将年轻的成年秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）暴露于不同浓度的商用农药或其他有毒物质中，持续2-24小时。随后，可利用表达荧光蛋白的品系对不同的神经元进行可视化观察。本文演示了如何使线虫接触农药并评估其神经元损伤情况。
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摘要
摘要
Caenorhabditis elegans 是一种强大的模式生物，被广泛用于众多研究实验室，以探究暴露于化学污染物、农药及其他多种有毒物质后所产生的生物学效应。这些线虫易于操作，即使在本科生物学实验室内，也可用于产生新颖的研究成果。通过一系列持续数周的、由学生主导的真实科研项目，学生可系统掌握行为学测量、细胞生物学和显微成像等方面的技术与方法，并将其应用于自主设计的研究课题中。其中一项关键技术是量化暴露于农药等化学毒物后出现神经退行性损伤的神经元百分比。将年轻成虫期的 C. elegans 线虫暴露于不同浓度的市售农药或其他类型毒物中，处理时间为 2–24 小时。随后，本科生可利用表达荧光蛋白的 C. elegans 品系来观察不同类型神经元的形态。该技术无需复杂的图像处理软件，即使在较低放大倍数下也具有良好的效果，因此无需昂贵的共聚焦显微镜。本文演示了如何用农药处理线虫，以及如何成像并评估神经元状态，并提供了一套简单明了的显微观察与神经元形态分析的操作流程。该技术所用材料成本低廉，大多数本科生物学实验室均可方便获取。该方法还可与运动行为、基础运动减缓或产卵行为等行为学指标相结合，开展一系列具有发表潜力的实验，使本科生以极低的成本获得真实的科研训练体验。
引言
Caenorhabditis elegans 是适用于生物学入门和中级课程中实验教学的理想模式生物。本实验方案可作为多周教学模块的一部分，用于探究常用农药对C. elegans行为及细胞生物学的多种影响。学生可借此学习如何设计并实施独立的研究项目，掌握数据分析与结果展示的技能。本文重点介绍将C. elegans暴露于农药混合物的实验步骤，以及后续对神经元形态变化的观察与分析方法。
草坪化学农药混合物广泛用于住宅和农业领域，可在任何本地园艺商店购买。人们日益关注这些化学物质对人类和野生动物的安全性1,2,3。学生可阅读科学文献，选择一种农药进行实验评估；在此过程中，他们能够学习基础生物学和神经生物学知识，以及实验设计与分析等重要的实验技能，还有移液、系列稀释、解剖显微镜操作、荧光显微镜观察、数码摄影和图表制作等基本实验技术。
本文所述的实验方案可作为生物学或神经科学中级课程中的独立实验，也可纳入一个持续数周的综合教学模块，该模块还可包括对特定神经元群所调控行为的测量。例如，本方案描述了利用一种在胆碱能神经元中表达绿色荧光蛋白GFP的线虫品系（LX 929）来评估调控运动的胆碱能神经元形态的方法4。这些线虫品系可从秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis elegans Genetics Center，https://cgc.umn.edu/）以极低价格获取。表达多巴胺能神经元GFP的品系（OH 7457）、胆碱能神经元GFP的品系（LX 929）或在所有神经元中表达mCherry的品系（PVX4）均为理想选择。学生还可同时测量线虫的运动行为，以获得与形态学评估相配套的行为数据。关于一个持续数周的学生小组项目的完整描述，可参见Susman的研究5。
该学生小组项目成本较低，易于为四人小组开展。所需材料包括解剖显微镜、可连接数码相机的荧光复合显微镜、培养皿、线虫生长琼脂培养基、生长受限的大肠杆菌（菌株OP50，来自CGC）、煤气灯本生灯或酒精灯、高压灭菌器、铂金丝，以及移液器、载玻片、盖玻片和玻璃巴斯德吸管等常规实验室用品。根据学生小组所测试的化学毒物种类，实验步骤可能需要在通风橱内操作或佩戴手套。本实验方案所用化学试剂为水溶性（非挥发性），并严格遵循制造商推荐的所有安全操作规程。
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方案
