Summary
若年成人 のCaenorhabditis elegans 線虫は、異なる濃度の市販の農薬または他の毒性物質に2〜24時間曝露される。次いで、蛍光発現株を用いて異なるニューロンを視覚化することができる。この論文は、線虫を農薬にさらし、ニューロンの損傷を評価する方法を実証する。
Abstract
Caenorhabditis elegans は、化学汚染物質、農薬、および多種多様な有毒物質への曝露の結果を理解するために多くの研究所で使用される強力なモデル生物である。これらの線虫は扱いやすく、学部の生物学研究室でも新しい研究成果を生み出すために使用できます。数週間にわたる本格的な学生主導の研究プロジェクトのラボシリーズは、行動測定、細胞生物学、顕微鏡検査の技術とアプローチのツールキットを学生に訓練し、プロジェクトに適用します。そのツールキットの1つの技術は、農薬のような化学毒性物質にさらされた後に神経変性損傷を示すニューロンの割合を定量化することです。若年成人 のC. elegans 線虫は、市販の農薬または他のタイプの毒性物質の異なる濃度に2〜24時間曝露され得る。その後、学部生は、蛍光発現株の C. elegansを用いて、異なるニューロンサブタイプを視覚化することができる。これらの技術は、高度な画像処理ソフトウェアを必要とせず、低倍率でも有効であるため、高価な共焦点顕微鏡の必要性が不要である。この論文は、線虫を農薬で処理する方法と、ニューロンを画像化してスコアリングする方法を示しています。また、ニューロン形態の顕微鏡検査および分析のための簡単なプロトコルも提供します。この技術に使用される材料は安価で、ほとんどの学部生物学部門で容易に入手可能です。このテクニックは、移動、基礎減速、産卵などの行動尺度と組み合わせて、潜在的に公開可能な一連の実験を行い、学部生に非常に低コストで本物の研究体験を提供することができます。
Introduction
Caenorhabditis elegans は、入門および中級レベルの学生のための生物科学コースの実験室コーストレーニングのための優れたモデル生物です。この実験室手順は、 C. elegans の行動および細胞生物学に対する一般的に使用される農薬の様々な影響を探求する数週間のモジュールの一部として使用することができる。学生は、データ分析とプレゼンテーションのスキルを教える独立したプロジェクトを設計して実行する方法を学ぶことができます。本稿では、 C. elegans を農薬混合物に曝露し、ニューロン形態への影響を観察および分析するためのプロトコルに焦点を当てる。
芝生の化学農薬混合物は、住宅用および農業用として広く使用されており、地元のガーデンストアで購入できます。人間や野生生物に対するこれらの化学物質の安全性に対する懸念が高まっています1,2,3。学生は科学文献を読み、実験評価のために農薬を選択することができ、そうすることで、基本的な生物学と神経生物学、実験設計や分析などの重要な実験室スキル、ピペッティングや連続希釈、解剖顕微鏡、蛍光顕微鏡、デジタル写真、フィギュア制作などの一般的なラボスキルを学ぶことができます。
この論文で説明するプロトコルは、生物学または神経科学の中級レベルのコースで単独で立つことも、特定のニューロングループによって支配される行動の測定を含む複数週のモジュールの一部にすることもできます。例えば、このプロトコールに記載されているのは、コリン作動性ニューロン4においてGFP(LX 929)を発現する線虫の株を用いた移動運動を支配するコリン作動性ニューロンの形態の評価である。これらの株は、 Caenorhabditis elegans Genetics Center(https://cgc.umn.edu/)から非常に低価格で入手できます。ドーパミン作動性ニューロン(OH 7457)、コリン作動性ニューロン(LX 929)、またはすべてのニューロンで発現されるmCherry(PVX4)においてGFPを発現する株はすべて良い選択である。学生はまた、移動を測定し、形態学の評価に付随するデータを取得することもできます。複数週間の学生グループプロジェクトの詳細については、Susman5を参照してください。
