Summary
זריקות תוך-גופיות בוצעו בעין הכבשה במטרה להעביר טיפול גנטי בתיווך ויראלי לרשתית.
Abstract
ישנן מספר שיטות להעברת סוכנים טיפוליים לרשתית, כולל intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, או ניהול מקומי. אספקת תרופות IVT כוללת זריקה לתוך ההומור הזגוגי של העין, חומר ג'לטיני הממלא את החדר האחורי של העין ושומר על צורת כדור הארץ. למרות שמסלול ה- IVT פחות ממוקד באופן ספציפי מאשר לידה תת-קרקעית, הוא הרבה פחות פולשני ונמצא בשימוש נרחב במסגרות קליניות למגוון מחלות עיניים.
בעבר הדגמנו את היעילות של העברה תוך-גופית של מוצר טיפול גנטי בתיווך נגיף אדנו (AAV) (AAV9). CLN5) בכבשים עם צורה טבעית של CLN5 של ליפופוסינוזיס עצבי (NCL). כבשים מושפעות קיבלו טיפול גנטי IVT בעין אחת, כאשר העין השנייה לא מטופלת משמשת כבקרה פנימית. מבנה ותפקוד הרשתית נשמרו בעין המטופלת עד 15 חודשים לאחר הטיפול, בעוד שהעין הלא מטופלת הפגינה ירידה הדרגתית בתפקוד וניוון חמור במהלך הבדיקה שלאחר המוות. בהתבסס על מחקרי הכבשים, מוצר הטיפול הגנטי CLN5 אושר כתרופה חדשה ניסיונית מועמדת (IND) על ידי מנהל המזון והתרופות של ארצות הברית בספטמבר 2021. מאמר זה מפרט את הפרוטוקול הכירורגי להעברת IVT של וקטור ויראלי טיפולי לעין הביצית.
Introduction
ניתן להשתמש במספר שיטות כדי להעביר חומרים טיפוליים לרשתית, כולל intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, או ניהול מקומי. כל מסלול של מתן כרוך בהתגברות על מחסומים כגון מחסום הדם-רשתית או הממברנות המגבילות הפנימיות והחיצוניות ויש לו שיעורי יעילות משתנים בהתאם לתרופה המועברת וליעד הרשתיתהספציפי 1,2.
אספקת תרופות IVT כוללת זריקה לתוך ההומור הזגוגי של העין, חומר ג'לטיני התופס את החדר האחורי של העין. תפקידו העיקרי של ההומור הזגוגי הוא לשמור על צורת כדור הארץ של העין ולשמור על רקמות העין, כגון העדשה והרשתית, במקום. ההומור הזגוגי מורכב ברובו ממים, עם כמויות קטנות של קולגן, חומצה היאלורונית וחלבונים אחרים שאינם קולוגניים3. הזרקת IVT היא הליך פשוט ונפוץ המשמש באופן שגרתי לטיפול במגוון רחב של מחלות עיניים, כולל ניוון מקולרי תלוי גיל, בצקת מקולרית סוכרתית, רטינופתיה סוכרתית, חסימת ורידים ברשתית ומספר ניוון רשתיתתורשתי 4,5.
ליפופוסצינוזות עצביות (NCL; מחלת באטן) הן קבוצה של מחלות אחסון ליזוזומליות קטלניות הגורמות לניוון חמור של המוח והרשתית. כיום ידועות 13 גרסאות של NCL הנובעות ממוטציות בגנים שונים (CLN1-8, CLN10-14) המשפיעות בעיקר על ילדים, אך יש להן גילאים משתנים של התפרצות וחומרת המחלה6. ה-NCLs חולקים תסמינים פרוגרסיביים נפוצים, כולל ירידה קוגניטיבית ומוטורית, התקפים ואובדן ראייה. אין תרופה ל-NCL; עם זאת, טיפול בתחליפי אנזימים מוכווני מוח נמצא כיום בניסויים קליניים למחלת CLN27,8, וטיפול גנטי בתיווך AAV הראה הבטחה רבה במחקרים פרה-קליניים, כאשר ניסוי קליני לטיפול גנטי CLN5 צפוי להתחיל בשנת 2022 9,10.
מינים רבים אחרים מפתחים צורות טבעיות של NCL, כולל חתולים, כלבים, כבשים ופרות. שני מודלים של ביצות NCL נמצאים כעת במחקר פעיל בניו זילנד: מודל מחלת CLN5 בכבשי בורדרדייל ומודל מחלת CLN6 בכבשים בדרום המפשייר. כבשים מושפעות מציגות רבים מהמאפיינים הקליניים והפתולוגיים של המחלה האנושית, כולל ניוון רשתית ואובדן ראייה10,11. למרות שטיפול גנטי CLN5 מכוון מוח בכבשים עם מחלת CLN5 יכול למנוע או לעצור ניוון מוחי וירידה קלינית, הכבשים המטופלות עדיין מאבדות את ראייתן9. זה הדגיש את הצורך לטפל ברשתית כדי לשמר את הראייה ולשמור על איכות חיים טובה יותר, מה שהוביל להקמת פרוטוקול לטיפול גנטי בעיניים בכבשים.
