2D sono state quindi in grado di identificare ed eliminare i neuroni RAE1+ , che a loro volta limitano il dolore cronico11. Dato che le cellule NK esprimono anche vari recettori neuropeptidici e che questi neuropeptidi sono noti per le loro capacità immunomodulatorie, appare sempre più importante studiare l'interazione tra cellule NK e neuroni nocicettori in vitro. Qui abbiamo ideato un semplice protocollo di co-coltura che consente ai ricercatori di studiare come i neuroni controllano la funzione delle cellule NK e, reciprocamente, come le cellule NK potrebbero modulare la funzione dei neuroni DRG. La citometria a flusso è stata utilizzata per immunofenotipare il modo in cui i neuroni modulano l'attivazione delle cellule NK. In alternativa, i ricercatori potrebbero utilizzare qPCR o sequenziamento dell'RNA per misurare i cambiamenti di trascrizione nelle cellule purificate FACS o analizzare la secrezione di fattori secreti, come citochine o neuropeptidi, utilizzando ELISA. I dati grezzi sono depositati e liberamente disponibili su www.talbotlab.com.
Qui abbiamo scoperto che i neuroni nocicettori TRPV1+ , secondari all'azione della capsaicina, bloccano l'attivazione delle cellule NK (espressione GM-CSF). Mentre la capsaicina utilizzata ad alta concentrazione può compromettere le funzioni delle cellule NK14, abbiamo escluso sperimentalmente questa possibilità poiché l'attività delle cellule NK non è stata influenzata dall'esposizione alla capsaicina (1 μM) in assenza di neuroni peptidergici (TRPV1cre: :D TAfl / wt). Poiché la capsaicina porta all'afflusso di calcio e al loro successivo rilascio nei neuropeptidi, questi dati suggeriscono che l'attivazione delle cellule NK è quindi probabilmente secondaria all'azione dei fattori solubili rilasciati dai neuroni. Pertanto, tale approccio di co-coltura è stato utile per studiare come il rilascio di neuropeptidi possa modulare la funzione delle cellule NK. Oltre ai fattori solubili, è probabile che anche le interazioni cellula-cellula locali tra i due tipi cellulari modulano le loro funzioni, qualcosa che dovrebbe essere testato sperimentalmente (ad esempio, confrontando l'impatto del mezzo condizionato con quello della co-coltura).
Nel complesso, tale interazione suggerisce che all'interno del microambiente tissutale, la funzione delle cellule NK è probabilmente sintonizzata dai terminali neuronali dei nocicettori. Questi dati sottolineano l'importanza di valutare le risposte infiammatorie in modo olistico studiando simultaneamente il ruolo dei neuroni e delle cellule immunitarie innate (cioè le cellule NK). Ad esempio, la diafonia cellula-neurone NK probabilmente svolge un importante ruolo biologico in contesti che vanno da lesioni nervose, lesioni tissutali, infezioni batteriche o virali a tumori maligni. Sono necessari lavori futuri, compreso l'uso di questo metodo di co-coltura, per valutare l'impatto dell'interazione tra cellule neuron-NK nella salute e nella malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), Canadian Institutes of Health Research (162211, 461274, 461275), Canadian Foundation for Innovation (37439), Canada Research Chair program (950-231859), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06824) e Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD16/32 | Jackson Laboratory | Cat no: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Cat no: 009669 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade | World Precision Instruments | Cat no: 504167 | |
| BV421 anti-mouse NK-1.1 | Fisher Scientific | Cat no: 12430112 | |
| Cell strainer (50 μm) | Fisher Scientific | Cat no: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat no: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/fl | Fisher Scientific | Cat no: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat no: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat no: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | Sigma | Cat no: CLS2595 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | Cat no: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | Cat no: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat no: L2020 | |
| Flat bottom 96-well plate | Sigma | Cat no: 03690 | |
| Glass Pasteur pipette | Sigma | Cat no: 470236-274 | |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) | VWR | Cat no: 02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Cat no: 03-50/31 | |
| L-Glutamine | Gibco | Cat no: A14867-01 | |
| Mouse recombinant IL-15 | Gibco | Cat no: 22400-089 | |
| Mouse recombinant IL-2 | Gibco | Cat no: 21103-049 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Life Technologies | Cat no: 13257-019 | |
| Neurobasal media | PeproTech | Cat no: 450-51-10 | |
| PE anti-mouse GM-CSF | PeproTech | Cat no: 212-12 | |
| Penicillin and Streptomycin | PeproTech | Cat no: 210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | Cat no: 19855 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biolegend | Cat no: 108732 | Clone PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Cat no: 137606 | Clone 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Cat no: 505406 | Clone MP1-22E9 |
| Tweezers and dissection tools. | Biolegend | Cat no: 65-0865-14 | |
| U-Shaped-bottom 96-well plate | Biolegend | Cat no: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
References
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