Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Интравитреальные инъекции в ячий глаз

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/63823
Automatic Translation
1, 1
1Faculty of Agriculture and Life Sciences, Lincoln University

Summary

Интравитреальные инъекции проводились в овечий глаз с целью доставки вирусно-опосредованной генной терапии к сетчатке.

Abstract

Существует несколько методов доставки терапевтических средств к сетчатке, включая интравитреальное (IVT), субретинальное, супрахориоидальное, периокулярное или местное введение. Доставка препарата IVT включает инъекцию в стекловидное тело глаза, желатиновое вещество, которое заполняет заднюю камеру глаза и поддерживает форму глазного шара. Хотя путь IVT менее специфичен, чем субретинальная доставка, он гораздо менее инвазивный и широко используется в клинических условиях для ряда глазных заболеваний.

Ранее мы продемонстрировали эффективность интравитреальной доставки продукта генной терапии, опосредованного аденоассоциированным вирусом (AAV) (AAV9. CLN5) у овец с естественной формой CLN5 нейронального цероидного липофусциноза (NCL). Пораженные овцы получали генную терапию IVT в одном глазу, а другой необработанный глаз служил внутренним контролем. Структура и функция сетчатки сохранялись в обработанном глазу в течение 15 месяцев после лечения, в то время как необработанный глаз демонстрировал прогрессирующее снижение функции и тяжелую атрофию во время патологоанатомического исследования. Основываясь на исследованиях на овцах, продукт генной терапии CLN5 был одобрен в качестве кандидата в исследуемые новые препараты (IND) Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США в сентябре 2021 года. В этой статье подробно описывается хирургический протокол доставки IVT терапевтического вирусного вектора в овечий глаз.

Introduction

Несколько методов могут быть использованы для доставки терапевтических агентов к сетчатке, включая интравитреальное (IVT), субретинальное, супрахороидальное, периокулярное или местное введение. Каждый путь введения включает преодоление барьеров, таких как барьер крови-сетчатки или внутренняя и внешняя ограничивающие мембраны, и имеет различные показатели эффективности в зависимости от доставляемого препарата и конкретной мишенисетчатки 1,2.

Доставка препарата IVT включает инъекцию в стекловидное тело глаза, студенистое вещество, которое занимает заднюю камеру глаза. Основная функция стекловидного тела заключается в поддержании формы глазного шара и удержании глазных тканей, таких как хрусталик и сетчатка, на месте. Стекловидное тело состоит в основном из воды, с небольшим количеством коллагена, гиалуроновой кислоты и других неколлагеновых белков3. Инъекция IVT является простой и распространенной процедурой, обычно используемой для лечения широкого спектра глазных состояний, включая возрастную макулярную дегенерацию, диабетический макулярный отек, диабетическую ретинопатию, окклюзию вен сетчатки и несколько наследственных дистрофий сетчатки 4,5.

Нейрональные цероидные липофусцинозы (NCL; Болезнь Баттена) представляют собой группу смертельных лизосомальных заболеваний хранения, которые вызывают тяжелую дегенерацию мозга и сетчатки. В настоящее время известно 13 вариантов NCL, возникающих в результате мутаций в различных генах (CLN1-8, CLN10-14), которые преимущественно поражают детей, но имеют различный возраст начала и тяжесть заболевания6. НКЛ имеют общие прогрессирующие симптомы, включая когнитивное и двигательное снижение, судороги и потерю зрения. Не существует лекарства от NCL; тем не менее, ферментозаместительная терапия, направленная на мозг, в настоящее время находится в клинических испытаниях для болезни CLN2 7,8, а генная терапия, опосредованная AAV, показала большие перспективы в доклинических исследованиях, а клиническое испытание генной терапии CLN5, как ожидается, начнется в 2022 году 9,10.

Многие другие виды развивают естественные формы NCL, включая кошек, собак, овец и коров. Две модели NCL овец в настоящее время активно изучаются в Новой Зеландии: модель болезни CLN5 у овец Бордердейла и модель болезни CLN6 у овец Южного Гемпшира. Пораженные овцы проявляют многие клинические и патологические особенности заболевания человека, включая атрофию сетчатки и потерю зрения10,11. Хотя генная терапия CLN5, направленная на мозг, у овец с болезнью CLN5 может предотвратить или остановить атрофию мозга и клиническое снижение, обработанные овцы все еще теряют зрение9. Это подчеркнуло необходимость лечения сетчатки для сохранения зрения и поддержания лучшего качества жизни, что привело к созданию протокола для глазной генной терапии у овец.

