Summary
本プロトコールは、ブロイラー胚における脂肪組織から前駆脂肪細胞を単離するための簡単な方法を記載する。この方法は、高収率での単離、初代培養、および前駆脂肪細胞の脂肪生成分化を可能にする。オイルレッドO染色および脂質/DNA染色は、分化培地で誘導された単離細胞の脂肪生成能力を測定しました。
Abstract
初代前駆脂肪細胞は、脂肪細胞の分化と代謝を制御する分子経路を理解するための貴重な実験系です。ニワトリ胚は、脂肪発生の初期段階から前駆脂肪細胞を単離する機会を提供する。この初代細胞は、前駆脂肪細胞の増殖および脂肪生成分化に影響を及ぼす因子を同定するために使用することができ、小児肥満および家禽における過剰な脂肪沈着の制御に関連する研究のための貴重なモデルとなる。出生後の脂肪組織の急速な成長は、ブロイラー鶏の筋肉成長から離れてそれを割り当てることによって効果的に飼料を無駄にします。したがって、脂肪組織発達の初期段階を理解する方法は、この傾向を調節し、人生の早い段階で脂肪膨張を制限する方法を特定する手がかりを提供する可能性がある。本研究は、市販のブロイラー(肉型)ニワトリ胚の発生脂肪組織から単離された前駆脂肪細胞の単離、初代培養、および脂肪生成分化のための効率的な方法を開発するために設計された。この手順は、高い生存率(〜98%)および成熟脂肪細胞への分化能力の増加を有する細胞を産生するように最適化されている。胚性前駆脂肪細胞の単離、培養、および分化のこの簡単な方法は、早期の脂肪の成長と発達の機能解析をサポートします。
Introduction
肥満は、成人と子供の両方にとって世界的な健康上の脅威です。太りすぎまたは肥満の子供は、成人として肥満になる可能性が約5倍高く、心血管疾患、糖尿病、および他の多くの併存疾患のリスクが著しく高くなります。2〜5歳の米国の子供の約13.4%が肥満1を有しており、過剰な体脂肪を蓄積する傾向が人生の非常に早い段階で動き出すことができることを示している。非常に異なる理由から、過剰な脂肪組織の蓄積はブロイラー(肉型)鶏にとって懸念事項です。現代のブロイラーは信じられないほど効率的ですが、生理学的に必要であるよりも多くの脂質を蓄積します2,3。この傾向は孵化直後に始まり、筋肉の成長から離れて割り当てることによって、最も高価な生産成分である飼料を効果的に無駄にします。したがって、子供とブロイラー鶏の両方にとって、非常に異なる理由にもかかわらず、脂肪組織の発達に影響を与える要因を理解し、人生の早い段階で脂肪膨張を制限する方法を特定する必要があります。
脂肪細胞は、前駆脂肪細胞から形成され、成熟した脂質貯蔵脂肪細胞を発達させるために分化を受ける脂肪組織由来幹細胞である。したがって、インビトロでの脂肪前駆細胞は、肥満研究のための貴重な実験モデルである。これらの細胞は、脂肪デポーの間質血管画分から単離され、脂肪細胞の分化および代謝を制御する分子経路の基本的な理解を提供することができる4、5。ひよこ胚は、卵を所望のスケジュールで培養すると、母親の犠牲を払わずに胚を取得して胚の一連の発生段階を観察できるため、実験操作が容易になるため、発生研究において好ましい実験モデルである。さらに、より大規模な動物モデルと比較して胚を得るために、複雑な外科的処置および長い期間を必要としない。したがって、ひよこ胚は、脂肪組織発達の初期段階から前駆脂肪細胞を得る機会を提供する。皮下脂肪組織は、胚期12日目(E12)の周りのひよこにおいて、大腿部の周囲に位置する明確に定義されたデポーとして見えるようになる。このデポーは、成熟脂肪細胞を形成するための発達の手がかりの下で積極的に分化を受ける高度に増殖性前駆脂肪細胞に富んでいる6,7。脂肪生成分化のプロセスは、ニワトリとヒトの間で同等である。したがって、ひよこ胚から単離された前駆脂肪細胞は、ヒトおよび家禽に関連する研究のための二重目的モデルとして使用することができる。しかし、前駆脂肪細胞の収量は、細胞が成熟脂肪細胞に成長するにつれて加齢とともに低下する5。
本プロトコールは、ブロイラーニワトリ胚において脂肪生成分化および脂肪細胞肥大がピークとなる段階(E16−E18)における脂肪組織からの前駆脂肪細胞の単離を最適化する8。この手順は、鶏の食事療法などの ovoにおいて発達中の胚が曝露される因子が脂肪細胞の発生および エキソビボでの脂肪生成可能性に及ぼす影響を評価することができる。また、脂肪形成に対する様々な操作(例えば、低酸素、栄養素添加、薬理学的アゴニスト、およびアンタゴニスト)または脂肪細胞前駆細胞の様々な'omes(例えば、トランスクリプトーム、メタボローム、メチローム)への影響を試験することもできる。脂肪形成の初期段階の表現として、このプロトコルを使用して得られた細胞は、家禽およびヒトに関連する研究のための貴重なモデルである。