עין הכבשה מייצגת מודל טוב של העין האנושית בשל הדמיון שלה בממדי הגלובוס של העין, נפח הזגוגית ומבנה הרשתית10,12,13. מאמר זה מפרט את הפרוטוקול הניתוחי להעברת IVT בנפח קטן (≤100 μL) של וקטור ויראלי טיפולי לעין הביצית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת לינקולן והם עולים בקנה אחד עם הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב לטיפול ושימוש בבעלי חיים במחקר ולחוק רווחת בעלי החיים של ניו זילנד (1999). כבשי בורדרדייל אובחנו בלידה14 והוחזקו בחוות מחקר של אוניברסיטת לינקולן. שלושה אווזים הומוזיגוטיים בני 3 חודשים (CLN5-/-) קיבלו זריקת IVT אחת לעין שמאל, כאשר עין ימין שלא טופלה משמשת כבקרה פנימית. נתוני אלקטרורטינוגרפיה ופתולוגיה הושוו לנתוני בקרה היסטוריים בריאים ומושפעים. הווקטור הנגיפי ששימש במחקר זה היה סרוטיפ נגיף 9 המשלים את עצמו הקשור לאדנו, המכיל את מקדם פעולת הבטא של עוף (CBh) ואת הביצית CLN5 המותאמת לקודון (scAAV9/CBh-oCLN5opt). הווקטור הנגיפי סופק על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה וקטור Core, צפון קרוליינה, ארה"ב.
1. טרום ניתוח
- אוטוקלאב את ערכת הניתוח (איור 1).
- הזימו את הכבשים במשך 24 שעות לפני הניתוח.
- רשום משקולות חיות לפני הניתוח.
איור 1: ערכת ניתוח תוך-ורידית. המכשירים הדרושים לניתוח IVT כוללים (1) ספקולום להחזקת העפעפיים פתוחים ו-(2) זוג מלקחיים מעוקלים לאף כדי לתפוס את הלחמית הבולבארית ולסובב את העין. (3) המוסטאט אף ישר נכלל גם כמכשיר חלופי לאחיזת הלחמית הבולבארית ולהחזקת העין במקומה אם היא התגלגלה חזרה למסלול העין. ערכה זו עוברת בדיקה אוטומטית לפני הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
2. הליך כירורגי
- לרסן את החיה, באמצעות קוצץ אלקטרוני, לגלח את הצמר מצד אחד של הצוואר מעל הווריד jugular.
- Occlude את הווריד jugular על ידי הפעלת לחץ בבסיס חריץ jugular ולדמיין את הווריד מורם.
- יש לשאוב את הכמות המתאימה של דיאזפם (0.3 מ"ג/ק"ג) וקטמין (7.5 מ"ג/ק"ג) לתוך מזרק סטרילי ולחבר מחט סטרילית של 20 גרם. הכנס את המחט לווריד הג'וגולרי ומשוך בעדינות בחזרה על הבוכנה כדי לוודא שהדם נכנס לרכזת והמחט נמצאת בתוך הווריד. לאחר האישור, לגרום באמצעות מתן תוך ורידי (jugular).
- מיד לאחר אינדוקציה, מניחים את החיה בשכיבה הגבית, מרחיבים את הצוואר ומחזיקים את הלשון למעלה וקדימה, באמצעות לרינגוסקופ כדי לדמיין את הגרון. בצע אינטובציה אנדוטרכאלית על ידי החדרה עדינה של צינור אנדוטרכאלי (גודל 6.0-9.0 בהתאם לגודל הכבשה) בין מיתרי הקול כאשר החיה נושפת. לנפח את השרוול האנדוטרכאלי מיד ולאבטח את הצינור עם עניבה סביב הלסת התחתונה. אשר את זרימת האוויר דרך הצינור.
- מעבירים את הכבשה לשולחן הניתוחים ומניחים אותה בשכיבה צידית.
- מיד לחבר את צינור endotracheal צינורות של מכונת הרדמה למסירת isoflurane ב 100% חמצן. בתחילה מתחילים עם 3%-4% איזופלוראן ולאחר מכן מפחיתים ל-2%-3% לצורך תחזוקה. שימו לב לאוורור הספונטני של הכבשים.
