Summary
El presente protocolo describe un método simple para aislar preadipocitos del tejido adiposo en embriones de pollos de engorde. Este método permite el aislamiento con alto rendimiento, cultivo primario y diferenciación adipogénica de preadipocitos. La tinción de aceite Rojo O y la tinción de lípidos /ADN midieron la capacidad adipogénica de las células aisladas inducidas con medios de diferenciación.
Abstract
Los preadipocitos primarios son un valioso sistema experimental para comprender las vías moleculares que controlan la diferenciación y el metabolismo de los adipocitos. Los embriones de pollo brindan la oportunidad de aislar los preadipocitos desde la etapa más temprana del desarrollo adiposo. Esta célula primaria se puede utilizar para identificar factores que influyen en la proliferación de preadipocitos y la diferenciación adipogénica, lo que los convierte en un modelo valioso para estudios relacionados con la obesidad infantil y el control del exceso de deposición de grasa en aves de corral. El rápido crecimiento del tejido adiposo postnatal desperdicia efectivamente el alimento al asignarlo lejos del crecimiento muscular en pollos de engorde. Por lo tanto, los métodos para comprender las primeras etapas del desarrollo del tejido adiposo pueden proporcionar pistas para regular esta tendencia e identificar formas de limitar la expansión adiposa temprano en la vida. El presente estudio fue diseñado para desarrollar un método eficiente para el aislamiento, el cultivo primario y la diferenciación adipogénica de preadipocitos aislados del tejido adiposo en desarrollo de embriones comerciales de pollos de engorde (tipo carne). El procedimiento se ha optimizado para producir células con alta viabilidad (~ 98%) y una mayor capacidad para diferenciarse en adipocitos maduros. Este método simple de aislamiento, cultivo y diferenciación de preadipocitos embrionarios apoya los análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de la grasa en los primeros años de vida.
Introduction
La obesidad es una amenaza para la salud mundial tanto para adultos como para niños. Los niños con sobrepeso u obesidad tienen aproximadamente cinco veces más probabilidades de ser obesos como adultos, lo que los coloca en un riesgo significativamente mayor de enfermedad cardiovascular, diabetes y muchas otras comorbilidades. Alrededor del 13.4% de los niños estadounidenses de 2 a 5 años de edad tienen obesidad1, lo que ilustra que la tendencia a acumular exceso de grasa corporal puede ponerse en marcha muy temprano en la vida. Por razones muy diferentes, la acumulación de exceso de tejido adiposo es una preocupación para los pollos de engorde (tipo carne). Los pollos de engorde modernos son increíblemente eficientes, pero aún acumulan más lípidos de lo fisiológicamente necesario 2,3. Esta tendencia comienza poco después de la eclosión y efectivamente desperdicia el alimento, el componente de producción más caro, al asignarlo lejos del crecimiento muscular. Por lo tanto, tanto para los niños como para los pollos de engorde, aunque por razones muy diferentes, existe la necesidad de comprender los factores que influyen en el desarrollo del tejido adiposo e identificar formas de limitar la expansión adiposa temprano en la vida.
Los adipocitos se forman a partir de preadipocitos, células madre derivadas del tejido adiposo que se someten a diferenciación para desarrollar células grasas maduras que almacenan lípidos. En consecuencia, los preadipocitos in vitro son un modelo experimental valioso para los estudios de obesidad. Estas células, aisladas de la fracción vascular estromal de los depósitos adiposos, pueden proporcionar una comprensión fundamental de las vías moleculares que controlan la diferenciación y el metabolismo de los adipocitos 4,5. Los embriones de pollitos son un modelo experimental favorable en los estudios de desarrollo porque cultivar óvulos en el horario deseado facilita la manipulación experimental, ya que permite obtener embriones sin el sacrificio de la madre para observar una serie de etapas de desarrollo de los embriones. Además, no se requieren procedimientos quirúrgicos complicados y largos períodos de tiempo para obtener embriones en relación con modelos animales más grandes. Por lo tanto, el embrión de pollito presenta una oportunidad para obtener preadipocitos desde las primeras etapas del desarrollo del tejido adiposo. El tejido adiposo subcutáneo se hace visible en el pollito alrededor del día embrionario 12 (E12) como un depósito claramente definido ubicado alrededor del muslo. Este depósito está enriquecido en preadipocitos altamente proliferativos que se diferencian activamente bajo señales de desarrollo para formar adipocitos maduros 6,7. El proceso de diferenciación adipogénica es comparable entre pollos y humanos. Por lo tanto, los preadipocitos aislados de embriones de pollo se pueden utilizar como un modelo de doble propósito para estudios relevantes para humanos y aves de corral. Sin embargo, el rendimiento de los preadipocitos disminuye con el envejecimiento a medida que las células crecen en adipocitos maduros5.