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Protocol
すべての動物の手順は、テネシー大学施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。受精したばかりの市販ブロイラー卵(Cobb 500)は、地元の孵化場から入手しました。卵を、胚発生日16〜18日目に解剖するまで相対湿度60%で38°Cでインキュベートした(E16−E18)。脂肪組織は、皮下(大腿骨)デポーから採取した。
1. 単離・培養の準備
- カルチャーフードと楽器を準備します。
- 解剖を開始する前に、層流フードに作業領域を設定します。作業領域とすべての機器を70%エタノールで拭いて消毒します。滅菌材料を使用してすべての手順を実行します。
注:容器および器具を細胞培養フードに戻す前に、必ず70%エタノールで綿棒で拭いてください。胚間で器具を容易に滅菌できるように、ボンネット内にベンチトップ器具滅菌器を配置することが推奨される。
警告: 器具滅菌器を使用する場合は、火傷や組織損傷を防ぐため、熱い器具を適切に冷却してください。最低冷却時間は3分を推奨します。使用前に70%エタノールで綿棒を拭きます。 - ストレート鉗子(120 mm)、ピンセット(110 mm)、2対の湾曲した鉗子(100 mm)、2対のストレートはさみ(140 mm)、湾曲した外科用はさみ(115 mm)、組織ストレーナー(250 μmナイロンメッシュ)、細胞ストレーナー(40 μmナイロンメッシュ)、円錐形遠心分離チューブ(15 mLと50 mL)、ペトリ皿(60 mmと100 mm)、 小型ビーカー(100mL)、70%エタノールスプレー、滅菌ガーゼ、ペーパータオル、ベンチトップワイパー( 材料表を参照)。
- 解剖を開始する前に、層流フードに作業領域を設定します。作業領域とすべての機器を70%エタノールで拭いて消毒します。滅菌材料を使用してすべての手順を実行します。
- 酵素液、採取培地、培養液を以下の手順に従って調製する。
注:溶液は事前に準備し、使用時まで4°Cで保管してください。培地は、組織採取前に氷の上に置く必要があります。このステップで使用されるすべての試薬は、 材料の表にリストされています。- DMEM/F12(ダルベッコの改変イーグル培地に2.50 mMのL-グルタミンと15 mMのHEPESバッファーを含む)を2.5 μg/mLのアムホテリシンBおよび1xペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)100 U/mLで補給することにより、脂肪組織の採取と酵素溶液の調製の両方に使用する培地を調製する。使用時まで4°Cで保存してください。
メモ:このメディアは、4°Cで保存すると1年間安定しています。 - ベタジンを1x PBS(pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水、カルシウム、マグネシウム、またはフェノールレッドを含まない)で20%(v / v)に希釈して滅菌溶液を調製し、2.5μg/mLのアムホテリシンBで使用時まで4°Cで保存します。
注:この溶液は、4°Cで保存すると2年間安定しています。 - 1型コラゲナーゼ(1mg/mL)をDMEM/F12に2.5μg/mLのアムホテリシンBおよび1x P/Sで溶解して酵素溶液を調製する(ステップ1.2.1)。新鮮なコラゲナーゼ溶液を作り、解剖中に氷上でそれを維持します。使用の約10分前に、この溶液を水浴中で37°Cでインキュベートして予備温め、その酵素活性を開始した。
注:脂肪組織100mgあたり約1mLのコラゲナーゼ溶液(1mg/mL)が必要です。 - DMEM/F12培地を1x P/Sおよび10%FBSで補うことにより、めっきおよび伝播に使用する成長培地を準備します。使用時まで4°Cで保存してください。
注:溶液は、4°Cで保存すると1年間安定しています。 - 1x PBSに2.5μg/mLのアムホテリシンBを添加して洗浄液を調製し、溶液を所望のpH7.4に調整する。使用時まで4°Cで保存してください。
注:この溶液は、4°Cで保存すると2年間安定しています。
- DMEM/F12(ダルベッコの改変イーグル培地に2.50 mMのL-グルタミンと15 mMのHEPESバッファーを含む)を2.5 μg/mLのアムホテリシンBおよび1xペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)100 U/mLで補給することにより、脂肪組織の採取と酵素溶液の調製の両方に使用する培地を調製する。使用時まで4°Cで保存してください。