この学生グループプロジェクトは非常に安価で、4人の学生のグループのためにセットアップするのが簡単です。必要な材料には、解剖顕微鏡、取り付けられたデジタルカメラを持つことができる蛍光化合物顕微鏡へのアクセス、ペトリプレートおよび線虫増殖寒天へのアクセス、増殖が制限された細菌(CGC由来のOP50株)、ガス炎ブンゼンバーナーまたはアルコールランプ、オートクレーブ、白金線、およびマイクロピペッター、顕微鏡スライドなどの一般的な実験室用品が含まれます。 カバースリップ、ガラスパスツールピペット。学生グループによって検査されている化学毒物に応じて、プロトコルのステップはヒュームフードの下または手袋で行われる必要があるかもしれません。このプロトコルは、水溶性(揮発性ではない)の化学混合物を使用し、製造業者が推奨するすべての安全な取り扱い手順に従います。
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Protocol
無脊椎動物のすべての使用は、施設の動物ケアおよび使用ガイドラインに準拠していた。
1. 農薬でコーティングされたペトリプレートの作製
- 寒天ペトリ皿(直径6cmが最適)を標準的な手順6を使用して準備する。
注:これらは数ヶ月前に作成し、使用時まで冷蔵庫に保管することができます。ベンチトップでプレートを室温(RT)にします。ほとんどの場合、学生グループには、水防除を含む農薬混合物の希釈ごとにプレートを提供する必要があります。 - 標識された1.5 mLマイクロフュージチューブで、選択した農薬の各希釈液の1 mLを調製する。安全な取り扱いのために、指示書を読み、手袋を提供するか、提案された場合はヒュームフードで作業してください。
注:試験する推奨希釈液:1 mLのフルパワー農薬、1:10 希釈水(100 μLの農薬、900 μLの蒸留水)、1:100の希釈(10 μLの農薬、990 μLの水)、1:1000の希釈(1:10の希釈液の10 μL、990 μLの水)など。 - ブンゼンバーナーの炎の中でガラスパスツールピペット(9mlサイズ)を慎重に曲げて、溶液スプレッダーを作ります。炎を使用してピペットの開口部を閉じます。次に、ペトリプレート上に各スプレッドする前にスプレッダーをエタノール滅菌します。
- マイクロピペッターを使用して、寒天の中心に100μLの希釈液(または水コントロール)を置き、滅菌スプレッダーで表面全体に静かに広げます。各使用前にスプレッダーを再滅菌してください。
- ペトリ皿を覆って脇に置き、溶液を「乾燥」するまで表面に浸します。
注:実験室の農薬と湿度レベルによっては、これには時間がかかる場合があります。生徒は,暴露期間の前日に自分の版を準備する必要があるかもしれません。 - 12時間より長い暴露期間の場合、線虫を添加する前に、 大腸菌 の一晩培養物をプレートに50μL加える。急性実験(12時間以下)の場合、プレート上に 大腸菌 を有する必要はない。
2. 農薬でコーティングされたプレートに線虫を添加する
注:学生は、 Caenorhabditis elegans Genetics Centerから入手可能な蛍光株LX929の成虫線虫(5日間の培養が最善です)のプレートを持っている必要があります。これには 2 つの手順があります。生徒が線虫を使った経験がある場合(たとえば、この手順が数週間の演習の一部であり、ワームピックで線虫を選ぶ方法をすでに学んでいる場合)、ステップ2.1を使用します。そうでない場合は、ステップ 2.2 を使用します。
- ワームピックで線虫を選ぶ。ブンゼンバーナーの炎を使ってパスツールピペットに溶かした1インチのプラチナワイヤーからワームピックを作ります。ピックの上に粘着性の 大腸菌 の小さな塊を拾い上げ、粘着性の塊を使用して成虫の線虫を拾う。まともなサンプルサイズを得るには、各処理プレートに10個の線虫を選びます。
注:経験の浅い学生は、手順2.2-2.3に従うことができます。 - マイクロピペットを使用して、線虫のプレート上に滅菌水1mLを置きます。線虫を持ち上げるために水を振り回し、線虫と一緒に液体を1.5mLのマイクロフュージチューブに取り出します。
- 線虫を重力で約10分間沈降させた後、少なくとも500μLの水を慎重に取り除き、廃棄する。線虫を再懸濁し、切り取られた黄色のピペットチップを使用して、各処理プレートに50〜100μLの懸濁したワームを除去する。各プレートに少なくとも10匹の成虫がいることを確認してください。
- タイマーを設定するか、時間をメモし、選択した期間のRTで線虫を公開します。選択した露光時間内に、ウェットマウント用の顕微鏡スライドを準備します。スライドは顕微鏡検査と同じ日に作成する必要があります。
注:学生グループは、自主学習の計画中に暴露時間を選択します。
3. ウェットマウント用の顕微鏡スライドの準備
注: 手順 3.1 ~ 3.3 は、各学生グループが実行できます。スライドを 3 枚ずつ用意します。
