Examinando o efeito dos pesticidas em Caenorhabditis elegans Neurônios

Summary

Os nematoides de caenorhabditis para jovens adultos são expostos a diferentes concentrações de pesticidas comerciais ou outros tóxicos por 2-24 h. Em seguida, diferentes neurônios podem ser visualizados usando cepas fluorescentes. Este artigo demonstra como expor nematoides a pesticidas e avaliar danos aos neurônios.

Abstract

Caenorhabditis elegans é um poderoso organismo modelo usado em muitos laboratórios de pesquisa para entender as consequências da exposição a poluentes químicos, pesticidas e uma grande variedade de substâncias tóxicas. Esses nematoides são fáceis de trabalhar e podem ser usados para gerar novos achados de pesquisa, mesmo no laboratório de biologia da graduação. Uma série de laboratórios de vários dias de projetos de pesquisa autênticos e orientados por estudantes treina os alunos em um kit de ferramentas de técnicas e abordagens em medidas comportamentais, biologia celular e microscopia que eles então aplicam em seus projetos. Uma técnica nesse kit de ferramentas é quantificar a porcentagem de neurônios que exibem danos neurodegenerativos após a exposição a um toxicante químico como um pesticida. Nematoides jovens adultos C. elegans podem ser expostos a diferentes concentrações de pesticidas disponíveis comercialmente ou outros tipos de tóxicos por 2-24 h. Em seguida, os estudantes de graduação podem visualizar diferentes subtipos de neurônios usando cepas fluorescentes de C. elegans. Essas técnicas não exigem software sofisticado de processamento de imagem e são eficazes até mesmo em baixas ampliações, tornando desnecessária a necessidade de microscopia confocal cara. Este artigo demonstra como tratar os nematoides com pesticidas e como imaginar e pontuar os neurônios. Também fornece um protocolo simples para a microscopia e análise da morfologia do neurônio. Os materiais utilizados para esta técnica são baratos e prontamente disponíveis na maioria dos departamentos de biologia de graduação. Essa técnica pode ser combinada com medidas comportamentais como locomoção, desaceleração basal ou colocação de ovos para realizar uma série potencialmente publicável de experimentos e dar aos estudantes de graduação uma experiência de pesquisa autêntica a um custo muito baixo.

Introduction

Caenorhabditis elegans é um excelente organismo modelo para formação de cursos laboratoriais em cursos de ciências biológicas para alunos de nível introdutório e intermediário. Este procedimento laboratorial pode ser usado como parte de um módulo de várias semanas que explora vários efeitos de pesticidas comumente usados no comportamento de C. elegans e biologia celular. Os alunos podem aprender a projetar e realizar projetos independentes que lhes ensinam habilidades de análise de dados e apresentação. Este artigo se concentra nos protocolos para expor C. elegans a misturas de pesticidas e, em seguida, observar e analisar os efeitos sobre a morfologia do neurônio.

Misturas de pesticidas químicos de gramado são amplamente utilizadas para uso residencial e agrícola e podem ser compradas em qualquer loja de jardim local. Há uma preocupação crescente com a segurança desses produtos químicos para humanos e vida selvagem ^1,2,3. Os alunos podem ler a literatura científica e selecionar um pesticida para avaliação experimental e, ao fazê-lo, podem aprender sobre biologia básica e neurobiologia, bem como importantes habilidades laboratoriais, como design e análise experimental, e habilidades gerais de laboratório como pipetação e diluições seriais, microscopia dissecando, microscopia fluorescente, fotografia digital e produção de figuras.