2. 脂肪組織の採取と消化
- 胚を安楽死させる。
- 胚発生16日目に、卵をインキュベーターから取り出します。微生物汚染の主な潜在的な原因は卵の表面です。したがって、卵を割る前に70%エタノールに浸した滅菌ガーゼで卵を綿棒で拭きます。ふさいだ後、ガラスから卵をクッションするためにペーパータオルが敷かれた小さなビーカー(100mL)の上に、尖った端を下げて卵を垂直に置きます。
- 鉗子のハンドルを使用して、卵の鈍い端をタップして卵を壊します。卵殻を慎重に取り除き、胚を除去するのに十分な大きさの開口部を作ります(ステップ2.1.3)。白色卵殻膜を静かに引き裂き、胚を露出させる(図1A)。滅菌ピンセットを使用して羊膜を注意深く突き刺します(図1B)。
注:羊膜嚢は、胚を囲む羊水で満たされた透明な膜です。 - まっすぐな鉗子で胚の首を軽くつかんで卵から胚を取り除きます。卵黄嚢を切断して胚から切り離し、胚を100mmのペトリ皿に移します。
- 手術用はさみや鉗子を使ってすぐに首を切ってください。
- 脂肪組織採取を行う。
- 胚体を70%エタノールで拭き取り、滅菌ガーゼで皮膚表面を優しくこすって羽毛を取り除きます。ベンチトップワイパーを使用して、皮膚や羽毛が採取された組織に触れないようにします。
- 脚と腹部の間の皮膚を切り取り、大腿骨脂肪デポのペアを明らかにします。
- 片手で湾曲した鉗子を使用して脚の周りの皮膚を保持します。もう一方の手で大腿骨皮下脂肪を静かに取り除き、湾曲した鉗子を使用してデポを脚から静かに引き離します。
注:脚に脂肪パッドに付着する結合組織は比較的少なく、脂肪パッド全体を鉗子のみを使用して1枚で取り外し可能にする必要があります。これは、(端部ではなく)湾曲した部分が除去のために脂肪パッドをクランプするように鉗子を後方に保持することによって促進することができる。- 必要に応じて、湾曲したはさみで脂肪パッドを切り取ります。必要に応じて、他の脂肪パッドと追加の胚で繰り返します。
注:E16のほとんどの胚から合計80mgの皮下脂肪を得ることができる(図1C)。これは典型的には〜1 x106 細胞を生成し、1つのT−25フラスコをプレートするのに十分である。このステップでは、脂肪パッドの重量が特定のブロイラーライン間で異なる可能性があるため、またブリーダーの鶏の年齢や食事などの制御不能な要因のために、出発物質の量を評価するために、いくつかの胚から脂肪パッドを計量することが有用かもしれません。皮下脂肪は、複数のフラスコにメッキするための細胞の適切な収量を確保するために、5つの卵から日常的に収集されました。
- 必要に応じて、湾曲したはさみで脂肪パッドを切り取ります。必要に応じて、他の脂肪パッドと追加の胚で繰り返します。
- 組織を15 mLチューブ内の〜5 mLの収集培地に移し、残りの卵について解剖を繰り返す。
- 回収した脂肪パッドを滅菌液を入れた60mmのペトリ皿に移し、皿を数回旋回させて、短時間すすぎます。
- 脂肪パッドを1x PBSを含む60 mmペトリ皿に移して、滅菌溶液を洗い流します。優しく渦巻く。1x PBSを含む2番目の60 mmペトリ皿に移して、この手順を繰り返します。
- 以下の手順に従って酵素消化および前駆脂肪細胞単離を行う。
- 脂肪組織を、組織100mgあたり約1mLの予め加温された酵素溶液を含む15mLチューブに移す。チューブに一対の長いまっすぐなはさみを浸し、溶液中の脂肪組織をできるだけ小さな断片(〜1mm3)に細かく刻みます(図2A)。
注:組織が完全にミンチ化されていない場合、細胞収量は減少します。 - ミンチ組織および酵素溶液を25mLオートクレーブ処理フラスコに移す。フラスコをパラフィンフィルムで包む。インキュベーター内のオービタルシェーカーに置き、消化ステップ中に37°Cで振とうします。
メモ:または、振とうウォーターバスを使用してください。いずれのアプローチでも、速度は、組織の破片がフラスコの底に沈降するのを防ぐのに十分でなければならないが、断片がフラスコの上部に推進されてガラスに付着したり、流体がパラフィンフィルムカバーに蓄積したりするほど速くてはならない。 - 〜30分後、1mLピペットチップの端部を直径約3mmに切断する。組織混合物を数回上下にピペットでつなぎ、脂肪組織から細胞を解放するのを助けます。フラスコをインキュベーター/ウォーターバスに戻し、振とうを再開します。