- スライドの片側だけにラベルテープを貼って、スライドを2枚用意します(図1、左パネル)。テープは、アガロースが均一な厚さのパッドを形成するための正しい厚さを作成するために使用されます。次に、図に示すように、清潔で未使用のスライドをベンチトップの上に置きます。
- マイクロピペッターを使用して、10 μL 滴の溶融アガロース (ddH2O で 3%、65 °C のドライブロックヒーターを使用して加熱) を中央にあるスライドの中央に置きます。
- 図に示すように、別のきれいなスライドをドロップのあるスライドに対して垂直に上に置き、ドロップを平らにします(図1、右側のパネル)。圧力をかけることで平らになり、アガロース滴がラベリングテープの厚さを形成するようにします。
- アガロースは約1分以内に固まります。次に、一定の圧力をかけて 2 つのスライドを分離します。寒天の円はスライドの1つに付着します。このスライドを寒天面を上にしてベンチトップに置き、1〜2分間乾燥させてから使用してください。
4. 顕微鏡スライドへの生きた線虫の取り付け
- アガロースパッドで調製したスライドに線虫を加えるには、1 Mアジ化ナトリウム(NaN3)を含む5 μLの水滴を寒天パッドに加えます。この溶液は、ワームを麻酔し、それらを固定化する。
注意:アジ化ナトリウムストック溶液は、摂取すると病気を引き起こす可能性があります。 - 次に、線虫(治療スライドあたり少なくとも10個)をワームピックを使用して液滴に移す。線虫を移すためにそれを使用する前後にピックを滅菌する。
- 鉗子を使用して、カバースリップを斜めに置き、ゆっくりと下げてカバースリップを追加します。鉛筆または金属製のプローブを使用して、カバースリップが滑りすぎたり下がったりしないようにします。
- 準備したウェットマウントを蛍光顕微鏡の上に置き、最初に10倍の倍率と位相コントラストの下で、次に位相コントラストと蛍光照明で40倍の倍率でワームを観察しました。
5. 蛍光顕微鏡
注:学生グループは、それぞれのタイプのいくつかのワームを別々の顕微鏡スライドにウェットマウントし、適切にラベルを付ける必要があります。以下の手順は、付属の三眼セットアップ、デジタルカメラ、およびコンピュータシステムを持つことができる標準的な蛍光化合物顕微鏡の使用に関する一般的なヒントです。この原稿に使用されたセットアップを 図 2 に示します。学生は、対物レンズ、光フィルターの種類、明視野と蛍光光を切り替える能力、デジタルカメラに光信号を送る方法など、顕微鏡の設定に精通している必要があります。
- 用意したウェットマウントを一度に1台ずつ顕微鏡ステージに置き、顕微鏡ステージクリップを使用して所定の位置に固定します。
- ウェットマウントの表示を開始するには、まず最も低い倍率(通常は10倍)で表示し、明視野または位相コントラストを使用して線虫を視覚化し、焦点を合わせます。
- 線虫が視野に入ったら、顕微鏡の細かいフォーカスノブを使用して線虫に焦点を合わせます。ダイヤルを回して照明を蛍光に切り替えます。次に、カメラに光を向けてデジタル画像をキャプチャします。イメージングソフトウェアを使用して照明を調整し、ニューロンが明るく照らされるが過飽和にならないようにします。
- ある時点で、セル画像と同じ倍率で定規の別の画像を取得して、その図の倍率スケールを提供します。透明な定規またはマイクロメートルスライドの短い部分を顕微鏡ステージ上に置き、細かい焦点ノブを使用してそれに焦点を合わせ、イメージングソフトウェアを使用して画像を得る。
- 可能であれば、より高い倍率で(少なくとも10個の別々の線虫から)追加の画像を得る。強烈な光は、画像化元の領域を漂白する可能性が高いため、画像化を注意深く監視し、光がスライドの同じ領域に長時間留まらないようにしてください。線虫と領域、ならびに治療と倍率を追跡するために、取得した画像に必ず名前を付けてください。
- コンピュータにフォルダを作成し、解析や図作成に使用するフォルダに画像を移動します。
6. 形態学的完全性評価尺度
注:ニューロンにおける神経変性損傷の重要な細胞学的特徴は、ソーマ形態の変化である。簡単に見て数えることができる3つの形態があります。
- 図3に示すように、滑らかで均一に蛍光プロセスと非丸い細胞体を持つニューロンを通常どおりにカウントします。
- 多くの場合、ソーマは健康で若いニューロンと比較して丸みを帯びて腫れて見えます。このようなニューロンを「丸みを帯びた」ものとして数えます。
- 長い神経プロセスを有するニューロンは、丸みを帯びた穿刺またはプロセス内のギャップさえあるブレビングを示すことがある。これらの特徴を示すニューロンを「有刺し」として数えます。
