Undersøgelse af virkningen af pesticider på Caenorhabditis elegans neuroner

Summary

Unge voksne Caenorhabditis elegans nematoder udsættes for forskellige koncentrationer af kommercielle pesticider eller andre toksiske stoffer i 2-24 timer. Derefter kan forskellige neuroner visualiseres ved hjælp af fluorescerende ekspressionerende stammer. Dette papir viser, hvordan man udsætter nematoder for pesticider og vurderer neuronskader.

Abstract

Caenorhabditis elegans er en kraftfuld modelorganisme, der anvendes i mange forskningslaboratorier til at forstå konsekvenserne af eksponering for kemiske forurenende stoffer, pesticider og en lang række giftige stoffer. Disse nematoder er nemme at arbejde med og kan bruges til at generere nye forskningsresultater, selv i bachelorbiologilaboratoriet. En flerugers laboratorieserie af autentiske, studenterdrevne forskningsprojekter træner eleverne i et værktøjssæt af teknikker og tilgange inden for adfærdsmålinger, cellebiologi og mikroskopi, som de derefter anvender på deres projekter. En teknik i dette værktøjssæt er at kvantificere procentdelen af neuroner, der udviser neurodegenerativ skade efter eksponering for et kemisk toksisk stof som et pesticid. Unge voksne C. elegans nematoder kan udsættes for forskellige koncentrationer af kommercielt tilgængelige pesticider eller andre typer toksiske stoffer i 2-24 timer. Derefter kan bachelorstuderende visualisere forskellige neuronundertyper ved hjælp af fluorescerende ekspresserende stammer af C. elegans. Disse teknikker kræver ikke sofistikeret billedbehandlingssoftware og er effektive ved selv lave forstørrelser, hvilket gør behovet for dyr konfokal mikroskopi unødvendigt. Dette papir viser, hvordan man behandler nematoderne med pesticider, og hvordan man afbilder og scorer neuronerne. Det giver også en ligetil protokol til mikroskopi og analyse af neuronmorfologi. De materialer, der anvendes til denne teknik, er billige og let tilgængelige i de fleste bachelorbiologiske afdelinger. Denne teknik kan kombineres med adfærdsmæssige foranstaltninger som bevægelse, basal opbremsning eller æglægning for at gennemføre en potentielt publicerbar række eksperimenter og give bachelorstuderende en autentisk forskningsoplevelse til en meget lav pris.

Introduction

Caenorhabditis elegans er en fremragende modelorganisme til laboratoriekursusuddannelse i biologiske videnskabskurser for introduktions- og mellemniveaustuderende. Denne laboratorieprocedure kan bruges som en del af et flerugers modul, der udforsker forskellige virkninger af almindeligt anvendte pesticider på C. elegans adfærd og cellebiologi. Studerende kan lære at designe og gennemføre uafhængige projekter, der lærer dem dataanalyse og præsentationsfærdigheder. Dette papir fokuserer på protokollerne til udsættelse af C. elegans for pesticidblandinger og derefter observere og analysere virkningerne på neuronmorfologi.

Græsplæne kemiske pesticidblandinger anvendes i vid udstrækning til bolig- og landbrugsbrug og kan købes hos enhver lokal havebutik. Der er stigende bekymring for sikkerheden af disse kemikalier for mennesker og dyreliv ^1,2,3. Studerende kan læse den videnskabelige litteratur og vælge et pesticid til eksperimentel evaluering og kan dermed lære om grundlæggende biologi og neurobiologi samt vigtige laboratoriefærdigheder som eksperimentelt design og analyse og generelle laboratoriefærdigheder som pipettering og serielle fortyndinger, dissekering af mikroskopi, fluorescerende mikroskopi, digital fotografering og figurproduktion.