- さらに15分後、フラスコの消化の完全性を確認してください。フラスコをシェーカーから取り出した後、流体層の上部に白っぽい細胞の層が形成される。組織断片がまだ残っている場合は、別のピペットチップから端を切り取り、混合物を静かに上下にピペットでピペットしてから、さらに15分間振とうを続けます。
注:完全に消化された組織/コラゲナーゼ混合物は乳白色の粥のように見えます。典型的には、組織は、1時間の穏やかな振盪の後に十分に消化される。この時点で多くの断片が残っている場合は、使用するコラゲナーゼ酵素に問題があることを示している可能性があります。一定の揺れは収量を増加させることができます。しかし、酵素や物理的ストレスへの長期暴露も細胞を損傷する可能性があります。 - 消化後、ピペットを軽く上下によく混ぜる。250 μm の組織ストレーナーをピペッティングで 15 mL チューブにろ過し、未消化組織や破片を除去します。
- フラスコをピペッティングによって4 mLの成長培地ですすぎ、ガラスに付着している可能性のある細胞を除去し、同じ15 mLチューブにろ過します。ピペッティングによって追加の増殖培地でストレーナーをすすぎ、捕捉された細胞を全量14mLまで緩めます。
- RTで5分間(50mLチューブで7分間)300 x g で遠心分離することによって細胞画分をペレット化する。
注:細胞培養フードに戻る前に、チューブを70%エタノールで綿棒で拭いてください。 - 上清を吸引する。セルペレットをはがさないように注意してください。ペレットを上下にピペッティングして1mLの赤血球溶解バッファー( 材料表を参照)に穏やかに再懸濁し、RTで5分間インキュベートする。赤血球が溶解されると、溶液は赤みを帯びます(図2B)。
メモ: RBC 溶解バッファーは、使用前に RT に置きます。ニワトリは有核赤血球9を有し、前駆脂肪細胞とともに組織培養皿に付着する。RBC溶解バッファーは、正確な細胞数との干渉を防ぐために、これらの細胞を溶解するために使用されます。 - 細胞を入れたチューブに5 mLの成長培地を加えて溶解バッファーを希釈し、上下にピペッティングして穏やかに混合します。ピペットを使用して、40 μm のセルストレーナーをろ過して新しい 50 mL チューブに入れ、さらに 5 mL の成長培地でストレーナーをすすいでください。
- ペレット細胞は、RTで7分間300 x g で遠心分離することによって、上清を慎重に吸引し、ピペッティングして1mLの増殖培地に残りの細胞ペレットを再懸濁する。
- 血球計数器、セルカウンター、およびトリパンブルー染色を使用して、細胞をカウントし、細胞の生存率を決定します。10 μL のサンプルを採取し、ピペッティングにより 10 μL のトリパンブルーと混合します。混合物の10μLを血球計数器に負荷し、10を測定する。
注:最初のスピン後に十分なセルペレットが容易に見えない場合は、遠心分離速度を600 x g に上げることができます。
- 血球計数器、セルカウンター、およびトリパンブルー染色を使用して、細胞をカウントし、細胞の生存率を決定します。10 μL のサンプルを採取し、ピペッティングにより 10 μL のトリパンブルーと混合します。混合物の10μLを血球計数器に負荷し、10を測定する。
- 脂肪組織を、組織100mgあたり約1mLの予め加温された酵素溶液を含む15mLチューブに移す。チューブに一対の長いまっすぐなはさみを浸し、溶液中の脂肪組織をできるだけ小さな断片(〜1mm3)に細かく刻みます(図2A)。
3. 前駆脂肪細胞の播種と培養
- T−25フラスコ中で予め加温された増殖培地の4mL中に〜1 x106 細胞を種子とする。他のタイプの培養容器を使用する場合は、同じめっき密度に従ってください。組織培養インキュベーターに入れ、一晩付着させる。
注:細胞は、5%CO2の加湿雰囲気を有する38°Cのインキュベーター内で培養される。鳥類細胞11 の増殖に最適な温度は38°Cであり、37°Cでゆっくりと増殖する。 - 翌日、培地を吸引し、ピペッティングによって細胞を1x PBSで穏やかに洗浄し、付着していない細胞または死んだ細胞を除去する。4 mLの新鮮な成長培地と交換してください。顕微鏡下で細胞を確認してください。細胞は、線維芽細胞のように紡錘状であるべきである(図2A)。
注:典型的には、前駆脂肪細胞はかなり迅速に(数時間以内に)付着する。細胞単離の成功または失敗は、この時点で(24時間後)確認することができる。 - 2 日ごとに 4 mL の新鮮な増殖培地と交換し、細胞が 70% ~ 80% のコンフルエントに達したら継代培養または凍結保存します (図 3C)。
4. 継代培養と凍結保存