El presente protocolo optimiza el aislamiento de los preadipocitos del tejido adiposo durante la etapa (E16-E18) en la que la diferenciación adipogénica y la hipertrofia de los adipocitos están en su punto máximo en embriones de pollos de engorde8. Este procedimiento puede evaluar los efectos de los factores a los que el embrión en desarrollo está expuesto in ovo, como la dieta de la gallina, sobre el desarrollo de los adipocitos y el potencial adipogénico ex vivo. También puede probar el impacto de varias manipulaciones (por ejemplo, hipoxia, adiciones de nutrientes, agonistas farmacológicos y antagonistas) en la adipogénesis o en los diversos 'omes( por ejemplo, transcriptoma, metaboloma, metiloma) de los progenitores de adipocitos. Como representación de la etapa más temprana de la formación adiposa, las células obtenidas utilizando este protocolo son modelos valiosos para estudios relevantes para aves de corral y humanos.
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Protocol
Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Tennessee. Los huevos de pollo de engorde comerciales recién fertilizados (Cobb 500) se obtuvieron de un criadero local. Los huevos se incubaron a 38 °C con un 60% de humedad relativa hasta las disecciones en los días embrionarios 16-18 (E16-E18). El tejido adiposo se recogió del depósito subcutáneo (femoral).
1. Preparación para el aislamiento y la cultura
- Prepara la campana de cultivo y los instrumentos.
- Antes de comenzar las disecciones, configure un área de trabajo en la campana de flujo laminar. Desinfectar el área de trabajo y todos los instrumentos mediante hisopo con etanol al 70%. Realizar todos los procedimientos utilizando materiales estériles.
NOTA: Siempre frote los recipientes e instrumentos con etanol al 70% antes de colocarlos de nuevo en la campana de cultivo celular. Se recomienda colocar un esterilizador de instrumentos de sobremesa en la capucha para que los instrumentos puedan esterilizarse fácilmente entre embriones.
PRECAUCIÓN: Cuando use un esterilizador de instrumentos, enfríe el instrumento caliente correctamente para evitar lesiones por quemaduras y daños en los tejidos. Se recomienda un tiempo mínimo de enfriamiento de 3 min. Hisopo con etanol al 70% antes de su uso. - Ensamble los siguientes instrumentos y recipientes en la campana: pinzas rectas (120 mm), pinzas (110 mm), dos pares de pinzas curvas (100 mm), dos pares de tijeras rectas (140 mm), tijeras quirúrgicas curvas (115 mm), colador de tejido (malla de nylon de 250 μm), colador celular (malla de nylon de 40 μm), tubos de centrífuga cónicos (15 ml y 50 ml), placas de Petri (60 mm y 100 mm), vaso de precipitados pequeño (100 ml), spray de etanol al 70% y gasa estéril, toalla de papel y limpiaparabrisas de sobremesa (ver Tabla de materiales).
- Antes de comenzar las disecciones, configure un área de trabajo en la campana de flujo laminar. Desinfectar el área de trabajo y todos los instrumentos mediante hisopo con etanol al 70%. Realizar todos los procedimientos utilizando materiales estériles.
- Prepare la solución enzimática, los medios de recopilación y los medios de cultivo siguiendo los pasos que se indican a continuación.
NOTA: Prepare las soluciones con anticipación y guárdelas a 4 °C hasta su uso. Los medios deben colocarse en hielo antes de la recolección de tejidos. Todos los reactivos utilizados en este paso se enumeran en la Tabla de materiales.- Preparar los medios utilizados tanto para la recolección de tejido adiposo como para la preparación de solución enzimática complementando DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium con 2,50 mM de L-glutamina y 15 mM de tampón HEPES) con 2,5 μg/mL de Anfotericina B y 1x penicilina/estreptomicina (P/S), 100 U/mL. Conservar a 4 °C hasta su uso.
NOTA: Este medio permanece estable durante 1 año cuando se almacena a 4 °C. - Prepare la solución de esterilización diluyendo Betadine al 20% (v/v) en 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato con pH 7.4, sin calcio, magnesio o rojo fenol) con 2.5 μg/mL de anfotericina B. Conservar a 4 °C hasta su uso.
NOTA: La solución es estable durante 2 años cuando se almacena a 4 °C. - Preparar la solución enzimática disolviendo la colagenasa tipo 1 (1 mg/ml) en DMEM/F12 con 2,5 μg/ml de anfotericina B y 1x P/S (paso 1.2.1). Haga una solución de colagenasa fresca y manténgala en hielo durante las disecciones. Aproximadamente 10 min antes de su uso, precalentando incubando esta solución a 37 °C en un baño de agua para iniciar su actividad enzimática.
NOTA: Se necesita aproximadamente 1 ml de solución de colagenasa (1 mg/ml) por cada 100 mg de tejido adiposo. - Prepare los medios de crecimiento utilizados para el recubrimiento y la propagación complementando los medios DMEM / F12 con 1x P / S y 10% FBS. Conservar a 4 °C hasta su uso.
NOTA: La solución es estable durante 1 año cuando se almacena a 4 °C. - Prepare la solución de lavado complementando 1x PBS con 2.5 μg / ml de anfotericina B. Ajuste la solución al pH deseado 7.4. Conservar a 4 °C hasta su uso.
NOTA: La solución es estable durante 2 años cuando se almacena a 4 °C.
