Summary
年轻的成年 秀丽隐杆线虫 暴露于不同浓度的商业杀虫剂或其他有毒物质2-24小时。然后，可以使用表达荧光的菌株可视化不同的神经元。本文演示了如何将线虫暴露在杀虫剂中并评估神经元损伤。
Abstract
秀丽隐杆线虫 是一种强大的模型生物，用于许多研究实验室，以了解暴露于化学污染物，杀虫剂和各种有毒物质的后果。这些线虫易于使用，可用于产生新的研究结果，即使在本科生物学实验室也是如此。为期数周的真实，学生驱动的研究项目实验室系列培训学生在行为测量，细胞生物学和显微镜方面的技术和方法工具包，然后将其应用于他们的项目。该工具包中的一项技术是量化在暴露于杀虫剂等化学毒物后表现出神经退行性损伤的神经元的百分比。年轻的成年 秀丽隐杆线 虫可以暴露于不同浓度的市售农药或其他类型的有毒物质2-24小时。然后，本科生可以使用 秀丽隐杆线虫的荧光表达菌株可视化不同的神经元亚型。这些技术不需要复杂的图像处理软件，即使在低放大倍率下也很有效，因此不需要昂贵的共聚焦显微镜。本文演示了如何用杀虫剂治疗线虫，以及如何对神经元进行成像和评分。它还为神经元形态学的显微镜检查和分析提供了一个简单的方案。用于该技术的材料价格低廉，并且在大多数本科生物系中都很容易获得。这种技术可以与运动，基础放慢或产卵等行为措施相结合，进行一系列可能可发表的实验，并以非常低的成本为本科生提供真实的研究体验。
Introduction
秀丽隐杆线虫 是一种优秀的模型生物，适用于入门级和中级学生的生物科学课程实验室课程培训。该实验室程序可以用作为期数周的模块的一部分，该模块探讨了常用杀虫剂对 秀丽隐杆线虫 行为和细胞生物学的各种影响。学生可以学习如何设计和开展独立的项目，教他们数据分析和演讲技巧。本文重点介绍将 秀丽隐杆线虫 暴露于农药混合物中的方案，然后观察和分析其对神经元形态的影响。
草坪化学农药混合物广泛用于住宅和农业用途，可以在任何当地的花园商店购买。人们越来越关注这些化学品对人类和野生动物的安全性1，2，3。学生可以阅读科学文献并选择农药进行实验评估，通过这样做，可以学习基本的生物学和神经生物学，以及重要的实验室技能，如实验设计和分析，以及一般实验室技能，如移液和连续稀释，解剖显微镜，荧光显微镜，数码摄影和人物制作。
本文中描述的协议可以单独在生物学或神经科学的中级课程中，也可以成为为期多周的模块的一部分，该模块还可以包括由特定神经元组控制的行为测量。例如，该协议中描述的是使用在胆碱能神经元中表达GFP（LX 929）的线虫菌株来控制运动的胆碱能神经元的形态的评估4。这些菌株可以从 秀丽隐杆线虫 遗传学中心（https://cgc.umn.edu/）以非常低的价格获得。在多巴胺能神经元（OH 7457），胆碱能神经元（LX 929）或所有神经元中表达的mCherry（PVX4）中表达GFP的菌株都是不错的选择。学生还可以测量运动并获得伴随形态评估的数据。关于一个为期多周的学生小组项目的完整描述可以在Susman5中找到。
这个学生小组项目非常便宜，很容易为四名学生的小组设置。所需的材料包括解剖显微镜，可以使用带有连接数码相机的荧光复合显微镜，培养皿和线虫生长琼脂，生长受限细菌（来自CGC的菌株OP50），气体火焰本生燃烧器或酒精灯，高压灭菌器，铂丝以及一般实验室用品，如微量移液器，显微镜载玻片， 盖玻片和玻璃巴斯德移液器。根据学生小组正在检查的化学毒物，协议中的步骤可能需要在通风橱下或戴手套下进行。该协议使用水溶性（非挥发性）的化学混合物，并遵循制造商建议的所有安全处理程序。
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Protocol
所有无脊椎动物的使用都符合该机构的动物护理和使用指南。
1. 农药包被培养皿的制备
- 使用标准程序准备琼脂培养皿（直径6厘米效果最佳）6.