- 古い培地を吸引し、ピペッティングによって4mLの1x PBSで細胞を穏やかに洗浄する。PBSを吸引し、T-25フラスコ内の細胞表面を覆うために0.1%トリプシン2mLを加え(他の培養容器に応じて体積を調整し)、38°Cで3〜4分間インキュベートする。
メモ: 細胞が培養プレートから剥離しているかどうかを確認します。培養プレートを軽く叩いて、細胞の剥離を助けます。細胞をトリプシンと長時間インキュベートすると、細胞が損傷します。 - トリプシン反応を阻害するために、予め温めた成長培地の等量を加える。ピペットを細胞表面を数回覆い、プレートを傾けて残りの細胞をほぐす。
- 細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、RTで5分間(50 mLチューブで7分間)300 x g で遠心分離します。上清を吸引する。
- 継代培養する場合は、ペレットを上下にピペッティングして1mLの増殖培地に再懸濁する。ステップ 2.3.9.1 で説明したようにセルを数え、ステップ 3.1 で最初に使用したのと同じめっき密度を使用して再プレートします。
- 凍結保存する場合は、90%のコンフルエント度を持つT-25フラスコ用に4mLの凍結培地を調製する。
メモ: フリーズメディアは、10% DMSO、30% FBS、および 60% DMEM/F12 で構成されています。 - 細胞ペレットを凍結培地に再懸濁し、1 mLの凍結培地を凍結培地に移す。凍結容器を使用して、クライオバイアルを-1°C/分までゆっくりと凍結します。容器を-80°Cの冷凍庫に一晩入れ、液体窒素に移して長期間保管します。
注:適切に凍結保存された前駆脂肪細胞は、少なくとも3年間生存率を維持し、解凍および播種時に新たに単離された細胞のように通常機能する。
5. アジポジェニック分化
注:2%ゼラチンコーティングプレートを使用して、細胞接着性を高めることができます。
- 蒸留水に2%(w/v)ゼラチン溶液( 材料表参照)を調製する。オートクレーブを121°Cで、15psiで30分間殺菌した。培養表面を5〜10μLのゼラチン溶液/ cm2 (すなわち、100〜200μg/ cm 2)でコーティングする。表面を均等にコーティングするために静かに旋回します。
- 一部の領域は最初にコーティングされていないままになる可能性があるため、ゼラチン溶液の均一な拡散についてプレートを確認してください。ゼラチンコーティングプレートを少なくとも1時間RTに留まらせます。ゼラチン溶液の全体積をウェルから取り除く。
注:これは井戸/皿の底に薄いゼラチンコートを残します。ゼラチン溶液は、細胞接着および増殖を変化させることなく、複数回(少なくとも10回)再利用することができる。ゼラチンコーティングされたディッシュを組織培養フードに少なくとも30分間保持してから、細胞をメッキします。 - ニワトリ前駆脂肪細胞を誘導し、増殖培地に脂肪酸を補うことにより脂肪生成分化を行わせる。脂肪生成分化培地(ADM)を調製するには、DMEM/F12に10%ニワトリ血清、1xリノール酸-オレイン酸-アルブミン(9.4μg/mL)、および1x P/S( 材料表を参照)を補充します。使用前にADMを新鮮で暖かいものにしてください。
注:ニワトリ前駆脂肪細胞は、他の種からの脂肪細胞に典型的に使用されるホルモンカクテルではなく、脂肪酸を培地に補充することによって、一般的に脂肪生成分化を受けるように誘導される12。 - 細胞が〜90%のコンフルエントに達したときに、増殖培地を脂肪生成分化培地に置き換えることによって分化を誘導する。この培地中の細胞を維持し、2日ごとに交換する。分化誘導から48時間以内に容易に見えるようになる脂肪滴の形成に基づいて、顕微鏡(20x)下で分化を目視で評価する。
6. 脂肪形成の評価
- 以下の手順に従ってオイルレッドO染色を行います。
- 細胞を6ウェルプレートにプレートし、〜90%のコンフルエントで脂肪生成分化を誘導する。
- 50mLチューブ内のオイルレッドO原液6部と蒸留水4部を組み合わせてオイルレッドOの作動溶液を調製する。上下にピペッティングして穏やかに混合し、RTで10分間放置した後、溶液を50mLチューブにゆっくりと注いで、漏斗内のグレード1ろ紙( 材料表を参照)をろ過します。
注:オイルレッドO原液は、オートクレーブボトルに0.7gのオイルレッドO( 材料表を参照)を200mLの100%イソプロパノールに溶解して作られています。よく混ぜて20分間放置します。4°Cで保存し、使用時まで光を避けてください。これは1年間安定しています。作業溶液は3時間使用できます。ただし、2時間以内に使用することをお勧めします。 - 培地を除去し、ピペットを使用して2mLの予め温めた1x PBSでウェルを2回穏やかに洗浄する。ピペッティングオフしてPBSを完全に取り外します。2 mL の 10% 緩衝ホルマリンで細胞を固定し、プレートをパラフィンフィルムで包みます。染色する前に、少なくとも1時間から最大2日間RTに放置してください。