Os protocolos descritos neste artigo podem ficar sozinhos em um curso de nível intermediário em biologia ou neurociência ou fazer parte de um módulo de várias semanas que também poderia incluir medições de comportamentos regidos por determinados grupos de neurônios. Por exemplo, descrito neste protocolo é uma avaliação da morfologia dos neurônios colinérgicos que governam a locomoção usando uma cepa de nematoide que expressa GFP (LX 929) em neurônios colinérgicos⁴. Essas cepas podem ser obtidas por preços muito baixos do Centro de Genética De Caenorhabditis Elegans (https://cgc.umn.edu/). Cepas expressas GFP em neurônios dopaminérgicos (OH 7457), neurônios colinérgicos (LX 929) ou mCherry expressos em todos os neurônios (PVX4) são todas boas escolhas. Os alunos também poderiam medir a locomoção e obter dados para acompanhar a avaliação da morfologia. Uma descrição completa de um projeto de grupo estudantil de várias semanas pode ser encontrada em Susman⁵.

Este projeto de grupo estudantil é bastante barato e fácil de configurar para grupos de quatro alunos. Os materiais necessários incluem um microscópio dissecando, acesso a um microscópio composto de fluorescência que pode ter uma câmera digital anexada, placas de Petri e acesso a ágar de crescimento de nematoide, bactérias limitadas ao crescimento (cepa OP50, do CGC), um queimador bunsen de chama de gás ou uma lâmpada de álcool, uma autoclave, fio de platina e suprimentos de laboratório gerais como micropipetters, slides de microscópio, tampas, e pipetas pasteur de vidro. Dependendo do toxicante químico que está sendo examinado pelos grupos estudantis, as etapas do protocolo podem precisar ocorrer sob um capuz de fumaça ou com luvas. Este protocolo utiliza misturas químicas solúveis em água (não voláteis), e todos os procedimentos de manuseio seguro recomendados pelo fabricante são seguidos.

Protocol

Todo o uso de animais invertebrados foi em conformidade com as orientações de cuidado animal e uso da instituição.

1. Preparação de placas de Petri revestidas de pesticidas

1. Prepare as placas de ágar Petri (6 cm de diâmetro funcionam melhor) utilizando procedimentos padrão⁶.
   NOTA: Estes podem ser feitos com meses de antecedência e armazenados na geladeira até o uso. Leve as placas à temperatura ambiente (RT) no banco. Na maioria dos casos, os grupos estudantis devem ser fornecidos com uma placa para cada diluição da mistura de pesticidas, incluindo um controle de água.
2. Prepare 1 mL de cada diluição do pesticida escolhido nos tubos de microfuça de 1,5 mL rotulados. Para um manuseio seguro, certifique-se de ler as instruções e fornecer luvas, ou trabalhar em um capô de fumaça, se sugerido.
   NOTA: Diluições sugeridas para testar: 1 mL de pesticida de força total, 1:10 diluição na água (100 μL de pesticida, 900 μL de água destilada), diluição de 1:100 (10 μL de pesticida, 990 μL de água), 1:1000 diluição (10 μL da diluição de 1:10, 990 μL de água), etc.
3. Faça um espalhador de solução dobrando cuidadosamente uma pipeta Pasteur de vidro (tamanho 9 ml) em uma chama de queimador Bunsen. Use a chama para fechar a abertura da pipeta. Em seguida, o etanol esteriliza o espalhador antes de cada um se espalhar na placa de Petri.
4. Usando uma micropipetter, coloque 100 μL da diluição (ou controle de água) no centro do ágar e espalhe suavemente pela superfície com o espalhador esterilizado. Reessarnize o espalhador antes de cada uso.
5. Reserve as placas de Petri cobertas e deixe a solução mergulhar na superfície até "secar".
   NOTA: Dependendo dos níveis de pesticidas e umidade em laboratório, isso pode levar algum tempo. Os alunos podem precisar preparar seus pratos um dia antes do período de exposição.
6. Para períodos de exposição maiores que 12 h, adicione 50 μL de uma cultura durante a noite de Escherichia coli às placas antes de adicionar os nematoides. Para experimentos agudos (12 h ou menos), não há necessidade de ter E. coli nas placas.