- עקוב אחר קצב הלב (דופק), קצב הנשימה, ריווי החמצן, רמות CO2 בסוף הגאות וטמפרטורת הגוף הרקטלית לאורך כל ההליך. ראו טבלה 1 לערכים פיזיולוגיים לפרמטרים אלה בכבשים מורדמות (משתנה, אך משמש כהנחיה).
- מניחים וילון גדול, סטרילי ומרובע על עגלת ניתוח כירורגית, ואחריו המכשירים הסטריליים.
- מקמו וילון כירורגי סטרילי ופנסטרי מעל העין להזרקה.
- לחטא את העין באופן אספטי באמצעות מזרק סטרילי של 20 מ"ל להשקיית העין עם תמיסת 1-5% פובידון-יוד.
- יש למרוח 1-2 טיפות אלקאין 0.5% W/V תמיסת עיניים, כהרדמה מקומית, על העין.
- יש להתאים ספקולום עיניים נופה באראקר-קוליברי (10 מ"מ) לעפעפיים כדי להחזיק את העין פתוחה.
- לתפוס את הלחמית bulbar על ההיבט הגבי של העין עם מלקחיים, ולסובב את כדור העין ventromedial.
| בהכרה | מורדם | נקודת התערבות קריטית מומלצת | |
| דופק (פעימות לדקה) | 50-80 (מנוחה) עד 280 (פעיל) | 50-80 | <50, >100 |
| קצב נשימה (נשימות לדקה) | 15-40 (מנוחה) עד 350 (מחומם יתר על המידה) | 10-30 | <8, >40 |
| רוויון חמצן (מ"מ כספית) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| CO2 סופני-גאות (מ"מ כספית) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| טמפרטורת הגוף (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36, >40 |
טבלה 1: ערכים פיזיולוגיים של פרמטרים שיש לעקוב אחריהם בכבשים מורדמות.
3. הכנה ויראלית
- יש לאחסן את ה-AAV בטמפרטורה של 80°C- עד לשימוש.
- ביום הניתוח, הפשירו את המספר הנדרש של בקבוקונים להעברת IVT על קרח.
- מיד לפני הניהול, מערבבים את הווקטור הנגיפי aliquot וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 10 שניות כדי לאסוף את התוכן.
- יש לדלל כל אליקוט וקטורי נגיפי בתמיסת מלח מסוננת סטרילית 1x עם פוספט (PBS) למינון הרצוי בנפח סופי של 100 μL. הכן דילולים וקטוריים בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בקושר חלבון נמוך של 1.5 מ"ל באמצעות קצוות פיפטה של מסנן סטרילי. יש להשליך את כל החומרים המתכלים שהיו במגע עם הווקטור הנגיפי בתמיסת החיטוי (ראו טבלת חומרים).
הערה: בפרסום המקורי15 המינון של החומר הטיפולי (AAV9. CLN5) היה 1.9 x 1010 גנומים נגיפיים. המינון המומלץ ישתנה בהתאם לסוכן הטיפולי הניתן; לכן, מינון לא נכלל בפרוטוקול הסטנדרטי המוצג כאן. - שאבו את מלוא 100 μL של הכנת וקטור AAV לתוך מזרק סטרילי, שטח מת נמוך 1 מ"ל עם מחט המחוברת באופן קבוע 28 G x 1/2 להזרקה מיידית. ודא שמשך הזמן מההכנה להזרקה הוא פחות מ-2 דקות.
4. ניהול ויראלי
- יש להחדיר את המחט כ-7 מ"מ אחורית לסקלרה בצד הצדדי של העין ובזווית אחורית כדי להימנע מהעדשה (איור 2 ואיור 3). לתת את הזריקה היחידה של 100 μL כמו בולוס קרוב ככל האפשר לרשתית מבלי להפריע למשטח הרשתית.
- יש לשטוף את העין בכ-10-15 מ"ל של תמיסת 1-5% פובידון-יוד ואחריה 10 מ"ל מלח לפני הסרת הספקולום והווילונות.
- הופכים את הכבשים וחוזרים עם העין השנייה במידת הצורך.
איור 2: סיבוב ונטרומדיאלי של כדור הארץ של העין. (A) תפסו את הלחמית הבולבארית עם מלקחיים שאינם מטורפים ו-(B) סובבו את החוטם בצורה וונטרומדית (כלומר, כלפי מטה ולכיוון החוטם) כדי לחשוף את פני השטח הגביים של העין לצורך הזרקה. קיצורים: V = גחון, D = גב, M = מדיאלי, L = לרוחב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מיקום ההזרקה ועומקה. המחט מוזרקת על ההיבט הגבי של כדור העין, ואת מלוא אורכו של פיר המחט (0.5 אינץ '/ 12.7 מ"מ) מוכנס לתוך העין. שימו לב לזווית המחט לכיוון החלק האחורי של העין כדי להימנע מהעדשה ולהזריק קרוב ככל האפשר לרשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
5. ניהול לאחר הניתוח
- עם השלמת ההליך, להפסיק הרדמה גז isoflurane, לשטוף את הקו עם 100% חמצן, לנתק את הצינור מן הצינור endotracheal, ולהעביר את הכבשים לחדר ההתאוששות.