7. データ分析と図作成
- 各処置について少なくとも10個の線虫について、健康な割合(丸めなし、ブレビングなし)および障害のある割合(丸めおよび/またはブレビング)をカウントした場合(図3)、利用可能な統計ソフトウェアを使用して統計分析を実行する。
- 蛍光的にタグ付けされたすべてのニューロンを数え、正常な形態、ブレビング形態、または丸め形態を示すニューロンの集計を保持し、分析された各線虫の総数のうち、各形態の割合を計算する。
- 図を準備するには、Powerpointなどの適切なソフトウェアに画像をインポートし、取得した定規またはマイクロメータ画像に基づいてラベルとスケールバーを追加します。
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Representative Results
この論文で説明されている方法とプロトコルは、生物学または神経科学の中級レベルの学部生にとって重要な実験室スキルを提供します。学生は、独立したプロジェクトを開発し、斬新な結果をもたらすことができる独自の設計の実験を行う上で重要な経験を得ることができます。 図3は 、最終的に出版された論文3の一部となった学生プロジェクトの最適な結果を示しています。学生プロジェクトの大半は公開可能な結果にはなりませんが、ほとんどの学生は洗練された図と図の凡例を作成することができ、ほとんどの学生はセル数を取得し、統計分析を行い、図またはデータテーブルを作成することもできます。特定のニューロンが特定の行動を支配する。したがって、この手順が、移動や走化性のアッセイなどの他の測定を含む数週間の独立したプロジェクトの一部である場合、結果として得られるプロジェクトは、複数の図と学生が誇りに思うことができるクラスのプレゼンテーションを生成します。
学生グループは、探索したい農薬の種類を選択できます。選択した農薬の有効成分に関する文献研究に応じて、学生はさまざまなニューロンを評価することができます。 C. elegans のすべてのニューロンが知られており、その機能がよく記述されているため、学生はドーパミンニューロンやコリン作動性ニューロンなどの特定のニューロンタイプを選択して、独立して設計された実験で研究することができます。この原稿で提供されている例では、学生はネオニコチノイド系農薬を検討し、コリン作動性ニューロンでGFPを発現する線虫の蛍光株を用いてコリン作動性ニューロンに焦点を当てた。 図4に示す別の例は、ドーパミンニューロンがGFP(OH7457)を発現する株を用いて、ドーパミン含有農薬がドーパミン作動性ニューロンに及ぼす影響を調べた学生グループからのより典型的な結果を示す。この特定の株は、ドーパミンニューロンにおいて明るいシグナルを示し、ニューロンは学生によって容易に視覚化された。しかし、時間が経つにつれて、この学生グループで起こったように、ニューロンが長期間光にさらされると蛍光シグナルが漂白します。
コースの学生が蛍光顕微鏡検査の経験がほとんどない場合は、練習でスキルが劇的に向上するため、実験を繰り返す機会を学生に与えるために、1週間余分に構築することをお勧めします。
研究室のインストラクターにとって難しいのは、複数の小グループがあり、それぞれが異なるニューロンタイプの形態を評価する場合です。異なる蛍光株は、入手または維持するのに高価ではありませんが、多数の異なる蛍光株を手元に置くためには、より多くの労力が必要です。ただし、プロジェクトの種類を使用可能な系統とリソースに制限することができます。学部生と非常にうまく機能する株には、LX929およびOH7547株が含まれます。mCherryを発現する汎ニューロンであるPVX4も、7,8で動作するのが非常に簡単な株です。
図1: C. elegansの湿式マウント用の顕微鏡スライドの作製方法の図。 左パネルは、ラベルテープの配置と2%〜3%アガロース(10μL)の液滴を示しています。次に、右側のパネルで、2番目のスライドを90°の角度で上に置き、アガロースの液滴をテープの厚さに平らにします。アガロースが固まると、スライドは慎重に分離されます。アガロースパッドはスライドの1つに付着します。乾燥を防ぐために、線虫は、パッド付きスライドの製造から1時間以内に、アジ化ナトリウム(線虫を麻痺させる)を含む緩衝液の液滴に入れられる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:本研究で用いたデジタルカメラ付き蛍光顕微鏡。 顕微鏡は、少人数のグループ(3〜4人)の学生を収容できるテーブルに座っています。