Summary
Las neuronas nociceptoras y las células NK interactúan activamente en un contexto inflamatorio. Un enfoque de co-cultura permite estudiar esta interacción.
Abstract
Las neuronas somatosensoriales han evolucionado para detectar estímulos nocivos y activar reflejos defensivos. Al compartir medios de comunicación, las neuronas nociceptoras también sintonizan las defensas del huésped al controlar la actividad del sistema inmunológico. La comunicación entre estos sistemas es principalmente adaptativa, ayudando a proteger la homeostasis, también puede conducir a, o promover, la aparición de enfermedades crónicas. Ambos sistemas coevolucionaron para permitir dicha interacción local, como se encuentra en los tejidos linfoides primarios y secundarios y la mucosa. Estudios recientes han demostrado que los nociceptores detectan y responden directamente a antígenos extraños, citoquinas derivadas de células inmunes y microbios.
La activación de los nociceptores no solo produce hipersensibilidad al dolor y picazón, sino que también reduce el umbral de disparo del nociceptor, lo que lleva a la liberación local de neuropéptidos. Los péptidos que son producidos por, y liberados de, los terminales periféricos de los nociceptores pueden bloquear la quimiotaxis y la polarización de los linfocitos, controlando la localización, la duración y el tipo de inflamación. La evidencia reciente muestra que las neuronas sensoriales interactúan con las células inmunes innatas a través del contacto célula-célula, por ejemplo, involucrando receptores del grupo 2D (NKG2D) en células asesinas naturales (NK).
Dado que las células NK expresan los receptores afines para varios mediadores producidos por nociceptores, es concebible que los nociceptores utilicen neuropéptidos para controlar la actividad de las células NK. Aquí, ideamos un método de cocultivo para estudiar las interacciones neuronal-célula NK nociceptor en un plato. Usando este enfoque, encontramos que las neuronas nociceptoras lumbares disminuyen la expresión de citoquinas de las células NK. En general, tal método reduccionista podría ser útil para estudiar cómo las neuronas inervantes de tumores controlan la función anticancerígena de las células NK y cómo las células NK controlan la eliminación de las neuronas lesionadas.
Introduction
Los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales se originan en los ganglios de la raíz dorsal (DRG). Los DRG se encuentran en el sistema nervioso periférico (SNP), entre el asta dorsal de la médula espinal y las terminales nerviosas periféricas. La naturaleza pseudo-unipolar de las neuronas DRG permite la transferencia de información de la rama periférica, que inerva el tejido diana, a la rama central, que lleva la información somatosensorial a la médula espinal1. Utilizando receptores de canales iónicos especializados, las neuronas de primer orden detectan las amenazas planteadas por patógenos, alérgenos y contaminantes2, lo que lleva a la afluencia de cationes (Na+,Ca2+) y a la generación de un potencial de acción 3,4,5.
Estas neuronas también envían potencial de acción antidrómica hacia la periferia, donde se había producido la detección inicial del peligro, lo que conduce a la liberación local de neuropéptidos 1,4. Por lo tanto, las neuronas nociceptoras sirven como un mecanismo de protección, alertando al huésped sobre el peligro ambiental 4,5,6,7.
Para comunicarse con las neuronas de segundo orden, los nociceptores liberan varios neurotransmisores (por ejemplo, glutamato) y neuropéptidos (por ejemplo, péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), sustancia P (SP) y péptido intestinal vasoactivo (VIP))6,7. Estos péptidos actúan sobre los capilares y promueven la extravasación plasmática, el edema y la afluencia local y la modulación de las células inmunes 2,4,7.
Los sistemas somatosensorial e inmune utilizan un sistema de comunicación compartido compuesto de citoquinas y neuropéptidos, y sus respectivos receptores afines4. Si bien esta comunicación bidireccional ayuda a proteger del peligro y preservar la homeostasis, también puede contribuir a la fisiopatología de la enfermedad4.
Las células NK se clasifican como células linfoides innatas y están especializadas para eliminar las células infectadas por virus. La función de las células NK está gobernada por un equilibrio de receptores estimulantes e inhibitorios, incluido el receptor activador NKG2D8. El ligando endógeno de NKG2D, ácido retinoico inducible temprano1 (RAE1), es expresado por células sometidas a estrés como tumorigénesis e infección 8,9.