- מניחים את הכבשים במשענת עצם החזה, עם רגליים תחובות מתחת, ומוניטור עד להחלמה מלאה. ודא שהפה של החיה נקי מכל מכשול.
- כאשר רפלקס הבליעה הוא ציין, חלקית לנפח את השרוול של צינור endotracheal בעדינות להסיר את הצינור מן הפה.
- מתן נוגד דלקת לא סטרואידי תוך שרירי לתוך שריר הירך האחורי של הגפיים האחוריות, אנטיביוטיקה תת עורית בצד הצוואר או מאחורי הכתף, ו 0.5% כלורמפניקול טיפות עיניים על פני כדור הארץ העין.
- ספק מים ומזון (כדורי לוצרן ומוץ) ברגע שהכבשים יכולות לעמוד ללא הפרעה.
- לתת 0.5% כלורמפניקול טיפות עיניים 2-3 ליום במשך 7 ימים לאחר הניתוח.
- השאירו את הכבשים בתוך הבית למשך הלילה לפני שהן חוזרות למשטח החיצוני כ-24 שעות לאחר הניתוח.
- שיא טמפרטורות רקטליות מדי יום במשך 3 שבועות. עקוב אחר כל שינוי בדופק או בקצב הנשימה, צריכת מזון, התנהגות עצבית, טמפרטורת גוף, משקל, יציבה, בריאות העיניים וסימנים קליניים של בריאות לקויה. יש לפנות לטיפול וטרינרי מתאים אם יש אינדיקציות לתופעות לוואי.
6. הערכת יעילות in vivo
- אם מטרת הזרקת IVT היא לשמר את הראייה, עקוב אחר יעילות in vivo בשיטות כגון בדיקת מבוך או אלקטרורטינוגרפיה (ERG) כדי להעריך את תפקוד תאי הרשתית או טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) להערכת מבנה הרשתית.
הערה: אמצעי יעילות אלה תוארו היטב לאחר טיפול גנטי IVT11,15,16.
7. ניתוח רקמות לאחר המוות
- לבצע המתת חסד של כבשים בשיטה מאושרת בנקודת קצה מתאימה לאחר ניתוח הזרקה תוך ויטרלית.
הערה: שיטות המתת חסד מוצעות, כגון תרופות המתת חסד וטרינריות תוך ורידיות או בורג שבוי חודר לעמוד השדרה הצווארי ואחריו exsanguination מהיר, מפורטים במקום אחר15,16. - קציר גלובוסים לעין כבשים באמצעות מספריים מעוקלים חדים/קהים כירורגיים. חותכים את הקנטוס הלטרלי והמדיאלי כדי להגדיל את פתח ארובת העין ולאחר מכן חותכים באופן שיטתי דרך קפלי הלחמית, רקמת החיבור, השרירים ועצב הראייה כדי לשחרר את כדור העין מהשקע.
- תיקון טבילה שלם, כדורי עיניים מנוקבים ב-10% פורמלין למשך שעתיים, ולאחר מכן פוסט-פיקסינג בתמיסה של Bouin למשך 4 שעות, מה שהופך חתך קטן (0.5 ס"מ) בסקלרה כדי לאפשר זלוף מספיק. לחלופין, טבילה-תיקון גלובוס העין בפתרון של דוידסון למשך 48 שעות.
- מעבדים מקטעים של רקמת העין באמצעות הטבעה שגרתית של שעוות פרפין וחיתוך ב-3-5 מיקרומטר.
הערה: הליכי צביעה עבור צביעה המטוקסילין ו eosin (H&E) וניתוח אימונוהיסטוכימי תוארו בעבר15,16. - הערך את היעילות ברקמות שלאחר המוות על ידי מדדים כגון עובי רשתית כולל, עובי שכבת הרשתית, ספירות של שורות תאי בשכבה גרעינית חיצונית, וכתמים אימונוהיסטוכימיים עבור סוגי תאי רשתית, גליה רשתית או חלבונים מעניינים.