注:1 Lの10%緩衝ホルマリン溶液を作るには、100 mLの37%ホルムアルデヒド、4.09 gのNaH2PO4、6.5 gのNa2HPO4 ( 材料表を参照)、および900 mLの蒸留水を混ぜます。ホルマリンを細胞に直接ピペットでつないでください。ウェルの底付近の側壁にそっと分注します。 - ホルマリンを除去し、2mLの蒸留水でウェルを穏やかに洗浄する。2mLの60%イソプロパノールと交換する。5分後、イソプロパノールを除去し、ウェルを約10分間完全に乾燥させる。すべての染色ステップをRTで実行します。
- 1 mLのOil Red O作業溶液を細胞に加え、RTで10〜20分間インキュベートします。ピペッティングで汚れを取り除き、余分な汚れが見えなくなるまで水道水に浸して5回洗浄します。最終すすぎの後、染色を視覚化し、顕微鏡下で画像を収集する前に、細胞に1mLの水を加える。
- ディッシュあたりの脂質蓄積を定量するには、水を除去し、6ウェルプレートのウェル内の細胞を完全に覆うのに十分な100%イソプロパノールを1〜2mL添加して、細胞からオイルレッドO色素を抽出します。プレートシェーカー上で穏やかに振とうしながらRTで10分間インキュベートする。
- 抽出液200 μLを96ウェルアッセイプレートのウェルに移す。分光光度計プレートリーダーを用いて相対染色量を定量し、495nmにおける吸光度を測定した。
- 細胞内脂肪滴および核の染色アッセイを行う。
- 黒い底96ウェルプレート中のプレート細胞は、ステップ5.3に記載されるように脂肪生成分化を誘導した。
- 細胞を染色するには、蛍光脂質染色剤と蛍光DNA染色剤( 材料表参照)を含む染色液を1ウェルあたり1x PBSに200 μL加えます。必要な染色剤の全体積を計算した後、ホイルラップチューブを使用して、溶液を光から保護するために、予め加温した1x PBSのmLあたり2滴のDNA染色剤および25μLの脂質染色剤を加える。RTで20分間インキュベートし、光から保護します。
- 蛍光プレートリーダーを使用して蛍光を読み取る( 材料表を参照)。赤色フィルターで脂質汚れ(励起:485 nm/発光:572 nm)を、青色/シアンフィルターでDNA染色(励起:359 nm/発光:450 nm)を検出します。
注:染色は、蛍光顕微鏡下で視覚化および画像撮影も可能です。 - 脂質染色強度をDNA染色強度に正規化し、細胞数13に対する脂質蓄積を定量化した。
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Representative Results
初代前駆脂肪細胞は形態学的に線維芽細胞に類似しており、不規則で星のような形状と中心核を有する(図2A-C)。細胞は組織培養プラスチックに容易に接着し、付着後すぐに増殖し始める。それらは、培地中に脂肪酸を供給されると、脂質滴(図3D)を急速に分化し、蓄積する。ここで表わされる単離物において報告された生存率(色素排除に基づく98%)は典型的である。細胞はかなり堅牢ですが、単離中の積極的な取り扱いは細胞の損傷につながり(図3E)、付着が悪く増殖に失敗する細胞を生成します。微生物汚染を防ぐために組み込まれた手順にもかかわらず、非滅菌材料の移送が起こり得る(図3F)。それらの急速な増殖速度のために、ひよこ胚前駆脂肪細胞は、培地中のグルコースを高い速度で消費する。メディアは、エネルギーの供給を維持するために48時間ごとに交換する必要があります。
ここで提示される代表的な結果は、ニワトリ胚前駆脂肪細胞の脂肪生成能を示す。これらの細胞は、脂肪生成条件下で脂肪滴を発達させるために迅速に蓄積し、蓄積は時間の経過とともに進行する(図4および図5)。脂肪形成の直接的な反映であるこれらの細胞における脂質蓄積の程度をよりよく視覚化および定量化するために使用することができる2つの方法が提示されている。Oil Red Oで脂質を染色することは、脂肪滴の蓄積を可視化および定量化する低コストの方法です(図4)。光学顕微鏡を使用して画像を収集し、画像が収集されるまで染色された細胞をベンチトップに保持することができます。細胞の各ディッシュにおける脂質蓄積は、染色剤を抽出し、分光光度計を用いて495nmにおける吸光度を読み取ることによって記載されているように定量することができる。選択した脂質とDNA染色剤の組み合わせを用いて、細胞数に対する脂質蓄積を定量することができ、これは培養中に持続し得る非脂肪生成性細胞を補う(図5)。いくつかの時点にわたって測定が行われる場合(図5B-C)、この組み合わせは、例えばホルモンまたはペプチドの添加に応答して、脂肪生成および増殖の両方を評価することを可能にする。