顕微鏡には、適切なデジタル画像キャプチャソフトウェアを備えたコンピュータにUSBケーブルで接続されたデジタルカメラがあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ニューロン形態に対するネオニコチノイド含有農薬の効果の評価。(B)農薬曝露(T+S)コリン作動性ニューロン。(c)2つの条件においてブレビングを呈するニューロンの割合。誤差範囲は平均の標準誤差です。p < 0.001 を一元配置分散分析から示します。12個の線虫から合計113個のニューロンを解析した。この図はBradfordら3から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ドーパミンニューロン形態に対するマンガン含有農薬の効果。 学生グループは、彼らの数字のためのスケールバーを提供しませんでしたが、40倍の倍率で画像を撮影しました。(A)コントロールワームにおける推定上のCECEPDLおよびCEPVLニューロンソーマ(標識)。無傷の頭部ニューロンソマタおよびそのプロセスは、変性の欠如を示す。(B)急性ばく露虫における推定CEPD L&Rプロセス(アスタリスク)およびCEPV L&Rニューロンソーマ(標識)。ソーマおよびプロセスはGFPを発現したが、背側プロセスにおけるGFP発現の抑制があるようである。(C)慢性ばく露されたワームにおける推定上のCEPDLおよびCEPVLニューロンソーマ(標識)。ソーマはGFPを発現せず、プロセスは目に見えず、有意な変性を示した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この原稿に記載されているプロトコルは、単独で、または数週間の独立した学生グループプロジェクトの一環として成功裏に機能します。プロトコルは、スタンドアロンの1週間の探索的経験にも適しています。線虫株は安価で、実験室で維持するのが簡単です。生徒は、ワームピックでワームを選ぶ方法や、プレートを水で洗い流し、重力で落ち着かせることによってそれらを動かす方法を簡単に学ぶことができます。実験は、単一のラボ期間にわたって、または数週間にわたって実施することができる。学生は独立して実験をデザインすることも、手順を提供することもできます。解剖顕微鏡は高価である必要はありません。最も高価なアイテムは、デジタルカメラ付きの蛍光顕微鏡です。これは、蛍光顕微鏡やデジタルカメラにアクセスできないラボを教えるための制限です。
蛍光顕微鏡、デジタルカメラ、コンピュータイメージングシステムが研究室で使用できない場合、学生は特定のニューロンによって支配される特定の単純な行動を測定できます。多くの行動アッセイが利用可能であり、Wormbook9で見つけることができます。この挙動は、解剖顕微鏡を用いて評価することができる。
このプロトコルの重要なステップは、線虫の湿式マウント用の顕微鏡スライドを準備することです。もう一つの重要なステップは、線虫を液滴に加えることである。プロトコルの最後の重要なステップは、線虫を蛍光照明に長時間さらさないようにして、信号を漂白させることです。インストラクターがこれらの重要なステップを指摘して、学生グループが練習し、彼らが与えられている指示に注意を払うことが重要です。
この方法論の最もエキサイティングな側面は、学生が出版可能な結果をもたらしたり、上級研究プロジェクトのように、より高度な研究の基礎となる可能性のある斬新で本物の実験を設計および実行できることです。この手順は、さまざまな農薬、農薬の混合物、および他の多くの異なる環境化学物質10を研究するために使用でき、実験計画、データ分析、図作成、および結果の提示に関する真に関連性の高い研究経験とトレーニングを学生に提供します。
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Disclosures
開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この原稿に記載されている作業は、神経科学の中級レベルのクラスのために行われました。試薬と物資のための資金は、ヴァッサー大学の生物学部によって提供された。顕微鏡とデジタルイメージングシステムもヴァッサー大学の生物学部によって提供されました。著者は、このコースを受講した多くの学生全員に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
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