De protokoller, der er beskrevet i dette papir, kan stå alene i et mellemliggende kursus i biologi eller neurovidenskab eller være en del af et flere ugers modul, der også kan omfatte målinger af adfærd styret af bestemte grupper af neuroner. For eksempel er beskrevet i denne protokol en vurdering af morfologien af kolinerge neuroner, der styrer bevægelse ved hjælp af en stamme af nematode, der udtrykker GFP (LX 929) i kolinerge neuroner⁴. Disse stammer kan fås til meget lave priser fra Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Stammer, der udtrykker GFP i dopaminerge neuroner (OH 7457), kolinerge neuroner (LX 929) eller mCherry udtrykt i alle neuroner (PVX4) er alle gode valg. Studerende kunne også måle bevægelse og få data til at ledsage vurderingen af morfologi. En fuldstændig beskrivelse af et flerugers studentergruppeprojekt findes i Susman⁵.

Dette studentergruppeprojekt er ret billigt og let at oprette for grupper på fire studerende. De nødvendige materialer omfatter et dissekeringsmikroskop, adgang til et fluorescensforbindelsesmikroskop, der kan have et vedhæftet digitalkamera, Petri-plader og adgang til nematodevækstar, vækstbegrænsede bakterier (stamme OP50, fra CGC), en gasflamme Bunsen-brænder eller en alkohollampe, en autoklave, platintråd og generelle laboratorieforsyninger som mikropipettere, mikroskopdias, dæksedler og pasteurpipetter af glas. Afhængigt af det kemiske toksiske stof, der undersøges af elevgrupperne, skal trinene i protokollen muligvis forekomme under en stinkhætte eller med handsker. Denne protokol bruger kemiske blandinger, der er vandopløselige (ikke flygtige), og alle sikre håndteringsprocedurer, der anbefales af producenten, følges.

Protocol

Al brug af hvirvelløse dyr var i overensstemmelse med institutionens retningslinjer for dyrepleje og brug.

1. Fremstilling af pesticidbelagte Petri-plader

1. Forbered agar Petriskåle (6 cm diameter fungerer bedst) ved hjælp af standardprocedurer⁶.
   BEMÆRK: Disse kan laves måneder i forvejen og opbevares i køleskabet indtil brug. Bring pladerne til stuetemperatur (RT) på bordpladen. I de fleste tilfælde skal elevgrupperne forsynes med en plade for hver fortynding af pesticidblandingen, herunder en vandkontrol.
2. Forbered 1 ml af hver fortynding af det valgte pesticid i mærkede 1,5 ml mikrofugerør. For sikker håndtering skal du læse instruktionerne og sørge for handsker eller arbejde i en stinkhætte, hvis det foreslås.
   BEMÆRK: Foreslåede fortyndinger, der skal testes: 1 ml pesticid med fuld styrke, 1:10 fortynding i vand (100 μL pesticid, 900 μL destilleret vand), 1:100 fortynding (10 μL pesticid, 990 μL vand), 1:1000 fortynding (10 μL af fortyndingen på 1:10, 990 μL vand) osv.
3. Lav en opløsningsspreder ved forsigtigt at bøje en pasteur-pipette af glas (9 ml størrelse) i en Bunsen-brænderflamme. Brug flammen til at lukke pipettens åbning. Derefter ethanol-sterilisere sprederen før hver spredning på Petri-pladen.
4. Brug en mikropipetter til at placere 100 μL af fortyndingen (eller vandkontrollen) på midten af agaren og spredes forsigtigt over overfladen med den steriliserede spreder. Gensteriliserer sprederen inden hver brug.
5. Sæt de tildækkede petriskåle til side, og lad opløsningen suge ind i overfladen, indtil den er "tør".
   BEMÆRK: Afhængigt af pesticid- og fugtighedsniveauerne i laboratoriet kan dette tage lidt tid. Eleverne skal måske forberede deres tallerkener dagen før eksponeringsperioden.
6. I eksponeringsperioder på mere end 12 timer tilsættes 50 μL af en Escherichia coli-kultur natten over til pladerne, inden nematoderne tilsættes. Ved akutte forsøg (12 timer eller mindre) er det ikke nødvendigt at have E. coli på pladerne.