Овечий глаз представляет собой хорошую модель человеческого глаза из-за его сходства в размерах глазного шара, объеме стекловидного тела иструктуре сетчатки 10,12,13. В этой статье подробно описывается хирургический протокол доставки IVT небольшого объема (≤100 мкл) терапевтического вирусного вектора в овечий глаз.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные протоколы были одобрены комитетом по этике животных Университета Линкольна и соответствуют руководящим принципам Национального института здравоохранения США по уходу и использованию животных в исследованиях и Закону о благополучии животных Новой Зеландии (1999). Овцы Бордердейл были диагностированы при рождении14 лет и содержались на исследовательских фермах Университета Линкольна. Три 3-месячных гомозиготных (CLN5-/-) овца получили одну инъекцию IVT в левый глаз, причем необработанный правый глаз действовал как внутренний контроль. Данные электроретинографии и патологии сравнивались с историческими здоровыми и пораженными контрольными данными. Вирусный вектор, использованный в этом исследовании, представлял собой самокомплементарный аденоассоциированный вирус серотипа 9, содержащий промотор бета-действия курицы (CBh) и оптимизированную для кодона овец CLN5 (scAAV9/CBh-oCLN5opt). Вирусный вектор был предоставлен Университетом Северной Каролины Vector Core, NC, США.

1. Предоперационная работа

  1. Автоклав хирургического набора (рисунок 1).
  2. Голодайте овец в течение 24 ч перед операцией.
  3. Записывайте живой вес перед операцией.

Figure 1
Рисунок 1: Комплект для интравитреальной хирургии. Инструменты, необходимые для операции IVT, включают (1) зеркало для удержания век открытыми и (2) пару изогнутых щипцов для захвата бульбарной конъюнктивы и вращения глаза. (3) Гемостат прямого носа также включен в качестве альтернативного инструмента для захвата бульбарной конъюнктивы и удержания глаза на месте, если он откатился обратно на глазную орбиту. Этот набор автоклавируется перед операцией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Хирургическая процедура

  1. Сдерживайте животное и с помощью электронных кусачек сбривайте шерсть с одной стороны шеи над яремной веной.
  2. Закупорите яремную вену, оказав давление на основание яремной бороздки и визуализируйте приподнятую вену.
  3. Вытяните соответствующее количество диазепама (0,3 мг/кг) и кетамина (7,5 мг/кг) в стерильный шприц и приложите стерильную иглу весом 20 г. Вставьте иглу в яремную вену и осторожно потяните обратно на поршень, чтобы убедиться, что кровь поступает в концентратор, а игла находится внутри вены. После подтверждения индуцируют путем внутривенного (яремного) введения.
  4. Сразу после индукции поместите животное в спинное лежание, вытяните шею и держите язык вверх и вперед, используя ларингоскоп для визуализации гортани. Выполните эндотрахеальную интубацию, аккуратно вставив эндотрахеальную трубку (размер 6,0-9,0 в зависимости от размера овцы) между голосовыми связками, когда животное выдыхает. Немедленно надуйте эндотрахеальную манжету и закрепите трубку завязкой вокруг нижней челюсти. Подтвердите поток воздуха через трубку.
  5. Переложите овцу на хирургический стол и поместите ее в боковое отделение.
  6. Немедленно подключите эндотрахеальную трубку к шлангам анестезиологического аппарата для доставки изофлурана в 100% кислороде. Первоначально начинают с 3%-4% изофлурана, а затем уменьшают до 2%-3% для поддержания. Наблюдайте за спонтанной вентиляцией овец.
  7. Мониторинг частоты сердечных сокращений (пульса), частоты дыхания, насыщения кислородом, конечных приливных уровней CO2 и ректальной температуры тела на протяжении всей процедуры. Физиологические значения этих параметров у обезболенных овец (переменные, но используются в качестве ориентира) см. в таблице 1 .
  8. Поместите большую, стерильную, квадратную драпировку на хирургическую операционную тележку, а затем стерильные инструменты.
  9. Поместите стерильную, фенестрированную хирургическую драпировку над глазом для инъекции.
  10. Асептически дезинфицировать глаза с помощью стерильного шприца объемом 20 мл для орошения глаз 1-5% раствором повидона-йода.
  11. Нанесите 1-2 капли Alcaine 0,5% W/V офтальмологического раствора, в качестве местного анестетика, на глаза.
  12. Поднесите зеркало глаза Nopa Barraquer-Colibri (10 мм) к векам, чтобы держать глаза открытыми.
  13. Захватите бульбарную конъюнктиву на дорсолатеральном аспекте глаза щипцами и вращайте глазной шар вентромедиально.
Сознательный Под наркозом Рекомендуемая критическая точка вмешательства
Частота сердечных сокращений (уд/мин) от 50-80 (отдых) до 280 (активный) 50-80 <50, >100
Частота дыхания (вдох/мин) 15-40 (отдых) до 350 (перегрев) 10-30 <8, >40
Насыщение кислородом (мм рт.ст.) 95-100 98-100 <90
Конечный прилив CO2 (мм рт.ст.) 35-45 35-45 >55
Температура тела (°C) 38.5-39.5 38.5-39.5 <36, >40