図1:脂肪組織採取(A)卵殻を砕くと、白色の卵殻膜が明らかになった。(b)滅菌ピンセットを用いて羊膜を突き刺す。(c)E16から合計〜80mgの大腿骨皮下脂肪を得ることができる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:酵素消化のための組織断片および消化後の細胞ペレット。 (A)酵素溶液中の脂肪組織を細切る(〜1mm3)。(b)矢印はRBC溶解後の細胞ペレットを示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:単離された初代前駆脂肪細胞の細胞形態比較 (A)単離後24時間における前駆脂肪細胞。(b)単離後48時間での脂肪前駆細胞。(C)単離後72時間で80%のコンフルエンシーを有する前駆脂肪細胞。(d)継代4で48時間脂肪生成誘導後の前駆脂肪細胞に、脂肪滴が見える。挿入図は、脂肪滴の拡大画像を示す。(E)損傷した細胞の代表的な画像。(F)矢印は、汚染された培養物中の黒い遊泳ドットを示す。スケール バー = 100 μm 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)エクスビボでの脂肪生成分化24時間、48時間、および72時間後のE16前駆脂肪細胞のオイルレッドO染色の代表的な画像。(B)オイルレッドO染色の溶出により測定した脂肪滴の定量。値は、ポストホック・テューキー±HSD検定による一元配置分散分析によってSD. a,b,c P < 0.05の平均として表されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:脂質染色/DNA染色による脂肪細胞分化の評価(A)エキソビボでの脂肪生成分化24時間、48時間、72時間後のE16前駆脂肪細胞の脂質染色(赤)およびDNA(青)染色の代表的な画像。(B)脂質染色(励起:485 nm/発光:572 nm)を行い、分化した前駆脂肪細胞における脂質蓄積を評価した。(C)DNA染色(励起:359nm/発光:450nm)を行い、細胞数の変動を評価した。(d)脂質とDNA染色の比率。脂質蓄積はDNA含量に正規化される。値は、ポストホック・テューキー±HSD検定による一元配置分散分析によってSD. a,b,c P<0.05の平均として表されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 年齢 (n=) | x106 細胞/100 mg 組織 | 生存率(%) |
| E12 (4) | 0.97 ± 0.115 a,b | 98.5 ± 0.58 a |
| E14 (4) | 1.22 ± 0.232 a,b | 98.3 ± 0.96 a,b |
| E16 (21) | 1.61 ± 1.717 a | 97.6 ± 1.58 a |
| E17 (4) | 0.81 ± 0.282 a,b | 96.8 ± 2.63 a,b |
| E18 (7) | 0.72 ± 0.611 a,b | 95.9 ± 1.81 a,b |
| E20 (4) | 0.94 ± 0.171 a,b | 97.8 ± 0.8 a,b |
| D4 (9) | 0.24 ± 0.164 a,b | 93.6 ± 4.28 b |
| D5 (4) | 0.25 ± 0.073 a,b | 98.5 ± 0.71 a,b |
| D7 (10) | 0.17 ± 0.162 b | 96.8 ± 3.49 a,b |
| D14 (4) | 0.25 ± 0.051 a,b | 99.0 ± 0.00 a,b |
表1:胚および孵化後のひよこから単離された細胞の平均細胞数および生存率。
値は、ポストホックTukey±HSD検定による一元配置分散分析によってSD. a,b P < 0.05の平均として表されます。
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Discussion
いくつかのよく記載されたプロトコールが前駆脂肪細胞14、15、16、17の単離を報告しているが、胚性前駆脂肪細胞に対する単離は最適化されており、これはブロイラーひよこの初期脂肪の成長および発達の機能分析に使用することができる。このプロトコールは、高い分化能を有する高い生存率胚性脂肪細胞前駆細胞を生じる。さらに、前駆脂肪細胞を単離するための提示された手順は、胚に限定されず、孵化後のひよこにおいて使用することができる。しかし、それはE16胚での使用に最適化されており、孵化後のひよこからの収量は、ひよこが急速に成長するにつれて結合組織の相対量の増加による可能性が高い(表1)。