Investigaciones recientes han demostrado que la lesión de los nervios periféricos impulsa a las neuronas sensoriales a expresar moléculas desadaptativas como la estatina 2 (STMN2) y la RAE1. Por lo tanto, a través del contacto célula-célula, las células NK que expresan NKG2D se activaron mediante la interacción con las neuronas que expresan RAE1. A su vez, las células NK fueron capaces de eliminar las neuronas nociceptoras lesionadas y la hipersensibilidad al dolor contundente normalmente asociada con la lesión nerviosa10. Además del eje NKG2D-RAE1, las células NK expresan los receptores afines para varios mediadores producidos por nociceptores. Por lo tanto, es posible que estos mediadores modulen la actividad de las células NK. Este artículo presenta un método de cocultivo para investigar la biología de la interacción neurona-célula NK nociceptora. Este enfoque ayudará a avanzar en la comprensión de cómo las neuronas nociceptoras modulan las respuestas inmunitarias innatas de las células a lesiones, infecciones o neoplasias malignas.
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Protocol
Los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Montreal (#22053, #22054) aprobaron todos los procedimientos con animales. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de soluciones y su composición y la Tabla de materiales para obtener una lista de materiales , equipos y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Aislamiento, cultivo y estimulación de células NK
- Generar neurona nociceptora intacta (control de camada; Ratones TRPV1 wt::D TA fl/wt) y ablacionados (TRPV1 cre::D TA fl/wt) cruzando ratones con toxina lox-stop-lox-diftérica (DTA fl/fl) con ratones TRPV1 cre/wt.
- Usando la inhalación deCO2, eutanasia a un ratón de control de compañero de camada ingenuo (TRPV1 wt: :D TAfl / wt).
- Recoger el bazo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 500 μL de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).
- Homogeneizar el bazo con un mortero.
- Diluir las células con 1 ml de PBS estéril.
- Filtrar la mezcla a través de un filtro celular de 50 μm en un tubo cónico de 15 ml.
- Rellene el volumen (10 ml) con PBS estéril.
- Recoja 10 μL y cuente las células con un hemocitómetro.
- Centrifugar las células (500 × g, 5 min) y retirar el sobrenadante.
- Resuspender las células a una concentración de 108 células/ml en medio suplementado RPMI 1640.
- Siga las instrucciones del fabricante para purificar magnéticamente las células NK del bazo utilizando un kit de aislamiento de células NK de ratón. Confirmar la pureza de las células NK mediante citometría de flujo11.
- Recoja 10 μL y cuente las células con un hemocitómetro.
- Centrifugar las células (500 × g, 5 min) y retirar el sobrenadante.
- Resuspender las células NK en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado (que contiene IL-2 e IL-15).
- Cultivo 2 × 106 células NK/ml en una placa de fondo en U de 96 pocillos durante 48 h.
2. Aislamiento y cultivo de neuronas DRG
- A las 24 h anteriores al final de la estimulación de células NK (paso 1.15), cubrir una placa de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de laminina (1 ng/ml) e incubar durante 45 min (37 °C).
- Después de la incubación, retire la solución y deje que los pocillos se sequen al aire en un gabinete de bioseguridad.
- Usando la inhalación deCO2, eutanasia la neurona nociceptora intacta (control de compañero de camada; TRPV1wt::D TA fl/wt) o ratones ablacionados (TRPV1cre::D TAfl/wt).
NOTA: La inhalación deCO2 es preferible a la dislocación cervical, ya que evita alterar los nervios espinales conectados a la DRG. - Asegure el mouse en la tabla en posición prona, levante la piel e incise la piel a lo largo de la columna dorsal. Consulte Perner et al. para un video detallado12.
- Cortar la articulación lumbosacra y separar el sacro de la columna lumbar con tijeras.
- Separe la columna vertebral cortando los músculos y las costillas a ambos lados de la columna vertebral en la dirección craneal hasta que se alcance la base del cráneo.
- Usando tijeras, corte la columna vertebral en la articulación atlanto-occipital.
- Eliminar el músculo y el tejido graso de la columna vertebral.
- Fije y abra la columna vertebral para extirpar la médula espinal y obtener acceso al DRG. Busque el DRG en los agujeros intervertebrales conectados a la médula espinal a través de la raíz dorsal pero separados de las meninges.
- Coseche los DRG en un tubo cónico de 15 ml lleno de 10 ml de DMEM suplementado con hielo frío.
- Centrifugar la preparación (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) y retirar el sobrenadante.
- Añadir 250 μL de PBS que contiene colagenasa IV (1 mg/ml) y dispasa II (2,4 U/ml).