הערה: לפרוטוקולים עבור ניתוחים אלה, ראה פרסומים קודמים15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היעילות של העברת IVT של וקטור טיפול גנטי CLN5 בהחלשת תפקוד לקוי של הרשתית וניוון בכבשים עם CLN5 NCL הוכחה בעבר על ידי קבוצת מחקר זו15. הכבשים המושפעות קיבלו זריקה אחת של 100 μL IVT של CLN5 ארוזה בסרוטיפ AAV 9 (AAV9) וקטור (AAV9). CLN5) לעין אחת, כאשר העין הנגדית משמשת כבקרה פנימית לא מטופלת. הראייה הוערכה מדי חודש מגיל ההזרקה (3 חודשים) ועד למחלה סופנית (18 חודשים). ניתוח לאחר המוות של היסטולוגיה רשתית בוצע על עיניים מטופלות ולא מטופלות, כמו גם על בקרות בריאות תואמות גיל ו- CLN5.
ניתוח אלקטרורטינוגרפיה (ERG) הדגים שמירה על תפקוד הרשתית בעין המטופלת, בעוד שהעין הלא מטופלת ירדה באופן דומה לבעלי חיים שנפגעו מ-CLN5 (איור 4)15. היסטולוגיה של הרשתית הייתה כמעט מנורמלת בעין המטופלת, עם עובי רשתית כולל הדומה לחיות בקרה בריאות ברשתית המרכזית. לעומת זאת, עובי הרשתית הלא מטופלת היה דומה לזה של בעלי חיים שנפגעו מ-CLN5 (איור 5)15. אחסון ליזוזומלי, מאפיין פתולוגי בולט של NCL, לא נצפה בעין המטופלת אך היה נוכח בעין הלא מטופלת15. תוצאות אלה מראות כי וקטור הריפוי הגנטי שהועבר באמצעות הזרקת IVT הצליח לעצור את פתוגנזה המחלה בעין הכבשה הנגועה ב-CLN5. הביטוי של חלבון חומצי פיברילרי גליה (GFAP), סמן של לחץ ברשתית ואסטרוליה, היה נמוך יותר בעיניים שטופלו מאשר בעיניים לא מטופלות, מה שמצביע על כך שדלקת הקשורה למחלה הוחלשה לאחר הטיפול (איור 6)15.
איור 4: תגובות ERG מותאמות לחושך של כבשים CLN5-/- לאחר אספקה תוך-גופית של AAV9. CLN5. (A) משרעת ERG ממוצעת (± SEM) לאורך זמן בעיניים המטופלות (ירוק כהה, n = 3) ולא מטופלות (ירוק בהיר, n = 3) של כבשים CLN5-/ - כבשים, כמו גם שליטה בריאה (כחול, n = 6) ו- CLN5 מושפעת (אדום, n = 6). (B) עקבות ERG מייצגים מהעיניים המטופלות והלא מטופלות ומבקרות בריאות וכבשים מושפעות בגיל 5 (קו שחור) ו-17 (קו אפור). * מציין P < 0.05. נתון זה מועתק מ-Murray et al.15 באישור Elsevier. קיצורים: ERG = אלקטרורטינוגרפיה; AAV = וירוס הקשור לאדנו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: עובי הרשתית של כבשי CLN5-/- לאחר אספקה תוך-גופית של AAV9. CLN5. פוטומיקרוגרפים מייצגים של כתמים היסטולוגיים של H&E בעיניים המטופלות והלא מטופלות של כבשים CLN5-/- בהשוואה לבקרות תואמות גיל. תמונות ומדידות עובי צולמו בשני מקומות; הרשתית המרכזית (A-E) והרשתית ההיקפית (F-J). (E) עובי רשתית ממוצע (± SEM) (μm) ברשתית המרכזית של העיניים שטופלו (ירוק כהה, n = 3) ולא מטופלות (ירוק בהיר, n = 3) בהשוואה לשליטה בריאה (כחול, n = 4) ו- CLN5 מושפעת (אדום, n = 4) רשתית. (J) עובי רשתית ממוצע (± SEM) (μm) ברשתית ההיקפית של העיניים המטופלות והלא מטופלות של כבשי CLN5-/- בהשוואה לבקרה בריאה ורשתית מושפעת CLN5. * מציין P < 0.05, **** מציין P < 0.0001. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. נתון זה מועתק מ- Murray et al.15 באישור Elsevier. קיצורים: NFL = שכבת סיבי עצב; GCL = שכבת תא גנגליון; IPL = שכבת פלקסיפורם פנימית; INL = שכבה גרעינית פנימית; OPL = שכבת פרספקס חיצונית; ONL = שכבה גרעינית חיצונית; IS/OS = מקטעים פנימיים וחיצוניים של פוטורצפטורים; RPE = אפיתל פיגמנט רשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: פעילות חיסונית של GFAP ברשתית של כבשים מסוג CLN5-/- לאחר לידה תוך-גופית של AAV9. CLN5. תמונות קונפוקליות מייצגות של פעילות חיסונית של GFAP בעיניים המטופלות והלא מטופלות של כבשי CLN5-/- בהשוואה לבקרות. (א-ד) פעילות חיסונית GFAP, (E-H) סמן גרעיני DAPI, (I-L) תמונות ממוזגות של שני הערוצים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. נתון זה מועתק מ- Murray et al.15 באישור Elsevier. קיצורים: NFL = שכבת סיבי עצב; GCL = שכבת תא גנגליון; INL = שכבה גרעינית פנימית; ONL = שכבה גרעינית חיצונית; IS/OS = מקטעים פנימיים וחיצוניים של פוטורצפטורים; GFAP = חלבון חומצי פיברילרי גליאלי; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זריקות תוך-ורידיות הן אחד ההליכים הכירורגיים הנפוצים ביותר ברפואת עיניים אנושית והוכחו כיעילות במתן טיפולים גנטיים בתיווך AAV לרשתית הכבשים. הוכחנו בעבר את היעילות של AAV9. טיפול גנטי CLN5 הניתן באופן תוך-ורידי בהחלשת תפקוד לקוי של הרשתית וניוון בכבשים עם CLN5 NCL15. יש לקוות כי התרגום של מסלול זה של מתן לחולי NCL אנושיים יועיל גם הוא.