Таблица 1: Физиологические значения параметров, подлежащих мониторингу у обезболенных овец.

3. Вирусная подготовка

  1. Храните векторные аликвоты AAV при температуре −80 °C до использования.
  2. В день операции разморозьте необходимое количество флаконов для доставки ИВТ на льду.
  3. Непосредственно перед введением вихрь вирусной векторной аликвоты и центрифуги при 400 × г в течение 10 с для сбора содержимого.
  4. Разбавьте каждый вирусный вектор аликвоты в стерильно-фильтрованном 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) до желаемой дозы в конечном объеме 100 мкл. Подготовьте векторные разведения в стерильной 1,5 мл низкобелковосвязывающей микроцентрифуги с использованием стерильных фильтрующих наконечников пипеток. Утилизируйте все расходные материалы, контактировавшие с вирусным переносчиком, в дезинфицирующем растворе (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В оригинальной публикации15 указана доза терапевтического средства (AAV9. CLN5) составил 1,9 х 1010 вирусных геномов. Рекомендуемая дозировка будет варьироваться в зависимости от вводимого терапевтического средства; поэтому дозировка не была включена в стандартный протокол, представленный здесь.
  5. Нарисуйте все 100 мкл векторного препарата AAV в стерильный шприц объемом 1 мл с постоянно прикрепленной иглой 28 G x 1/2 для немедленной инъекции. Убедитесь, что продолжительность времени от приготовления до инъекции составляет менее 2 мин.

4. Вирусное введение

  1. Вставьте иглу примерно на 7 мм сзади к склере в боковом аспекте глаза и под углом кзади, чтобы избежать хрусталика (рисунок 2 и рисунок 3). Вводят однократную инъекцию 100 мкл в виде болюса как можно ближе к сетчатке, не нарушая поверхность сетчатки.
  2. Промыть глаза примерно 10-15 мл 1-5% раствора повидона-йода с последующим 10 мл физиологического раствора перед удалением зеркала и драпировки.
  3. Переверните овцу и повторите другим глазом, если это необходимо.

Figure 2
Рисунок 2: Вентромедиальное вращение глазного шара. (А) Захватите бульбарную конъюнктиву с незубчатыми щипцами и (Б) вращайте вентромедиально (т.е. вниз и к морде), чтобы обнажить дорсолатеральную поверхность глаза для инъекции. Сокращения: V = вентральный, D = дорсальный, M = медиальный, L = латеральный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Расположение и глубина впрыска. Игла вводится в дорсолатеральный аспект глазного шара, а в глаз вводится вся длина ствола иглы (0,5 дюйма / 12,7 мм). Обратите внимание на угол иглы к задней части глаза, чтобы избежать хрусталика и сделать инъекцию как можно ближе к сетчатке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Послеоперационное лечение