- Preparar los medios utilizados tanto para la recolección de tejido adiposo como para la preparación de solución enzimática complementando DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium con 2,50 mM de L-glutamina y 15 mM de tampón HEPES) con 2,5 μg/mL de Anfotericina B y 1x penicilina/estreptomicina (P/S), 100 U/mL. Conservar a 4 °C hasta su uso.
2. Recolección y digestión de tejido adiposo
- Eutanasia del embrión.
- En el día embrionario 16, retire los huevos de la incubadora. La principal fuente potencial de contaminación microbiana es la superficie del huevo; por lo tanto, frote los huevos con una gasa estéril empapada en etanol al 70% antes de romperlos. Después de frotar, coloque el huevo verticalmente con el extremo puntiagudo hacia abajo sobre un vaso de precipitados pequeño (100 ml) forrado con toallas de papel para amortiguar el huevo del vaso.
- Usando el mango de las pinzas, rompe un huevo golpeando el extremo romo del huevo. Retire cuidadosamente la cáscara del huevo para crear una abertura lo suficientemente grande como para extraer el embrión (paso 2.1.3). Rasgar suavemente la membrana de la cáscara blanca para exponer el embrión (Figura 1A). Perfore el amnios con cuidado usando pinzas estériles (Figura 1B).
NOTA: El saco amniótico es una membrana transparente llena de líquido amniótico que encierra el embrión. - Retire el embrión del óvulo agarrando ligeramente el cuello del embrión con fórceps rectos. Cortar el saco vitelino para desconectarlo del embrión y transferir el embrión a una placa de Petri de 100 mm.
- Decapita inmediatamente usando tijeras quirúrgicas y fórceps.
- Realizar la recolección de tejido adiposo.
- Frote el cuerpo del embrión con etanol al 70% y frote suavemente la superficie de la piel con una gasa estéril para eliminar las plumas, ya que pueden interferir con la filtración en pasos posteriores después de la digestión. Use limpiaparabrisas de sobremesa para evitar que la piel y las plumas toquen el tejido recolectado.
- Corte la piel entre las piernas y la región abdominal para revelar el par de depósitos adiposos femorales.
- Sostenga la piel alrededor de la pierna con fórceps curvos con una mano. Retire suavemente la grasa subcutánea femoral con la otra mano, usando pinzas curvas para alejar suavemente el depósito de la pierna.
NOTA: Hay relativamente poco tejido conectivo que se adhiere a la almohadilla de grasa de la pierna, y toda la almohadilla de grasa debe ser extraíble en una sola pieza usando solo fórceps. Esto se puede facilitar sosteniendo los fórceps hacia atrás para que las porciones curvas (en lugar de los extremos) sujeten la almohadilla de grasa para su eliminación.- Si es necesario, corte la almohadilla de grasa con tijeras curvas. Repita con la otra almohadilla de grasa y embriones adicionales según sea necesario.
NOTA: Se puede obtener un total de 80 mg de grasa subcutánea de la mayoría de los embriones en E16 (Figura 1C). Esto generalmente produce ~ 1 x 106 células, suficiente para platear un matraz T-25. Podría ser útil en este paso pesar las almohadillas de grasa de unos pocos embriones para evaluar la cantidad de material de partida, ya que los pesos de las almohadillas de grasa pueden variar entre líneas específicas de pollos de engorde, y debido a factores incontrolables, como la edad de la gallina reproductora y la dieta. La grasa subcutánea se recolectó rutinariamente de cinco huevos para garantizar un rendimiento adecuado de células para el recubrimiento en múltiples matraces.
- Si es necesario, corte la almohadilla de grasa con tijeras curvas. Repita con la otra almohadilla de grasa y embriones adicionales según sea necesario.
- Transfiera los tejidos a ~ 5 ml de medios de recolección en un tubo de 15 ml y repita la disección para los óvulos restantes.
- Enjuague brevemente las almohadillas de grasa recolectadas transfiriéndolas a una placa de Petri de 60 mm que contenga una solución de esterilización y girando la placa varias veces.
- Enjuague la solución de esterilización transfiriendo almohadillas de grasa a una placa de Petri de 60 mm que contenga 1x PBS. Gira suavemente. Repita este paso transfiriendo a una segunda placa de Petri de 60 mm que contenga 1x PBS.
- Realice la digestión enzimática y el aislamiento de preadipocitos siguiendo los pasos a continuación.
- Transfiera los tejidos adiposos a un tubo de 15 ml que contenga ~ 1 ml de solución enzimática precalentada por 100 mg de tejido. Sumerja un par de tijeras largas y rectas en el tubo y extraiga finamente los tejidos adiposos de la solución en trozos lo más pequeños posible (~1 mm3) (Figura 2A).
NOTA: El rendimiento celular se reducirá si los tejidos no se pican a fondo. - Transfiera el tejido picado y la solución enzimática a un matraz en autoclave de 25 ml. Envuelva el matraz con película de parafina. Colocar en un agitador orbital dentro de una incubadora y agitar a 37 °C durante la etapa de digestión.