2. Tilsætning af nematoder til pesticidbelagte plader

BEMÆRK: Studerende bliver nødt til at have en plade af voksne nematoder (5 dages kulturer er bedst) af den fluorescerende stamme LX929, som er tilgængelig fra Caenorhabditis elegans Genetics Center. Der er to mulige procedurer for dette. Hvis eleverne har haft tidligere erfaring med at arbejde med nematoder (for eksempel hvis denne procedure er en del af en flerugers øvelse, og de allerede har lært at plukke nematoder med en ormplukning), skal du bruge trin 2.1. Hvis de ikke har det, skal du bruge trin 2.2.

1. Vælg nematoder med en orm pluk. Mode en orm pluk fra en 1 i stykke platintråd, der smeltes til en Pasteur pipette ved hjælp af en Bunsen brænder flamme. Tag en lille klat klæbrig E. coli op på plukningen, og hent derefter voksne nematoder ved hjælp af den klæbrige klat. For en anstændig prøvestørrelse skal du vælge 10 nematoder til hver behandlingsplade.
   BEMÆRK: Studerende uden meget erfaring kan følge trin 2.2-2.3.
2. Brug en mikropipette til at placere 1 ml sterilt vand på nematodepladen. Svirp vandet rundt for at løfte nematoderne op, og fjern derefter væsken med nematoderne til et 1,5 ml mikrofugerør.
3. Lad nematoderne sætte sig ved tyngdekraften i ca. 10 minutter, fjern derefter forsigtigt mindst 500 μL af vandet og kassér det. Resuspend nematoderne, og fjern 50-100 μL suspenderede orme til hver behandlingsplade ved hjælp af en afskåret gul pipettespids. Sørg for, at hver plade har mindst 10 voksne orme.
4. Indstil en timer, eller noter tiden, og udsæt nematoderne ved RT i den valgte tidsperiode. I løbet af den valgte eksponeringstid skal du forberede mikroskopdias til våde monteringer. Lysbillederne skal laves samme dag som mikroskopien.
   BEMÆRK: Elevgrupper vil have valgt deres eksponeringstid under planlægningen af deres uafhængige undersøgelse.

3. Forberedelse af mikroskopdias til våde monteringer

BEMÆRK: Trin 3.1-3.3 kan udføres af hver elevgruppe. Forbered tre dias hver.

1. Forbered to dias ved kun at placere et stykke etikettape på den ene side af diaset (figur 1, venstre panel). Båndet bruges til at skabe den korrekte tykkelse for agarose til at danne en pude af ensartet tykkelse. Placer derefter et rent, ubrugt dias mellem dem på bordpladen, som illustreret i figuren.
2. Brug en mikropipetter til at placere en 10 μL dråbe smeltet agarose (3% i ddH₂O, opvarmet ved hjælp af en 65 ° C tør blokvarmer) på midten af diaset, der er i midten.
3. Flad dråben ved at placere et andet rent dias ovenpå, vinkelret på diaset med dråben, som vist på figuren (figur 1, højre panel). Flad ved at påføre tryk, så agarosefaldet danner tykkelsen af mærkningsbåndet.
4. Agarose vil størkne inden for ca. 1 min. Påfør derefter konstant tryk for at adskille de to dias. Agarcirklen klæber til et af diasene. Hvil dette dias, agar med siden op, på bordpladen, og lad det tørre i 1-2 min før brug.

4. Montering af levende nematoder på mikroskopdias

1. For at tilføje nematoder til det tilberedte dias med agarosepuden tilsættes en 5 μL dråbe vand indeholdende 1 M natriumazid (NaN₃) til agarpuden. Denne løsning anæstesiser ormene og immobiliserer dem.
   FORSIGTIG: Natriumazid stamopløsning kan forårsage sygdom, hvis den indtages.
2. Overfør derefter nematoder (mindst 10 pr. Behandlingsdias) til dråben ved hjælp af en ormplukning. Steriliser plukningen før og efter brug den til overførsel af nematoder.
3. Brug tang til at tilføje et dækslip ved at placere det i en vinkel og langsomt sænke det. Undgå, at dæksedlen glider eller sænkes for hurtigt ved hjælp af en blyant eller metalsonde.
4. Placer den forberedte våde montering på et fluorescerende mikroskop for at observere ormene, først under 10x forstørrelse og fasekontrast, derefter under 40x forstørrelse med fasekontrast og fluorescerende belysning.