הפרוטוקול להזרקות IVT בנפח קטן לעין כבש הוא פשוט יחסית ולא פולשני, ניתן לשחזור בקלות וקל למי שאינו מומחה ללמוד. ההצלחה תלויה בתאי המטרה בתוך הרשתית, בטיפול המועבר, ובמיקום וכיוון ההזרקה עצמה. למרות שזריקות IVT נחשבות לעתים קרובות ליעילות ביותר בהתמקדות בשכבות הרשתית הפנימיות, חוקרים רבים הוכיחו את היעילות של זריקות IVT במחלות שבהן הרשתית החיצונית היא המיקום העיקרי של פתוגנזה של מחלה15,17,18,19. ההבדלים בתוצאות התפקודיות והפתולוגיות בעקבות זריקות IVT קשורים ככל הנראה גם לסוג הטיפול שניתן. לדוגמה, ריפוי גנטי להעברת גנים המקודדים חלבונים מסיסים (למשל, CLN5) הוכח כיעיל הרבה יותר מטיפולים גנטיים להעברת גנים המקודדים חלבונים תוך-תאיים או הקשורים לממברנה (לדוגמה, CLN6)15. ללא קשר למטרה ולסוג הטיפול, חשוב מאוד לתקן את מקום ההזרקה ואת זווית ההזרקה כדי למקסם את היעילות. כפי שמתואר בפרוטוקול, אתר ההזרקה לכבשים צריך להיות בערך 7 מ"מ אחורי לסקלרה בהיבט הצדדי של העין וזווית אחורית כדי למקד את הזגוגית האחורית. זווית המחט היא גם כדי למנוע את העדשה וגם כדי לכוון את התרופה המוזרקת קרוב ככל האפשר לרשתית. השימוש במזרק בטיחות עם 28 G (או קטן יותר) x 0.5 במחט שטח מת נמוך הוא חיוני כדי למזער את אי הנוחות הקשורה להזרקה ואת הנפח המת שנותר במחט או ברכזת. מחט באורך זה ניתנת להחדרה מלאה לעין הכבשה בזווית אחורית ללא מיקרוסקופ כירורגי ו/או סיכון לניקוב הרשתית. חוקרים שיש להם גישה למיקרוסקופ כירורגי יכולים להשתמש בו כדי לספק רמה נוספת של ודאות סביב הימנעות מהפרעה ברשתית. אחרת, שימוש במזרקי בטיחות ומודעות לממדים של גלובוס עין הכבשים בגיל המטופל מספיק כדי לבצע הליך זה בבטחה15.
כאשר תופסים את העין כדי לסובב אותה באופן מדיאלי ולחשוף את אתר ההזרקה, חיוני להשתמש במכשירים א-טראומטיים שאינם נגועים כדי למנוע פגיעה ברקמה העדינה של העין. אם העין ממוקמת במרכז, קל יחסית לתפוס את הלחמית הבולבארית בגבול הסקלרה והקשתית ולסובב ביד אחת, תוך כדי הזרקה ביד השנייה. עם זאת, אם העין הסתובבה מחוץ למרכז, אשר יכול להתרחש תחת הרדמה כללית, לעתים קרובות יש צורך להשתמש hemostat כדי להדק על הלחמית bulbar ולסובב את העין למקומה, משאיר את hemostat במקום להמשיך עם ההליך.