所有无脊椎动物的使用均符合本机构的动物护理和使用指南。
1. 农药包被培养皿的制备
- 使用标准方法制备琼脂培养皿（直径6 cm效果最佳）6。
注意：这些培养皿可提前数月制备，并储存于冰箱中备用。使用前将其置于实验台上恢复至室温（RT）。大多数情况下，应为每个学生小组提供对应每种农药稀释浓度的培养皿，包括一个水对照组。 - 在已标记的1.5 mL微量离心管中分别配制1 mL选定农药的各稀释液。为确保安全操作，请务必阅读说明书，并根据建议佩戴手套或在通风橱中操作。
注意：建议测试的稀释浓度包括：1 mL原液农药、1:10稀释液（100 µL农药 + 900 µL蒸馏水）、1:100稀释液（10 µL农药 + 990 µL水）、1:1000稀释液（取1:10稀释液10 µL + 990 µL水）等。 - 通过本生灯火焰小心弯曲一支玻璃巴斯德吸管（9 ml规格），并用火焰封闭其尖端，制成涂布棒。每次在培养皿上涂布前，均需用乙醇对涂布棒进行灭菌。
- 使用微量移液器将100 µL稀释液（或水对照）加至琼脂表面中央，再用已灭菌的涂布棒轻轻均匀涂布整个表面。每次使用前均需重新灭菌涂布棒。
- 将培养皿盖好后静置，使溶液充分渗入琼脂表面，直至"干燥"。
注意：根据农药种类及实验室湿度情况，此过程可能需要较长时间。学生可能需要在暴露处理前一天完成培养皿的制备。 - 对于暴露时间超过12小时的实验，在添加线虫前需向培养皿中加入50 µL过夜培养的Escherichia coli。对于急性实验（12小时或更短），培养皿中无需添加E. coli。
2. 将线虫添加到农药包被的培养板中
注意：学生需要准备一皿成年线虫（以培养5天的培养物为佳），菌株为荧光标记的LX929，该菌株可从秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis elegans Genetics Center）获得。本步骤有两种可选操作方案：如果学生此前已有线虫操作经验（例如，本实验为多周连续实验的一部分，且学生已掌握使用线虫挑取工具转移线虫的技术），请采用步骤2.1；若无相关经验，则请采用步骤2.2。
- 用线虫挑针挑取线虫。将一段1英寸长的铂金丝在本生灯火焰上熔接到巴斯德移液管上，制成线虫挑针。将挑针蘸取少量黏稠的 E. coli，然后利用该黏性小团挑取成年线虫。为获得足够的样本量，每块处理培养板需挑取10只线虫。
注意：缺乏经验的学生可按照步骤2.2–2.3操作。 - 使用微量移液器将1 mL无菌水加入线虫培养板中。轻轻晃动液体以悬浮线虫，随后将含有线虫的液体转移至1.5 mL微量离心管中。
- 让线虫在重力作用下静置沉降约10分钟，然后小心吸除至少500 µL上清液并弃去。重新悬浮线虫，使用剪去尖端的黄色移液器吸头，将50–100 µL悬浮液转移至每块处理培养板中。确保每块培养板至少含有10只成年线虫。
- 设置计时器或记录起始时间，在室温下对线虫进行预定时间的处理。在处理期间，准备用于湿封片的显微镜载玻片。载玻片应在显微观察当天制备。
注意：各学生小组应在独立研究设计阶段已确定其处理时间。
3. 制备湿封片显微镜载玻片
注意：步骤 3.1-3.3 可由每组学生独立完成。每组准备三张载玻片。
- 准备两张载玻片，仅在每张载玻片的一侧贴上标签胶带（图1，左图）。胶带用于确保琼脂糖形成厚度均匀的垫层。然后按照图示，在实验台面上将一张干净且未使用的载玻片置于这两张载玻片之间。
- 使用微量移液器吸取10 µL已融化的琼脂糖（3% ddH2O溶液，用65 °C干浴加热器加热融化），滴加至中间载玻片的中央位置。
- 如图所示（图1，右图），将另一张干净的载玻片垂直盖在滴有琼脂糖的载玻片上，通过施加压力使液滴展平，直至琼脂糖的厚度与标签胶带的厚度一致。
- 琼脂糖约在1分钟内凝固。随后，施加稳定压力将两张载玻片分开。琼脂糖圆片将附着于其中一张载玻片上。将此载玻片（琼脂糖面朝上）平放在实验台面上，静置干燥1–2分钟后再使用。
4. 将活体线虫固定在显微镜载玻片上
- 将含有 1 M 叠氮化钠（NaN3）的 5 µL 水滴加到带有琼脂糖垫的载玻片上，以加入线虫。该溶液可麻醉线虫并使其 immobilize（固定）。