NOTA: Alternativamente, use un baño de agua agitada. Con cualquiera de los dos enfoques, la velocidad debe ser suficiente para evitar que los trozos de tejido se asienten en el fondo del matraz, pero no debe ser tan rápida como para que las piezas se impulsen a la parte superior del matraz y se peguen al vidrio, o que el líquido se acumule en la cubierta de la película de parafina. - Después de ~ 30 min, corte el extremo de una punta de pipeta de 1 ml a un diámetro de aproximadamente 3 mm. Pipetear la mezcla de tejido hacia arriba y hacia abajo varias veces para ayudar a liberar las células del tejido adiposo. Devuelva el matraz a la incubadora/baño de agua y reanude el temblor.
- Después de 15 minutos adicionales, revise el matraz para verificar la integridad de la digestión. Después de retirar el matraz del agitador, se formará una capa de células blanquecinas en la parte superior de la capa de líquido. Si aún quedan fragmentos de tejido, corte el extremo de otra punta de pipeta y pipetee suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo, luego continúe agitando durante 15 minutos adicionales.
NOTA: La mezcla de tejido completamente digerido / colagenasa se parece al quimo lechoso. Por lo general, el tejido se digiere lo suficiente después de 1 h de agitación suave. Si quedan muchos fragmentos en este punto, puede indicar un problema con la enzima colagenasa utilizada. El temblor constante puede aumentar el rendimiento; sin embargo, la exposición prolongada a la enzima y el estrés físico también pueden dañar las células. - Después de la digestión, pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Filtre a través de un colador de tejido de 250 μm en un tubo de 15 ml mediante pipeteo para eliminar cualquier trozo de tejido no digerido y escombros.
- Enjuague el matraz con 4 ml de medios de crecimiento mediante pipeteo para eliminar las células que puedan adherirse al vidrio y filtre en el mismo tubo de 15 ml. Enjuague el colador con medios de crecimiento adicionales mediante pipeteo para aflojar las células atrapadas, hasta un volumen total de 14 ml.
- Pellet la fracción celular por centrifugación a 300 x g durante 5 min a RT (7 min para tubo de 50 mL).
NOTA: Siempre frote los tubos con etanol al 70% antes de regresar a la campana de cultivo celular. - Aspirar el sobrenadante. Tenga cuidado de no desalojar la bolita celular. Resusped suavemente el pellet en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (ver Tabla de materiales) mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo, e incube durante 5 minutos en RT. La solución se volverá rojiza a medida que se lisan los glóbulos rojos (Figura 2B).
NOTA: Coloque el búfer de lisis de RBC en RT antes de usarlo. Los pollos tienen glóbulos rojos nucleados9, y se adhieren a los platos de cultivo de tejidos junto con los preadipocitos. El tampón de lisis de glóbulos rojos se utiliza para lisar estas células para evitar su interferencia con los recuentos celulares precisos. - Agregue 5 ml de medios de crecimiento al tubo que contiene las células para diluir el tampón de lisis y mezcle suavemente mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Usando una pipeta, filtre a través de un colador de células de 40 μm en un nuevo tubo de 50 ml y enjuague el colador con 5 ml adicionales de medios de crecimiento.
- Células de pellets centrifugando a 300 x g durante 7 min en RT. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el pellet celular restante en 1 ml de medios de crecimiento mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo.
- Use un hemocitómetro, un contador celular y una tinción de Trypan Blue para contar las células y determinar la viabilidad celular. Tomar 10 μL de muestra y mezclar con 10 μL de Trypan Blue mediante pipeteo. Cargue 10 μL de la mezcla en el hematocitómetro y mida10.
NOTA: Las velocidades de centrifugación se pueden aumentar a 600 x g si no se ven suficientes gránulos celulares después del giro inicial.
- Use un hemocitómetro, un contador celular y una tinción de Trypan Blue para contar las células y determinar la viabilidad celular. Tomar 10 μL de muestra y mezclar con 10 μL de Trypan Blue mediante pipeteo. Cargue 10 μL de la mezcla en el hematocitómetro y mida10.
- Transfiera los tejidos adiposos a un tubo de 15 ml que contenga ~ 1 ml de solución enzimática precalentada por 100 mg de tejido. Sumerja un par de tijeras largas y rectas en el tubo y extraiga finamente los tejidos adiposos de la solución en trozos lo más pequeños posible (~1 mm3) (Figura 2A).
3. Siembra y cultivo de preadipocitos
- Semilla ~ 1 x 106 células en 4 ml de medios de crecimiento precalentados en un matraz T-25. Siga la misma densidad de recubrimiento si utiliza otros tipos de recipientes de cultivo. Colocar en la incubadora de cultivo de tejidos y dejar fijar durante la noche.
NOTA: Las células se cultivan en una incubadora de 38 °C con una atmósfera humidificada de 5% de CO2. La temperatura óptima para el crecimiento de las células aviares11 es de 38 ° C, y crecen lentamente a 37 ° C. - Al día siguiente, aspire los medios y lave suavemente las células con 1x PBS mediante pipeteo para eliminar las células no adheridas o muertas. Reemplace con 4 ml de medios de crecimiento frescos. Revise las células bajo un microscopio. Las células deben tener forma delgada, como los fibroblastos (Figura 2A).