2. Adicionando nematoides a placas revestidas de pesticidas

NOTA: Os alunos precisarão ter um prato de nematoides adultos (as culturas de 5 dias são as melhores) da cepa fluorescente LX929, que está disponível no Centro de Genética De Caenorhabditis Elegans . Há dois procedimentos possíveis para isso. Se os alunos tiveram experiência anterior trabalhando com nematoides (por exemplo, se esse procedimento faz parte de um exercício de várias semanas e já aprenderam a escolher nematoides com uma picareta de vermes), use o Passo 2.1. Se não o fizerem, use o passo 2.2.

1. Escolha nematoides com uma picareta de vermes. Fore uma picareta de um pedaço de fio de platina que é derretido a uma pipeta Pasteur usando uma chama de queimador Bunsen. Pegue uma pequena bolha de E. coli pegajoso na picareta e, em seguida, pegue nematoides adultos usando a bolha pegajosa. Para um tamanho amostral decente, escolha 10 nematoides para cada placa de tratamento.
   NOTA: Estudantes sem muita experiência podem acompanhar as Etapas 2.2-2.3.
2. Use uma micropipette para colocar 1 mL de água estéril na placa de nematoides. Swish a água ao redor para levantar os nematoides, em seguida, remova o líquido com os nematoides para um tubo de microfuge de 1,5 mL.
3. Deixe os nematoides se estabelecerem por gravidade por cerca de 10 minutos, depois remova cuidadosamente pelo menos 500 μL da água e descarte. Resuspenque os nematoides e, usando uma ponta de pipeta amarela cortada, remova 50-100 μL de vermes suspensos em cada placa de tratamento. Certifique-se de que cada placa tem pelo menos 10 vermes adultos.
4. Defina um temporizador ou observe a hora e exponha os nematoides no RT para o período de tempo escolhido. Durante o tempo de exposição escolhido, prepare slides de microscópio para montagens molhadas. Os slides devem ser feitos no mesmo dia da microscopia.
   NOTA: Os grupos de estudantes terão escolhido seu tempo de exposição durante o planejamento de seu estudo independente.

3. Preparando slides de microscópio para montagens molhadas

NOTA: As etapas 3.1-3.3 podem ser realizadas por cada grupo de estudantes. Prepare três slides cada.

1. Prepare dois slides colocando uma fita de etiqueta em apenas um lado do slide (Figura 1, painel esquerdo). A fita é usada para criar a espessura correta para a agarose para formar uma almofada de espessura uniforme. Em seguida, posicione um slide limpo e nãousado entre eles no banco, como ilustrado na figura.
2. Use uma micropipetter para colocar uma gota de 10 μL de agarose derretida (3% em ddH₂O, aquecido usando um aquecedor de bloco seco de 65 °C) no centro do escorregador que fica no meio.
3. Achate a gota colocando outro slide limpo na parte superior, perpendicular ao slide com a gota, como mostrado na figura (Figura 1, painel direito). Achatar aplicando pressão, de modo que a gota de agarose forma a espessura da fita de rotulagem.
4. A agarose se solidificará em cerca de 1 min. Em seguida, aplique pressão constante para separar os dois slides. O círculo de ágar vai aderir a um dos slides. Descanse este slide, lado de ágar para cima, no banco, e deixe secar por 1-2 minutos antes de usar.

4. Montagem de nematoides vivos para slides de microscópio

1. Para adicionar nematoides ao slide preparado com a almofada de agarose, adicione uma gota de 5 μL de água contendo 1 M de azida de sódio (NaN₃) à almofada de ágar. Esta solução anestesia os vermes e os imobiliza.
   ATENÇÃO: A solução de azida de sódio pode causar doenças se ingerida.
2. Em seguida, transfira nematoides (pelo menos 10 por slide de tratamento) para a gotícula usando uma picareta de vermes. Esterilize a picareta antes e depois de usá-la para transferir nematoides.
3. Use fórceps para adicionar uma mancha de cobertura colocando-a em um ângulo e baixando-a lentamente. Evite que a mancha de cobertura escorregue ou baixe muito rapidamente usando um lápis ou sonda metálica.
4. Coloque o suporte molhado preparado em um microscópio fluorescente para observar os vermes, primeiro sob ampliação de 10x e contraste de fase, depois sob ampliação de 40x com contraste de fase e iluminação fluorescente.