- Incubar el DRG con solución de colagenasa IV/Dispasa II (C/D) (80 min, 37 °C, agitación leve). Al agrupar ganglios de varios ratones, mantener una proporción de 125 μL de solución C / D por ganglio.
- Para inactivar las enzimas, agregue 5 ml de medio DMEM suplementado.
- Centrifugar la solución (200 × g, 5 min) y retirar suavemente el sobrenadante con una pipeta.
- Para evitar la pérdida celular no deseada, deje ~ 100 μL del sobrenadante.
- Agregue 1 ml de medio DMEM suplementado.
- Con una pistola de pipeta y tres pipetas Pasteur de vidrio de tamaños decrecientes, triture suavemente (~10 arriba/abajo por tamaño de pipeta Pasteur) el DRG en una preparación de una sola celda.
- En un gabinete de bioseguridad, diluir la albúmina sérica bovina (BSA) en PBS estéril hasta una concentración final del 15%. Conservar 1 ml de alícuotas a −20 °C.
- Cree un gradiente de BSA en un tubo cónico de 15 ml agregando 2 ml de PBS estéril y dispensando lentamente 1 ml de solución de BSA al 15% en la parte inferior del tubo. Evite interrumpir el gradiente retirando suavemente la pipeta.
- Con una pipeta P200, pipetea lentamente la suspensión de ganglios triturados (que contiene las neuronas) hacia el lado del tubo en el gradiente.
- Centrifugar el gradiente BSA que contiene neuronas (200 × g, 12 min, temperatura ambiente). Ajuste la aceleración y desaceleración de la centrífuga a la velocidad mínima.
NOTA: Después de la centrifugación, las neuronas estarán en la parte inferior del tubo, mientras que los restos celulares quedarán atrapados en el gradiente BSA. - Retire suavemente todo el sobrenadante con una pipeta.
- Resuspender las células en 500 μL de Neurobasal.
- Placa 104 neuronas por pocillo (200 μL de neurobasal/pocillo) en una placa de 96 pocillos de fondo plano recubierta de laminina.
NOTA: En promedio, un investigador podrá llenar ~ 8 pocillos por ratón. - Cultivar las neuronas (37 °C, durante la noche) para permitir la unión.
3. Cocultivo y citometría de flujo
- Retire lentamente el neurobasal del cultivo neuronal.
- Después de 48 h de estimulación con IL-2 e IL-15 (ver pasos 1.14-1.15), resuspender las células NK y añadir 105 células NK/pocillo al cultivo neuronal (placa inferior plana de 96 pocillos).
NOTA: En promedio, el investigador podrá llenar ~ 6 pocillos por ratón. - Cocultivo de las células en MX neurobasal suplementado (37 °C, 48 h).
- Recoger las celdas, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Desechar el sobrenadante y teñir las células con Viability Dye eFlour-780 (1:1.000, 15 min, 4 °C).
- Recoger las células, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Bloquear sitios inespecíficos en las células con CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).
- Recoger las células, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Tinción (15 min, 4 °C) de las células con BV421 anti-NK-1.1 (1:100), isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-NKp46 (1:100) y ficoeritrina (PE) anti-GM-CSF (1:100).
- Recoger las células, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Desechar el sobrenadante, resuspender las células en tampón FACS (500 μL) e inmunofenotipar las células NK mediante citometría de flujo11. Consulte la Figura 1A para conocer la estrategia de acceso.
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Representative Results
Las células NK se purificaron magnéticamente a partir de esplenocitos de ratones de control de camada (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) y estimulados (48 h) con IL-2 e IL-15. Las células NK se cultivaron solas o cocultivadas con neuronas DRG recolectadas de la neurona nociceptora intacta (control de compañero de camada; TRPV1wt::D TA fl/wt) o ratones ablacionados (TRPV1cre::D TAfl/wt). Luego, las células se expusieron al agonista capsaicina TRPV1 (1 μM) o su vehículo. Después de 24 h de cocultivo, las células NK fueron purificadas por FACS y sus niveles de activación fueron inmunofenotipados mediante citometría de flujo (Figura 1A).