  1. По завершении процедуры прекратите ингаляционную анестезию газом изофлуран, промойте линию 100% кислородом, отсоедините шланг от эндотрахеальной трубки и переведите овец в послеоперационную палату.
  2. Поместите овец в стернальную ложбину, подвернув ноги под нее, и следите за полным выздоровлением. Убедитесь, что рот животного очищен от любых препятствий.
  3. При соблюдении глотательного рефлекса частично сдувают манжету эндотрахеальной трубки и аккуратно вынимают трубку изо рта.
  4. Вводят внутримышечное нестероидное противовоспалительное средство в мышцу бицепса бедра задней конечности, подкожные антибиотики на стороне шеи или за плечом и 0,5% хлорамфеникол глазных капель на поверхность глазного шара.
  5. Обеспечьте воду и пищу (гранулы люцерны и плевелы), как только овца сможет стоять без посторонней помощи.
  6. Вводят 0,5% хлорамфеникол глазных капель 2-3 в день в течение 7 дней после операции.
  7. Держите овец в помещении на ночь, прежде чем вернуться в открытый загон примерно через 24 часа после операции.
  8. Записывайте ректальные температуры ежедневно в течение 3 недель. Следите за любыми изменениями пульса или частоты дыхания, потреблением пищи, нейроповедением, температурой тела, весом, осанкой, здоровьем глаз и клиническими признаками плохого самочувствия. Обратитесь за соответствующей ветеринарной помощью, если есть какие-либо признаки неблагоприятных событий.

6. Оценка эффективности in vivo

  1. Если целью инъекции IVT является сохранение зрения, контролируйте эффективность in vivo с помощью таких методов, как тестирование лабиринта или электроретинография (ERG) для оценки функции клеток сетчатки или оптическая когерентная томография (OCT) для оценки структуры сетчатки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти показатели эффективности были хорошо описаны после генной терапии IVT 11,15,16.

7. Посмертный анализ тканей

  1. Выполните эвтаназию овец одобренным методом в соответствующей конечной точке после интравитреальной инъекционной операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемые методы эвтаназии, такие как внутривенное введение ветеринарных препаратов для эвтаназии или проникающий болт в шейный отдел позвоночника с последующим быстрым экссангинацией, подробно описаны в другом месте15,16.
  2. Собирайте шары с овечьими глазами с помощью хирургических острых / тупых изогнутых ножниц. Отрежьте боковой и медиальный кантус, чтобы увеличить отверстие глазницы, а затем систематически разрезайте конъюнктивальные складки, соединительную ткань, мышцы и зрительный нерв, чтобы освободить глазной шар от гнезда.
  3. Погружение -фиксация неповрежденных, энуклеированных глазных глобусов в 10% формалине в течение 2 ч с последующей постфиксацией в растворе Буэна в течение 4 ч, делая небольшой (0,5 см) разрез в склере для обеспечения достаточной перфузии. Кроме того, можно зафиксировать глазные шары в растворе Дэвидсона в течение 48 ч.
  4. Обрабатывайте участки тканей глаза с помощью обычного встраивания и разрезания парафинового воска на 3-5 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры окрашивания гематоксилина и эозина (H&E) и иммуногистохимического анализа были описаны ранее15,16.
  5. Оцените эффективность в посмертной ткани с помощью таких показателей, как общая толщина сетчатки, толщина слоя сетчатки, количество клеточных рядов наружного ядерного слоя и иммуногистохимическое окрашивание для типов клеток сетчатки, глии сетчатки или белков, представляющих интерес.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы для этих анализов см. в предыдущих публикациях15,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эффективность доставки IVT вектора генной терапии CLN5 в ослаблении дисфункции и дегенерации сетчатки у овец с CLN5 NCL ранее была продемонстрирована этой исследовательской группой15. Пораженные овцы получали одну инъекцию 100 мкл IVT CLN5, упакованную в вектор AAV серотипа 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) в один глаз, при этом контралатеральный глаз служит необработанным внутренним контролем. Зрение оценивали ежемесячно с возраста при инъекции (3 месяца) до терминальной стадии заболевания (18 месяцев). Посмертный анализ гистологии сетчатки проводился на обработанных и необработанных глазах, а также на соответствующих возрасту здоровых и пораженных CLN5 контрольных группах.

Анализ электроретинографии (ERG) продемонстрировал сохранение функции сетчатки в обработанном глазу, в то время как необработанный глаз снижался аналогично животным, пораженным CLN5 (рисунок 4)15. Гистология сетчатки была почти нормализована в обработанном глазу, с общей толщиной сетчатки, сопоставимой со здоровыми контрольными животными в центральной сетчатке. Напротив, толщина необработанной сетчатки была сопоставима с животными, пораженными CLN5 (рисунок 5)15. Лизосомальное хранение, отличительная патологическая особенность NCL, не наблюдалось в обработанном глазу, но присутствовало в необработанном глазу15. Эти результаты показывают, что вектор генной терапии, доставленный с помощью инъекции IVT, смог остановить патогенез заболевания в пораженном CLN5 овечьем глазу. Экспрессия глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), маркера стресса сетчатки и астроглии, была ниже в обработанных глазах, чем в необработанных глазах, что указывает на то, что воспаление, связанное с заболеванием, ослабевало после лечения (рисунок 6)15.