עיני הכבשים חזקות והתאוששו היטב לאחר טיפול IVT עם AAV9 הנושא שחלות CLN5, כאשר רק כבשה אחת מפתחת אובאיטיס בעין המטופלת שבוע לאחר הזרקה15. במקרה זה, האובאיטיס נפתרה תוך שבוע ולא הייתה לה השפעה ארוכת טווח על הראייה. מלבד מקרה אחד זה, לא דווחו השפעות שליליות של זריקות IVT במחקרהראשון שפורסם 15, או ב->30 בעלי חיים נוספים בתוכנית המחקר שהוזרקו בגיל 3 חודשים, 6 חודשים או 9 חודשים בהתאם לפרוטוקול המתואר כאן. עם זאת, ישנם אמצעים כמותיים נוספים של בטיחות בהזרקה שחוקרים עשויים לשקול להוסיף להערכות שלהם לאחר הניתוח. אלה כוללים מדדים של לחץ תוך עיני (IOP), הדמיית פונדוס או OCT. תמונות של הפונדוס לפני ואחרי ההזרקה יכולות להדגיש אם היה הפרעה כלשהי של הרשתית בגלל ההזרקה, ובטווח הארוך, יכולות לספק סקירה כללית של בריאות הרשתית באופן כללי.
במקרה שבו מוזרק סמן פלואורסצנטי, הדמיה פלואורסצנטית של הפונדוס יכולה לסייע בהדמיה של התפשטות הסמן המוזרק16,20. ניתן להשתמש ב-OCT כדי לדמיין את הרשתית בחתך רוחב in vivo כדי לזהות כל נזק מבני פוטנציאלי לאחר ההזרקה ולמדוד את עובי הרשתית לאורך זמן בתגובה לטיפול. ניתן להעריך את תפקוד הראייה לאחר ההזרקה גם על ידי ERG או בדיקת מבוך15,16. במקרה של טיפול גנטי בתיווך ויראלי IVT, יש לשקול את השפעת התגובה החיסונית ונוכחות נוגדנים מנטרלים לווקטורים של AAV. למרות שאינו חלק מהפרוטוקול המתואר כאן עבור כבשים, מוצע כי נבדקים נבדקים לנוכחות נוגדנים מנטרלים נגד AAV לפני טיפול גנטי, ללא קשר למסלול המתן, כדי להגביר את יעילות ההתמרה16,21. הקוראים מופנים לדיון מקיף יותר בסוגיית התגובות החיסוניות ל-AAV על ידי Whitehead et al.22.
סיבוך נפוץ במהלך הליכי IVT הוא דימום תת-לחמית (SCH)23, אשר יכול להתרחש אם נימי הלחמית bulbar מנוקבים במהלך החדרת מחט. למרבה המזל, SCH הוא בדרך כלל לא מזיק ופותר תוך מספר ימים; עם זאת, עדיף להימנע נימים הלחמית בעת החדרת המחט. לאחר הזרקת IVT, חשוב לטפל בעיניים המוזרקות בטיפות עיניים אנטיביוטיות (למשל, כלוראמפניקול) ולנטר את העיניים לאיתור סימנים של זיהום או דלקת (אובאיטיס). אירוע נפוץ נוסף במהלך הליכי IVT הוא עלייה ב- IOP. עליות אלה הן לרוב עליות חולפות בלחץ בדקות שלאחר ההזרקה ואינן גורמות לנזק ארוך טווח24,25. עם זאת, ישנם מקרים בהם יש לשקול ולפקח על IOP. כאשר קיימים מצבים עיניים קיימים כגון גלאוקומה, או כאשר נפחים גבוהים יותר (≥100 μL) מוזרקים, יש לעקוב מקרוב אחר IOP, ויש לשקול פרסנטזיס מניעתי של התא הקדמי כדי להפחית את הלחץ בגלובוס העין 4,16. בנוסף, קפיצות חוזרות ונשנות ב- IOP במקרה של זריקות IVT חוזרות ונשנות יכולות להיות דאגה ויש להחליש אותן כנ"ל4. כאן, אנו מדגימים IVT לצורך טיפול גנטי יחיד בתיווך AAV; לכן, ההשלכות ארוכות הטווח של זריקות חוזרות ונשנות אינן שיקול מרכזי.
המגבלות של זריקות IVT כוללות את הצורך לחדור מחסומים אנטומיים ואת ספציפיות המטרה הנמוכה יותר בהשוואה לשיטות פולשניות יותר. ראשית, החומר המוזרק יהיה מדולל בזגוגית ולאחר מכן יש מרחק להתפזר דרך חלל הזגוגית ורקמת הרשתית אל תאי המטרה. משמעות הדבר היא שהרשתית הפנימית מתמרת בקלות רבה יותר מאשר הרשתית החיצונית לאחר הזרקת IVT, וייתכן שיהיה צורך במינונים גבוהים יותר כדי לנטרל את הדילול26. הפרוטוקול המתואר כאן מדגיש את החשיבות של הזרקת קרוב ככל האפשר לרשתית כדי למתן את ההשפעות של דילול ודיפוזיה דרך הגוף הזגוגי. לכן, האורך המלא של פיר המחט 0.5 אינץ '/ 12.7 מ"מ מוכנס לתוך העין. היתרון הנוסף של החדרת אורך המחט המלא הוא הסיכוי המופחת לרפלוקס נוזלי במהלך הזרקה 4,27.