Cuando se cultivaron solas, las células NK expresaron niveles basales de GM-CSF y NKp46. Cuando se co-cultivó con neuronas DRG recolectadas de ratones nociceptores intactos (TRPV1 wt: :D TAfl / wt), la estimulación con capsaicina disminuyó la expresión de células NK de GM-CSF. La capsaicina no tuvo impacto en la activación de las células NK cuando se cocultivó con neuronas DRG cosechadas de ratones nociceptores ablacionados (TRPV1cre: :D TAfl / wt) (Figura 1A, B). Vale la pena señalar que la ablación celular mediada por TRPV1cre utilizando toxina diftérica A (DTA) eliminará todas las neuronas TRPV1+, peptidérgicas y no peptidérgicas por igual (células MrgD+)13,14.
Figura 1: Las neuronas TRPV1+ controlan la activación de las células NK. Las células NK se purificaron magnéticamente a partir de esplenocitos de ratones de control de camada (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) y estimulados (48 h) con IL-2 e IL-15. Las células NK se cultivaron solas o cocultivadas con neuronas DRG recolectadas de la neurona nociceptora intacta (control de compañero de camada; TRPV1wt::D TA fl/wt) o ratones ablacionados (TRPV1cre::D TAfl/wt). Luego, las células se expusieron al agonista capsaicina TRPV1 (1 μM) o su vehículo. Después de 24 h de cocultivo, las células NK fueron purificadas por FACS y sus niveles de activación fueron inmunofenotipados mediante citometría de flujo (A). Cuando se cultivaron solas, las células NK expresaron niveles basales de GM-CSF y NKp46. La expresión de GM-CSF disminuyó cuando las células NK se cocultivaron con neuronas DRG recolectadas de ratones nociceptores intactos (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) y estimulados con capsaicina (A, B). El nivel de NKp46 no se vio afectado (A, B). La capsaicina no tuvo impacto en la activación de las células NK cuando se cocultivó con neuronas DRG cosechadas de ratones ablacionados con nociceptores (TRPV1cre: :D TAfl / wt) (A, B). Se muestran los diagramas representativos del sistema de control de los bienes sobre el terreno (A). Los datos se presentan como media ± S.E.M (B). El experimento se repitió tres veces y se obtuvieron conclusiones similares. Se muestra el número de animales sometidos a ensayo; n = 5 réplicas biológicas/grupo (B). Los valores de p se muestran en la figura y se determinan mediante un ANOVA unidireccional post-hoc Bonferroni (B). Abreviaturas: TRPV1 = receptor transitorio potencial catiónico subfamilia V miembro 1; NK = asesino natural; DTA = toxina diftérica A; DRG = ganglio de la raíz dorsal; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; GM-CSF = factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; Veh = vehículo; Cap = capsaicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Composición | ||
| Colagenasa/Dispasa (C/D) | PBS estéril suplementado con colagenasa (1 mg/ml) y dispasa II (2,4 U/ml) | ||
| DMEM | DMEM estéril suplementado con FBS (10%), penicilina (100 UI) y estreptomicina (100 μg/ml) | ||
| RPMI 1640 suplementado | RMPI estéril 1640 suplementado con penicilina (100 UI), estreptomicina (100 μg/ml), suero fetal bovino (10%), L-glutamina (300 ng/ml), IL-2 recombinante de ratón (200 U/ml) e IL-15 recombinante de ratón (10 ng/ml) | ||
| Neurobasal | Neurobasal estéril suplementado con penicilina (100 UI), estreptomicina (100 μg/ml), L-glutamina (200 μM), B-27 (2%), NGF (50 ng/ml) y GDNF (2 ng/ml) | ||
| Neurobasal MX | Neurobasal estéril suplementado con penicilina (100 UI), estreptomicina (100 μg/ml), L-glutamina (200 μM), B-27 (2%), NGF (50 ng/ml), GDNF (2 ng/ml), IL-2 recombinante de ratón (200 U/mL) e IL-15 recombinante de ratón (10 ng/mL) | ||
| Búfer de clasificación FACS | PBS estéril suplementado con FBS (2%) y EDTA (1 mM) | ||
Tabla 1: Lista de soluciones y medios utilizados en este protocolo. Abreviaturas: NGF = factor de crecimiento nervioso; GDNF = factor neurotrófico derivado de células gliales; FBS = suero fetal bovino; PBS = solución salina tamponada con fosfato.