Figure 4
Рисунок 4: Адаптированные к темноте ответы ERG овец CLN5-/- после интравитреальной доставки AAV9. CLN5. (A) Средние (± SEM) амплитуды ERG с течением времени у обработанных (темно-зеленый, n = 3) и необработанных (светло-зеленый, n = 3) глаз CLN5-/- овец, а также здоровый контроль (синий, n = 6) и CLN5-пораженных (красный, n = 6) овец. (B) Репрезентативные следы ERG от обработанных и необработанных глаз и здоровых контрольных групп и пораженных овец в возрасте 5 (черная линия) и 17 (серая линия) месяцев. * обозначает P < 0,05. Эта цифра воспроизведена из Murray et al.15 с разрешения Elsevier. Сокращения: ERG = электроретинография; AAV = аденоассоциированный вирус. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Толщина сетчатки CLN5-/- овец после интравитреальной доставки AAV9. CLN5. Репрезентативные микрофотографии гистологического окрашивания H&E в обработанных и необработанных глазах овец CLN5-/- по сравнению с контрольной группой, соответствующей возрасту. Изображения и измерения толщины проводились в двух местах; центральная сетчатка (A-E) и периферическая сетчатка (F-J). (E) Средняя (± SEM) толщина сетчатки (мкм) в центральной части сетчатки обработанных (темно-зеленый, n = 3) и необработанных (светло-зеленый, n = 3) глаз по сравнению со здоровой контрольной (синий, n = 4) и CLN5-пораженной (красная, n = 4) сетчаткой. (J) Средняя (± SEM) толщина сетчатки (мкм) в периферической сетчатке обработанных и необработанных глаз CLN5-/- овец по сравнению со здоровым контролем и сетчаткой, пораженной CLN5. * обозначает P < 0,05, **** означает P < 0,0001. Шкала стержней = 50 мкм. Эта цифра воспроизведена из Murray et al.15 с разрешения Elsevier. Сокращения: NFL = слой нервных волокон; GCL = слой ганглиозных клеток; IPL = внутренний плексиформный слой; INL = внутренний ядерный слой; OPL = наружный плексиформный слой; ONL = внешний ядерный слой; IS/OS = внутренний и наружный сегменты фоторецепторов; RPE = пигментный эпителий сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Иммунореактивность GFAP в сетчатке CLN5-/- овец после интравитреальной доставки AAV9. CLN5. Репрезентативные конфокальные изображения иммунореактивности GFAP в обработанных и необработанных глазах CLN5-/- овец по сравнению с контрольной группой. (А-Д) Иммунореактивность GFAP, ядерный маркер (E-H) DAPI, (I-L) Объединенные изображения двух каналов. Шкала бар = 20 мкм. Эта цифра воспроизведена из Murray et al.15 с разрешения Elsevier. Сокращения: NFL = слой нервных волокон; GCL = слой ганглиозных клеток; INL = внутренний ядерный слой; ONL = внешний ядерный слой; IS/OS = внутренний и наружный сегменты фоторецепторов; GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Интравитреальные инъекции являются одной из наиболее распространенных хирургических процедур в офтальмологии человека и доказали свою эффективность в доставке AAV-опосредованной генной терапии к сетчатке овец. Ранее мы продемонстрировали эффективность AAV9. Генная терапия CLN5 проводилась интравитреально при ослаблении дисфункции и дегенерации сетчатки у овец с помощью CLN5 NCL15. Есть надежда, что перевод этого пути введения пациентам с НКЛ также окажется полезным.

