检测杀虫剂对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）神经元的影响

摘要

将年轻的成年秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）暴露于不同浓度的商用农药或其他有毒物质中，持续2-24小时。随后，可利用表达荧光蛋白的品系对不同的神经元进行可视化观察。本文演示了如何使线虫接触农药并评估其神经元损伤情况。

摘要

Caenorhabditis elegans 是一种强大的模式生物，被广泛用于众多研究实验室，以探究暴露于化学污染物、农药及其他多种有毒物质后所产生的生物学效应。这些线虫易于操作，即使在本科生物学实验室内，也可用于产生新颖的研究成果。通过一系列持续数周的、由学生主导的真实科研项目，学生可系统掌握行为学测量、细胞生物学和显微成像等方面的技术与方法，并将其应用于自主设计的研究课题中。其中一项关键技术是量化暴露于农药等化学毒物后出现神经退行性损伤的神经元百分比。将年轻成虫期的 C. elegans 线虫暴露于不同浓度的市售农药或其他类型毒物中，处理时间为 2–24 小时。随后，本科生可利用表达荧光蛋白的 C. elegans 品系来观察不同类型神经元的形态。该技术无需复杂的图像处理软件，即使在较低放大倍数下也具有良好的效果，因此无需昂贵的共聚焦显微镜。本文演示了如何用农药处理线虫，以及如何成像并评估神经元状态，并提供了一套简单明了的显微观察与神经元形态分析的操作流程。该技术所用材料成本低廉，大多数本科生物学实验室均可方便获取。该方法还可与运动行为、基础运动减缓或产卵行为等行为学指标相结合，开展一系列具有发表潜力的实验，使本科生以极低的成本获得真实的科研训练体验。

引言

Caenorhabditis elegans 是适用于生物学入门和中级课程中实验教学的理想模式生物。本实验方案可作为多周教学模块的一部分，用于探究常用农药对C. elegans行为及细胞生物学的多种影响。学生可借此学习如何设计并实施独立的研究项目，掌握数据分析与结果展示的技能。本文重点介绍将C. elegans暴露于农药混合物的实验步骤，以及后续对神经元形态变化的观察与分析方法。

草坪化学农药混合物广泛用于住宅和农业领域，可在任何本地园艺商店购买。人们日益关注这些化学物质对人类和野生动物的安全性^1,2,3。学生可阅读科学文献，选择一种农药进行实验评估；在此过程中，他们能够学习基础生物学和神经生物学知识，以及实验设计与分析等重要的实验技能，还有移液、系列稀释、解剖显微镜操作、荧光显微镜观察、数码摄影和图表制作等基本实验技术。

本文所述的实验方案可作为生物学或神经科学中级课程中的独立实验，也可纳入一个持续数周的综合教学模块，该模块还可包括对特定神经元群所调控行为的测量。例如，本方案描述了利用一种在胆碱能神经元中表达绿色荧光蛋白GFP的线虫品系（LX 929）来评估调控运动的胆碱能神经元形....

方案

所有无脊椎动物的使用均符合本机构的动物护理和使用指南。

1. 农药包被培养皿的制备

1. 使用标准方法制备琼脂培养皿（直径6 cm效果最佳）⁶。
   注意：这些培养皿可提前数月制备，并储存于冰箱中备用。使用前将其置于实验台上恢复至室温（RT）。大多数情况下，应为每个学生小组提供对应每种农药稀释浓度的培养皿，包括一个水对照组。
2. 在已标记的1.5 mL微量离心管中分别配制1 mL选定农药的各稀释液。为确保安全操作，请务必阅读说明书，并根据建议佩戴手套或在通风橱中操作。
   注意：建议测试的稀释浓度包括：1 mL原液农药、1:10稀释液（100 µL农药 + 900 µL蒸馏水）、1:100稀释液（10 µL农药 + 990 µL水）、1:1000稀释液（取1:10稀释液10 µL + 990 µL水）等。
3. 通过本生灯火焰小心弯曲一支玻璃巴斯德吸管（9 ml规格），并用火焰封闭其尖端，制成涂布棒。每次在培养皿上涂布前，均需用乙醇对涂布棒进行灭菌。
4. 使用微量移液器将100 µL稀释液（或水对照）加至琼脂表面中央，再用已灭菌的涂布棒轻轻均匀涂布整个表面。每次使用前均需重新灭菌涂布棒。
5. 将培养皿盖好后静置，使溶液充分渗入琼脂表面，直至"干燥"。
   ​注....