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Discussion
Davies et al.11 encontraron que las neuronas lesionadas regulan al alza la RAE1. A través del contacto célula-célula, las células NK que expresan NKG2D fueron capaces de identificar y eliminar las neuronas RAE1+ , que a su vez limitan el dolor crónico11. Dado que las células NK también expresan varios receptores de neuropéptidos, y que esos neuropéptidos son conocidos por sus capacidades inmunomoduladoras, parece cada vez más importante estudiar la interacción entre las células NK y las neuronas nociceptoras in vitro. Aquí ideamos un protocolo simple de cocultivo que permite a los investigadores estudiar cómo las neuronas controlan la función de las células NK y, recíprocamente, cómo las células NK podrían modular la función de las neuronas DRG. La citometría de flujo se utilizó para inmunofenotipar cómo las neuronas modulan la activación de las células NK. Alternativamente, los investigadores podrían usar qPCR o secuenciación de ARN para medir los cambios de transcripción en células purificadas por FACS o analizar la secreción de factores secretados, como citoquinas o neuropéptidos, utilizando ELISA. Los datos brutos se depositan y están disponibles gratuitamente en www.talbotlab.com.
Aquí encontramos que las neuronas nociceptoras TRPV1+ , secundarias a la acción de la capsaicina, bloquean la activación de las células NK (expresión de GM-CSF). Si bien la capsaicina utilizada en una alta concentración puede afectar las funciones de las células NK14, descartamos esta posibilidad experimentalmente ya que la actividad de las células NK no se vio afectada por la exposición a la capsaicina (1 μM) en ausencia de neuronas peptidérgicas (TRPV1cre: :D TAfl / wt). Como la capsaicina conduce a la afluencia de calcio y su posterior liberación en neuropéptidos, estos datos sugieren que la activación de las células NK es, por lo tanto, probablemente secundaria a la acción de los factores solubles liberados por las neuronas. Por lo tanto, este enfoque de cocultivo fue útil para estudiar cómo la liberación de neuropéptidos puede modular la función de las células NK. Además de los factores solubles, las interacciones celular-célula locales entre los dos tipos de células también es probable que modulen sus funciones, algo que debe probarse experimentalmente (por ejemplo, comparando el impacto del medio condicionado con el del cocultivo).
En general, tal interacción sugiere que dentro del microambiente tisular, la función de las células NK probablemente esté sintonizada por los terminales de las neuronas nociceptoras. Estos datos enfatizan la importancia de evaluar las respuestas inflamatorias de manera integral mediante el estudio simultáneo del papel de las neuronas y las células inmunes innatas (es decir, las células NK). Por ejemplo, la diafonía entre células NK y neuronas probablemente desempeña un papel biológico importante en contextos que abarcan desde lesiones nerviosas, lesiones tisulares, infecciones bacterianas o virales hasta neoplasias malignas. Se necesita trabajo futuro, incluido el uso de este método de cocultivo, para evaluar el impacto de la interacción neurona-célula NK en la salud y la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (162211, 461274, 461275), la Fundación Canadiense para la Innovación (37439), el programa de la Cátedra de Investigación de Canadá (950-231859), el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (RGPIN-2019-06824) y el Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD16/32 | Jackson Laboratory | Cat no: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Cat no: 009669 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade | World Precision Instruments | Cat no: 504167 | |
| BV421 anti-mouse NK-1.1 | Fisher Scientific | Cat no: 12430112 | |
| Cell strainer (50 μm) | Fisher Scientific | Cat no: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat no: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/fl | Fisher Scientific | Cat no: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat no: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat no: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | Sigma | Cat no: CLS2595 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | Cat no: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | Cat no: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat no: L2020 | |
| Flat bottom 96-well plate | Sigma | Cat no: 03690 | |
| Glass Pasteur pipette | Sigma | Cat no: 470236-274 | |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) | VWR | Cat no: 02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Cat no: 03-50/31 | |
| L-Glutamine | Gibco | Cat no: A14867-01 | |
| Mouse recombinant IL-15 | Gibco | Cat no: 22400-089 | |
| Mouse recombinant IL-2 | Gibco | Cat no: 21103-049 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Life Technologies | Cat no: 13257-019 | |
| Neurobasal media | PeproTech | Cat no: 450-51-10 | |
| PE anti-mouse GM-CSF | PeproTech | Cat no: 212-12 | |
| Penicillin and Streptomycin | PeproTech | Cat no: 210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | Cat no: 19855 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biolegend | Cat no: 108732 | Clone PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Cat no: 137606 | Clone 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Cat no: 505406 | Clone MP1-22E9 |
| Tweezers and dissection tools. | Biolegend | Cat no: 65-0865-14 | |
| U-Shaped-bottom 96-well plate | Biolegend | Cat no: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
References
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