Протокол для небольших инъекций IVT в овечий глаз относительно прост и неинвазивный, легко воспроизводимый и легкий для изучения неспециалистом. Успех зависит от клеток-мишеней в сетчатке, проводимой терапии, а также местоположения и направления самой инъекции. Хотя инъекции IVT часто считаются наиболее эффективными для нацеливания на внутренние слои сетчатки, многие исследователи продемонстрировали эффективность инъекций IVT при заболеваниях, где внешняя сетчатка является основным местом патогенеза заболевания 15,17,18,19. Различия в функциональных и патологических исходах после инъекций ИВТ также, вероятно, связаны с типом проводимой терапии. Например, было показано, что генная терапия для доставки генов, кодирующих растворимые белки (например, CLN5), гораздо более эффективна, чем генная терапия для доставки генов, кодирующих внутриклеточные или мембранно-связанные белки (например, CLN6)15. Независимо от цели и типа терапии, очень важно правильно определить место инъекции и угол, чтобы максимизировать эффективность. Как описано в протоколе, место инъекции для овец должно быть приблизительно 7 мм позади склеры на боковом аспекте глаза и под углом сзади, чтобы нацелиться на заднее стекловидное тело. Зацепление иглы заключается как в том, чтобы избежать хрусталика, так и в том, чтобы направить введенный препарат как можно ближе к сетчатке. Использование предохранительного шприца с постоянно прикрепленным 28 G (или меньше) x 0,5 в игле с низким мертвым пространством имеет решающее значение для минимизации дискомфорта, связанного с инъекцией, и мертвого объема, остающегося в игле или ступице. Эта длинная игла может быть полностью вставлена в глаз овцы под задним углом без хирургического микроскопа и/или риска прокола сетчатки. Исследователи, которые имеют доступ к хирургическому микроскопу, могут использовать это, чтобы обеспечить дополнительный уровень уверенности в предотвращении разрушения сетчатки. В противном случае, используя безопасные шприцы и зная размеры шара овечьего глаза в возрасте лечения, достаточно, чтобы безопасно выполнить эту процедурув 15 лет.

При захвате глаза, чтобы повернуть его медиально и обнажить место инъекции, важно использовать незубые атравматические инструменты, чтобы избежать повреждения деликатной ткани глаза. Если глаз расположен в центре, относительно легко схватить бульбарную конъюнктиву на границе склеры и радужки и повернуть одной рукой, одновременно вводя другой рукой. Однако, если глаз повернулся в сторону от центра, что может произойти под общей анестезией, часто необходимо использовать гемостат, чтобы зажать бульбарную конъюнктиву и повернуть глаз в положение, оставив гемостат на месте для продолжения процедуры.

Овечьи глаза устойчивы и хорошо восстанавливаются после лечения IVT AAV9 с овец CLN5, и только у одной овцы развивается увеит в обработанном глазу через 1 неделю после инъекции15. В этом случае увеит разрешился в течение 1 недели и не оказал долгосрочного влияния на зрение. Помимо этого одного случая, не было зарегистрировано никаких негативных эффектов инъекций IVT в первом опубликованном исследовании15 или в >30 дополнительных животных в исследовательской программе, введенных в возрасте 3 месяцев, 6 месяцев или 9 месяцев в соответствии с протоколом, описанным здесь. Тем не менее, существуют дополнительные количественные показатели безопасности инъекций, которые исследователи могут захотеть добавить к своим послеоперационным оценкам. К ним относятся измерения внутриглазного давления (ВГД), визуализация глазного дна или ОКТ. Изображения глазного дна до и после инъекции могут выделять, если произошло какое-либо нарушение сетчатки из-за инъекции, и в долгосрочной перспективе могут обеспечить обзор здоровья сетчатки в целом.

В случае, когда вводится флуоресцентный маркер, флуоресцентная визуализация глазного дна может помочь с визуализацией распространения введенного маркера16,20. OCT может быть использован для визуализации сетчатки в поперечном сечении in vivo для выявления любых потенциальных структурных повреждений после инъекции и измерения толщины сетчатки с течением времени в ответ на лечение. Послеинъекционная зрительная функция также может быть оценена с помощью ERG или тестирования лабиринта15,16. В случае вирусно-опосредованной генной терапии ИВТ следует учитывать влияние иммунного ответа и наличие нейтрализующих антител к векторам AAV. Хотя это и не является частью протокола, изложенного здесь для овец, предполагается, что субъекты проверяются на наличие анти-AAV нейтрализующих антител до генной терапии, независимо от пути введения, для повышения эффективности трансдукции16,21. Читатели обращаются к более полному обсуждению вопроса об иммунных реакциях на AAV Уайтхедом и др.22.