5. Microscopia fluorescente

NOTA: Os grupos de estudantes devem fazer um montão molhado de vários worms de cada tipo em slides de microscópio separados, que eles devem rotular adequadamente. As instruções a seguir são dicas gerais sobre o uso de um microscópio composto de fluorescência padrão que pode ter uma configuração trinocular anexada, câmera digital e sistema de computador. A configuração usada para este manuscrito é vista na Figura 2. Os alunos devem estar familiarizados com as configurações do microscópio, incluindo os objetivos, tipos de filtros de luz, capacidade de alternar entre campo brilhante e luz de fluorescência, como enviar o sinal de luz para a câmera digital, etc.

1. Coloque uma montagem molhada preparada de cada vez no palco do microscópio e fixe-a no lugar usando os clipes do estágio do microscópio.
2. Comece a visualizar as montagens molhadas pela primeira visualização com o objetivo de ampliação mais baixo, que normalmente é 10x, e use campo brilhante ou contraste de fase para visualizar e focar nos nematoides.
3. Uma vez que um nematoide esteja localizado no campo de visão, concentre-se nele usando o botão de foco fino no microscópio. Mude a iluminação para a fluorescência girando o mostrador. Em seguida, direcione a luz para a câmera para capturar as imagens digitais. Ajuste a iluminação usando o software de imagem para que os neurônios estejam brilhantemente iluminados, mas não supersaturados.
4. Em algum momento, obtenha uma imagem separada de uma régua na mesma ampliação que as imagens celulares para fornecer uma escala de ampliação para sua figura. Coloque uma pequena seção de uma régua transparente, ou um slide de micrômetro, no estágio do microscópio, concentre-se nele usando o botão de foco fino e obtenha uma imagem usando o software de imagem.
5. Obtenha imagens adicionais (de pelo menos 10 nematoides separados) em ampliações mais altas, se possível. A luz intensa provavelmente clareará a área de onde está sendo imagem, então monitore cuidadosamente a imagem e não permita que a luz permaneça na mesma área do slide por longos períodos de tempo. Não deixe de citar as imagens adquiridas para acompanhar o nematoide e região, bem como o tratamento e ampliação.
6. Faça uma pasta no computador e mova as imagens para a pasta para uso na análise e preparação de figuras.

6. Escala de avaliação da integridade morfológica

NOTA: Uma característica citológica chave do dano neurodegenera nos neurônios é uma mudança na morfologia soma. Existem três morfologias que podem ser facilmente vistas e contadas.

1. Conte os neurônios com processos suaves e uniformemente fluorescentes e corpos celulares não redondos como normal, como mostrado na Figura 3.
2. Muitas vezes a soma se torna arredondada e inchada em comparação com neurônios jovens e saudáveis. Conte os neurônios que se parecem com isso como "arredondados".
3. Neurônios com processos neurais longos podem exibir sangramentos, onde há puncta arredondada ou mesmo lacunas nos processos. Conte os neurônios que mostram essas características como "sangrado".

7. Análise de dados e elaboração de figuras

1. Se a porcentagem saudável (sem arredondamento, sem blebbing) e a porcentagem prejudicada (arredondamento e/ou blebbing) para pelo menos dez nematoides para cada tratamento foram contabilizados (Figura 3), realizem análises estatísticas utilizando software estatístico disponível.
2. Conte todos os neurônios que são marcados fluorescentemente, mantendo uma contagem daqueles que apresentam morfologia normal, morfologia blebbing ou morfologia arredondada, e então calcular a porcentagem de cada morfologia fora da contagem total para cada nematoide analisado.
3. Para preparar figuras, importe as imagens em um software apropriado como o Powerpoint e, em seguida, adicione etiquetas e uma barra de escala baseada na imagem da régua ou micrômetro adquirida.