5. Fluorescerende mikroskopi

BEMÆRK: Elevgrupper skal lave en våd montering af flere orme af hver type på separate mikroskopdias, som de skal mærke passende. Instruktionerne, der følger, er generelle tip om brugen af et standard fluorescensforbindelsesmikroskop, der kan have en vedhæftet trinokulær opsætning, digitalkamera og computersystem. Opsætningen til dette manuskript ses i figur 2. Eleverne skal være bekendt med mikroskopets indstillinger, herunder målene, typer af lysfiltre, evne til at skifte mellem lyst felt og fluorescenslys, hvordan man sender lyssignalet til digitalkameraet mv.

1. Placer en forberedt våd montering ad gangen på mikroskopscenen, og fastgør den på plads ved hjælp af mikroskopets sceneclips.
2. Begynd at se de våde monteringer ved først at se med det laveste forstørrelsesmål, som typisk er 10x, og brug lys felt- eller fasekontrast til at visualisere og fokusere på nematoderne.
3. Når en nematode er placeret i synsfeltet, skal du fokusere på den ved hjælp af den fine fokusknap på mikroskopet. Skift belysningen til fluorescensen ved at dreje drejeknappen. Ret derefter lyset til kameraet for at tage de digitale billeder. Juster belysningen ved hjælp af billedbehandlingssoftwaren, så neuronerne er stærkt belyste, men ikke overmættede.
4. På et tidspunkt skal du få et separat billede af en lineal med samme forstørrelse som cellebillederne for at give en forstørrelsesskala for deres figur. Placer en kort sektion af en gennemsigtig lineal eller et mikrometer dias på mikroskopscenen, fokuser på det ved hjælp af den fine fokusknap, og få et billede ved hjælp af billedbehandlingssoftwaren.
5. Få yderligere billeder (fra mindst 10 separate nematoder) ved højere forstørrelser, hvis det er muligt. Det intense lys vil sandsynligvis blege det område, hvorfra det bliver afbildet, så overvåg omhyggeligt billeddannelsen og lad ikke lyset forblive på det samme område af diaset i lange perioder. Sørg for at navngive de erhvervede billeder for at holde styr på nematoden og regionen samt behandlingen og forstørrelsen.
6. Lav en mappe på computeren og flyt billederne ind i mappen til brug i analyse og figurforberedelse.

6. Skalaen for vurdering af morfologisk integritet

BEMÆRK: En vigtig cytologisk egenskab ved neurodegenerativ skade i neuroner er en ændring i soma-morfologien. Der er tre morfologier, der let kan ses og tælles.

1. Tæl neuronerne med glatte, ensartet fluorescerende processer og ikke-runde cellelegemer som normalt, som vist i figur 3.
2. Ofte bliver soma afrundet og hævet udseende sammenlignet med sunde, unge neuroner. Tæl neuronerne, der ser sådan ud som "afrundede".
3. Neuroner med lange neurale processer kan udvise blebbing, hvor der er afrundet puncta eller endda huller i processerne. Tæl neuronerne, der viser disse funktioner som "blebbed".

7. Dataanalyse og figurforberedelse

1. Hvis procentdelen sund (ingen afrunding, ingen blødning) og procentdelen forringet (afrunding og/eller blegning) for mindst ti nematoder for hver behandling blev talt (figur 3), udføres statistisk analyse ved hjælp af tilgængelig statistisk software.
2. Tæl alle de neuroner, der er fluorescerende mærket, og hold en opgørelse over dem, der udviser normal morfologi, blebbing morfologi eller afrunding morfologi, og beregn derefter procentdelen af hver morfologi ud af det samlede antal for hver analyseret nematode.
3. For at forberede figurer skal du importere billederne til en passende software som Powerpoint og derefter tilføje etiketter og en skalalinje baseret på linealen eller mikrometerbilledet, der er erhvervet.