Распространенным осложнением во время процедур ИВТ является субконъюнктивальное кровоизлияние (SCH)23, которое может возникнуть, если капилляры в бульбарной конъюнктиве проколоты во время введения иглы. К счастью, SCH, как правило, безвредна и разрешается в течение нескольких дней; однако лучше избегать конъюнктивальных капилляров при введении иглы. После инъекции ИВТ важно лечить введенные глаза глазными каплями-антибиотиками (например, хлорамфениколом) и контролировать глаза на наличие любых признаков инфекции или воспаления (увеита). Другим распространенным событием во время процедур ИВТ является увеличение ВГД. Эти увеличения чаще всего являются преходящими скачками давления в течение нескольких минут после инъекции и не вызывают длительного повреждения24,25. Тем не менее, есть случаи, когда ВГД следует учитывать и контролировать. Когда присутствуют ранее существовавшие глазные состояния, такие как глаукома, или когда вводятся большие объемы (≥100 мкл), следует тщательно контролировать ВГД, а профилактический парацентез передней камеры следует рассматривать для снижения давления в глазном шаре 4,16. Кроме того, повторные всплески ВГД в случае повторных инъекций ИВТ могут вызывать беспокойство и должны быть ослаблены, как выше4. Здесь мы демонстрируем ИВТ для целей одной AAV-опосредованной генной терапии; поэтому долгосрочные последствия повторных инъекций не являются основным соображением.

Ограничения инъекций ИВТ включают необходимость проникновения через анатомические барьеры и более низкую специфичность мишени по сравнению с более инвазивными методами. Сначала введенное вещество будет разбавлено в стекловидном теле, а затем имеет расстояние для диффузии через стекловидное тело и ткань сетчатки к клеткам-мишеням. Это означает, что внутренняя сетчатка легче трансдуцируется, чем внешняя сетчатка после инъекции IVT, и для противодействия разведению26 могут потребоваться более высокие дозы. Протокол, описанный здесь, подчеркивает важность инъекций как можно ближе к сетчатке для смягчения последствий разведения и диффузии через стекловидное тело. Таким образом, полная длина вала иглы 0,5 дюйма / 12,7 мм вставляется в глаз. Дополнительным преимуществом введения полной длины иглы является снижение вероятности рефлюкса жидкости во время инъекции 4,27.

Хотя этот текущий протокол опускает его, рекомендуется отложить удаление иглы на несколько минут после инъекции, чтобы еще больше снизить вероятность рефлюкса жидкости. Кроме того, инъекцию следует делать медленно, чтобы струя вводимой жидкости не нарушала работу сетчатки или не вызывала быстрого всплеска ВГД, а повышенная скорость инъекции не влияла на скорость диффузии через стекловидное тело28,29. Внутренняя ограничивающая мембрана (ILM) является основным барьером между стекловидным телом и сетчаткой, который функционирует для ограничения движения молекул в сетчатку30. Тем не менее, проницаемость ILM может быть увеличена при пищеварении или хирургическом пилинге и, вероятно, увеличивается в больном глазу, что облегчает проникновение терапевтических молекул.

Что касается целевой специфичности, введение IVT имеет наименьшее значение по сравнению с другими внутриглазными путями, такими как субретинальный и супрахориоидальный, как обсуждалось выше и в других местах10. Тем не менее, новые поколения AAV обычно разрабатываются для содержания модификаций, которые улучшают нацеливание на определенные типы клеток или более эффективно преодолевают барьеры, такие как ILM31. Использование таких модифицированных капсидов повысило эффективность трансдукции после введения IVT в ряд модельных видов 5,32,33.

Цель генной терапии, подробно описанной Murray et al.15 , состояла в том, чтобы доставить функциональную копию гена CLN5 ; поэтому одним из показателей эффективности является наличие трансдуцированных клеток, экспрессирующих белок CLN5. Мы попытались использовать иммуногистохимию для обнаружения CLN5-трансдуцированных клеток в сетчатке, как мы обычно делаем в ткани мозга овец; однако антитело, которое мы обычно используем в свободно плавающей ткани мозга, не работает в парафиновой ткани сетчатки. Поиск и устранение неисправностей и исследование альтернативных способов обнаружения гена или белка, представляющего интерес в сетчатке, в настоящее время проводятся для повышения эффективности. Одним из потенциальных способов достижения этого является инъекция вирусного вектора, содержащего репортерный ген (например, зеленый флуоресцентный белок; ГФП) и оценка экспрессии GFP с помощью иммуногистохимии. Другим способом оценки эффективности является использование количественной ПЦР для оценки уровней экспрессии трансгенов.