Representative Results

Os métodos e protocolos descritos neste artigo fornecem importantes habilidades laboratoriais para estudantes de graduação de nível intermediário em biologia ou neurociência. Os alunos podem adquirir experiências importantes no desenvolvimento de um projeto independente e na condução de um experimento de seu próprio design que poderia fornecer novos resultados. A Figura 3 mostra um resultado ideal de um projeto estudantil que eventualmente se tornou parte de um artigo publicado³. Embora a maioria dos projetos estudantis não resulte em resultados publicáveis, a maioria dos alunos é capaz de criar uma figura sofisticada e uma lenda da figura, e a maioria também é capaz de obter contagem celular, realizar análise estatística e criar uma figura ou tabela de dados. Neurônios particulares governam comportamentos específicos. Assim, quando este procedimento faz parte de um projeto independente de várias semanas que inclui outras medidas como ensaios de locomoção ou quimiotaxis, o projeto resultante rende múltiplos números e uma apresentação de classe da qual os alunos podem se orgulhar.

Grupos de estudantes podem escolher o tipo de pesticida que desejam explorar. Dependendo de suas pesquisas bibliodesuídas sobre o ingrediente ativo do pesticida que selecionaram, os alunos podem avaliar diferentes neurônios. Como todos os neurônios em C. elegans são conhecidos e suas funções bem descritas, os alunos podem escolher tipos neuronais específicos, como neurônios de dopamina ou neurônios colinérgicos, para estudar em um experimento projetado independentemente. No exemplo fornecido neste manuscrito, os alunos examinaram um pesticida neonicotinóide e se concentraram em neurônios colinérgicos usando uma cepa fluorescente de nematoide expressando GFP em neurônios colinérgicos. Outro exemplo, mostrado na Figura 4, mostra um resultado mais típico de um grupo de estudantes que examinou os efeitos de um pesticida contendo manganês em neurônios dopaminérgicos usando uma cepa na qual os neurônios de dopamina expressam GFP (OH7457). Esta cepa em particular mostra um sinal brilhante nos neurônios da dopamina, e os neurônios foram prontamente visualizados pelos alunos. No entanto, com o tempo, o sinal fluorescente branqueia se os neurônios são expostos à luz por longos períodos de tempo, como ocorreu com esse grupo estudantil.

Se os alunos do curso tiveram muito pouca experiência com microscopia fluorescente, é uma boa ideia construir em uma semana extra para dar aos alunos a chance de repetir sua experiência, já que suas habilidades melhorarão drasticamente com a prática.

Um aspecto desafiador para o instrutor de laboratório é se existem vários pequenos grupos, cada um avaliando a morfologia de diferentes tipos de neurônios. As diferentes cepas fluorescentes não são caras para obter ou manter, mas há mais esforço necessário para ter inúmeras cepas fluorescentes diferentes na mão. No entanto, é possível limitar os tipos de projetos às cepas e recursos disponíveis. As cepas que funcionam muito bem com os estudantes de graduação incluem as cepas LX929 e OH7547. PVX4, que é um mCherry pan-neuronal, também é uma cepa muito fácil de trabalhar com ^7,8.

Figura 1: Diagrama de como preparar slides de microscópio para montagens molhadas de C. elegans. O painel esquerdo mostra a colocação da fita de etiqueta e a gota de 2%-3% de agarose (10 μL). Em seguida, no painel direito, um segundo slide é colocado em cima em um ângulo de 90° para achatar a gota de agarose até a espessura da fita. Uma vez que a agarose se solidificou, os slides são cuidadosamente separados. A almofada de agarose vai aderir a um dos slides. Para evitar a secagem, os nematoides são colocados em uma gota de tampão contendo azida de sódio (que paralisa os nematoides) dentro de uma hora após a produção do slide com almofada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O microscópio de fluorescência com uma câmera digital usada neste estudo. O microscópio fica em uma mesa que pode acomodar pequenos grupos (três a quatro) de estudantes. O microscópio tem uma câmera digital conectada por um cabo USB a um computador com software apropriado de captura de imagem digital. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Avaliação dos efeitos de um pesticida contendo neonicotinóides na morfologia do neurônio. (A) Neurônios colinérgicos não tratados da cepa fluorescente LX929. (B) Neurônios colinérgicos expostos a pesticidas (T+S). (C) Percentual de neurônios que apresentam sangramento nas duas condições. As barras de erro são o erro padrão da média. indica p < 0,001 de um ANOVA unidirecional. Foram analisados 113 neurônios de 12 nematoides individuais. Este número foi modificado de Bradford, et ^al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Efeitos de um pesticida contendo manganês na morfologia do neurônio de dopamina. O grupo estudantil não forneceu uma barra de escala para sua figura, mas tirou a imagem em 40x de ampliação. (A) CepdL putativo e cepvl soma neuronal (rotulado) em worms de controle. O neurônio da cabeça intacto somata e seus processos indicam falta de degeneração. (B) Processos putativos de L&R (asterisco) e CEPV L&R neuronal soma (rotulado) em vermes expostos agudos. A soma e os processos expressaram GFP, mas parece haver um amortecimento da expressão GFP em processos dorsais. (C) CEPDL putativo e soma neuronal CEPVL (rotulado) em vermes expostos crônicos. A soma não expressou GFP, e os processos não foram visíveis, indicando degeneração significativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os protocolos descritos neste manuscrito funcionam sozinhos ou como parte de um projeto de grupo estudantil independente de várias semanas. Os protocolos também são favoráveis a experiências exploratórias autônomas de uma semana. As cepas de nematoide são baratas e fáceis de manter no laboratório de pesquisa. Os alunos podem prontamente aprender a escolher vermes com uma picareta de vermes ou como movê-los lavando placas com água e permitindo que eles se instalem pela gravidade. Os experimentos podem ser realizados ao longo de um único período de laboratório ou durante várias semanas. Os alunos podem projetar independentemente seus experimentos, ou um procedimento pode ser fornecido a eles. Os microscópios de dissecação não têm que ser caros. O item mais caro é o microscópio fluorescente com uma câmera digital. Esta é uma limitação para laboratórios de ensino que não têm acesso a um microscópio fluorescente ou câmera digital.

Se um microscópio fluorescente e um sistema de imagem digital e de imagem de computador não estiverem disponíveis para uso em laboratório, os alunos poderão medir comportamentos simples específicos que são regidos por neurônios específicos. Muitos ensaios comportamentais estão disponíveis e podem ser encontrados no Wormbook⁹. Os comportamentos podem ser avaliados usando o microscópio de dissecação.

Um passo crítico neste protocolo é preparar os slides do microscópio para as montagens molhadas dos nematoides. Outro passo crítico é adicionar os nematoides à gotícula. Um passo crítico final no protocolo é garantir não expor os nematoides à iluminação fluorescente por tanto tempo que ele branqueia o sinal. Seria importante que o instrutor apontasse essas etapas críticas para que os grupos de alunos pratiquem e prestem atenção nas instruções que estão sendo dadas.

O aspecto mais emocionante dessa metodologia é que os alunos podem projetar e realizar experimentos novos e autênticos que possam produzir resultados publicáveis ou se tornar a base para pesquisas mais avançadas, como um projeto de pesquisa sênior. Os procedimentos podem ser usados para estudar uma variedade de pesticidas, misturas de pesticidas e muitos outros diferentes produtos químicos ambientais¹⁰, o que proporciona aos alunos uma experiência de pesquisa e treinamento verdadeiramente relevante em design experimental, análise de dados, preparação de figuras e apresentação de resultados.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250