注意：这些可以提前几个月制作，并储存在冰箱中直到使用。将板材带到台式上的室温 （RT）。在大多数情况下，应为学生团体提供每次稀释农药混合物的盘子，包括水控制。 - 在标记的1.5 mL微量离心管中制备1mL所选农药的每种稀释液。为了安全操作，请务必阅读说明并提供手套，或在通风橱中工作（如果建议）。
注意：建议稀释测试：1 mL全效农药，1：10水稀释（100 μL农药，900 μL蒸馏水），1：100稀释（10 μL农药，990 μL水），1：1000稀释（10 μL1：10稀释，990 μL水）等。 - 通过在本生燃烧器火焰中小心弯曲玻璃巴斯德移液器（9ml大小）来制作溶液撒布器。使用火焰关闭移液器的开口。然后在每次铺展到培养皿上之前对撒布器进行乙醇灭菌。
- 使用微量滴注器，将100μL稀释液（或水控制）放在琼脂的中心，并用灭菌的撒布器轻轻地涂抹在表面上。每次使用前对吊具进行重新灭菌。
- 将覆盖的培养皿放在一边，让溶液浸入表面直至“干燥”。
注意：根据实验室中的杀虫剂和湿度水平，这可能需要一些时间。学生可能需要在暴露期前一天准备他们的盘子。 - 对于超过12小时的暴露期，在加入线虫之前向平板中加入50μL 大肠杆菌 过夜培养物。对于急性实验（12小时或更短），不需要在平板上有 大肠杆菌 。
2. 将线虫添加到农药包衣板中
注意：学生需要有一盘荧光菌株LX929的成年线虫（最好进行5天培养），该菌株可从 秀丽隐杆线虫 遗传学中心获得。为此，有两种可能的过程。如果学生以前有过使用线虫的经验（例如，如果此过程是为期数周的练习的一部分，并且他们已经学会了如何使用蠕虫选择线虫），请使用步骤2.1。如果没有，请使用步骤 2.2。
- 用蠕虫镐挑线虫。使用本生燃烧器火焰将1英寸铂丝熔化到巴斯德移液器中，从1英寸铂丝中制作蠕虫镐。在镐上捡起一小团粘性 大肠杆菌 ，然后用粘性斑点捡起成年线虫。为了获得适当的样本量，为每个处理板选择10个线虫。
注意：没有太多经验的学生可以按照步骤2.2-2.3进行操作。 - 使用微量移液管将1mL无菌水放在线虫板上。将水漱口以提升线虫，然后将与线虫一起取出液体到1.5 mL微量离心管中。
- 让线虫在重力作用下沉降约10分钟，然后小心地除去至少500μL水并丢弃。重悬线虫，并使用切断的黄色移液器吸头，将50-100μL悬浮蠕虫除去到每个处理板上。确保每个盘子至少有10只成虫。
- 设置计时器，或记下时间，并在所选时间段内在RT处暴露线虫。在所选的曝光时间内，为湿式安装准备显微镜载玻片。载玻片应与显微镜检查在同一天制作。
注意：学生团体将在计划独立学习期间选择他们的暴露时间。
3. 为湿式安装准备显微镜载玻片
注意：步骤 3.1-3.3 可由每个学生组执行。每张准备三张幻灯片。
- 通过在载玻片的一侧仅放置一块标签胶带来准备两张载玻片（图1，左面板）。胶带用于为琼脂糖创建正确的厚度，以形成厚度均匀的垫。然后在工作台上放置一个干净的、未使用的滑块，如图所示。
- 使用微量滴注器将10μL熔化的琼脂糖（3%的ddH2O，使用65°C干式加热器加热）放在中间的载玻片中心。
- 通过将另一张干净的幻灯片放在顶部，垂直于带有液滴的幻灯片，使液滴变平，如图所示（图1，右面板）。通过施加压力使胶合物变平，因此琼脂糖滴形成标记带的厚度。
- 琼脂糖将在约1分钟内固化。然后，施加稳定的压力以分离两张载玻片。琼脂圈将粘附在其中一个幻灯片上。将这张载玻片，琼脂面朝上，放在台面上，让它干燥1-2分钟，然后再使用。
4. 将活线虫安装到显微镜载玻片上
- 要将线虫添加到具有琼脂糖垫的制备的载玻片中，向琼脂垫中加入含有1M叠氮化钠（NaN3）的5μL水滴。该解决方案麻醉蠕虫并使其固定。
注意：如果摄入叠氮化钠储备溶液，可能会导致疾病。 - 然后使用蠕虫镐将线虫（每张治疗玻片至少10个）转移到液滴上。在使用镐子转移线虫之前和之后对其进行消毒。
- 使用镊子添加盖玻片，方法是将其放置在一定角度并缓慢降低盖玻片。使用铅笔或金属探头防止盖玻片滑落或下降过快。
- 将准备好的湿支架放在荧光显微镜上观察蠕虫，首先在10倍放大倍率和相衬下，然后在40倍放大镜下，使用相衬和荧光灯照明。
5. 荧光显微镜
注意：学生小组应该在单独的显微镜载玻片上湿装每种类型的几种蠕虫，并应适当地标记。以下说明是关于使用标准荧光复合显微镜的一般提示，该显微镜可以连接三目设置，数码相机和计算机系统。用于此手稿的设置如图 2 所示。学生应熟悉显微镜的设置，包括物镜，滤光片的类型，在明场和荧光之间切换的能力，如何将光信号发送到数码相机等。
- 在显微镜载物台上一次放置一个准备好的湿支架，并使用显微镜载物台夹将其固定到位。
- 首先使用最低放大倍率物镜（通常为10倍）观看湿支架，并开始观察湿支架，并使用明场或相差来可视化和聚焦线虫。
- 一旦线虫位于视野中，使用显微镜上的精细聚焦旋钮对其进行聚焦。通过转动刻度盘将照明切换到荧光。然后将光线引导至相机以捕获数字图像。使用成像软件调整照明，使神经元明亮地照射，但不会过度饱和。
- 在某些时候，以与细胞图像相同的放大倍率获得标尺的单独图像，以为其图形提供放大比例。将透明尺子或千分尺载玻片的一小段放在显微镜载物台上，使用精细对焦旋钮对其进行聚焦，并使用成像软件获得图像。
- 如果可能，以更高的放大倍率获得其他图像（来自至少10个单独的线虫）。强光可能会漂白正在成像的区域，因此请仔细监控成像，不要让光线长时间停留在载玻片的同一区域。确保命名采集的图像，以跟踪线虫和区域，以及治疗和放大。
- 在计算机上创建一个文件夹，然后将图像移动到该文件夹中，以用于分析和图形准备。
6. 形态完整性评估量表
注意：神经元神经退行性损伤的一个关键细胞学特征是体细胞形态的变化。有三种形态可以很容易地查看和计数。
- 计数具有平滑，均匀荧光过程的神经元和非圆形细胞体为正常，如图 3所示。
- 通常，与健康，年轻的神经元相比，体细胞变得圆润和肿胀。将看起来像这样的神经元算作“四舍五入”。
- 具有长神经过程的神经元可以表现出出血，其中有圆形的puncta甚至间隙。将显示这些特征的神经元计为“出血”。
7. 数据分析和图表准备
- 如果计算了每次治疗至少十个线虫的健康百分比（无四舍五入，无血斑）和受损百分比（四舍五入和/或血斑）（图3），则使用可用的统计软件进行统计分析。
- 计算所有被荧光标记的神经元，记录那些表现出正常形态，出血形态或四舍五入形态的神经元，然后计算每种形态在所分析的每种线虫总数中的百分比。
- 要准备图表，请将图像导入适当的软件（如Powerpoint），然后根据获取的标尺或千分尺图像添加标签和比例尺。
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Representative Results
本文中描述的方法和方案为生物学或神经科学的中级本科生提供了重要的实验室技能。学生可以在开发独立项目和进行自己的设计实验中获得重要的经验，这些实验可以提供新颖的结果。 图3 显示了最终成为已发表论文3一部分的学生项目的最佳结果。虽然大多数学生项目不会产生可发布的结果，但大多数学生能够创建复杂的数字图例，并且大多数学生还能够获得细胞计数，进行统计分析以及创建图形或数据表。特定的神经元控制着特定的行为。因此，当该程序是为期数周的独立项目的一部分时，该项目包括其他测量，如运动或趋化性测定，由此产生的项目会产生多个数字和学生可以自豪的课堂演示。
学生团体可以选择他们希望探索的农药类型。根据他们对他们选择的农药活性成分的文献研究，学生可能会评估不同的神经元。由于 秀丽隐杆线虫 中的所有神经元都是已知的，并且它们的功能得到了很好的描述，学生可以选择特定的神经元类型，如多巴胺神经元或胆碱能神经元，在独立设计的实验中进行研究。在本手稿中提供的示例中，学生检查了一种新烟碱类杀虫剂，并使用在胆碱能神经元中表达GFP的线虫荧光菌株来关注胆碱能神经元。另一个例子如图 4所示，显示了一个学生小组的更典型的结果，该研究小组使用多巴胺神经元表达GFP的菌株（OH7457）检查了含锰农药对多巴胺能神经元的影响。这种特殊的菌株在多巴胺神经元中显示出明亮的信号，并且神经元很容易被学生可视化。然而，随着时间的推移，如果神经元长时间暴露在光线下，荧光信号就会漂白，就像这个学生组一样。
如果课程中的学生对荧光显微镜的经验很少，那么最好在额外的一周内为学生提供重复实验的机会，因为他们的技能会随着实践而大大提高。