注意：叠氮化钠储备溶液若被摄入可能引起中毒。 - 使用线虫挑取工具将线虫（每张处理载玻片至少 10 条）转移至液滴中。在使用挑取工具前后均需对其进行灭菌。
- 使用镊子以倾斜角度放置盖玻片，并缓慢放下。可使用铅笔或金属探针防止盖玻片滑动或下降过快。
- 将制备好的湿封片置于荧光显微镜下观察线虫，先在 10x 放大倍数下使用相差显微镜观察，再在 40x 放大倍数下结合相差显微镜与荧光照明进行观察。
5. 荧光显微镜
注意：学生小组应在不同的显微镜载玻片上分别制作每种类型的多个蠕虫的湿封片，并进行适当标记。以下说明是关于使用标准荧光复合显微镜的一般提示，该显微镜可配备三目镜装置、数码相机和计算机系统。本文所用设备设置如图2所示。学生应熟悉显微镜的各项设置，包括物镜、滤光片类型、明场与荧光模式之间的切换方法，以及如何将光信号传输至数码相机等操作。
- 每次将一个制备好的湿片置于显微镜载物台上，并使用显微镜载物台夹固定。
- 开始观察湿片时，首先使用最低放大倍数的物镜（通常为10x），采用明场或相差显微镜观察并聚焦线虫。
- 当在视野中找到线虫后，使用显微镜的细调焦旋钮对其进行聚焦。将照明模式切换至荧光，通过旋转转盘实现；然后将光线引导至相机以获取数字图像。使用成像软件调节照明强度，使神经元明亮可见但不发生过饱和。
- 在适当时候，以与细胞图像相同的放大倍数单独拍摄一段标尺的图像，以便为图示提供放大比例尺。将一小段透明标尺或镜台测微尺放置在显微镜载物台上，使用细调焦旋钮聚焦，并通过成像软件获取图像。
- 如条件允许，对至少10个独立的线虫在更高放大倍数下获取额外图像。强光可能会导致成像区域发生漂白，因此需密切监控成像过程，避免光线长时间照射在载玻片的同一区域。务必对获取的图像进行命名，以便记录对应的线虫、观察区域、处理条件及放大倍数。
- 在计算机上创建一个文件夹，并将所有图像移入该文件夹，用于后续分析和图表制作。
6. 形态完整性评估量表
注意：神经元中神经退行性损伤的一个关键细胞学特征是胞体形态的改变。有三种形态可以轻松观察和计数。
- 将细胞体不呈圆形、突起平滑且荧光均匀的神经元计数为正常神经元，如图3所示。
- 与健康的年轻神经元相比，神经元胞体常变得圆润且呈现肿胀外观。将呈现此类形态的神经元计数为"圆形"。
- 具有较长神经突起的神经元可能出现出芽样改变（blebbing），表现为突起上出现圆形小泡状结构，甚至出现断裂间隙。将表现出上述特征的神经元计数为"出芽样"。
7. 数据分析与图表制作
- 若已统计每种处理条件下至少十只线虫中健康（无变圆、无出泡）个体所占百分比及受损（变圆和/或出泡）个体所占百分比（图3），则使用现有的统计学软件进行统计分析。
- 计数所有荧光标记的神经元，分别记录具有正常形态、出泡形态或变圆形态的神经元数量，然后计算每只被分析线虫中各类形态神经元占总数的百分比。
- 制图时，将图像导入合适的软件（如Powerpoint），根据所获取的标尺或显微测微尺图像添加标注和比例尺。
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结果
本文所述的方法与实验方案为生物学或神经科学专业中等水平的本科生提供了重要的实验技能。学生可通过这些内容获得开展独立研究项目的重要经验，并实施自行设计的实验，从而可能获得新颖的研究结果。图3展示了一项学生成果的范例，该成果最终成为已发表论文的一部分3。尽管大多数学生项目无法达到发表水平，但大多数学生能够制作出结构严谨的图表及图注，并能够完成细胞计数、统计分析，以及绘制图表或制作数据表格。特定神经元调控特定行为。因此，当本实验作为包含运动能力检测或趋化性分析等其他测量指标的多周独立研究项目的一部分时，最终的研究成果将包含多个图表，并形成令学生自豪的课程报告。
学生小组可以选择希望研究的农药类型。根据他们对所选农药中活性成分的文献调研，学生可能会评估不同类型的神经元。由于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的所有神经元均已明确，且其功能已有详尽描述，学生可在自主设计的实验中选择特定类型的神经元进行研究，例如多巴胺能神经元或胆碱能神经元。本文提供的示例中，学生研究了...