細胞単離の成功は、最終的に、付着した細胞の形状および数を観察することによって評価される(図3A)。組織画分が消化される時間が長すぎる場合、特に組織の解離が1.5時間以上進行する場合、細胞数が少ないか損傷した細胞が観察されます(図3E)。したがって、1.5時間の消化を超えないようにすることをお勧めします。一方、1時間の消化後に組織断片がはっきりと残っている場合は、消化時間または量を増やす必要があります。得られた脂肪組織量も、ニワトリの遺伝的系統に応じて変化し得る。このプロトコルが他の年齢または種の細胞を単離するために使用される場合、コラゲナーゼの量および消化時間の両方を変更する必要がある可能性が高い。
初代細胞培養の一般的な制限は、単離された細胞が培養物中の数回の継代後に脂肪生成可能性を失い始めることである。したがって、胚性脂肪前駆細胞が脂肪生成能力を失わないようにするために、単離の数日以内に分化を誘導することが重要である。胚のアジポジェニック前駆体は、コンフルエントまたはホルモン誘導を必要とせずに、上述の培地製剤において成熟脂肪細胞に容易に分化する。継代4(10〜14日)までの細胞は、誘起から48時間以内に容易に分化される(図3D)。
初代細胞培養における細胞汚染の制御は、真菌汚染が最も一般的である別の課題である。記載されているように、アムホテリシンBの使用は、真菌の増殖を防止するのに一般的に有効である18、19。それは、生存率または脂肪生成可能性に顕著な影響を及ぼさずに、培養培地中に低濃度で含むことができる。識別不能な微生物汚染物質は、細胞単離の数日後に現れる黒い遊泳ドットの形で観察されている(図3F)。これらは細胞増殖に悪影響を及ぼし、この感染が一度起こると除去することは不可能であった20。これらの汚染物質が卵の中や上に見つかった未知の微生物種であったのか、それとも別の供給源から生じたのかは不明である。このプロトコルは、卵子21から胚を無菌的に抽出することによって汚染のリスクを最小限に抑えようとする。解剖中にフードに熱ベースの器具滅菌器を使用すると、特に複数の胚が解剖される場合に、汚染の可能性を最小限に抑えるのにも役立ちます。
このプロセスにおける1つの考慮事項は、分化中の組織培養プレートへの細胞接着の減少であり、細胞が脂肪滴を形成および拡張するにつれての物理的変化から生じる。細胞内に含まれているが、脂肪滴は浮力があり、大きいと、細胞が表面から浮き上がるのを促進する傾向があるバルーンとして作用するように見える。したがって、分化を誘導しながら、特に脂肪形成が評価される場合には、前駆脂肪細胞を取り扱う際に注意が必要である。ここで提示されるプロトコールは培養表面を修飾しないが、2%ゼラチンでコーティングされたディッシュに細胞をメッキすると、細胞接着を高めることができる。また、洗浄液のpHを7.4に確認し、細胞洗浄やDNA染色剤との混合時には予め加温したPBS溶液を使用して低温ストレスを軽減することも重要です。
複数の胚を使用して、十分な数の細胞を単離して、複数回の継代、拡張、および細胞が脂肪生成能を失うリスクを必要とせずに、実験的複製を生じさせることができる。RNAは、遺伝子発現研究のためのフェノールまたは膜ベースの商業的方法を用いて単離された前および分化したニワトリ胚脂肪細胞の両方から容易に単離することができる。6ウェルプレートの単一ウェルから、cDNA合成およびその後のqPCRまたはRNAseqに使用するのに十分なRNAを得ることができる。
要約すると、細胞モデルを単離するためのひよこ胚内の脂肪デポーのアクセシビリティは、家禽とヒトの両方にとって非常に関連性が高い。このプロトコールは比較的簡単に実行でき、 インビトロで脂肪原性分化を受けるように容易に誘導することができる高い割合の生細胞を産出する。受精鶏卵は、最小限のコストで様々な商業的供給源から得ることができるので、これらの細胞は実用化のために容易に入手可能なモデルとなる。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、このプロトコルを支援し最適化してくれたUT AgResearchと動物科学科に感謝する。この作業はUSDAの助成金によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
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