למרות שהפרוטוקול הנוכחי משמיט אותו, מומלץ לעכב את הסרת המחט למספר דקות לאחר ההזרקה כדי להפחית עוד יותר את הסיכויים לרפלוקס נוזלי. בנוסף, ההזרקה צריכה להיעשות באיטיות כדי להבטיח כי סילון של נוזל מוזרק לא לשבש את הרשתית או לגרום לזינוק מהיר ב- IOP, ומהירות מוגברת של הזרקה אינה משפיעה על שיעורי הדיפוזיה דרךהזגוגית 28,29. הממברנה המגבילה הפנימית (ILM) היא המחסום העיקרי בין הזגוגית לרשתית, אשר תפקידה להגביל את תנועת המולקולות לתוך הרשתית30. עם זאת, החדירות של ILM ניתן להגדיל על ידי עיכול או קילוף כירורגי והוא כנראה מוגברת בעין החולה, מה שהופך את החדירה של מולקולות טיפוליות קל יותר.
לגבי ספציפיות היעד, ניהול IVT יש הכי פחות בהשוואה לנתיבים תוך עיניים אחרים כגון subretinal ו suprachoroidal, כפי שנדון לעיל ובמקומות אחרים10. עם זאת, דורות חדשים של AAVs מפותחים באופן שגרתי כדי להכיל שינויים, אשר משפרים את המיקוד לסוגי תאים מסוימים או מתגברים ביעילות רבה יותר על מחסומים כגון ILM31. השימוש בקפסידים מותאמים כאלה הגביר את יעילות ההתמרה בעקבות מתן IVT במספר מיני מודל 5,32,33.
מטרת הטיפול הגנטי שפורט על ידי Murray et al.15 הייתה לספק עותק פונקציונלי של הגן CLN5 ; לכן, מדד אחד ליעילות הוא נוכחותם של תאים מתמרים המבטאים חלבון CLN5. ניסינו להשתמש באימונוהיסטוכימיה כדי לזהות תאים שעברו התמרת CLN5 ברשתית, כפי שאנו עושים באופן שגרתי ברקמת מוח של כבשים; עם זאת, הנוגדן שאנו משתמשים בו בדרך כלל ברקמת מוח צפה בחופשיות אינו פועל ברקמת רשתית משובצת פרפין. פתרון בעיות וחקירת דרכים חלופיות לגילוי הגן או החלבון המעניין ברשתית מתבצעים כדי להוסיף להערכת היעילות. אחת הדרכים האפשריות להשיג זאת היא על ידי הזרקת וקטור ויראלי המכיל גן מדווח (כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק; GFP) והערכת ביטוי GFP באמצעות אימונוהיסטוכימיה. דרך נוספת להעריך יעילות היא שימוש ב-PCR כמותי כדי להעריך את רמות הביטוי הטרנסגנים.
פיתוח פרוטוקולים לזריקות IVT בבעלי חיים גדולים הוא צעד מכריע לקראת טיפול במחלות ניווניות של הרשתית, במיוחד מחלות עם מרכיב גנטי, שכן טיפול גנטי IVT הוא טיפול פוטנציאלי מבטיח. עבור מחלות ניווניות שבהן הרשתית כבר שברירית, טיפול IVT מהווה פחות סיכון לניתוק הרשתית או לקרע. בהתחשב בדמיון בגודל ובמבנה של הכבשים והעיניים האנושיות, אופטימיזציה של המינון והנפח של זריקות IVT בכבשים היא צעד רלוונטי לקראת תרגום למרפאה. מאמר זה מפרט את הפרוטוקול להזרקת IVT לעין הכבש, שהוא בטוח ומראה שיעור נמוך מאוד של תגובות דלקתיות בעיניים. שיטה זו גם מדגימה את היעילות של טיפול גנטי בעיניים בתיווך AAV9 לטיפול במרכיב הרשתית של NCL בכבשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר סטיב היפ (BVSc, CertVOphthal) על עזרתו בהקמת פרוטוקול זה ובביצוע הזריקות שתוארו על ידי Murray et al.15. המחברים מכירים גם במימון של CureKids ניו זילנד, קרן המחקר הרפואי של קנטרברי, Neurogene Inc, והאגודה לתמיכה ומחקר של מחלות באטן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
References
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
- Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
- Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
- Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
- Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
- Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
- Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
- Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
- Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
- Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
- Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
- Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
- Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
- Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
- Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
- Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
- Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
- Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
- Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
- Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
- Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
- Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
- Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
- Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).