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讨论
本文所述的实验方案可单独使用，也可作为多周学生自主小组项目的组成部分，同样适用于独立的一周探索性实验。线虫品系价格低廉，且在实验室中易于维持培养。学生可轻松掌握使用线虫挑取工具挑取线虫，或通过向培养板加水冲洗并利用重力沉降来转移线虫的方法。实验可在一次实验课内完成，也可分多周进行。学生可自主设计实验，也可由教师提供具体实验流程。解剖显微镜无需昂贵设备，实验中最昂贵的仪器是配备数码相机的荧光显微镜。对于无法获得荧光显微镜或数码相机的教学实验室而言，这构成了一定的限制。
如果实验室无法使用荧光显微镜、数码相机和计算机成像系统，学生可以测量由特定神经元调控的某些简单行为。多种行为检测方法均可采用，可在Wormbook中找到相关方法9。这些行为可通过解剖显微镜进行评估。
本方案中的一个关键步骤是为线虫的湿片制备显微镜载玻片。另一个关键步骤是将线虫加入液滴中。方案中的最后一个关键步骤是确保不要将线虫暴露在荧光照明下过长时间，以免导致信号漂白。教师应重点指出这些关键步骤，以便学生小组在操作时...
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披露
不存在需要披露的利益冲突。
致谢
本文所述工作是在神经科学中级课程中完成的。试剂和耗材的资金由瓦萨学院生物系提供。显微镜和数字成像系统也由瓦萨学院生物系提供。作者感谢所有选修本课程的学生们。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Fisher Scientific | BP97445 | |
| 琼脂糖 | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| 酒精灯 | Fisher Scientific | 17012826 | |
| 本生灯 | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans 菌株 | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| 胆固醇 | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| 数码相机 | Nikon | 可根据需求有所不同 | |
| 解剖显微镜 | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli 菌株（OP50） | C. elegans Genetics Center | ||
| 乙醇 | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | 可根据需求有所不同 | |
| 成像软件 | Nikon | 可根据需求有所不同 | |
| 接种环 | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB 液体培养基基础 | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| 微量离心管 | Fisher Scientific | 05408129 | |
| 载玻片 | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| 巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| 培养皿 | Fisher Scientific | AS4050 | |
| 移液器吸头 | Fisher Scientific | 94060316 | |
| 移液器 | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| 铂金丝 | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| 磷酸钾缓冲液 | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| 叠氮化钠 | Fisher Scientific | AC447810250 |
参考文献
- Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
- Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
- Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 15 (9), 0238637(2020).
- Jospin, M., et al. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 7 (12), 1000265(2009).
- Susman, K. Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , Wiley Blackwell. Hoboken, New Jersey. (2015).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. Metal-induced neurodegeneration in C. elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).
- Hart, A. Behavior. WormBook. , (2006).
- Harlow, P. H., et al. The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome. Scientific Reports. 6 (1), 22965(2016).
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