Representative Results

De metoder og protokoller, der er beskrevet i dette papir, giver vigtige laboratoriefærdigheder til bachelorstuderende på mellemniveau i biologi eller neurovidenskab. Studerende kan få vigtig erfaring med at udvikle et uafhængigt projekt og gennemføre et eksperiment af deres eget design, der kan give nye resultater. Figur 3 viser et optimalt resultat af et studenterprojekt, der til sidst blev en del af en publiceret opgave³. Mens de fleste elevprojekter ikke resulterer i publicerbare resultater, er de fleste studerende i stand til at skabe en sofistikeret figur- og figurlegende, og de fleste er også i stand til at opnå celletællinger, foretage statistisk analyse og oprette en figur eller datatabel. Særlige neuroner styrer specifik adfærd. Når denne procedure således er en del af et flerugers uafhængigt projekt, der inkluderer andre målinger som analyser af bevægelse eller kemotaxis, giver det resulterende projekt flere tal og en klassepræsentation, som eleverne kan være stolte af.

Elevgrupper kan vælge den type pesticid, de ønsker at udforske. Afhængigt af deres litteraturforskning om den aktive ingrediens i det pesticid, de har valgt, kan eleverne evaluere forskellige neuroner. Da alle neuronerne i C. elegans er kendt og deres funktioner velbeskrevet, kan eleverne vælge specifikke neuronale typer, som dopaminneuroner eller kolinerge neuroner, til at studere i et uafhængigt designet eksperiment. I eksemplet i dette manuskript undersøgte eleverne et neonicotinoidpesticid og fokuserede på kolinerge neuroner ved hjælp af en fluorescerende stamme af nematode, der udtrykker GFP i kolinerge neuroner. Et andet eksempel, vist i figur 4, viser et mere typisk resultat fra en elevgruppe, der undersøgte virkningerne af et manganholdigt pesticid på dopaminerge neuroner ved hjælp af en stamme, hvor dopaminneuroner udtrykker GFP (OH7457). Denne særlige stamme viser et lyst signal i dopaminneuroner, og neuronerne blev let visualiseret af studerende. Men over tid bleges det fluorescerende signal, hvis neuronerne udsættes for lyset i lange perioder, som det skete med denne elevgruppe.

Hvis de studerende på kurset har haft meget lidt erfaring med fluorescerende mikroskopi, er det en god idé at bygge en ekstra uge ind for at give de studerende en chance for at gentage deres eksperiment, da deres færdigheder vil blive dramatisk forbedret med praksis.

Et udfordrende aspekt for laboratorieinstruktøren er, hvis der er flere små grupper, der hver vurderer morfologien af forskellige neurontyper. De forskellige fluorescerende stammer er ikke dyre at opnå eller vedligeholde, men der kræves en større indsats for at have mange forskellige fluorescerende stammer ved hånden. Det er dog muligt at begrænse projekttyperne til de tilgængelige belastninger og ressourcer. Stammer, der fungerer meget godt med bachelorstuderende, omfatter LX929- og OH7547-stammerne. PVX4, som er en pan-neuronal ekspressorerende mCherry, er også en meget let stamme at arbejde med ^7,8.