NOTA: Por lo general, los preadipocitos se adhieren con bastante rapidez (en unas pocas horas). El éxito o fracaso del aislamiento celular se puede confirmar en este momento (después de 24 h). - Reemplazar con 4 ml de medios de crecimiento frescos cada 2 días y subcultivar o criopreservar células cuando alcancen un 70%-80% de confluencia (Figura 3C).
4. Subcultivo y criopreservación
- Aspire los medios viejos y lave suavemente las células con 4 ml de 1x PBS mediante pipeteo. Aspire PBS, agregue 2 ml de tripsina al 0,1% para cubrir la superficie celular en un matraz T-25 (ajuste el volumen en consecuencia para otros recipientes de cultivo) y luego incube durante 3-4 min a 38 ° C.
NOTA: Observe si las células están separadas de la placa de cultivo. Golpee la placa de cultivo suavemente para ayudar al desprendimiento celular. Incubar células con tripsina durante demasiado tiempo dañará las células. - Agregue un volumen equivalente de medios de crecimiento precalentados para inhibir la reacción de tripsina. Pipete sobre la superficie de la celda varias veces, inclinando la placa para aflojar las celdas restantes.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrífuga a 300 x g durante 5 minutos a RT (7 minutos para un tubo de 50 ml). Aspirar el sobrenadante.
- Si se subcultiva, resuspenda el pellet en 1 ml de medio de crecimiento mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Cuente las celdas como se describe en el paso 2.3.9.1 y, a continuación, vuelva a repetirlas utilizando la misma densidad de chapado utilizada inicialmente en el paso 3.1.
- Si se criopreserva, prepare 4 ml de medios de congelación para un matraz T-25 con 90% de confluencia.
NOTA: Los medios de congelación consisten en 10% DMSO, 30% FBS y 60% DMEM / F12. - Resuspend cell pellet en medios de congelación y transferir 1 mL de medios de congelación a un criovial. Congele los crioviales lentamente a -1 °C/min con un recipiente de congelación. Coloque el recipiente en un congelador de -80 °C durante la noche y luego transfiéralo a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
NOTA: Los preadipocitos criopreservados adecuadamente mantienen su viabilidad durante al menos 3 años y generalmente funcionan como células recién aisladas cuando se descongelan y se chapan.
5. Diferenciación adipogénica
NOTA: Se pueden usar placas recubiertas de gelatina al 2% para mejorar la adhesión celular.
- Prepare una solución de gelatina al 2% (p/v) (ver Tabla de Materiales) en agua destilada. Autoclave a 121 °C, 15 psi durante 30 min para esterilizar. Cubra la superficie de cultivo con 5-10 μL de solución de gelatina/cm2 (es decir, 100-200 μg/cm2). Gire suavemente para cubrir uniformemente la superficie.
- Revise las placas para una propagación uniforme de la solución de gelatina, ya que algunas regiones pueden permanecer sin recubrimiento inicialmente. Deje que la placa recubierta de gelatina permanezca en RT durante al menos 1 h. Retire todo el volumen de solución de gelatina de los pocillos.
NOTA: Esto dejará una fina capa de gelatina en el fondo de los pocillos / platos. La solución de gelatina se puede reutilizar varias veces (al menos 10 veces) sin alterar la adhesión y el crecimiento celular. Permita que los platos recubiertos de gelatina permanezcan en la campana de cultivo de tejidos durante al menos 30 minutos antes de enchapar las células. - Inducir a los preadipocitos de pollo a someterse a la diferenciación adipogénica complementando los medios de crecimiento con ácidos grasos. Para preparar medios de diferenciación adipogénica (ADM), complemente DMEM/F12 con suero de pollo al 10%, 1x Ácido Linoleico-Ácido Oleico-Albúmina (9.4 μg/mL) y 1x P/S (ver Tabla de Materiales). Haga que ADM sea fresco y caliente antes de su uso.
NOTA: Los preadipocitos de pollo son comúnmente inducidos a someterse a la diferenciación adipogénica mediante la suplementación de medios con ácidos grasos en lugar de cócteles hormonales típicamente utilizados para los adipocitos de otras especies12. - Inducir la diferenciación reemplazando los medios de crecimiento con medios de diferenciación adipogénica cuando las células alcanzan ~ 90% de confluencia. Mantenga las células en este medio, reemplazándolas cada 2 días. Evaluar la diferenciación visualmente bajo un microscopio (20x) en función de la formación de gotas lipídicas, que se hacen fácilmente visibles dentro de las 48 h de inducir la diferenciación.
6. Evaluación de la adipogénesis
- Realice la tinción oil red O siguiendo los pasos a continuación.
- Coloque las células en una placa de seis pocillos e induzca la diferenciación adipogénica a ~ 90% de confluencia.
- Prepare una solución de trabajo de Oil Red O combinando seis partes de la solución madre de Oil Red O con cuatro partes de agua destilada en un tubo de 50 ml. Mezcle suavemente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo y deje reposar durante 10 minutos en RT, y luego filtre a través de un papel de filtro de Grado 1 (consulte la Tabla de materiales) dentro del embudo vertiendo lentamente la solución en un tubo de 50 ml.