对于实验室讲师来说，一个具有挑战性的方面是，如果有多个小组，每个小组评估不同神经元类型的形态。不同的荧光菌株的获得或维护成本并不高，但是手头上有许多不同的荧光菌株需要更多的努力。但是，可以将项目类型限制为可用的应变和资源。对本科生非常有效的菌株包括LX929和OH7547菌株。PVX4是一种泛神经元表达mCherry，也是一种非常容易与7，8一起使用的菌株。
图1：如何为 秀丽隐杆线虫的湿装座制备显微镜载玻片的图表。 左图显示了标签胶带和2%-3%琼脂糖（10μL）液滴的位置。然后，在右侧面板中，以90°角将第二张载玻片放置在顶部，以将琼脂糖液滴压平至胶带的厚度。一旦琼脂糖固化，载玻片就会被小心地分离。琼脂糖垫将粘附在其中一个载玻片上。为了防止干燥，线虫在用垫子生产载玻片后一小时内被放入含有叠氮化钠（使线虫麻痹）的缓冲液滴中。 请点击此处查看此图的大图。
图2：本研究中使用的带有数码相机的荧光显微镜。 显微镜位于一张桌子上，可容纳一小群（三到四名学生）。显微镜有一个数码相机，通过USB电缆连接到具有适当数字图像捕获软件的计算机。 请点击此处查看此图的大图。
图3：评估含新烟碱类杀虫剂对神经元形态的影响。 （A）来自荧光菌株LX929的未经处理的胆碱能神经元。（B） 农药暴露（T+S）胆碱能神经元。（C）在这两种情况下表现出出血的神经元的百分比。误差线是均值的标准误差。表示 p <单因子方差分析 0.001。共分析了来自12个线虫的113个神经元。这个数字是从Bradford等人3修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图4：含锰农药对多巴胺神经元形态的影响。 学生组没有为他们的身材提供比例尺，而是以40倍放大倍率拍摄图像。（A）推定的CEPDL和CEPVL神经元体瘤（标记）在对照蠕虫中。完整的头部神经元体细胞及其过程表明缺乏退化。（B）急性暴露蠕虫的推定CEPD L&R过程（星号）和CEPV L&R神经元体瘤（标记）。体细胞和过程表达了GFP，但在背突中GFP表达似乎有抑制。（C）慢性暴露蠕虫的推定CEPDL和CEPVL神经元体瘤（标记）。体细胞不表达GFP，并且过程不可见，表明显着退化。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本手稿中描述的协议成功地单独工作或作为为期数周的独立学生小组项目的一部分。这些协议也适合于独立的，为期一周的探索性体验。线虫菌株价格便宜，易于在研究实验室中维护。学生可以很容易地学习如何用蠕虫镐来挑选蠕虫，或者如何通过用水冲洗板并允许它们通过重力沉降来移动它们。实验可以在单个实验室期间或数周内进行。学生可以独立设计他们的实验，或者可以向他们提供程序。解剖显微镜不一定很昂贵。最昂贵的物品是带数码相机的荧光显微镜。对于无法使用荧光显微镜或数码相机的教学实验室来说，这是一个限制。
如果荧光显微镜，数码相机和计算机成像系统不能在实验室中使用，学生可以测量由特定神经元控制的特定简单行为。有许多行为检测可用，可以在Wormbook9中找到。可以使用解剖显微镜评估行为。
该协议中的关键步骤是为线虫的湿支架准备显微镜载玻片。另一个关键步骤是将线虫添加到液滴中。该协议的最后一个关键步骤是确保线虫不会在荧光灯照射下暴露太长时间，以至于它漂白了信号。对于教师来说，指出这些关键步骤非常重要，以便学生团体练习并密切关注他们所得到的指示。
这种方法最令人兴奋的方面是，学生可以设计和进行新颖而真实的实验，这些实验可以产生可发表的结果或成为更高级研究的基础，如高级研究项目。这些程序可用于研究各种农药，农药混合物和许多其他不同的环境化学品10，这为学生提供了在实验设计，数据分析，图形制备和结果呈现方面真正相关的研究经验和培训。
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Disclosures
没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
本手稿中描述的工作是为神经科学的中级课程完成的。试剂和用品的资金由瓦萨学院的生物系提供。显微镜和数字成像系统也由瓦萨学院的生物系提供。作者感谢所有参加这门课程的许多学生。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
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