Figur 1: Diagram over, hvordan man forbereder mikroskopdias til våde monteringer af C. elegans. Det venstre panel viser placeringen af etikettape og dråben på 2% -3% agarose (10 μL). Derefter placeres et andet dias i højre panel ovenpå i en 90 ° vinkel for at flade agarosedråben til båndets tykkelse. Når agarose er størknet, adskilles diasene forsigtigt. Agarosepuden klæber til et af diasene. For at forhindre udtørring placeres nematoderne i en dråbe buffer indeholdende natriumazid (som lammer nematoderne) inden for en time efter produktionen af diaset med pude. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Fluorescensmikroskopet med et digitalkamera, der anvendes i denne undersøgelse. Mikroskopet sidder ved et bord, der kan rumme små grupper (tre til fire) af studerende. Mikroskopet har et digitalt kamera forbundet med et USB-kabel til en computer med passende digital billedoptagelsessoftware. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Evaluering af virkningerne af et neonicotinoidholdigt pesticid på neuronmorfologi. (A) Ubehandlede kolinerge neuroner fra den fluorescerende stamme LX929. (B) Pesticideksponerede (T+S) kolinerge neuroner. (C) Procentdel af neuroner, der udviser blødning i de to tilstande. Fejllinjer er standardfejlen i middelværdien. angiver p < 0,001 fra en envejs ANOVA. I alt 113 neuroner fra 12 individuelle nematoder blev analyseret. Dette tal er blevet ændret fra Bradford, et ^al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Virkninger af et manganholdigt pesticid på dopaminneuronmorfologi. Elevgruppen gav ikke en skalabjælke til deres figur, men tog billedet ved 40x forstørrelse. (A) Putative CEPDL og CEPVL neuronale soma (mærket) i kontrolorme. Den intakte hovedneuron somata og deres processer indikerer mangel på degeneration. (B) Formodede CEPD L&R-processer (stjerne) og CEPV L&R neuronal soma (mærket) i akutte eksponerede orme. Soma og processer udtrykte GFP, men der synes at være en dæmpning af GFP-udtryk i dorsale processer. (C) Putative CEPDL og CEPVL neuronale soma (mærket) i kronisk eksponerede orme. Soma udtrykte ikke GFP, og processerne var ikke synlige, hvilket indikerer signifikant degeneration. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

De protokoller, der er beskrevet i dette manuskript, fungerer med succes alene eller som en del af et fler ugers uafhængigt studentergruppeprojekt. Protokollerne er også modtagelige for enkeltstående, en uges sonderende oplevelser. Nematodestammerne er billige og nemme at vedligeholde i forskningslaboratoriet. Studerende kan let lære at plukke orme med en ormplukning eller hvordan man flytter dem ved at skylle plader med vand og lade dem slå sig ned ved tyngdekraften. Eksperimenterne kan udføres i løbet af en enkelt laboratorieperiode eller over flere uger. Studerende kan selvstændigt designe deres eksperimenter, eller en procedure kan leveres til dem. Dissekering af mikroskoper behøver ikke at være dyrt. Den dyreste vare er det fluorescerende mikroskop med et digitalt kamera. Dette er en begrænsning for undervisningslaboratorier, der ikke har adgang til et fluorescerende mikroskop eller digitalkamera.

Hvis et fluorescerende mikroskop og digitalkamera og computerbilleddannelsessystem ikke er tilgængelige til brug i laboratoriet, kan de studerende måle specifik enkel adfærd, der styres af bestemte neuroner. Mange adfærdsmæssige assays er tilgængelige og kan findes i Wormbook⁹. Adfærden kan vurderes ved hjælp af dissekeringsmikroskopet.

Et kritisk trin i denne protokol er at forberede mikroskopets dias til nematodernes våde monteringer. Et andet kritisk skridt er at tilføje nematoderne til dråben. Et sidste kritisk trin i protokollen er at sørge for ikke at udsætte nematoderne for fluorescerende belysning så længe, at det bleger signalet. Det ville være vigtigt for instruktøren at påpege disse kritiske trin, så elevgrupper praktiserer og er opmærksomme nøje på de instruktioner, de får.

Det mest spændende aspekt af denne metode er, at eleverne kan designe og udføre nye og autentiske eksperimenter, der kan give publicerbare resultater eller blive grundlaget for mere avanceret forskning, som et seniorforskningsprojekt. Procedurerne kan bruges til at studere en række pesticider, blandinger af pesticider og mange andre forskellige miljøkemikalier¹⁰, som giver eleverne en virkelig relevant forskningserfaring og træning i eksperimentelt design, dataanalyse, figurforberedelse og præsentation af resultater.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250