NOTA: La solución madre de Oil Red O se hace disolviendo 0.7 g de Oil Red O (ver Tabla de Materiales) en 200 mL de isopropanol al 100% en una botella autoclave. Mezclar bien y dejar reposar durante 20 min. Conservar a 4 °C y mantener alejado de la luz hasta su uso. Esto es estable durante 1 año. La solución de trabajo se puede utilizar durante 3 h; sin embargo, se recomienda usarlo dentro de las 2 h. - Retire los medios y lave suavemente los pocillos dos veces con 2 ml de PBS 1x precalentado con una pipeta. Retire el PBS por completo mediante pipeteo. Fije las células con 2 ml de formalina tamponada al 10% y envuelva la placa con película de parafina. Dejar en RT durante al menos 1 h y hasta 2 días antes de la tinción.
NOTA: Para hacer 1 L de solución de formalina tamponada al 10%, mezcle 100 ml de formaldehído al 37%, 4,09 g de NaH2PO4, 6,5 g de Na2HPO4 (ver Tabla de materiales) y 900 ml de agua destilada. No pipetee la formalina directamente sobre las células. Dispense suavemente en la pared lateral cerca del fondo del pozo. - Retire la formalina y lave suavemente los pocillos con 2 ml de agua destilada. Sustituir por 2 mL de isopropanol al 60%. Después de 5 min, retire el isopropanol y deje que los pocillos se sequen completamente durante unos 10 min. Realice todos los pasos de tinción en RT.
- Agregue 1 ml de solución de trabajo Oil Red O a las células e incube durante 10-20 min en RT. Retire la mancha mediante pipeteo y lave cinco veces sumergiendo en agua del grifo hasta que no se vea un exceso de mancha. Después del enjuague final, agregue 1 ml de agua a las células antes de visualizar la tinción y recolectar imágenes bajo un microscopio.
- Para cuantificar la acumulación de lípidos por plato, elimine el agua y extraiga el colorante Oil Red O de las células agregando 1-2 ml de isopropanol al 100% que es suficiente para cubrir las células en un pozo de placa de seis pocillos por completo. Incubar con agitación suave en un agitador de placas durante 10 min en RT.
- Transfiera 200 μL de la extracción a un pozo de la placa de ensayo de 96 pocillos. Cuantificar la cantidad relativa de mancha utilizando un lector de placas espectrofotómetro para medir la absorbancia a 495 nm.
- Realizar el ensayo de tinción de las gotas lipídicas intracelulares y del núcleo.
- Placas de células en placas negras inferiores de 96 pocillos e inducen la diferenciación adipogénica como se describe en el paso 5.3.
- Para teñir las células, agregue 200 μL de la solución de tinción que contiene una tinción lipídica fluorescente y una tinción fluorescente de ADN (ver Tabla de materiales) en 1x PBS por pozo. Después de calcular el volumen total de la tinción requerida, agregue dos gotas de la tinción de ADN y 25 μL de la tinción lipídica por ml de PBS precalentado 1x utilizando un tubo envuelto en lámina para proteger la solución de la luz. Incubar en RT durante 20 min y proteger de la luz.
- Lea la fluorescencia usando un lector de placas fluorescentes (ver Tabla de Materiales). Detectar la tinción lipídica (Excitación: 485 nm/Emisión: 572 nm) utilizando un filtro rojo y la tinción de ADN (Excitación: 359 nm/Emisión: 450 nm) a través de un filtro azul/cian.
NOTA: La tinción también se puede visualizar y las imágenes se pueden capturar bajo un microscopio fluorescente. - Normalizar las intensidades de la tinción lipídica a las intensidades de la tinción de ADN para cuantificar la acumulación de lípidos en relación con la célula número13.
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Representative Results
Los preadipocitos primarios son morfológicamente similares a los fibroblastos, con formas irregulares en forma de estrella y un núcleo central (Figura 2A-C). Las células se adhieren fácilmente al plástico de cultivo de tejidos y comienzan a proliferar poco después de la unión. Se diferencian rápidamente y acumulan gotas lipídicas (Figura 3D) cuando se les proporcionan ácidos grasos en los medios. La viabilidad (98%, basada en la exclusión del tinte) reportada en los aislamientos aquí representados es típica. Si bien las células son bastante robustas, el manejo agresivo durante el aislamiento conduce al daño celular (Figura 3E), produciendo células que se adhieren mal y no proliferan. A pesar de los procedimientos incorporados para prevenir la contaminación microbiana, puede ocurrir la transferencia de material no estéril (Figura 3F). Debido a su rápida tasa de crecimiento, los preadipocitos embrionarios de pollo consumen glucosa en los medios de comunicación a altas tasas. Los medios deben cambiarse cada 48 h para mantener su suministro de energía.
Los resultados representativos presentados aquí ilustran el potencial adipogénico de los preadipocitos embrionarios de pollo. Estas células se acumulan rápidamente para desarrollar gotas lipídicas en condiciones adipogénicas, y la acumulación progresa con el tiempo (Figura 4 y Figura 5). Se han presentado dos métodos que se pueden utilizar para visualizar y cuantificar mejor el grado de acumulación de lípidos en estas células, que es un reflejo directo de la adipogénesis. La tinción de lípidos con Aceite Rojo O es un método de bajo costo para visualizar y cuantificar la acumulación de gotas lipídicas (Figura 4). Se utiliza un microscopio de luz para recolectar imágenes, y las células teñidas se pueden mantener en la mesa de trabajo hasta que se recopilen las imágenes. La acumulación de lípidos en cada plato de células se puede cuantificar como se describe extrayendo la mancha y leyendo la absorbancia a 495 nm utilizando un espectrofotómetro. Utilizando la combinación de las tinciones seleccionadas de lípidos y ADN, fue posible cuantificar la acumulación de lípidos en relación con el número de células, lo que compensa las células no adipogénicas que pueden persistir en cultivo (Figura 5). Si se toman medidas en varios puntos de tiempo (Figura 5B-C), esta combinación permite evaluar tanto la adipogénesis como la proliferación, por ejemplo, en respuesta a hormonas o péptidos añadidos.
Figura 1: Recolección de tejido adiposo. (A) Al romper la cáscara del huevo, se reveló la membrana de la cáscara blanca. (B) Perforación del amnios con pinzas estériles. (C) Se puede obtener un total de ~ 80 mg de grasa subcutánea femoral de E16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fragmentos de tejido para digestión enzimática y pellet celular después de la digestión. (A) Tejido adiposo picado en solución enzimática (~1 mm3). (B) Las flechas indican gránulos celulares después de la lisis de los glóbulos rojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparaciones de morfología celular de preadipocitos primarios aislados. (A) Preadipocitos a las 24 h después del aislamiento. (B) Preadipocitos a las 48 h después del aislamiento. (C) Preadipocitos con 80% de confluencia a las 72 h después del aislamiento. (D) Los preadipocitos después de 48 h de inducción adipogénica en el paso 4, las gotas de lípidos son visibles. El recuadro indica la imagen ampliada de las gotas lipídicas. (E) Imagen representativa de las células dañadas. (F) La flecha indica puntos negros de natación en cultivos contaminados. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación de la acumulación de lípidos por tinción de Oil Red O. (A) Imágenes representativas de la tinción de Oil Red O de preadipocitos E16 después de 24 h, 48 h y 72 h de diferenciación adipogénica ex vivo. Barras de escala = 100 μm. (B) Cuantificación de gotas lipídicas medida por elución de tinción de Oil Red O. Los valores se expresan como media ± SD. a,b,c P < 0,05 por ANOVA unidireccional con la prueba HSD de Posthoc Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Evaluación de la diferenciación de adipocitos por tinción lipídica/tinción de ADN. (A) Imágenes representativas de la tinción lipídica (rojo) y la tinción de ADN (azul) de preadipocitos E16 después de 24 h, 48 h y 72 h de diferenciación adipogénica ex vivo. Barras de escala = 150 μm. (B) Se realizó tinción lipídica (Excitación: 485 nm/Emisión: 572 nm) para evaluar la acumulación de lípidos en preadipocitos diferenciados. (C) Se realizó tinción de ADN (Excitación: 359 nm/Emisión: 450 nm) para evaluar las variaciones en el número de células. (D) La proporción de lípidos y tinción de ADN. La acumulación de lípidos se normaliza al contenido de ADN. Los valores se expresan como media ± SD. a,b,c P < 0,05 por ANOVA unidireccional con la prueba HSD de posthoc Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Edad (n=) | x106 células/100 mg de tejido | Viabilidad (%) |
| E12 (4) | 0,97 ± 0,115 a,b | 98,5 ± 0,58 a |
| E14 (4) | 1,22 ± 0,232 a,b | 98,3 ± 0,96 a,b |
| E16 (21) | 1,61 ± 1,717 a | 97,6 ± 1,58 a |
| E17 (4) | 0,81 ± 0,282 a,b | 96,8 ± 2,63 a,b |
| E18 (7) | 0,72 ± 0,611 a,b | 95,9 ± 1,81 a,b |
| E20 (4) | 0,94 ± 0,171 a,b | 97,8 ± 0,8 a,b |
| D4 (9) | 0,24 ± 0,164 a,b | 93,6 ± 4,28 b |
| D5 (4) | 0,25 ± 0,073 a,b | 98,5 ± 0,71 a,b |
| D7 (10) | 0,17 ± 0,162 b | 96,8 ± 3,49 a,b |
| D14 (4) | 0,25 ± 0,051 a,b | 99,0 ± 0,00 a,b |
Tabla 1: Número medio de células y viabilidad de células aisladas de pollitos embrionarios y post-eclosión.
Los valores se expresan como media ± SD. a,b P < 0,05 por ANOVA unidireccional con la prueba HSD de Posthoc Tukey.
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Discussion
Aunque varios protocolos bien descritos han reportado el aislamiento de preadipocitos 14,15,16,17, se ha optimizado el aislamiento para preadipocitos embrionarios, que pueden usarse para análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de grasa en la vida temprana en pollitos de engorde. Este protocolo produce progenitores de adipocitos embrionarios de alta viabilidad con alto potencial de diferenciación. Además, el procedimiento presentado para aislar los preadipocitos no se limita a los embriones, sino que se puede utilizar en pollitos posteriores a la eclosión. Sin embargo, se ha optimizado para su uso con embriones E16, y los rendimientos de los pollitos después de la eclosión son considerablemente más bajos (Tabla 1), probablemente debido a aumentos en la cantidad relativa de tejido conectivo a medida que los polluelos crecen rápidamente.
El éxito del aislamiento celular se evalúa en última instancia observando la forma y el número de células unidas (Figura 3A). Se puede observar un bajo número de células o células dañadas cuando las fracciones de tejido se digieren demasiado tiempo, especialmente cuando la disociación tisular progresa durante más de 1,5 h (Figura 3E). Por lo tanto, se recomienda que no se superen las 1,5 h de digestión. Por otro lado, si el fragmento de tejido permanece claramente después de una hora de digestión, se debe aumentar el tiempo digestivo o la cantidad. La cantidad de tejido adiposo obtenida también puede variar dependiendo de la cepa genética del pollo. Si este protocolo se utiliza para aislar células de otras edades o especies, es probable que sea necesario modificar tanto la cantidad de colagenasa como el tiempo de digestión.
Una limitación común del cultivo celular primario es que las células aisladas comienzan a perder potencial adipogénico después de varios pasajes en cultivo; por lo tanto, es importante inducir la diferenciación a los pocos días del aislamiento para garantizar que los preadipocitos embrionarios no pierdan su capacidad adipogénica. Los precursores adipogénicos de embriones se diferencian fácilmente en adipocitos maduros en la formulación de medios descrita anteriormente, sin necesidad de confluencia o inducción hormonal. Las células hasta el paso 4 (10-14 días) se diferencian fácilmente dentro de las 48 h de la inducción (Figura 3D).
El control de la contaminación celular en el cultivo celular primario es otro desafío, donde la contaminación por hongos es la más común. El uso de Anfotericina B, como se describe, es generalmente eficaz en la prevención del crecimiento de hongos18,19. Se puede incluir a bajas concentraciones en los medios de cultivo sin efectos notables sobre la viabilidad o el potencial adipogénico. Se han observado contaminantes microbianos no identificables en forma de puntos negros de natación que aparecen unos días después del aislamiento celular (Figura 3F). Estos afectaron negativamente el crecimiento celular y fueron imposibles de eliminar una vez que se produjo esta infección20. Se desconoce si estos contaminantes eran una especie microbiana desconocida que se encuentra en o sobre los huevos o surgieron de otra fuente. Este protocolo intenta minimizar el riesgo de contaminación mediante la extracción aséptica de embriones del óvulo21. El uso de un esterilizador de instrumentos a base de calor en la campana durante la disección también ayuda a minimizar el potencial de contaminación, especialmente cuando se diseccionan múltiples embriones.
Una consideración en el proceso es la disminución de la adhesión celular a la placa de cultivo de tejidos durante la diferenciación, como resultado de los cambios físicos a medida que las células forman y expanden las gotas de lípidos. Aunque están contenidas dentro de las células, las gotas de lípidos son flotantes y, cuando son grandes, parecen actuar como globos que tienden a promover la elevación de las células desde la superficie. Por lo tanto, se debe tener cuidado en el manejo de los preadipocitos mientras se induce la diferenciación, y particularmente cuando se evalúa la adipogénesis. Si bien el protocolo presentado aquí no modifica la superficie de cultivo, la adhesión celular se puede mejorar al enchapar las células en platos recubiertos con gelatina al 2%. También es importante confirmar que el pH de las soluciones de lavado es de 7.4 y usar una solución de PBS precalentada al lavar las células y mezclarlas con la tinción de ADN para reducir el estrés por frío.
Usando múltiples embriones, se puede aislar un número suficiente de células para producir réplicas experimentales sin la necesidad de múltiples pasajes, la expansión y el riesgo de que las células pierdan su potencial adipogénico. El ARN se puede aislar fácilmente de adipocitos embrionarios de pollitos pre y diferenciados aislados utilizando métodos comerciales basados en fenol o membrana para estudios de expresión génica. Se puede obtener suficiente ARN de un solo pocillo de una placa de seis pocillos para su uso en la síntesis de ADNc y la qPCR de seguimiento o RNAseq.
En resumen, la accesibilidad de los depósitos adiposos en el embrión de pollo para aislar un modelo celular es muy relevante tanto para las aves de corral como para los seres humanos. Este protocolo es relativamente simple de realizar, y produce un alto porcentaje de células viables que pueden ser fácilmente inducidas a someterse a la diferenciación adipogénica in vitro. Los huevos de gallina fertilizados se pueden obtener de varias fuentes comerciales a un costo mínimo, lo que hace que estas células sean un modelo fácilmente disponible para uso práctico.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a UT AgResearch y al Departamento de Ciencia Animal por apoyar y optimizar este protocolo. Este trabajo fue financiado por una subvención del USDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | EVOS | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
References
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