结果

本文所述的方法与实验方案为生物学或神经科学专业中等水平的本科生提供了重要的实验技能。学生可通过这些内容获得开展独立研究项目的重要经验，并实施自行设计的实验，从而可能获得新颖的研究结果。图3展示了一项学生成果的范例，该成果最终成为已发表论文的一部分³。尽管大多数学生项目无法达到发表水平，但大多数学生能够制作出结构严谨的图表及图注，并能够完成细胞计数、统计分析，以及绘制图表或制作数据表格。特定神经元调控特定行为。因此，当本实验作为包含运动能力检测或趋化性分析等其他测量指标的多周独立研究项目的一部分时，最终的研究成果将包含多个图表，并形成令学生自豪的课程报告。

学生小组可以选择希望研究的农药类型。根据他们对所选农药中活性成分的文献调研，学生可能会评估不同类型的神经元。由于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的所有神经元均已明确，且其功能已有详尽描述，学生可在自主设计的实验中选择特定类型的神经元进行研究，例如多巴胺能神经元或胆碱能神经元。本文提供的示例中，学生研究了.......

讨论

本文所述的实验方案可单独使用，也可作为多周学生自主小组项目的组成部分，同样适用于独立的一周探索性实验。线虫品系价格低廉，且在实验室中易于维持培养。学生可轻松掌握使用线虫挑取工具挑取线虫，或通过向培养板加水冲洗并利用重力沉降来转移线虫的方法。实验可在一次实验课内完成，也可分多周进行。学生可自主设计实验，也可由教师提供具体实验流程。解剖显微镜无需昂贵设备，实验中最昂贵的仪器是配备数码相机的荧光显微镜。对于无法获得荧光显微镜或数码相机的教学实验室而言，这构成了一定的限制。

如果实验室无法使用荧光显微镜、数码相机和计算机成像系统，学生可以测量由特定神经元调控的某些简单行为。多种行为检测方法均可采用，可在Wormbook中找到相关方法⁹。这些行为可通过解剖显微镜进行评估。

本方案中的一个关键步骤是为线虫的湿片制备显微镜载玻片。另一个关键步骤是将线虫加入液滴中。方案中的最后一个关键步骤是确保不要将线虫暴露在荧光照明下过长时间，以免导致信号漂白。教师应重点指出这些关键步骤，以便学生小组在操作时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Fisher Scientific	BP97445
琼脂糖	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
酒精灯	Fisher Scientific	17012826
本生灯	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans 菌株	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
胆固醇	Fisher Scientific	AAA1147030
盖玻片	Fisher Scientific	12-545-AP
数码相机	Nikon		可根据需求有所不同
解剖显微镜	Nikon	SMZ745
E. coli 菌株（OP50）	C. elegans Genetics Center
乙醇	Fisher Scientific	BP2818100
荧光显微镜	Nikon		可根据需求有所不同
成像软件	Nikon		可根据需求有所不同
接种环	Fisher Scientific	131045
LB 液体培养基基础	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
微量离心管	Fisher Scientific	05408129
载玻片	Fisher Scientific	22-265446
巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20A
培养皿	Fisher Scientific	AS4050
移液器吸头	Fisher Scientific	94060316
移液器	Fisher Scientific	14-386-319
铂金丝	Genesee Scientific	59-1M30P
磷酸钾缓冲液	Fisher Scientific	AAJ61413AP
叠氮化钠	Fisher Scientific	AC447810250