Разработка протоколов инъекций IVT крупным животным является важным шагом на пути к лечению дегенеративных заболеваний сетчатки, особенно заболеваний с генетическим компонентом, поскольку генная терапия IVT является многообещающим потенциальным терапевтическим средством. Для дегенеративных заболеваний, когда сетчатка уже хрупкая, лечение IVT представляет меньший риск отслоения или разрыва сетчатки. Учитывая сходство в размерах и структуре овечьих и человеческих глаз, оптимизация дозы и объема инъекций ИВТ у овец является важным шагом на пути к переводу в клинику. В этой статье подробно описывается протокол инъекции ИВТ в овечий глаз, который безопасен и показывает очень низкий уровень глазных воспалительных реакций. Этот метод также демонстрирует эффективность Окулярной генной терапии, опосредованной AAV9, для устранения сетчаточного компонента NCL у овец.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Стива Хипа (BVSc, CertVOphthal) за его помощь в установлении этого протокола и выполнении инъекций, описанных Murray et al.15. Авторы также признают финансирование со стороны CureKids New Zealand, Кентерберийского фонда медицинских исследований, Neurogene Inc и Ассоциации поддержки и исследований болезни Баттена.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle Fisher Scientific, Auckland, New Zealand 05-561-28 Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar
1.5 mL microcentrifuge tube Sigma Aldrich HS4323 Autoclave tubes to sterilise prior to use
Anesthesia machine with gas bench and monitor  Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand
Antibiotic eye drops  Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)
BrightMount plus anti-fade mounting medium Abcam, Cambridge, United Kingdom ab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States 10236276001
Diazepam sedative Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand 5 mg/mL
Endotracheal tubes Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size
Eye speculum Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand KP151/14 Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Fenestrated surgical drape Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand DI583 Or similar 
Filter Tips Interlab, Auckland, New Zealand 10, 200, and 1,000 µL 
Formaldehyde solution (37%) Fisher Scientific, Auckland, New Zealand AJA809-2.5PL Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 Invitrogen Carlsbad, CA, USA  A-11012 Use at a dilution of 1:500
Isoflurane anesthetic Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand
Ketamine HCl anesthetic/analgesic PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand 100 mg/mL
Laryngoscope (veterinary) KaWe Medical, Denmark Miller C blade, size 2
Needles  Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand 302025 BD Hypodermic Needles, or similar
Non-steroidal anti-inflammatory Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand 49402/008 Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Non-toothed forceps Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand AB864/16 Or similar 
Non-toothed hemostat Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand AA150/12 Or similar 
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand 16210072
Oxygen (medical) BOC Gas, Christchurch, New Zealand D2 cylinder, gas code 180
Phosphate buffered saline  Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand 10010023 Sterile, filtered
Povidone-Iodine solution Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand 005835 Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) Dako, Glostrup, Denmark Z0334 Use at a dilution of 1:2,500
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 University of North Carolina Vector Core, NC, USA. scAAV9/CBh-oCLN5opt
Sodium Chloride 0.9% IV Solution Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand AHB1322 Commercial name: Saline solution 
Subcutaneous antibiotics Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)
Surgical sharp blunt curved scissors  Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand SSSHBLC130
Terumo Syringe Luer Lock Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand SH159/SH160 Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline
Virkon Disinfectant Powder EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ 28461115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
  2. Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
  3. Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
  4. Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
  5. Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
  6. Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
  7. Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
  8. Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
  9. Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
  10. Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
  11. Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
  12. Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
  13. Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
  14. Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
  15. Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
  16. Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
  17. Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
  18. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
  19. Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
  20. Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
  21. Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
  22. Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
  23. Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
  24. Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
  25. Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
  26. Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
  27. Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
  28. Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
  29. Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
  30. Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
  31. Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
  32. Kleine Holthaus, S. -M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
  33. Kleine Holthaus, S. -M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).

Tags

Медицина выпуск 185
Интравитреальные инъекции в ячий глаз
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murray, S. J., Mitchell, N. L.… More

Murray, S. J., Mitchell, N. L. Intravitreal Injections in the Ovine Eye. J. Vis. Exp. (185), e63823, doi:10.3791/63823 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter